Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) stanowi ważne narzędzie do oceny skuteczności przeciwciał terapeutycznych w immunoterapii nowotworów. Ocena aktywności ADCC w komórkach nowotworowych ma zasadnicze znaczenie dla opracowania i optymalizacji terapii opartych na przeciwciałach. W tym miejscu proponujemy podejście metodologiczne polegające na wykorzystaniu zestawu do testów biologicznych ADCC do ilościowej oceny reakcji ADCC przy użyciu komórek raka tarczycy jako komórek efektorowych. Protokół polega na kohodowli komórek efektorowych z docelowymi komórkami nowotworowymi w różnych proporcjach w obecności przeciwciała terapeutycznego. Zestaw do testów biologicznych ADCC zastosowany w tym eksperymencie zawiera genetycznie zmodyfikowane komórki efektorowe wyrażające gen reporterowy lucyferazy pod kontrolą elementów odpowiedzi czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFAT). Po związaniu antygenu powierzchniowego na komórkach docelowych z przeciwciałami i komórkami efektorowymi, komórki efektorowe uwalniają lucyferazę, umożliwiając ilościowe określenie cytotoksyczności poprzez pomiar sygnału luminescencji. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów ADCC, metoda ta dowiodła wiązania docelowego antygenu z przeciwciałami i komórkami efektorowymi, co może dać wiarygodne wyniki w krótkim czasie.
Wprowadzenie
Cytotoksyczność zależna od przeciwciał, zależna od komórek (ADCC) jest ważnym mechanizmem, dzięki któremu przeciwciała wywołują efekty zabijania komórek za pośrednictwem układu immunologicznego1,2,3. Komórki odpornościowe są aktywowane przez wiązanie się z przeciwciałem terapeutycznym, które oddziałuje z antygenami powierzchniowymi komórek docelowych w celu uwolnienia granzymów, perforyny, co prowadzi do śmierci komórki docelowej. Te komórki odpornościowe obejmują komórki NK i neutrofile2,3,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wykrywanie ekspresji EGFR i VEGFR w komórkach docelowych
UWAGA: Użyj western blotting, aby wykryć ekspresję docelowego antygenu w komórkach docelowych.
- Przygotowanie próbki
- Hoduj komórki (linie komórkowe ludzkiego raka tarczycy BHT-101 i SW-1736) w kolbach T75 przy użyciu pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% antybiotyków (penicylina-streptomycyna).
- Zbierz komórki, gdy są w 80% zlewne, usuwając pożywkę hodowlaną i myjąc komórki PBS. Dodać 5 ml PBS i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek w celu usun....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ekspresję EGFR i VEGFR w docelowych liniach komórkowych BHT-101 i SW-1736 wykryto za pomocą metody western blotting. Ekspresję EGFR stwierdzono w komórkach BHT-101 oraz SW-1736, natomiast nie wykryto ekspresji VEGFR (Rysunek 3).
Z wykorzystaniem zestawu do bioanalizy ADCC wykryliśmy reakcję ADCC przeciwciała anty-EGFR, cetuksymabu, używając linii komórkowych EGFR-dodatnich, BHT-101 i SW-1736, jako komórek docelowych. Bevacizumab, inaktywator VEGF, został użyty jak.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiliśmy metodę ADCC Bioassay do oceny reakcji ADCC przeciwciała terapeutycznego. Metoda jest prosta i wykorzystuje prosty format "dodaj-wymieszaj-odczyt" do pomiaru.
Przed przeprowadzeniem eksperymentu ekspresja docelowego antygenu w komórkach docelowych musi zostać potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej lub western blot. Cytometria przepływowa będzie lepszym narzędziem do wykrywania antygenu powierzchniowego. Jednak zastosowanie cytometrii przepływowej może stre.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni Prof. Zeng (IMCB, A*STAR) za wsparcie tej pracy. Badanie to było wspierane przez Youth Foundation of National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82202231) oraz Projekt Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w prowincji Zhejiang w Chinach (2021KY110,2024KY824).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Rozcieńczyć 10x w PBS, aby uzyskać 0,05% Trypsyna |
| 1x Tris Bufor Sól Solna (TBS) | 1. BAZA | BUF-3030-1X1L | Do mycia membranowego w western blotting |
| 1,5 M Bufor Tris, pH 8,8 | 1. BAZA | BUF-1419-1L-pH8,8 | Do przygotowania żelu SDS |
| 2-merkaptoetanol | Sigma Aldrich | M7522-100ML | Do przygotowania próbki western blotting |
| 30% roztwór akrylamidu/Bis | Bio-Rad | #1610158 | Do przygotowania żelu SDS |
| 4x Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610747 | Do przygotowania próbki western blotting |
| 96-dołkowa biała mikropłytka polistyrenowa z przezroczystym płaskim dnem | Corning Incorporated | 3610 | Do testu ADCC |
| Test biologiczny ADCC Komórki efektorowe (0,65 ml) | Promega | G7011 | Zawiera zestaw podstawowy do testu biologicznego ADCC reporter (Promega G7010), 1 x 1 fiolka |
| Zestaw rdzeniowy do badania biologicznego ADCC | Promega | G7010 | Wymieniony jako zestaw do testów biologicznych ADCC do testu ADCC w tym eksperymencie |
| Nadsiarczan amonu | Sigma Aldrich | A3678-25G | Do przygotowania żelu SDS |
| Bewacyzumab (humanizowane przeciwciało anty VEGF) | MVASI-Stosowanie | jako przeciwciało kontroli ujemnej w teście | |
| ADCCBHT-101 | Instytut Leibniza DSMZ | ACC279 | Ludzka linia komórkowa anaplastycznego brodawkowatego raka tarczycy |
| Bufor do oznaczania lucyferazy Bio-Glo | Promega | G7941 | Zawiera zestaw rdzeniowy do reporterowego testu biologicznego ADCC (Promega G7010), 1 x 10 ml |
| substratu do oznaczania lucyferazy Bio-Glo (liofilizowany) | Promega | G7941 | Zawiera zestaw rdzeniowy do badania biologicznego reporterowego ADCC (Promega G7010), 1 x 1 fiolka |
| Skrobak do komórek | GenFollower | GD00235 | Do usuwania komórek z kolby hodowlanej |
| Cetuksymab (chimeryczne przeciwciało anty-EGFR) | ERBITUX-Zastosowanie | jako przeciwciało terapeutyczne w teście ADCC | |
| Chemiluminescencyjny substrat HRP | Merck Millipore | WBKLS0500 | Do wykrywania białek w western blotting |
| Woda destylowana | Gibco | 15230-162 | Do przygotowania żelu SDS |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Gibco | 10270-106 | Suplement pożywki |
| hodowlanej System obrazowania iBright CL1500 | Thermo Scientific | 2462621100038 | Do wykrywania białek w western blot |
| L-glutamina, 200 mM | Gibco | 25030-081 | Suplement pożywki |
| hodowlanej Surowica o niskiej IgG Promega | G7110 | Zawiera zestaw rdzeniowy do reporterowego testu biologicznego ADCC (Promega G7010), 1 x 4 ml | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | 42876589 | Wirówka |
| Mysie przeciwciała monoklonalne anty-EGFR | BD Biosciences | 610016 | Przeciwciało pierwszorzędowe w western blotting |
| Mysie przeciwciała monoklonalne anty-VEGFR | BD Biosciences | 571194 | Przeciwciało pierwszorzędowe w |
| nieenzymatycznym buforze dysocjacji komórek | Sigma Aldrich | C5789-100ML | Do pobierania komórek z kolby T75 |
| Penicylina-Streptomycyna | PAN Biotech | P06-07100 | Przeciwbakteryjny dla pożywki |
| hodowlane Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,2, sterylnie filtrowana | 1. BASE | CUS-2048-1x1L | Stosować jako roztwór myjący dla komórek |
| Zestaw do testowania Pierce BCA | Thermo Scientific | 23225 | Do pomiaru stężenia białka |
| proteazy i fosfatazy | Thermo Scientific | A32959 | Do trawienia białek w przygotowaniu próbki do western blotting |
| PVDF błona (Immobilin-P) | Merck Millipore | IPVH00010 | Do przenoszenia białek w western blotting |
| Królik anty-mysie IgG, Fc i gamma; Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP | Jackson ImmunoResearch | 315-035-046 | Przeciwciało drugorzędowe w pożywce Western Blot |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Koziorożec Naukowy | RPMI-XA | Pożywka do hodowli komórkowych |
| RPMI-1640 | Promega | G7080 | Zawiera zestaw podstawowy do badania biologicznego ADCC (Promega G7010), 1 x 36 ml |
| Odtłuszczone mleko w proszku | Merck Millipore | 70166-500G | Do blokowania błony w western blotting |
| Dodecylosiarczan sodu | 1. BASE | BIO-2050-500g | Do preparatu żelu SDS |
| SW-1736 | Cytion | 300453 | Ludzka linia komórkowa raka płaskonabłonkowego tarczycy Kolby |
| hodowlane T75 | SPL Lifesciences | 70075 | Kolba do hodowli komórkowych |
| Tecan Multimode Reader model Spark 10M | Tecan | 1607000294 | do kwantyfikacja luminescencji |
| TEMED | Bio-Rad | #1610801 | Do przygotowania żelu SDS |
| Tween-20 | Promega | H5151 | Do mycia membran w western blot |
| Analizator żywotności komórek Vi-cell XR | Beckman Coulter | AL15072 | Licznik komórek |
Bibliografia
- Zahavi, D., AlDeghaither, D., O'Connell, Enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: a strategy for improving antibody-based immunotherapy. Antib Ther. 1 (1), 7-12 (2018).
- Fenis, A., Demaria, O., Gauthier, L., Vivier, E. New immune cell engag....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
