Method Article

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to dwuwarstwowe nanocząsteczki pochodzenia komórkowego, zamknięte w dwuwarstwie lipidowej, niereplikowalne. EV przyciągają obecnie uwagę w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na ich rolę w regulacji komunikacji międzykomórkowej, potencjalnie służąc jako cenne biomarkery chorób sercowo-naczyniowych. Jednak proteom EV i jego potencjał jako biomarkera w diagnostyce sercowo-naczyniowej pozostają słabo poznane. Protokół ten przedstawia znormalizowaną metodę izolacji i kwantyfikacji EV pochodzących z osocza oraz analizy ich ładunku białkowego przy użyciu próbek osocza od pacjentów zgłaszających się na Oddział Bólu Klatki Piersiowej dużego szpitala uniwersyteckiego. Po rutynowej flebotomii EV są izolowane z osocza za pomocą ultrawirowania różnicowego. Wzbogacenie specyficznych białek markerowych EV w izolatach EV jest wizualizowane za pomocą immunoblottingu, a średni rozkład wielkości i stężenia EV w osoczu są określane ilościowo za pomocą analizy śledzenia nanocząstek. Wreszcie, ultrasprawna chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas jest wykorzystywana do bezznacznikowej analizy proteomu EV. Protokół ten zapewnia zatem kompleksowe podejście do badania i wykorzystania EV pochodzących z osocza jako potencjalnych nośników krytycznych informacji biologicznych, a także do zbadania ich potencjału jako nowych biomarkerów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), według nomenklatury niejednolicie zdefiniowane, to nanocząstki otoczone dwuwarstwą lipidową i uwalniane przez różne typy komórek, które nie mają zdolności do replikacji1. Ta zróżnicowana grupa obejmuje egzosomy, subpopulację EV pochodzenia endosomalnego, zwykle o średnicy od około 40 nm do 160 nm2. Wykrywalne w licznych płynach ustrojowych3, EV ułatwiają komunikację międzykomórkową poprzez przenoszenie różnych aktywnych biomolekuł, takich jak białka, mRNA, mikroRNA i lipidy. W ten sposób EV dostarczają informacji o swojej komórce, z której pochodzą, za pomocą spe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tego protokołu, zrekrutowano przykładową kohortę pacjentów, składającą się z trzech zdrowych pacjentów kontrolnych bez widocznych lub podstawowych objawów choroby sercowo-naczyniowej oraz dwóch pacjentów z zawałem mięśnia sercowego bez odcinka ST (NSTEMI). Uprzednia zgoda została udzielona przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Heidelbergu (zgoda IRB #S-351/2015), a przed rekrutacją uzyskano pisemną zgodę od wszystkich pacjentów. Pacjenci zostali zrekrutowani z Oddziału Bólu Klatki Piersiowej Oddziału Kardiologii Szpitala Uniwersyteckiego w Heidelbergu na podstawie wstępnego obrazu klinicznego, wywiadu medycznego i wyników badań ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV zostały wyizolowane z próbek osocza (n = 3) pacjentów bez jawnej choroby sercowo-naczyniowej, jak również od pacjentów z zawałem mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI; n = 2), przy użyciu ustalonego protokołu ultrawirowania różnicowego. Odpowiednie oddzielenie EV osocza zostało potwierdzone przez immunoblotting białek wzbogaconych w EV TSG-101, aneksyny 5 (Anx5) i CD9 w izolatach EV w porównaniu z osoczem zubożonym w EV od tych samych pacjentów (Figura 1A). Transferyna, służąca jako k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia praktyczną, krok po kroku, gotową do użycia metodologię separacji i charakterystyki EV plazmy, a także wprowadzenie do nieznakowanej analizy proteomu, która nadaje się do integracji z rutynową praktyką kliniczną. Szczegółowy opis i ścisłe przestrzeganie ujednoliconej metodologii izolacji EV z próbek osocza są ważne dla zapewnienia powtarzalności uzyskanych wyników. Aktualna literatura wskazuje, że warunki przedanalityczne mogą znacząco wpływać na późniejsze pomiary i dalsze analizy izolatów EV. Dlat.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG otrzymała honoraria dla wykładowców od Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; otrzymał instytucjonalne granty badawcze od Roche Diagnostics i Daiichi Sankyo, a poza zgłoszoną pracą pełni funkcję konsultanta dla Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis i Boehringer Ingelheim. JBK otrzymał dofinansowanie związane z projektem od Niemieckiego Centrum Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym (DZHK) i Roche Diagnostics. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego ze zgłoszoną pracą.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Heidi Deigentasch, Amelie Werner i Elisabeth Mertz za ich wsparcie organizacyjne podczas tego projektu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Bufor do próbek LaemmliBio-rad1610747
10x Bufor RIPAAbcamab156034
Butelka z poliwęglanu 26,3 ml z zespołem nakrętki do ultrawirowaniaBeckman Coulter355654
5810R Wirówka stołowaEppendorf5811000015
Acetonitryl (ACN)Biosolve0001204101BS
Ditiotriitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537
Kwas mrówkowy 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Jodoacetamid (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Spektrometr mas Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS działający buforThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical Oprogramowanie NS300
Nanosight NTA 3.2Malvern Panalytical 
Strona 4  bis 12 %, Żele białkowe Bis-TrisInvitrogenNP0323
Ultrawirówka podłogowa Optima XPN-80Beckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619
Koktajl inhibitorów proteazy/fosfatazy (100X)Technologia sygnalizacji komórkowej5872S
Marker białkowyThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Hybrydowy spektrometr mas kwadrupolowo-orbitrapowyThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Szybkie barwienie coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 µ m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE żel handlowyThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Szybki koncentratorpróżniowy Savant Swiss-Prot
(Uniprot) Baza danych białek Homo sapiens (UP000005640, czerwiec 2020)UniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Kwas trifluorooctowy (TFA) do HPLC >99%, 100 mlSigma-Aldrich302031-100ML
Trypsyna MS-GradeThermo Fisher90058
Typ 50.2 Ti Rotor o stałym kącie nachyleniaBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WodaBiosolve0023214102BS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

Related Articles