Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hodowla sferoidów to model 3D, który zapewnia lepszą replikację mikrośrodowiska in vivo w porównaniu do tradycyjnych kultur dwuwymiarowych (2D). Inwazja jest wynikiem komórkowym, który jest niezwykle interesujący w biologii raka. W tym protokole opracowaliśmy alternatywną strategię oceny inwazji komórek nowotworowych in vitro, wykorzystując heterosferoidy składające się z raka płaskonabłonkowego jamy ustnej (OSCC), fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i monocytów. Te heterosferoidy mają na celu naśladowanie mikrośrodowiska guza (TME), w tym dwóch istotnych typów komórek nienowotworowych obok komórek rakowych. Każdy typ komórki został oznaczony ważnymi markerami fluorescencyjnymi emitującymi różne długości fal przed utworzeniem sferoidy. Po uformowaniu heterosferoidy zostały wysiane na warstwie macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z mięśniaka gładkokomórkowego człowieka w górnym przedziale mikroporowatej błony. Inwazję oceniano w osi z za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy cyfrowe uzyskano w odpowiednich kanałach fluorescencyjnych w odstępach co 10 μm, pokrywając głębokość 90 μm w osi z. Analizę przeprowadzono przy użyciu darmowego oprogramowania do przetwarzania obrazu, obliczając zintegrowaną intensywność fluorescencji w każdym obrazie i kanale fluorescencji. Takie podejście umożliwia bardziej dynamiczną analizę wzorców inwazji komórek w wielowarstwowym kontekście, a także badanie przestrzennej kolokalizacji różnych typów komórek podczas inwazji.
Wprowadzenie
Inwazja to proces, w którym komórki nowotworowe migrują przez macierz zewnątrzkomórkową do otaczającej tkanki1,2. W miarę postępu guza komórki nowotworowe są narażone na coraz bardziej złożone mikrośrodowiska. Mikrośrodowisko guza obejmuje różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej i typy komórek nienowotworowych. Komórki zrębu, w tym fibroblasty i rezydujące makrofagi, przebudowują mikrośrodowisko, wydzielając składniki macierzy zewnątrzkomórkowej i czynniki wzrostu oraz cytokiny, które z kolei wpływają na funkcje komórek nowotworowych3. Zrębowe i naciekające komórki leukocytów również bezpośrednio oddziałują z komórkami nowotworowymi, ze sobą nawzajem oraz z macierzą zewnątrzkomórkową w trójwymiarowym mikrośrodowisku. Podsumowując, skład TME wpływa na skuteczność i wzór inwazji komórek nowotworowych4.
Zawiła natura mikrośrodowiska guza wymaga wdrożenia skutecznych metodologii do zrozumienia interakcji międzykomórkowych w tkance nowotworowej. Większość testów in vitro stosowanych do oceny inwazji przeprowadzono głównie w tradycyjnych modelach 2D i/lub hodowlach pojedynczych typów komórek5,6,7,8, co nadmiernie upraszcza złożony proces inwazji i ma wiele ograniczeń, takich jak brak architektury tkankowej, składników zrębu i in vivo Odtwarzalności. Hodowle sferoidalne reprezentują jeden model kultur 3D in vitro, który naśladuje morfologię masy nowotworowej, umożliwiając interakcje komórka-komórka i komórka-macierz obejmujące cechy fizyczne i biochemiczne9. Wykorzystanie modeli hodowlanych 3D wzrosło w ostatnich dziesięcioleciach i istnieją dowody na to, że różne wyniki biologiczne, takie jak odpowiedź na leczenie, morfologia komórek i ekspresja genów, różnią się w porównaniu z modelem 2D9,10.
Ten protokół demonstruje metodę oceny inwazji in vitro w ludzkiej macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu hodowli komórek sferoidalnych 3D. Ponadto zastosowaliśmy heterosferoidy składające się z komórek nowotworowych, fibroblastów i monocytów, aby naśladować mikrośrodowisko guza z dwoma istotnymi typami komórek nienowotworowych. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej wzdłuż różnych płaszczyzn inwazji w kierunku mikroporowatej błony umożliwia wizualizację tego procesu w bardziej dynamicznym i wielowarstwowym kontekście.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zastosowanie pierwotnych ludzkich komórek zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Etyki Badań nad Ludźmi (CAAE 57895822.0.0000.5416) przy School of Dentistry at Araraquara - UNESP. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu wykorzystanego w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie komórek do hodowli komórkowej 3D
UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek, które będą tworzyć heterosferoid.
UWAGA: W tym eksperymencie wygenerowano sferoidy (patrz krok 2) składające się z linii komórkowej OSCC (SCC9), fibroblastów (pierwotnych fibroblastów związanych z nowotworem z biopsji raka języka) oraz monocytów (pierwotnych monocytów od zdrowych dawców). Dobierz typ komórek zgodnie z celami eksperymentalnymi. - Sprawdź liczbę i żywotność komórek przy użyciu hemocytometru i barwienia błękitem trypanu.
UWAGA: Stosunek komórek w tym protokole wynosi 5:3:2 (5 000 komórek nowotworowych : 3 000 fibroblastów : 2 000 monocytów), co daje łącznie 10 000 komórek na sferoid. Zoptymalizuj stosunek i całkowitą liczbę komórek zgodnie z celami eksperymentalnymi. - Rozcieńcz oddzielnie komórki w probówkach 1,5 mL w medium bez suplementów, odpowiednim dla każdego typu komórek (np. dla komórek nowotworowych – DMEM/F12; dla fibroblastów – DMEM; dla monocytów – RPMI), aby uzyskać odpowiednią gęstość wysiewu wynoszącą 5 000 komórek nowotworowych na dołek, 3 000 fibroblastów na dołek i 2 000 monocytów na dołek, lub 500 000 komórek na mililitr.
UWAGA: Aby zapewnić odpowiednią liczbę komórek do eksperymentu, użyj o 20% więcej niż wymagana całkowita liczba, uwzględniając potencjalne straty podczas etapów barwienia i wirowania. - Oznakuj oddzielnie różne typy komórek za pomocą odrębnych fluorescencyjnych barwników żywotności, które utrzymują się w żywych komórkach przez kilka pokoleń. Dodaj zoptymalizowane stężenia barwnika fluorescencyjnego do medium zawierającego komórki (np. komórki nowotworowe: CFSE – barwnik zielony; fibroblasty: CMTPX – barwnik czerwony; monocyty: Violet BMQC – barwnik niebieski) i inkubuj w 37 °C przez 20 min.
UWAGA: Wybierz sondy fluorescencyjne o różnych widmach wzbudzenia i emisji, aby uniknąć nakładania się widm, zgodnie ze specyfikacją używanego mikroskopu konfokalnego. - Wirowaj komórki przy 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby utworzyć osad komórkowy. Odessaj medium za pomocą pipety 200 µL i resuspenduj w 1 mL 1x PBS.
- Wirowaj przy 400 x g przez 5 min, aby utworzyć osad komórkowy, a następnie resuspenduj całkowitą liczbę komórek w 1 mL suplementowanego medium hodowlanego, odpowiednio do użytego typu/linii komórkowej (np. komórki nowotworowe – 100 µg/mL streptomycyny, 100 IU/mL penicyliny, 10% (vol) FBS i 400 µg/mL hydrokortyzonu; fibroblasty i monocyty – 100 µg/mL streptomycyny, 100 IU/mL penicyliny, 10% (vol) FBS). Sprawdź intensywność fluorescencji pod mikroskopem i policz komórki przy użyciu barwienia błękitem trypanu.
2. Trójwymiarowa (3D) hodowla komórek
UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano metodę biodruku w polu magnetycznym11 w celu stworzenia heterosferoidów. W tej metodzie komórki są namagnesowywane przy użyciu biokompatybilnych nanocząsteczek magnetycznych i poddawane łagodnym siłom magnetycznym. Należy zoptymalizować stosunek nanocząsteczek do komórek w zależności od rodzaju komórek. Można również zastosować alternatywne metody tworzenia kultur sferoidów. Kroki opisane w tej sekcji należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Dodać nanocząstki magnetyczne w stosunku 1 µL nanocząstek na 20 000 komórek i dokładnie resuspendować, mieszając 10 razy.
- Wirować komórki z prędkością 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min, a następnie resuspendować, mieszając 10 razy. Powtórzyć ten cykl wirowania i resuspensji jeszcze dwa razy.
UWAGA: Zmagnetyzowane komórki utworzą pellet o brązowym zabarwieniu. - Po zakończeniu ostatniego cyklu wirowania odessać medium i resuspendować komórki w 34 µL na dołek (34 µL/5 000 komórek nowotworowych; 34 µL/3 000 komórek fibroblastów; 34 µL/2 000 komórek monocytów) uzupełnionego medium hodowlanego (DMEM/F12 zawierającego 100 µg/mL streptomycyny, 100 IU/mL penicyliny i 5% (obj.) FBS) dla komórek nowotworowych.
UWAGA: Obliczyć objętość na podstawie wielkości dołka. W tym protokole zastosowano płytki 96-dołkowe, co dało łącznie 100 µL medium na dołek. - Przenieść wszystkie komórki do nowej probówki w celu kokultywacji, a następnie resuspendować.
- Przenieść 100 µL kokultywowanych komórek do każdego dołka płytki o ultra-niskiej adhezji (ultra-low attachment plate).
- Umieścić generator pola magnetycznego do sferoidów pod płytką, aby wywołać agregację i formowanie sferoidów, a następnie inkubować w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) przez 3 h.
UWAGA: Czas ekspozycji na pole magnetyczne może się różnić w zależności od wielkości lub składu sferoidów. - Usunąć pole magnetyczne i umieścić płytkę w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na co najmniej 24 h, aby umożliwić produkcję białek macierzy zewnątrzkomórkowej oraz interakcje komórka-komórka/komórka-macierz.
3. Przygotowanie mikroporowatej membrany powlekanej macierzą zewnątrzkomórkową
UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Nanieś 50 µL dostępnej komercyjnie macierzy zewnątrzkomórkowej na środek mikroporowatej membrany w płytce 24-dołkowej, używając końcówki 200 µL.
UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkową należy przechowywać na wilgotnym lodzie. Podczas nakładania macierzy nie dotykaj mikroporowatej membrany. - Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą sterylnej igły i upewnij się, że macierz pokrywa całą powierzchnię membrany.
- Umieść membranę w inkubatorze (37 °C) na 1 h, aby umożliwić żelowanie macierzy zewnątrzkomórkowej.
4. Test inwazyjności
UWAGA: Kroki opisane w tej sekcji należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Do dolnej komory membrany mikroporowatej dodać 500 µL pożywki DMEM/F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej w charakterze chemoatraktanta.
- Ostrożnie usunąć pożywkę z uformowanych sferoidów i delikatnie dodać 50 µL/dołek świeżej, nieuzupełnionej pożywki DMEM/F12 na heterosferoid.
UWAGA: Krok ten można wykonać, używając uchwytu do metody biodruku w polu magnetycznym. - Odciąć końcówkę końcówki do pipety o niskiej retencji (200 µL) za pomocą sterylnych nożyczek.
UWAGA: Wielkość końcówki zależy od rozmiaru sferoidu. - Pobrać sferoid wraz z 50 µL pożywki za pomocą końcówki o niskiej retencji.
UWAGA: Krok ten należy wykonywać powoli i ostrożnie, aby uniknąć dezagregacji sferoidu. - Delikatnie umieścić sferoid na powierzchni macierzy zewnątrzkomórkowej.
UWAGA: Nie dotykać zżelowanej macierzy zewnątrzkomórkowej. - Ostrożnie dodać po kropli 150 µL nieuzupełnionej pożywki DMEM/F12, aby osiągnąć całkowitą objętość 200 µL.
- Umieścić płytkę w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 48 h.
UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od linii komórkowej lub protokołu.
5. Pozyskiwanie obrazów
- Do obrazowania należy wykorzystać mikroskop konfokalny.
- Skonfigurować mikroskop zgodnie z charakterystyką wzbudzenia i emisji zastosowanych żywych barwników fluorescencyjnych (np. barwnik CFSE: laser 488 nm i długość fali detekcji 520 nm; fibroblasty: barwnik CMTPX: laser 561 nm i długość fali detekcji 610 nm; monocyty: barwnik Violet BMQC: laser 405 nm i długość fali detekcji 516 nm).
- Umieścić płytkę na stole mikroskopu.
- Zlokalizować sferoidy/komórki w świetle przechodzącym przy powiększeniu 10x.
- Zmienić powiększenie na 40x.
- Ustawić moc lasera oraz wzmocnienie detektora dla każdego kanału fluorescencyjnego.
- Wyznaczyć punkt startowy stosu Z (Z-Stack) jako płaszczyznę ogniskową membrany, lokalizując pory membrany w świetle przechodzącym.
- Dla każdego kanału, włącznie ze światłem przechodzącym, zarejestrować trzy obrazy poniżej i od pięciu do ośmiu obrazów powyżej membrany wzdłuż osi z. Należy zachować odstępy 10 µm między obrazami, obejmując całkowitą głębokość 90-120 µm w osi z.
- Po wygenerowaniu obrazów zapisać projekt w pliku z rozszerzeniem .czi.
6. Ekstrakcja obrazów
UWAGA: Sposób korzystania z oprogramowania do analizy obrazu wyjaśniono poniżej.
- Otwórz plik .czi za pomocą oprogramowania do edycji obrazów (patrz Tabela materiałów).
- Kliknij Processing w prawym górnym rogu, a następnie wybierz Single. Następnie kliknij Method i wybierz Image Export.
- Wybierz plik w sekcji Input.
- Kliknij przycisk Parameters, a następnie wybierz następujące ustawienia: Filetype (Tagged Image File Format - .TIFF), Compression (LZM), Resize (100%), Apply Display Curve And Channel Color, Individual Channel Images, Use Channel Names, Define Subsets (Channel, zaznacz wszystkie kanały), Z-Position (extract all), Region (Full), Tiles (Export selected tiles) oraz Export to (wybierz folder docelowy).
UWAGA: Aby wyeksportować scalone obrazy z kanałów, wybierz następujące ustawienia: Filetype (Tagged Image File Format - .TIFF), Compression (LZM), Resize (100%), Apply Display Curve And Channel Color, Merged Channels Image, Use Channel Names, Define Subsets (Channel, zaznacz konkretne kanały do nałożenia), Z-Position (extract all), Region (Full), Tiles (Export selected tiles) oraz Export to (wybierz folder docelowy). - Kliknij ikonę Apply znajdującą się w prawym górnym rogu.
UWAGA: Ten krok spowoduje jednoczesny eksport obrazów z różnych kanałów.
7. Analiza obrazu
UWAGA: W tym kroku wyjaśniono sposób korzystania z bezpłatnego oprogramowania.
- Kliknij File w lewym górnym rogu, wybierz Open, wskaż obraz, a następnie kliknij OK.
- Kliknij Analyze, następnie Set Measurements i zaznacz Area, Integrated Density oraz Display Label. Kliknij OK.
- Kliknij Analyze, a następnie Measure.
UWAGA: Upewnij się, że powierzchnia wszystkich obrazów jest taka sama. „Integrated Density” wyświetla dwie wartości: (1) Raw Integrated Density (RawIntDen): suma wszystkich wartości pikseli w obrazie; (2) Integrated Density (IntDen): iloczyn średniej wartości szarości i powierzchni. Ponieważ obraz jest w kolorze RGB, a powierzchnia wszystkich obrazów jest identyczna, zaleca się stosowanie RawIntDen jako wartości pomiaru fluorescencji. Różnice w wartościach fluorescencji (intensywności i ilości) między obrazami mogą wskazywać na zmienność intensywności inwazji i proliferacji komórek. Inną metodą normalizacji wzorca inwazji w macierzy zewnątrzkomórkowej w kierunku membrany mikroporowatej przy użyciu ko-kultur różnych typów komórek jest obliczenie stosunku wartości RawIntDen:
Ratio RawIntDen =
Wartość stosunku równa 1 reprezentuje obraz/lokalizację wzdłuż osi z z najwyższym stopniem inwazji/lokalizacji komórek dla danego typu komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejsze badanie przedstawia alternatywną metodę oceny inwazji komórkowej in vitro z wykorzystaniem sferoidów złożonych z różnych typów komórek. Umożliwia ona analizę wzorców inwazji komórkowej w kontekście wielowarstwowym oraz badanie dynamiki kolokalizacji komórek podczas procesu inwazji (Rysunek 1).
Obrazy w polu jasnym przedstawiają lokalizację sferoidów/komórek, zidentyfikowanych jako ciemne/czarne aglomeraty (Rycina 2A...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Trójwymiarowe hodowle sferoidalne są potężnym podejściem do badania różnych aspektów biologii komórki. W tym badaniu przedstawiamy protokół oceny inwazji komórek nowotworowych przy użyciu heterosferoidów, które naśladują mikrośrodowisko guza w wielowarstwowym i bardziej dynamicznym podejściu. Metoda ta pozwala na ocenę kolokalizacji i wzorców inwazji w obecności nienowotworowych komórek zrębu.
Istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają rozważenia. Po pierwsze, ważne jest, aby wybrać kom...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fundację Badawczą São Paulo (FAPESP 20/10544-1 i 20/10664-7). Niektóre obrazy zostały wygenerowane przy użyciu BioRender.com.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96 Zestaw do biodruku Well, | Greiner Bio-one | 655840 | Pole magnetyczne napędu sferoidalnego. Napęd przytrzymujący. 96-dołkowa mikropłytka, powierzchnia odpychająca komórki |
| CellTrace CFSE Zestaw do proliferacji komórek | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| CellTracker Red CMTPX | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34552 | |
| CellTracker Fioletowy BMQC Barwnik | Invitrogen, Thermo Fisher | C10094 | |
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31600-034 | |
| DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12400-024 | |
| Macierz zewnątrzkomórkowa z Myogel | doi: 10.1186/s12885-015-1944-z | Mieszanka złożona z miożelu (2,4 mg/mL), kolagenu (0,8 mg/mL) i niesuplementowanej pożywki z komórek nowotworowych | |
| FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12657-029 | |
| Hydrokortyzon | Sigma | H088 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Software | |
| Nanoshuttle-PL | Greiner Bio-one | 657841 | Nanocząstki magnetyczne |
| Igła 23 G | Medix | AHMD004 | 25 x 0,60 mm (23 G x 1) |
| PBS pH 7,2 (1x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 2012-027 | |
| Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Końcówki do pipet | Axygen, Corning Inc. | TF-200-L-R-S | Końcówka do pipet z barierą (filtrem), 200 &mikro; L Filtr o niskiej retencji, krótki, maksymalny odzysk |
| RPMI | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31800-022 | |
| TransWell 24 well | Costar, Corning Inc. | 3422 | Transwell Przepuszczalne podpory Wkładka 6,5 mm, płytka 24-dołkowa; 0,8 &mikro; m Membrana poliwęglanowa |
| Zen 3.4 (niebieska edycja) | Oprogramowanie Grupy |
Bibliografia
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges. Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: Plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Front Cell Dev Biol. 7, 1-16 (2019).
- Nagy, ÁG., Székács, I., Bonyár, A., Horvath, R. Simple and automatic monitoring of cancer cell invasion into an epithelial monolayer using label-free holographic microscopy. Sci Rep. 12 (1), 1-13 (2022).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res Rev Mutat Res. 752 (1), 10-24 (2013).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. (88), e51046(2014).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - A comparison of different. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2016).
- Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 1-15 (2022).
- Trindade, J., et al. Magnetic 3D cell culture State of the art and current advances. Life Sci. 286, 1-8 (2021).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).
- Lin, Y. N., et al. Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture. J Vis Exp. (160), e61392(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
