Artykuł metodologiczny

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/67115

⸱

9 sierpnia 2024

 , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja chemiczna jest niezwykle ważna dla zdrowia organizmu, rozmnażania i ogólnego dobrego samopoczucia. Rozumienie ścieżek molekularnych, procesów nerwowych i obliczeń rządzących tymi sygnałami jest nadal aktywnym dziedziną badań. Nitkownik Caenorhabditis elegans zapewnia potężny model do badania tych procesów, ponieważ produkuje lotny feromon płciowy. Feromon ten jest syntetyzowany przez niezapłodnione samice lub hermafrodytów pozbawionych plemników i służy jako atrakcyjny czynnik dla samców.

Ten protokół opisuje szczegółową metodę izolowywania lotnego feromon płciowego z kilku szczepów C. elegans (szczep WT N2, daf-22 i fog-2) oraz C. remanei. Dostarczamy również protokołu do ilościowego określania reakcji chemotaksji samców na lotny feromon płciowy. Nasza analiza wykorzystuje pomiary takie jak indeks chemotaksji (C.I.), czas przybycia (A.T.) oraz wykres trajektorii, aby dokładnie porównać reakcje samców w różnych warunkach. Ta metoda umożliwia porównania pomiędzy samcami o różnym pochodzeniu genetycznym lub etapach rozwojowych. Ponadto, opisany tutaj układ eksperymentalny jest przystosowany do badania innych chemikaliów chemoatrakcyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Współdziałanie między komunikacją chemiczną a sukcesem reprodukcyjnym jest podstawową zasadą w całym królestwie zwierząt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Feromony płciowe wywołują szeroki zakres zachowań seksualnie dymorficznych, niezbędnych do zlokalizowania partnerów, koordynowania kroków związanych z znalezieniem i przyciąganiem partnera, a ostatecznie promują rozmnażanie danego gatunku11,12,13,14,15,16,17. Osiągnięto znaczny postęp w zrozumieniu sygnalizacji feromonowej, ale mechanizmy molekularne, obwody neuronowe i procesy obliczeniowe rządzące tymi interakcjami często pozostają niedokładnie określone18,19,20,21,22,23,24,25,26.

Niematoda Caenorhabditis elegans zapewnia potężny model do rozważania tych pytań. Co godne odnotowania, C. elegans wykazuje niezwykłą strategię rozrodczą - hermafrodyci mogą się samozapłodnić, ale także krzyżować się z samcami27,28,29,30,31,32,33. Ta elastyczność wymaga solidnego systemu komunikacji do sygnalizowania statusu rozrodczego. C. elegans jest znany ze swoich dobrze scharakteryzowanych feromonów rozpuszczalnych w wodzie, askarozydów, które odgrywają różnorodne role w rozwoju, zachowaniu i interakcjach społecznych. Ostatnie odkrycia ujawniły odrębną klasę lotnych feromonów płciowych stosowanych przez nicienie. Feromony te są specyficznie produkowane przez dojrzałe seksualnie C. elegans i C. remanei samica niewinna oraz hermafrodyci z wyczerpanym nasieniem i służą jako środek przyciągający dla dorosłych samców29,34,35. Atrakcyjność ta wykazuje znaczący dymorfizm płciowy w swojej produkcji i percepcji. Gonada somatyczna samicy reguluje syntezę tego lotnego feromon płciowego, a produkcja dynamicznie odzwierciedla status rozrodczy, ustając po kopulacji i wznowiona kilka godzin później29,34.

Rozumienie komunikacji feromonowej u nicieni zapewnia wgląd w ewolucję systemów komunikacji chemicznej, współdziałanie między stanem rozrodczym a zachowaniem oraz mechanizmy leżące u podstaw seksualnie dymorficznego przetwarzania neuronowego24,26,36,37,38,39. Badania implikują neuron amfidow AWA u samców jako kluczowy dla wykrywania feromonów, przy czym receptor sprzężony z białkiem G SRD-1 odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu feromonów u samców24. C. elegans jest dobrze przystosowany do badania chemicznej komunikacji zwierząt, szczególnie sygnalizacji feromonowej płciowej, ze względu na jego uzależnienie od układu węchowego w poszukiwaniu partnera. Podczas gdy wiele jest znane o sygnalizacji askarozydów, system lotnych feromonów płciowych oferuje unikalne możliwości porównania25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Ponadto C. elegans jest potężnym modelem genetycznym ze względu na jego w pełni sekwencjonowany genom, wyraźnie zdefiniowaną linię komórkową i dobrze scharakteryzowane mutanty węchowe.

Jednakże pełna obwódka neuron

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Surowe ekstrakcja feromonów płciowych z samic i hermafrodytów

  1. Protokół synchronizacji C. elegans
    1. Przygotowanie dorosłych samic lub hermafrodytów
      1. Monitoruj codziennie płyty kulturowe do momentu, gdy istnieje duża populacja dorosłych samic/hermafrodytów i źródło pokarmu OP50 wyczerpuje się. Używając fog-2 C. elegans i żeńskich C. remanei do surowej ekstrakcji feromonów płciowych, przygotuj zsynchronizowane jaja z zamężnych samic.
        UWAGA: W tym protokole, C. elegans fog-2 mutant XX zwierzęta, które nie produkują plemników, są nazywane C. elegans samicami.
    2. Mycie i osadzanie robaków
      1. Zmyj dorosłe robaki z mieszanej płytki populacyjnej za pomocą buforu M9. Zbieraj zawiesinę robaków do 1,5 mL mikrocentryfugowej probówki. Wyśrodkuj przez 0,5-1 min przy 1 500 x g, aby osadzić robaki.
        UWAGA: Wstępne oczyszczenie dla silnego zanieczyszczenia (opcjonalnie): Pozostaw robaki osiąść w probówce, jeśli są silnie zanieczyszczone. Wypiję nadstan do usunięcia bakterii i powtórz, aż nadstan stanie się przezroczysty.
    3. Wybielanie
      1. Dodaj 200 µL buforu M9 do pelletu robaków. Przygotuj bufor lizy mieszając domowy bielak i 1 M NaOH w proporcji 1:1. Dodaj 500 µL tego bufora lizy do mieszaniny, wiruj przez 10 s, a następnie zatrzymaj się, aby monitorować warunki lizy pod mikroskopem sekcującym. Powtórz ten proces wirowania przez 10 s, a następnie obserwacji, aż dorosłe robaki zostaną całkowicie rozłożone.
    4. Zatrzymanie wybielania i osadzanie zarodków
      1. Gdy dorosłe robaki zostaną zlizowane na małe fragmenty (ale nie całkowicie rozpuszczone), natychmiast dodaj 500 µL buforu M9, aby spowolnić reakcję. Wyśrodkuj przez 15 000 x g przez 30-60 s, aby osadzić zarodki.
        UWAGA: Nadmierne lizanie może uszkodzić zarodki. Zatrzymaj reakcję, gdy ciała dorosłych robaków rozpadły się na małe fragmenty. Lizowanie trwa podczas wyśrodkowania i kroków mycia, aż zostanie usunięty cały bufor lizujący.
    5. Wyśrodkuj zarodki 5x z 1 mL buforu M9, wyśrodkując przez 15 000 x g przez 30-60 s po każdym myciu. Usuń nadstan po wyśrodkowaniu.
    6. Synchronizacja
      1. Ponownie zawieś zarodki w 800 µL buforu M9 w 1,5 mL mikrocentryfugowej probówce. Obróć probówkę w 20°C przez 12-15 h dla wylęgu L1 i zatrzymania robaków na etapie L1 z powodu braku pokarmu. Uwolnij i hoduj robaki w 20°C przez 3 dni, aż osiągną etap L4.

2. Surowa ekstrakcja feromonów płciowych z jednodniowych panienek ( Rysunek 1A)

UWAGA: Stosujemy wcześniej ustalony protokół24 do ekstrakcji feromonów płciowych z jednodniowych panienek fog-2 (feminizacja linii zarodkowej) mutantek C. elegans i żeńskich C. remanei.

  1. Przygotowanie dorosłych samic
    1. Wybierz i wyizoluj około 200 żeńskie fog-2 na etapie L4 jeden dzień przed ekstrakcją feromonów. Aby upewnić się, że zebrano tylko panienki, starannie oddzielaj te żeńskie fog-2 według płci i rozłóż je na trzech oddzielnych 6 cm płytkach OP50 NGM. Umieść małą ilość bakterii OP50 w środku każdej płytki.
      UWAGA: Rozłóż 200 żeńskich robaków na etapie L4 na trzech oddzielnych płytkach, aby uniknąć ryzyka przypadkowego wprowadzenia samca na płytkę. Jeśli wybrano samca, prawdopodobnie sparzy się on z wieloma samicami, w wyniku czego większość samic zostanie zapłodniona następnego dnia, gdy staną się dorosłymi. Zapłodnione samice nie emitują lotnych feromonów płciowych, dopóki plemniki nie zostaną wyczerpane, co wpływa na wyniki ekstrakcji. Ograniczone źródło pokarmu ogranicza hermafrodytów do mniejszego obszaru w środku płytki, minimalizując szansę na ucieczkę z płytki podczas okresu izolacji.
  2. Proces ekstrakcji
    1. W dniu ekstrakcji (dzień 1 dojrzałości rozrodczej, 3 dni po wypuszczeniu robaków z zatrzymania na etapie L1), wybierz i izoljuj 100 panieńskich, jednodniowych żeńskich fog-2 do mikrocentryfugowej probówki zawierającej 1 mL buforu M9. Myj samiczki 5x buforem M9, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne i inkubuj je w 100 µL buforu M9 przez 6 h w 20°C, aby pozwolić na produkcję i akumulację feromonów w podłożu.
    2. Przeprowadź podobny proces ekstrakcji dla żeńskich <

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza trajektorii percepcji wadliwej substancji feromonowej z wadliwą chemoatraktacją w badaniu chemoatraktacji
To badanie chemoatraktacji niezawodnie odróżnia szczepy dzikie i mutanty C. elegans w ich reakcji na lotne feromony płciowe. Sukcesywne eksperymenty z samcami him-5 konsekwentnie wykazują mocną chemotaksję w kierunku źródła feromonów. Odzwierciedla to wysokiej wartości indeksu chemotaksji (C.I.) (Rycina 2), często przekraczającej 0,5, co wskazuje na silne preferowanie źródła feromonów. Z kolei eksperymenty z mutantami receptorów feromonów srd-1 konsekwentnie dają negatywne wyniki. C.I. dla samców srd-1 wynosi zazwyczaj około zera24. Potwierdza to zdolność badania do wykrycia braku reakcji chemotaktycznej.

W nieoptymalnych eksperymentach liczne czynniki mogą wpływać na wyniki. Na przykład niewystarczające stężenie feromonów może prowadzić do słabych reakcji u samców him-5, podczas gdy skażenie lub niewłaściwe postępowanie mogą powodować nieprzewidywalne ruchy u obu szczepów. Scenariusze te prowadzą do niższych wartości C.I. dla samców him-5 i potencjalnie mylących niezerowych wartości dla samców srd-1. Dlatego też, pomyślna implementacja tego protokołu charakteryzuje się wyraźnym rozróżnieniem indeksów chemotaksji pomiędzy szczepami dzikimi a mutantami, wspieranym przez analizę trajektorii wizualnie potwierdzającą różnice w zachowaniu (Rycina 3). Analiza danych powinna obejmować statystyczne porównania wartości C.I. aby upewnić się, że obserwowane różnice są istotne.

Demonstracja analizy i wizualizacji danych z badania chemoatraktacji opartego na wideo
Sukcesywne wyniki badania: Rycina 3 przedstawia mocną reakcję chemotaktyczną samców him-5 na lotny feromon płciowy. Kolorowe trajektorie ujawniają (A) koszt czasowy, (B) odległość: rosnąca bliskość źródła feromonów w czasie, potwierdzając przyciąganie robaków. (C) prędkość: różne prędkości wzdłuż trajektorii, dostarczające wglądu w dynamikę reakcji chemotaktycznych. (D) prostowność: jak bezpośrednio robaki poruszają się w kierunku źródła feromonów. Im prostsza ścieżka, tym bardziej efektywne i ukierunkowane jest ich przemieszczanie się w reakcji na chemiczny atraktant. (E) Poprawność kierunku: to pokazuje zdolność robaków do dokładnego orientowania się i przemieszczania w kierunku źródła feromonów, chemicznego atraktanta. W zasadzie mierzy to, jak dobrze robaki potrafią wyczuć gradient chemiczny i poruszać się wzdłuż niego, aby osiągnąć swój cel.

Spadek prędkości do zera zazwyczaj wskazuje na zatrzymanie lub zwrot. Łączenie informacji o prędkości z danymi dotyczącymi prostowności może pomóc w identyfikacji zdarzeń skrętu. Konkretnie, zdarzenie skrętu jest wskazane, gdy prędkość spada do zera, a prostowność jest również bardzo niska. Natomiast eksperymenty z mutantami o wadliwych zmysłach lub te przeprowadzone w nieoptymalnych warunkach (np. niska koncentracja feromonów, nieodpowiednia gęstość robaków) mogą prowadzić do różnych wyników.

Porównując trajektorie i mierząc parametry takie jak kierunkowość, prędkość i prostowność, naukowcy mogą zdobyć wgląd w podstawowe mechanizmy chemotaksji. Sukcesywne eksperymenty z jasnymi, ukierunkowanymi trajektoriami w stronę źródła feromonów potwierdzają zdolność badania do wykrywania stymulantów przyciągających. Z kolei brak takich wzorców w negatywnych kontrolach lub u mutantów potwierdza specyficzność badania i jego zdolność do identyfikacji defektów sensorycznych. Oparty na wideo metoda masowego badania chemoatraktacji, jak pokazano na Rycinie 3, dostarcza potężnego narzędzia do analizy szczegółów zachowania chemotaksycznego robaków. Analizując indywidualne trajektorie, naukowcy mogą odkryć nie tylko obecność lub brak przyciągania, ale również różnicę w reakcji, oferując głębsze zrozumienie podstawowych mechanizmów genetycznych i nerwowych rządzących chemotaksją.

figure-results-1
Rycina 1: Przepływ ekstrakcji surowych feromonów płciowych. Surowe feromony płciowe są ekstraktowane z zsynchronizowanych, jednodniowych, niezamężnionych samic mutanta fog-2 C. elegans oraz samic dzikich C. remanei, gdzie robaki są zsynchronizowane, przemywane, izolowany i inkubowany w buforze M9 na potrzeby produkcji feromonów. Wyekstrahowany surowy surowiec zawierający feromony jest przechowywany w temperaturze -80 °C do 1 roku do stosowania w badaniach chemoatraktacji, z testami kontroli jakości przeprowadzanymi za pomocą samców N2 lub him-5 aby zweryfikować przyciągającość. W przypadku masowej ekstrakcji z 6-d

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia solidną metodologię wyodrębniania lotnych feromonów płciowych z C. elegans, wraz z ustanowieniem solidnego testu chemoatrakcji w celu zmierzenia reakcji chemoatrakcji samców. Dodatkowe informacje można znaleźć w podręczniku użytkownika WormLab (patrz Tabela Materiałów); podstawowy kod do wizualizacji trajektorii ruchu robaków znajduje się w sekcji protokołu 7.3.8.5. Kilka kluczowych kroków w protokole jest istotnych dla wyniku. Po pierwsze, staranne synchronizacja populacji robaków jest niezbędna do kontroli wieku i stanu reprodukcyjnego, zapewniając skuteczne wyodrębnienie lotnych feromonów płciowych z panienek lub hermafrodytów pozbawionych plemników29,34. Po drugie, wielokrotne kroki mycia są konieczne, aby dokładnie usunąć bakterie, minimalizując zanieczyszczenia, które mogłyby zakłócić sygnalizację feromonów w następnych testach chemotaksji. Następnie, wybór parametrów testu, takich jak stężenie przyciągającego czynnika, wielkość płytki i czas trwania testu, wszystkie te czynniki mogą wpływać na wyniki i muszą być dostosowane do określonych celów eksperymentu.

Dokładne czasy suszenia i spójne rozmieszczenie miejsc testowych są kluczowe dla niezawodnych wyników testu chemotaksji. Mokre płytki znacząco wpływają na wskaźnik chemotaksji. Jeśli warstwa wody pozostaje na powierzchni agaru, siły kapilarne mogą uwięzić robaki na początkowym punkcie. Może to utrudniać ich ruch, prowadząc do fałszywie negatywnych wyników w teście. Ponadto przedłużone czasy suszenia stanowią inne wyzwanie dla robaków uwalnianych później. Gdy płytka wysycha, lotne składniki feromonów parują i dyfundują, tworząc mniej wyraźny gradient stężenia. Utrudnia to później uwolnionym robakom zlokalizowanie docelowego feromonów, nawet jeśli są wolne od ograniczenia ruchu. Dlatego należy upewnić się, że płytki są wystarczająco suche, aby wyeliminować wszelką wilgoć na powierzchni, która mogłaby wpłynąć na wyniki eksperymentu.

Objętość roztworu agaru dodanego do płytek musi być dostosowana do specyficznych wymagań eksperymentu, zapewniając optymalne warunki testu. Grubość warstwy agaru, dostosowywana poprzez zmianę ilości roztworu agaru wlanego na talerz. Zazwyczaj krótsza odległość między czynnikiem przyciągającym a płytką agarową prowadzi do bardziej niezawodnych wyników. Z kolei większa odległość może pomóc wyeliminować wpływ nielotnych składników, zapewniając czystszą ocenę wpływu lotnego czynnika przyciągającego. Grubość agaru może być dostosowana do specyficznych potrzeb eksperymentu, jak pokazano na Rysunku 2B.

Proces wybierania 20 robaków nie powinien przekraczać 1-2 minut, aby uniknąć wysychania i pogorszenia stanu zdrowia wcześniej wybranych robaków, co mogłoby wpłynąć na wyniki. Upewnij się, że robaki są uwalniane na płytkę testową jednocześnie, aby zapobiec losowemu oddalaniu się wcześniej wypuszczonych robaków od punktu startowego. Opóźnienia w tym kroku mogą prowadzić do różnych pozycji startowych w próbkach, co skutkuje niesprawiedliwymi porównaniami. Cały proces od wybierania samców do zamknięcia pokrywy powinien zająć od 2 do 5 minut.

Dostosuj odstęp między miejscami eksperymentalnymi/kontrolnymi a punktem startowym na płytce testowej zgodnie z wielkością płytki i określonymi celami eksperymentu. Zwiększenie odległości między miejscami może uczynić test bardziej wymagającym, co jest korzystne dla wykrycia subtelnych efektów. Z kolei zmniejszenie odległości tworzy bardziej solidny test, który wyróżnia poważne defekcje.

Rozwiązywanie problemów może być konieczne w różnych punktach protokołu. Jeśli wyodrębniony feromon nie wywołuje reakcji chemotaksji, należy dokładnie zweryfikować wiek i stan reprodukcyjny żeńskich i hermafrodytycznych źródeł. Tylko panienki lub hermafrodyty pozbawione plemników wytwarzają docelowy feromon. Ze względu na wysoką efektywność kojarzenia się samców C. elegans, obecność nawet jednego samca na płytce izolacji L4 samic może znacząco wpłynąć na wyniki. Dodatkowo, upewnij się kontroli zakażenia bakteryjnego w całym procesie ekstrakcji. Chociaż ten protokół ekstrakcji oferuje prosty sposób uzyskania surowych lotnych feromonów płciowych, ma pewne ograniczenia. Surowy ekstrakt feromonów może zawierać śladowe ilości innych cząsteczek sygnałowych, co utrudnia jednoznaczne izolowanie specyficznych efektów samego feromonów płciowych. Funkcjonalne składniki lotnego feromonów płciowych nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Chociaż nie zgłoszono żadnych funkcjonalnych różnic między feromonami płciowymi jednodniowych panienek a sześciodniowych hermafrodytów, nie można wykluczyć subtelnej różnicy.

W teście chemoatrakcji, niski wskaźnik chemotaksji może wskazywać na problem ze zdrowiem lub stadium rozwojowym testowanych samców. Aby zapewnić optymalne wyniki, użyj zdrowych jednodniowych dorosłych samców wyhodowanych w temperaturze 20 °C na czystej płytce OP50 bez zanieczyszczenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni dr Tingtao Zhou za zaprojektowanie i napisanie kodu dla wizualizacji trajektorii wykorzystanych w naszej analizie. Ta praca była wspierana przez finansowanie: R01 NS113119 (PWS), stypendium dla starszych doktorantów Chen oraz Instytut Neurologii Tianqiao i Chrissy Chen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 cm Petri dishesFalcon25373-100Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishesFalcon25373-085Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)CGC
CentrifugeEppendorfcentrifuge 5418 Any brand should work.
Chemoattraction assay platesHomemade solutionN/A1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
CholesterolAlfa Aesar57-88-5
Dissecting MicroscopeLeicaLeicaMZ75 Any brand should work.
E. Coli OP50CGC
EthanolKoptec64-17-5
fog-2(q71) (JK574)CGC
him-5(e1490)(CB4088)CGC
Household bleachClorox Germicidal bleach concentrated Bleach
M9 bufferHomemade solutionN/A3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, PowderMacronM1063-500GM-EA
MicrowaveTOSHIBAN/A Any brand should work.
N2CGC
NaOHSigma-aldrichS318-31 M
NGM plates solutionHomemade solutionN/A2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
ParafilmBemis13-374-10Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
PeptoneVWR97063-324
Pipet- aidDrummond Scientific 4-000-100 Any brand should work.
Plastic paper OctagoWaterproof Screen Printing Inkjet Transparency Filmhttps://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chlorideSigma-aldrichSLBP2366V
Potassium phosphateSpectrum7778-77-0
PipetteEppendorfSKU: EPPR4331; MFG#: 223130000620 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
RotatorLabnetSKU: LI-H5500 Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chlorideVWR7647-14-5
sodium phosphate dibasicSigma-aldrichSLCG3888
Tris-baseSigma-aldrich77-86-1
Tris-Cl Roche1185-53-1
TryptoneVWR97063-390
VortexScientific industriesVortex-Genie 2 Any brand should work.
WormLab system MBF BioscienceN/Ahttps://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
WormpickerHomemade N/Amade with platinum and glass pipet tips

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Audesirk, T. E. Chemoreception in Alphysia californica. Iii. Evidence for pheromones influencing reproductive behavior. Behav Biol. 20 (2), 235-243 (1977).
  2. Traynor, K. S., Le Conte, Y., Page, R. E. Jr Queen and young larval pheromones impact nursing and reproductive physiology of honey bee (Apis mellifera) workers. Behav Ecol Sociobiol. 68 (12), 2059-2073 (2014).
  3. Cowley, J. J., Wise, D. R. Pheromones, growth and behaviour. Ciba Found Study Group. 35, 144-170 (1970).
  4. Epple, G. Pheromones in primate reproduction and social behavior. Adv Behav Biol. 11, 131-155 (1974).
  5. Levinson, H. Z. Possibilities of using insectistatics and pheromones in pest control. Naturwissenschaften. 62 (6), 272-282 (1975).
  6. Roelofs, W. Manipulating sex pheromones for insect suppression. Environ Lett. 8 (1), 41-59 (1975).
  7. Marchlewska-Koj, A. Pheromones and mammalian reproduction. Oxf Rev Reprod Biol. 6, 266-302 (1984).
  8. Keverne, E. B. Neuroendocrinology briefings 11: Pheromones and reproduction. J Neuroendocrinol. 12 (11), 1045-1046 (2000).
  9. Rekwot, P. I., Ogwu, D., Oyedipe, E. O., Sekoni, V. O. The role of pheromones and biostimulation in animal reproduction. Anim Reprod Sci. 65 (3-4), 157-170 (2001).
  10. Gomez-Diaz, C., Benton, R. The joy of sex pheromones. EMBO reports. 14 (10), 874-883 (2013).
  11. Shorey, H. H., Gaston, L. K., Jefferson, R. N. Insect sex pheromones. Adv Pest Control Res. 8, 57-126 (1968).
  12. Bruce, H. M. Pheromones and behavior in mice. Acta Neurol Psychiatr Belg. 69 (7), 529-538 (1969).
  13. Shorey, H. H., Bartell, R. J. Role of a volatile female sex pheromone in stimulating male courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 18 (1), 159-164 (1970).
  14. Bobadoye, B., et al. Evidence of aggregation-sex pheromone use by longhorned beetles (coleoptera: Cerambycidae) species native to Africa. Environ Entomol. 48 (1), 189-192 (2019).
  15. Saunders, J. R. Sex pheromones in bacteria. Nature. 275 (5682), 692-694 (1978).
  16. Schulz, S., Toft, S. Identification of a sex pheromone from a spider. Science. 260 (5114), 1635-1637 (1993).
  17. Finnegan, D. E., Chambers, J. Identification of the sex pheromone of the guernsey carpet beetle, Anthrenussarnicus mroczkowski (coleoptera: Dermestidae). J Chem Ecol. 19 (5), 971-983 (1993).
  18. Vaillancourt, L. J., Raudaskoski, M., Specht, C. A., Raper, C. A. Multiple genes encoding pheromones and a pheromone receptor define the b beta 1 mating-type specificity in Schizophyllum commune. Genetics. 146 (2), 541-551 (1997).
  19. Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-22 (2013).
  20. Sakai, N., et al. A sexually conditioned switch of chemosensory behavior in C. elegans. PLoS One. 8 (7), e68676(2013).
  21. Sengupta, S., Smith, D. P. How Drosophila detect volatile pheromones: signaling, circuits, and behavior. Neurobiology of chemical communication. Mucignat-Caretta, C. , CRC Press. (2014).
  22. Zhang, Y. K., Reilly, D. K., Yu, J., Srinivasan, J., Schroeder, F. C. Photoaffinity probes for nematode pheromone receptor identification. Org Biomol Chem. 18 (1), 36-40 (2019).
  23. Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Dynamic regulation of adult-specific functions of the nervous system by signaling from the reproductive system. Curr Biol. 29 (23), 4116-4123.e3 (2019).
  24. Wan, X., et al. SRD-1 in AWA neurons is the receptor for female volatile sex pheromones in C. elegans males. EMBO Rep. 20 (3), e46288(2019).
  25. Peckol, E. L., Troemel, E. R., Bargmann, C. I. Sensory experience and sensory activity regulate chemosensory receptor gene expression in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (20), 11032-11038 (2001).
  26. Jang, H., et al. Neuromodulatory state and sex specify alternative behaviors through antagonistic synaptic pathways in. C. elegans. Neuron. 75 (4), 585-592 (2012).
  27. Liu, K. S., Sternberg, P. W. Sensory regulation of male mating behavior in Caenorhabditis elegans. Neuron. 14 (1), 79-89 (1995).
  28. Chasnov, J. R., Chow, K. L. Why are there males in the hermaphroditic species Caenorhabditis elegans. Genetics. 160 (3), 983-994 (2002).
  29. Chasnov, J. R., So, W. K., Chan, C. M., Chow, K. L. The species, sex, and stage specificity of a Caenorhabditis sex pheromone. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (16), 6730-6735 (2007).
  30. Susoy, V., et al. Natural sensory context drives diverse brain-wide activity during C. elegans mating. Cell. 184 (20), 5122-5137.e17 (2021).
  31. Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  32. Click, A., Savaliya, C. H., Kienle, S., Herrmann, M., Pires-Dasilva, A. Natural variation of outcrossing in the hermaphroditic nematode Pristionchus pacificus. BMC Evol Biol. 9, 75(2009).
  33. Anderson, J. L., Morran, L. T., Phillips, P. C. Outcrossing and the maintenance of males within C. elegans populations. J Hered. 101 (suppl_1), S62-S74 (2010).
  34. Leighton, D. H., Choe, A., Wu, S. Y., Sternberg, P. W. Communication between oocytes and somatic cells regulates volatile pheromone production in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 17905-17910 (2014).
  35. White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  36. Fagan, K. A., et al. A single-neuron chemosensory switch determines the valence of a sexually dimorphic sensory behavior. Curr Biol. 28 (6), 902-914.e5 (2018).
  37. Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: A genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24 (34), 7427-7434 (2004).
  38. Frady, E. P., Palmer, C. R., Kristan, W. B. Jr Sexual attraction: Sex-specific wiring of neural circuitry. Curr Biol. 22 (22), R953-R956 (2012).
  39. Liu, Q., et al. Two preputial gland-secreted pheromones evoke sexually dimorphic neural pathways in the mouse vomeronasal system. Front Cell Neurosci. 13, 455(2019).
  40. Ludewig, A. H., et al. Pheromone sensing regulates Caenorhabditis elegans lifespan and stress resistance via the deacetylase sir-2.1. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5522-5527 (2013).
  41. Golden, J. W., Riddle, D. L. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
  42. Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans. Nat Chem Biol. 3 (7), 420-422 (2007).
  43. Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).
  44. Butcher, R. A., Ragains, J. R., Kim, E., Clardy, J. A potent dauer pheromone component in Caenorhabditis elegans that acts synergistically with other components. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14288-14292 (2008).
  45. Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Counteracting ascarosides act through distinct neurons to determine the sexual identity of C. elegans pheromones. Curr Biol. 27 (17), 2589-2599.e3 (2017).
  46. Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Sex pheromones of C. elegans males prime the female reproductive system and ameliorate the effects of heat stress. PLoS Genet. 11 (12), e1005729(2015).
  47. Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  48. Kaplan, F., et al. Ascaroside expression in Caenorhabditis elegans is strongly dependent on diet and developmental stage. PLoS One. 6 (3), e17804(2011).
  49. Pungaliya, C., et al. A shortcut to identifying small molecule signals that regulate behavior and development in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (19), 7708-7713 (2009).
  50. Srinivasan, J., et al. A modular library of small molecule signals regulates social behaviors in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10 (1), e1001237(2012).
  51. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  52. Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
  53. Von Reuss, S. H., et al. Comparative metabolomics reveals biogenesis of ascarosides, a modular library of small-molecule signals in C. elegans. J Am Chem Soc. 134 (3), 1817-1824 (2012).
  54. Choe, A., et al. Sex-specific mating pheromones in the nematode panagrellus redivivus. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20949-20954 (2012).
  55. Hsueh, Y. P., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Sternberg, P. W. Nematode-trapping fungi eavesdrop on nematode pheromones. Curr Biol. 23 (1), 83-86 (2013).
  56. Hong, M., et al. Early pheromone experience modifies a synaptic activity to influence adult pheromone responses of C. elegans. Curr Biol. 27 (20), 3168-3177.e3 (2017).
  57. Ryu, L., et al. Feeding state regulates pheromone-mediated avoidance behavior via the insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 37 (15), e98402(2018).
  58. Diaz, S. A., Lindström, J., Haydon, D. T. Basic demography of Caenorhabditis remanei cultured under standard laboratory conditions. J Nematol. 40 (3), 167(2008).
  59. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook : the online review of C.elegans biology. , 1-29 (2006).
  60. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. JoVE: J Vis Exp. (74), e50069(2013).
  61. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lotna feromonatest chemotaksjiatrakcyjno dla samc wilo ciowe oznaczanie feromon wsynchronizacja nicienianaliza trajektoriikomunikacja nicieni

Powiązane artykuły