Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.
Artykuł metodologiczny
Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) stanowi ważne narzędzie do oceny skuteczności przeciwciał terapeutycznych w immunoterapii nowotworów. Ocena aktywności ADCC w komórkach nowotworowych ma zasadnicze znaczenie dla opracowania i optymalizacji terapii opartych na przeciwciałach. W tym miejscu proponujemy podejście metodologiczne polegające na wykorzystaniu zestawu do testów biologicznych ADCC do ilościowej oceny reakcji ADCC przy użyciu komórek raka tarczycy jako komórek efektorowych. Protokół polega na kohodowli komórek efektorowych z docelowymi komórkami nowotworowymi w różnych proporcjach w obecności przeciwciała terapeutycznego. Zestaw do testów biologicznych ADCC zastosowany w tym eksperymencie zawiera genetycznie zmodyfikowane komórki efektorowe wyrażające gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą elementów odpowiedzi czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFAT). Po związaniu antygenu powierzchniowego na komórkach docelowych z przeciwciałami i komórkami efektorowymi, komórki efektorowe uwalniają lucyferazę, umożliwiając ilościowe określenie cytotoksyczności poprzez pomiar sygnału luminescencji. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów ADCC, metoda ta dowiodła wiązania docelowego antygenu z przeciwciałami i komórkami efektorowymi, co może dać wiarygodne wyniki w krótkim czasie.
Wprowadzenie
Cytotoksyczność zależna od przeciwciał, zależna od komórek (ADCC) jest ważnym mechanizmem, dzięki któremu przeciwciała wywołują efekty zabijania komórek za pośrednictwem układu immunologicznego1,2,3. Komórki odpornościowe są aktywowane przez wiązanie się z przeciwciałem terapeutycznym, które oddziałuje z antygenami powierzchniowymi komórek docelowych w celu uwolnienia granzymów, perforyny, co prowadzi do śmierci komórki docelowej. Te komórki odpornościowe obejmują komórki NK i neutrofile2,3,4,5,6,7. Test ADCC stał się ważnym narzędziem do oceny skuteczności przeciwciał terapeutycznych8,9.
W konwencjonalnym teście ADCC, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) lub komórki NK są używane jako komórki efektorowe do monitorowania skuteczności przeciwciała terapeutycznego poprzez ilościowe określenie śmiertelności komórek celu. Nasza metoda wykorzystuje zestaw do testów biologicznych ADCC, który zawiera genetycznie zmodyfikowane komórki efektorowe wyrażające gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą elementów odpowiedzi czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFAT). Następnie określamy ilościowo wiązanie antygenu powierzchniowego na komórkach docelowych z przeciwciałem i komórkami efektorowymi. Metoda ta opiera się na reakcji ADCC zachodzącej w krótkim czasie bez konieczności użycia ludzkich komórek PBMC. Etapy eksperymentalne obejmują kohodowlę komórek efektorowych z komórkami docelowymi w obecności przeciwciał terapeutycznych.
Podczas inkubacji, przeciwciało terapeutyczne wiąże się z docelowym antygenem na powierzchni komórek docelowych, co prowadzi do wiązania komórek efektorowych i fragmentu Fc przeciwciała. Aktywuje to element odpowiedzi NFAT i uwalnia sygnały luminescencyjne do ilościowej oceny reakcji ADCC.
Przed przeprowadzeniem eksperymentu, ekspresja docelowego antygenu w komórkach docelowych musi zostać potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej lub western bloting. Komórki docelowe są hodowane i pasażowane do 96-dołkowych płytek przez 24 godziny przed eksperymentem. Różne stężenia przeciwciała terapeutycznego są dodawane do różnej liczby komórek efektorowych w celu uzyskania obliczonego stosunku komórek efektorowych do docelowych.
Kluczowe kroki w tej metodzie obejmują (1) przygotowanie komórek docelowych i efektorowych, (2) stosunek komórek efektorowych do docelowych, (3) przygotowanie różnych stężeń przeciwciała i (4) zróżnicowany czas trwania inkubacji. Po inkubacji sygnały luminescencji są mierzone za pomocą luminometru, zapewniając ilościowy odczyt aktywności ADCC. W porównaniu z innymi metodami pomiaru ADCC, ta metoda jest stosunkowo prosta w obsłudze, a wyniki są dokładne.
Test biologiczny reporterowy ADCC wskazuje na wiązanie docelowego antygenu, przeciwciała terapeutycznego i komórek odpornościowych w aktywacji szlaku ADCC. To wiązanie aktywuje transkrypcję genów poprzez szlak NFAT w komórkach Jurkata modyfikowanych komórkami efektorowymi ze stabilną ekspresją receptora FcγRIIIa, wariantu V158 (o wysokim powinowactwie). Element odpowiedzi NFAT pośredniczy w ekspresji lucyferazy w komórkach efektorowych10,11. Aktywność biologiczna przeciwciała w mechanizmie działania (MOA) ADCC jest określana ilościowo za pomocą sygnału lucyferazy wytwarzanego przez szlak NFAT. Sygnał lucyferazy w komórkach efektorowych - komórkach Jurketa eksprymujących receptor FcγRIIIa - jest oznaczany ilościowo za pomocą czytnika luminescencji (Ryc. 1). Stosunek sygnału do szumu w teście jest wysoki.
Protokół
1. Wykrywanie ekspresji EGFR i VEGFR w komórkach docelowych
UWAGA: Użyj western blotting, aby wykryć ekspresję docelowego antygenu w komórkach docelowych.
- Przygotowanie próbki
- Hoduj komórki (linie komórkowe ludzkiego raka tarczycy BHT-101 i SW-1736) w kolbach T75 przy użyciu pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% antybiotyków (penicylina-streptomycyna).
- Zbierz komórki, gdy są w 80% zlewne, usuwając pożywkę hodowlaną i myjąc komórki PBS. Dodać 5 ml PBS i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek w celu usunięcia komórek z kolby hodowlanej. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Policz komórki za pomocą licznika komórek.
- Podwielokrotność 5 × 106 komórek BHT-101 i SW-1736 do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
- Wirować komórki w temperaturze 135 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć sklarowany nad nim PBS.
- Poddać lizie osad komórkowy, dodając 100 μl buforu do lizy RIPA zawierającego inhibitory proteazy fosfatazy przez 5 minut na lodzie. Przenieść lizat do probówki o pojemności 2 ml, odwirować przy 15 000 × g przez 15 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml.
- Zmierz stężenie białka w lizacie komórkowym za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA).
- Pobrać 70 μg białka z lizatu komórkowego z każdej próbki, dodać 2 do próbek Laemmli uzupełniony 10% 2-merkaptoetanolem i gotować próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu denaturacji próbek.
- Elektroforeza żelowa i transfer membranowy
- Przygotuj 8% żel poliakryloamidowy dodecylosiarczanu sodu (SDS), używając wody destylowanej (4,7 ml), 30% akrylamidu (2,7 ml), 1,5 M buforu Tris, pH 8,8 (2,5 ml), 10% dodecylosiarczanu sodu (0,1 ml), 10% nadsiarczanu amonu (100 μl) i TEMED (10 μl).
- Uruchomić 70 μg zdenaturowanych próbek w 8% żelu poliakryloamidowym SDS pod napięciem 80 V przez 20 minut i przy napięciu 120 V przez 100 minut.
- Przenieść białko z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 100 V przez 90 minut.
- Po przeniesieniu zablokuj membranę 7% odtłuszczonym mlekiem rozcieńczonym w buforze TBS-T (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) przez 1 godzinę.
- Inkubacja przeciwciał
- Inkubować zablokowaną błonę z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i króliczemu receptorowi przeciw naczyniowemu śródbłonkowi czynnika wzrostu (VEGFR) (rozcieńczonym w stosunku 1:1 000 w 7% odtłuszczonym mleku) przez noc w temperaturze 4 °C.
- Po inkubacji dokładnie przemyć membranę buforem soli fizjologicznej Tris (TBS-T) (20 mM Tris pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,2% Tween-20) przez 7 minut i powtórzyć 4x.
- Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (rozcieńczonym w stosunku 1:4 000 w 7% odtłuszczonym mleku (TBS-T)) przez 1 godzinę.
- Po inkubacji dokładnie przemyć membranę buforem TBS-T przez 7 minut i powtórzyć 4 razy.
- Wykrywanie białek
- Inkubować membranę w chemiluminescencyjnym podłożu HRP przygotowanym przez zmieszanie 1 ml roztworu nadtlenku substratu HRP z 1 ml odczynnika Luminol do substratu HRP (oba odczynniki pochodzą z zestawu substratów chemiluminescencyjnych) przez 2 minuty.
- Wizualizacja membrany za pomocą systemu obrazowania.
2. Przygotowanie komórek docelowych
- Hoduj docelowe limfocyty T, komórki BHT-101 i SW-1736 wykładniczo, aż do 80% zlewania się w pożywce RPMI uzupełnionej 10% FBS, 1% L-glutaminą i 1% antybiotykami (penicylina-streptomycyna) w kolbach T-75.
- Po wyjęciu pożywki należy raz umyć komórki PBS. Inkubować komórki z 1 ml nieenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek przez 5 minut w celu usunięcia przylegających komórek. Dodać PBS, aby zatrzymać reakcję nieenzymatycznego buforu dysocjacji komórek. Wirować komórki w temperaturze 135 × g przez 5 minut i dodać 5 ml PBS.
UWAGA: Tutaj używamy nieenzymatycznego bufora dysocjacji komórek, aby zachować integralność białka powierzchniowego błony. - Policz komórki i umieść je w 15 000 komórek/dołkach w 96-dołkowych, białych mikropłytkach polistyrenowych z przezroczystym, płaskim dnem.
3. Przygotowanie przeciwciała terapeutycznego o różnych stężeniach
- Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć cetuksymabu (chimerycznego przeciwciała anty-EGFR) do wiązania EGFR i użyć Bevacizumab (humanizowane przeciwciało anty VEGF-A) jako kontroli negatywnej.
- Przygotuj bufor do testu biologicznego ADCC, dodając 1,4 ml surowicy o niskiej zawartości IgG do 33,6 ml RPMI-1640 (dostarczonego w zestawie).
- Użyć buforu do testu biologicznego ADCC do rozcieńczenia przeciwciał. Przygotuj 400 μl każdego przeciwciała w trzech różnych stężeniach: 30 μg/ml, 3 μg/ml i 0,3 μg/ml (3x stężenie), aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL, 1 μg/ml i 0,1 μg/ml dla szerokiego spektrum w celu wykrycia optymalnej dawki.
UWAGA: Końcowe stężenia przeciwciał opierają się na 25 μl hodowanych komórek docelowych, 25 μl komórek efektorowych i 25 μl przeciwciał w każdym dołku 96-dołkowej płytki.
4. Przygotowanie komórek efektorowych
- Przed użyciem należy przechowywać ogniwa efektorowe w temperaturze -80 °C.
- Przed użyciem podgrzej bufor do testu biologicznego ADCC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
- Rozmrozić komórki efektorowe testu biologicznego ADCC z chłodni w temperaturze -80 °C, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (około 2-3 min). Delikatnie rozkołysać i sprawdzić wzrokowo fiolkę, ale nie odwracać jej podczas procesu rozmrażania.
- Przenieś 630ul komórek efektorowych do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3,6 ml buforu testowego ADCC. Dobrze wymieszaj, delikatnie odwracając rurkę 2x.
5. Inkubacja komórek efektorowych z przeciwciałem i komórkami docelowymi
- Po całonocnej inkubacji usuń pożywkę z komórek docelowych (15 000 komórek rakowych na studzienkę) i dodaj 25 μl buforu do testu biologicznego ADCC i 25 μl cetuksymabu (antagonisty EGFR) i bewacyzumabu (antagonisty VEGF), aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 μg / ml, 1 μg / ml lub 10 μg / ml komórek docelowych w każdym dołku zgodnie z Rysunek 2.
- Dodaj 75 000 komórek efektorowych w 25 μl buforu do testu biologicznego ADCC na studzienkę do 96-dołkowej mikropłytki zawierającej komórki docelowe. Studzienki oznaczone jako Brak mAb działają jako brak kontroli przeciwciał (Rysunek 2).
- Dodaj bufor do testu biologicznego ADCC do studzienek oznaczonych jako AB (bufor do testu biologicznego ADCC) w celu ślepej próby.
- Inkubować płytkę przez 6 godzin.
6. Ilościowy odczyt aktywności ADCC
- Przygotować odczynnik do oznaczania lucyferazy na 4 godziny przed pomiarem, dodając bufor do testu lucyferazy do substratu do testu lucyferazy (liofilizowanego).
- Po 6 godzinach inkubacji komórek docelowych, przeciwciał i komórek efektorowych, dodać 75 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut.
- Po okresie inkubacji zmierz sygnał luminescencji w każdym studzience za pomocą luminometru, zapewniając ilościowy odczyt aktywności ADCC.
- Do analizy danych oblicz indukcję krotności w następujący sposób:
Indukcja krotności = RLU (indukowane przeciwciałem - tło) / RLU (brak kontroli przeciwciał - tło).
Gdzie RLU jest względnymi jednostkami luminescencji; Indukowane przeciwciałami są studzienki B3 do B8 i C3 do C8; Brak kontroli przeciwciał = B2 i C2; Tło = Średni RLU od dołka A2 do A5 (Rysunek 2).
Wyniki
Ekspresję EGFR i VEGFR w docelowych liniach komórkowych BHT-101 i SW-1736 wykryto za pomocą metody western blotting. Ekspresję EGFR stwierdzono w komórkach BHT-101 oraz SW-1736, natomiast nie wykryto ekspresji VEGFR (Rysunek 3).
Z wykorzystaniem zestawu do bioanalizy ADCC wykryliśmy reakcję ADCC przeciwciała anty-EGFR, cetuksymabu, używając linii komórkowych EGFR-dodatnich, BHT-101 i SW-1736, jako komórek docelowych. Bevacizumab, inaktywator VEGF, został użyty jako przeciwciało kontrolne ujemne. Różne stężenia przeciwciał i komórek efektorowych inkubowano z komórkami docelowymi. Sygnał luminescencyjny wykryto za pomocą czytnika płytek (Rysunek 2). Wyższy stopień indukcji aktywności ADCC odnotowano w grupach z cetuksymabem (przeciwciało anty-EGFR), natomiast w przypadku bevacizumabu (antagonista VEGF) nie zaobserwowano aktywności ADCC dla obu linii komórkowych. Wykazało to efekt ADCC skierowany przeciwko zewnątrzkomórkowym antygenom błonowym EGFR dla obu linii komórkowych. Stosując tę metodę, zwalidowano reakcję ADCC w obecności cetuksymabu w dwóch liniach komórkowych anaplastycznego raka tarczycy (BHT101 i SW1736) (Rysunek 4).
Rycina 1: Schematyczny rysunek przedstawiający reakcję ADCC z użyciem zestawu do bioproby ADCC. Miejsca wiązania antygenu w przeciwciałach terapeutycznych wiążą się z antygenami powierzchniowymi w komórkach docelowych. Wiązanie to prowadzi do połączenia fragmentu Fc przeciwciała z receptorami FcƳRIIIa komórek efektorowych, które zostały zmodyfikowane genetycznie za pomocą NFAT-RE luc, co generuje sygnał luminescencyjny w komórkach efektorowych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie instrukcji zestawu ADCC Reporter Bioassay Core za zgodą autora12. Skróty: ADCC = Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał); Fc = Fragment crystallizable region (fragment krystalizowalny); NFAT = Nuclear Factor of Activated T-cell (jądrowy czynnik aktywowanych limfocytów T); RE = Response element (element odpowiedzi); luc = Lucyferaza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2Odczyt luminescencji oraz schemat eksperymentalny układu płytki 96-dołkowej w systemie kokultury ADCC. Sygnały luminescencyjne są odczytywane za pomocą czytnika luminescencji. Wiersz A: 1st-9th do studników wlewamy bufor do testu ADCC (ADCC Bioassay Buffer). Rząd B: 3rd-8th dołeczki zawierają układ reakcji ADCC dla BHT101 (komórki docelowe + przeciwciało + komórki efektorowe). 2nd dołek jest pozbawiony przeciwciała. 9th dołek zawiera wyłącznie bufor do testu ADCC. Rząd C: 3rd-8th do dołków wprowadzono układ reakcyjny ADCC dla linii SW-1736 (komórki docelowe + przeciwciała + komórki efektorowe). 2nd dołek nie zawiera przeciwciała. 9th dołek zawiera wyłącznie bufor do bioanalizy ADCC. Rząd D: 1st-9th do studzienek wlano bufor do analizy (Assay Buffer). Skróty: ADCC = cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał; AB = bufor do bioanalizy ADCC; VEGFR = receptor wzrostuttrwalszego śródbłonka naczyniowego; EGFR = receptor naskórkowego czynnika wzrostu; mAb = przeciwciało monoklonalne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Detekcja ekspresji EGFR i VEGFR w liniach raka tarczycy BHT-101 i SW-1736 za pomocą techniki western blotting. W obu liniach komórkowych wykryto ekspresję EGFR, ale nie VEGFR. B-aktynę wykorzystano jako kontrolę ładunku. Skróty: EGFR = receptor Epidermal Growth Factor; VEGFR = receptor naczyniowy czynnika wzrostu naskórka. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Krotność indukcji aktywności ADCC. (A) Linia komórkowa raka tarczycy BHT-101 wykazuje efekt ADCC w obecności przeciwciała anty-EGFR Cetuksymabu. (B) Linia komórkowa raka tarczycy SW-1736 wykazuje efekt ADCC w obecności przeciwciała anty-EGFR Cetuksymabu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiliśmy metodę ADCC Bioassay do oceny reakcji ADCC przeciwciała terapeutycznego. Metoda jest prosta i wykorzystuje prosty format "dodaj-wymieszaj-odczyt" do pomiaru.
Przed przeprowadzeniem eksperymentu ekspresja docelowego antygenu w komórkach docelowych musi zostać potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej lub western blot. Cytometria przepływowa będzie lepszym narzędziem do wykrywania antygenu powierzchniowego. Jednak zastosowanie cytometrii przepływowej może stresować komórki, powodując apoptozę i wpływając na żywotność komórki, a tym samym na ogólną analizę. Ponadto kosztuje więcej niż western blotting. W tym eksperymencie zastosowaliśmy western blot jako szybszą i bardziej opłacalną metodę, ponieważ antygeny celowane są znanymi antygenami powierzchniowymi komórek.
Jako komórki efektorowe wykorzystano zmodyfikowane komórki Jurkat, które stabilnie eksprymowały receptor FcγRIIIa, wariant V158 (o wysokim powinowactwie) oraz element odpowiedzi NFAT, który napędza ekspresję lucyferazy świetlika. Aktywacja szlaku NFAT powoduje produkcję lucyferazy, a jej aktywność jest określana ilościowo w postaci odczytu luminescencji. Sygnał reprezentuje również aktywność ADCC.
Najpierw komórki docelowe (T) inkubuje się z komórkami efektorowymi (E) w obecności różnych ilości przeciwciał na 96-dołkowych płytkach przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze CO2 . Stosunek efektora do celu wynoszący 5:1 służy do optymalizacji sygnału. Na przykład 75 000 komórek efektorowych dodano do 15 000 komórek docelowych. Pod koniec inkubacji do każdej studzienki dodaje się odczynnik do oznaczania lucyferazy Bio-Glo, inkubuje się przez 30 minut, a luminescencję (RLU, względne jednostki lucyferazy) mierzy się za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.
Kluczowymi krytycznymi etapami tego protokołu są: (1) Postępowanie z komórkami efektorowymi. Fiolka z komórkami nie powinna być odwracana podczas procesu rozmrażania, delikatnie kołysać i musi być używana natychmiast po rozmrożeniu, aby zapobiec niepożądanej śmierci komórki lub wpłynąć na wydajność wykrywania biologicznego. (2). Ważne jest, aby do pomiarów luminescencji używać białych 96-dołkowych mikropłytek z polistyrenu z przezroczystym, płaskim dnem, ponieważ luminescencja jest wychwytywana od spodu czytnika.
W tym badaniu zaobserwowaliśmy silniejsze i słabsze reakcje ADCC przeciwciała anty-EGFR, cetuksymabu, w zależności od ilości komórek docelowych i stężenia przeciwciał. Niektóre powody, dla których warto zająć się kalibracją słabych reakcji ADCC: (1) Odczyty testu reporterowego ADCC pochodzą z komórek efektorowych (E), ze stałą liczbą 75 000 komórek na studzienkę w systemie reakcyjnym ADCC tego badania. Dlatego optymalizacja jakości komórek docelowych (T) jest jednym z aspektów, który można poprawić. Stosunek E:T w tym badaniu wynosił 5:1, który można było dostosować do 20:1. (2) Stężenie przeciwciał jest również jednym z ważnych czynników wpływających na reakcję ADCC. Korekty można dokonać poprzez seryjne rozcieńczanie przeciwciał w celu zbadania optymalnego zakresu stężeń, uzyskując w ten sposób maksymalną odpowiedź w raporcie ADCC. (3) Czas inkubacji przeciwciał, komórek docelowych i komórek efektorowych ma również kluczowe znaczenie dla wyników eksperymentalnych. W tym badaniu inkubowaliśmy przez 6 godzin, które można przedłużyć do 24 godzin, aby uzyskać optymalną reakcję ADCC. (4) Ponadto należy również zbadać stężenie roztworu buforowego (niskie IgG) do oznaczania ADCC. Optymalne stężenie w surowicy dla odpowiedzi ADCC można osiągnąć w zakresie od 1% do 10%.
Ta eksperymentalna metoda jest szybka i prosta, umożliwiając ukończenie w ciągu jednego dnia za pomocą prostego protokołu "dodaj-wymieszaj-odczyt". Wyniki są stabilne i podatne na testy wsadowe. Jednak ten zestaw do testów biologicznych nie wykrywa śmierci komórki, jak konwencjonalne metody ADCC, które wykorzystują komórki PBMC lub NK jako komórki efektorowe12,13. Zamiast tego wykorzystuje komórki Jurkat z ekspresją receptora FcγRIIIa jako komórki efektorowe, co będzie kosztować więcej, ponieważ komórki są modyfikowane genetycznie. W porównaniu z tradycyjnymi eksperymentami ADCC 13,14 eliminuje wymóg oddawania krwi od osób zdrowych i pozwala uniknąć złożonego procesu ekstrakcji komórek odpornościowych, łagodząc w ten sposób indywidualne różnice, które mogłyby mieć wpływ na wyniki. Wykryte sygnały luminescencyjne pochodzą z wiązania komórek efektorowych z komórkami docelowymi, a nie z faktycznej śmierci komórek docelowych. W związku z tym mogą wystąpić rozbieżności w porównaniu ze standardowymi metodami wykrywania ADCC. Ponadto bufor dysocjacji komórek, który jest droższy niż trypsyna, służy do odłączania przylegających komórek w celu utrzymania integralności błony.
Analiza genów reporterowych ADCC wykazuje doskonałą dokładność i stabilność, służąc jako metoda analizy skuteczności do masowego wykrywania terapeutycznych leków opartych na przeciwciałach. Może również funkcjonować jako krytyczna metoda analizy do charakterystyki cząsteczek terapeutycznych i rozwoju procesu15.
Podsumowując, ADCC jest ważnym mechanizmem immunologicznym, a ilościowe wykrywanie ADCC ma ogromne znaczenie w dziedzinie immunoterapii. Ta eksperymentalna metoda oferuje skuteczny sposób ilościowego pomiaru ADCC15.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Prof. Zeng (IMCB, A*STAR) za wsparcie tej pracy. Badanie to było wspierane przez Youth Foundation of National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82202231) oraz Projekt Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w prowincji Zhejiang w Chinach (2021KY110,2024KY824).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Rozcieńczyć 10x w PBS, aby uzyskać 0,05% Trypsyna |
| 1x Tris Bufor Sól Solna (TBS) | 1. BAZA | BUF-3030-1X1L | Do mycia membranowego w western blotting |
| 1,5 M Bufor Tris, pH 8,8 | 1. BAZA | BUF-1419-1L-pH8,8 | Do przygotowania żelu SDS |
| 2-merkaptoetanol | Sigma Aldrich | M7522-100ML | Do przygotowania próbki western blotting |
| 30% roztwór akrylamidu/Bis | Bio-Rad | #1610158 | Do przygotowania żelu SDS |
| 4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | Do przygotowania próbki western blotting |
| 96-dołkowa biała mikropłytka polistyrenowa z przezroczystym płaskim dnem | Corning Incorporated | 3610 | Do testu ADCC |
| Test biologiczny ADCC Komórki efektorowe (0,65 ml) | Promega | G7011 | Zawiera zestaw podstawowy do testu biologicznego ADCC reporter (Promega G7010), 1 x 1 fiolka |
| Zestaw rdzeniowy do badania biologicznego ADCC | Promega | G7010 | Wymieniony jako zestaw do testów biologicznych ADCC do testu ADCC w tym eksperymencie |
| Nadsiarczan amonu | Sigma Aldrich | A3678-25G | Do przygotowania żelu SDS |
| Bewacyzumab (humanizowane przeciwciało anty VEGF) | MVASI-Stosowanie | jako przeciwciało kontroli ujemnej w teście | |
| ADCCBHT-101 | Instytut Leibniza DSMZ | ACC279 | Ludzka linia komórkowa anaplastycznego brodawkowatego raka tarczycy |
| Bufor do oznaczania lucyferazy Bio-Glo | Promega | G7941 | Zawiera zestaw rdzeniowy do reporterowego testu biologicznego ADCC (Promega G7010), 1 x 10 ml |
| substratu do oznaczania lucyferazy Bio-Glo (liofilizowany) | Promega | G7941 | Zawiera zestaw rdzeniowy do badania biologicznego reporterowego ADCC (Promega G7010), 1 x 1 fiolka |
| Skrobak do komórek | GenFollower | GD00235 | Do usuwania komórek z kolby hodowlanej |
| Cetuksymab (chimeryczne przeciwciało anty-EGFR) | ERBITUX-Zastosowanie | jako przeciwciało terapeutyczne w teście ADCC | |
| Chemiluminescencyjny substrat HRP | Merck Millipore | WBKLS0500 | Do wykrywania białek w western blotting |
| Woda destylowana | Gibco | 15230-162 | Do przygotowania żelu SDS |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Gibco | 10270-106 | Suplement pożywki |
| hodowlanej System obrazowania iBright CL1500 | Thermo Scientific | 2462621100038 | Do wykrywania białek w western blot |
| L-glutamina, 200 mM | Gibco | 25030-081 | Suplement pożywki |
| hodowlanej Surowica o niskiej IgG Promega | G7110 | Zawiera zestaw rdzeniowy do reporterowego testu biologicznego ADCC (Promega G7010), 1 x 4 ml | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | Wirówka |
| Mysie przeciwciała monoklonalne anty-EGFR | BD Biosciences | 610016 | Przeciwciało pierwszorzędowe w western blotting |
| Mysie przeciwciała monoklonalne anty-VEGFR | BD Biosciences | 571194 | Przeciwciało pierwszorzędowe w |
| nieenzymatycznym buforze dysocjacji komórek | Sigma Aldrich | C5789-100ML | Do pobierania komórek z kolby T75 |
| Penicylina-Streptomycyna | PAN Biotech | P06-07100 | Przeciwbakteryjny dla pożywki |
| hodowlane Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,2, sterylnie filtrowana | 1. BASE | CUS-2048-1x1L | Stosować jako roztwór myjący dla komórek |
| Zestaw do testowania Pierce BCA | Thermo Scientific | 23225 | Do pomiaru stężenia białka |
| proteazy i fosfatazy | Thermo Scientific | A32959 | Do trawienia białek w przygotowaniu próbki do western blotting |
| PVDF błona (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | Do przenoszenia białek w western blotting |
| Królik anty-mysie IgG, Fc i gamma; Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Przeciwciało drugorzędowe w pożywce Western Blot |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Koziorożec Naukowy | RPMI-XA | Pożywka do hodowli komórkowych |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | Zawiera zestaw podstawowy do badania biologicznego ADCC (Promega G7010), 1 x 36 ml |
| Odtłuszczone mleko w proszku | Merck Millipore | 70166-500G | Do blokowania błony w western blotting |
| Dodecylosiarczan sodu | 1. BASE | BIO-2050-500g | Do preparatu żelu SDS |
| SW-1736 | Cytion | 300453 | Ludzka linia komórkowa raka płaskonabłonkowego tarczycy Kolby |
| hodowlane T75 | SPL Lifesciences | 70075 | Kolba do hodowli komórkowych |
| Tecan Multimode Reader model Spark 10M | Tecan | 1607000294 | do kwantyfikacja luminescencji |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | Do przygotowania żelu SDS |
| Tween-20 | Promega | H5151 | Do mycia membran w western blot |
| Analizator żywotności komórek Vi-cell XR | Beckman Coulter | AL15072 | Licznik komórek |
Bibliografia
- Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
- Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engagers for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 24 (7), 471-486 (2024).
- Pinto, S., Pahl, J., Schottelius, A., Carter, P. J. Reimagining antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer: the potential of natural killer cell engagers. Trends Immunol. 43 (11), 932-946 (2022).
- Ochoa, M. C., et al. Antibody-dependent cell cytotoxicity: immunotherapy strategies enhancing effector NK cells. Immunol Cell Biol. 95 (4), 347-355 (2017).
- Wang, W., Erbe, A. K., Hank, J. A., Morris, Z. S. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front Immunol. 6, 368(2015).
- Chung, S., et al. Characterization of in vitro antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activity of therapeutic antibodies - impact of effector cells. J Immunol Methods. 407, 63-75 (2014).
- Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
- Cheng, Z. J., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Methods. 414, 69-81 (2014).
- Parekh, B. S., et al. Development and validation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter gene assay. MAbs. 4 (3), 310-318 (2012).
- Hogarth, P. M., Pietersz, G. A. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond. Nat Rev Drug Discov. 11 (4), 311-331 (2012).
- Chung, S., et al. Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcgamma receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities. MAbs. 4 (3), 326-340 (2012).
- Promega. ADCC Reporter Bioassay Core Kit Technical Manual. , https://www.promega.sg/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/adcc-reporter-bioassay-core-kit-protocol.pdf?rev=bec36264c0b6470591ded081377d207d&sc_lang=en (2023).
- Miller, A. S., Tejada, M. L., Gazzano-Santoro, H. Methods for measuring antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in vitro. Methods Mol Biol. 1134, 59-65 (2014).
- Lo Nigro, C., et al. NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: biological evidence and clinical perspectives. Ann Transl Med. 7 (5), 105(2019).
- Gómez Román, V. R., Murray, J. C., Weiner, L. M. Antibody Fc. Ackerman, M. E., Nimmerjahn, F. , Academic Press. 1-27 (2014).
Przedruki i uprawnienia
