Method Article

Ekstrakcja lotnych feromonów płciowych i test chemoatrakcyjności w Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/67115

⸱

August 9th, 2024

 , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i kwantyfikacji reakcji na lotny feromon płciowy u C. elegans, dostarczając narzędzi do badania chemicznej komunikacji i trajektorii nawigacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja chemiczna jest niezbędna dla zdrowia organizmu, reprodukcji i ogólnego dobrobytu. Zrozumienie szlaków molekularnych, procesów neuronowych i obliczeń rządzących tymi sygnałami pozostaje aktywnym obszarem badań. Nicienie Caenorhabditis elegans stanowią potężny model do badania tych procesów, ponieważ wytwarzają lotny feromon płciowy. Feromon ten jest syntetyzowany przez dziewicze samice lub hermafrodyty zubożone w plemniki i służy jako atraktant dla samców.

Ten protokół opisuje szczegółową metodę izolowania lotnych feromonów płciowych z kilku szczepów C. elegans (WT szczep N2, daf-22 i fog-2) oraz C. remanei. Udostępniamy również protokół do ilościowego określania męskiej odpowiedzi chemotaksji na lotny feromon płciowy. Nasza analiza wykorzystuje pomiary, takie jak wskaźnik chemotaksji (CI), czas przybycia (AT) i wykres trajektorii, aby dokładnie porównać reakcje samców w różnych warunkach. Metoda ta pozwala na rzetelne porównania między samcami o różnym pochodzeniu genetycznym lub etapie rozwoju. Co więcej, opisana tutaj konfiguracja eksperymentalna jest przystosowana do badania innych substancji chemicznych chemoatrakcyjnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzajemne oddziaływanie między komunikacją chemiczną a sukcesem reprodukcyjnym jest fundamentalną zasadą w całym królestwie zwierząt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Feromony płciowe wyzwalają szeroki wachlarz dymorficznych zachowań płciowo niezbędnych do lokalizowania partnerów, koordynowania kroków związanych ze znalezieniem i przyciągnięciem partnera, a ostatecznie promowania rozmnażania gatunku11,12,13,14,15,16,17. Poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu sygnalizacji feromonowej, ale mechanizmy molekularne, obwody neuronalne i procesy obliczeniowe rządzące tymi interakcjami często pozostają niew pełni zdefiniowane18,19,20,21,22,23,24, 25,26.

Nicienie Caenorhabditis elegans dostarczają potężnego modelu do analizowania tych pytań. Warto zauważyć, że C. elegans wykazuje niezwykłą strategię reprodukcyjną - hermafrodyty mogą samozapładniać, ale także krzyżować się z samcami27,28,29,30,31,32,33. Ta elastyczność wymaga solidnego systemu komunikacji do sygnalizowania stanu rozrodczego. C. elegans jest znany ze swoich dobrze scharakteryzowanych rozpuszczalnych w wodzie feromonów, askarozydów, które odgrywają różne role w rozwoju, zachowaniu i interakcjach społecznych. Niedawne odkrycia ujawniły odrębną klasę lotnych feromonów płciowych stosowanych przez nicienie. Feromony te są wytwarzane przez dojrzałe płciowo dziewicze samice C. elegans i C. remanei oraz hermafrodyty zubożone w plemniki, służąc jako atraktant dla dorosłych samców29,34,35. Ten atraktant wykazuje niezwykły dymorfizm płciowy w swojej produkcji i percepcji. Samica gonady somatycznej rządzi syntezą tego lotnego feromonu płciowego, a produkcja dynamicznie odzwierciedla stan rozrodczy, zatrzymując się po kryciu i wznawiając kilka godzin później29,34.

Zrozumienie komunikacji feromonów płciowych nicieni dostarcza wglądu w ewolucję chemicznych systemów komunikacyjnych, wzajemne oddziaływanie między stanem rozrodczym a zachowaniem oraz mechanizmy leżące u podstaw dymorficznego płciowo przetwarzania neuronalnego24,26,36,37,38,39. Badania sugerują, że neuron amfidowy AWA u mężczyzn ma kluczowe znaczenie dla wykrywania feromonów, a receptor sprzężony z białkiem G SRD-1 odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu feromonów u mężczyzn24. C. elegans doskonale nadaje się do badania komunikacji chemicznej zwierząt, zwłaszcza sygnalizacji feromonów płciowych, ze względu na zależność od układu węchowego w poszukiwaniu partnera. Chociaż wiele wiadomo na temat sygnalizacji askarozydowej, system lotnych feromonów płciowych oferuje wyjątkowe możliwości porównania25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Co więcej, C. elegans jest potężnym modelowym organizmem genetycznym ze względu na w pełni zsekwencjonowany genom, jasno zdefiniowaną linię komórkową i dobrze scharakteryzowane mutanty węchowe.

Jednak kompletne obwody neuronalne zaangażowane w przetwarzanie tego feromonu, obliczenia, które przekładają jego percepcję na ukierunkowane zachowania związane z poszukiwaniem partnera, oraz regulacja jego biosyntezy pozostają do pełnego wyjaśnienia. Dalsze badania nad tymi procesami mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia różnorodnych mechanizmów rządzących komunikacją zwierząt i zachowaniami reprodukcyjnymi. Identyfikacja kluczowych genów biorących udział w syntezie, wydzielaniu i percepcji feromonów może przyczynić się do odkrycia nowych czynników molekularnych w komunikacji między zwierzętami. Opisane tutaj testy stanowią podstawę do odpowiedzi na te pytania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Prymitywna ekstrakcja feromonów płciowych od samic i hermafrodytów

  1. Protokół synchronizacji C. elegans
    1. Przygotowanie dorosłych samic lub hermafrodytów
      1. Codziennie monitoruj płytki hodowlane, aż pojawi się duża populacja dorosłych samic / hermafrodytów i źródło pożywienia OP50 wyczerpie się. Używając samic fog-2 C. elegans i WT C. remanei do ekstrakcji surowych feromonów płciowych, przygotuj zsynchronizowane jaja z pokrytych samic.
        UWAGA: W tym protokole zmutowane zwierzęta XX C. elegans fog-2, które nie wytwarzają własnego plemnika, są określane jako samice C. elegans.
    2. Mycie i granulowanie robaków
      1. Zmyj dorosłe robaki z płytki o mieszanej populacji za pomocą buforu M9. Zebrać zawiesinę robaków do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 500 × g przez 0,5-1 minutę w celu osadzenia robaków.
        UWAGA: Czyszczenie wstępne w przypadku silnych zabrudzeń (opcjonalnie): Pozwól robakom osiąść w tubie, jeśli są mocno zanieczyszczone. Odpipetować supernatant w celu usunięcia bakterii i powtarzać tę czynność, aż supernatant stanie się klarowny.
    3. bielenie
      1. Dodać 200 μl buforu M9 do osadu robaka. Przygotować bufor do lizy, mieszając wybielacz domowy i 1 M NaOH w stosunku 1:1. Dodać 500 μl tego buforu do lizy do mieszaniny, wirować przez 10 s, a następnie zrobić przerwę w celu monitorowania stanu lizy pod mikroskopem preparacyjnym. Powtórz ten proces 10-sekundowych wirów, a następnie obserwuj, aż dorosłe robaki zostaną w pełni zlizowane.
    4. Zaprzestanie bielenia i granulowania zarodków
      1. Gdy dorosłe robaki są poddawane lizie na małe fragmenty (ale nie są całkowicie rozpuszczone), natychmiast dodaj 500 μl buforu M9, aby spowolnić reakcję. Wirować przy 15 000 × g przez 30-60 s w celu osadzenia zarodków.
        UWAGA: Nadmierna liza może uszkodzić zarodki. Przerwij reakcję, gdy dorosłe ciała robaków rozpadną się na małe fragmenty. Liza jest kontynuowana podczas wirowania i etapów mycia, aż cały bufor do lizy zostanie usunięty.
    5. Umyj zarodki 5x 1 ml buforu M9, odwirowując przy 15 000 × g przez 30-60 s po każdym myciu. Usunąć supernatant po odwirowaniu.
    6. synchronizacja
      1. Zawiesić zarodki w 800 μl buforu M9 w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Obracać rurkę w temperaturze 20 °C przez 12-15 godzin w celu wylęgu L1 i zatrzymania robaków na etapie L1 z powodu braku dopływu pokarmu. Uwolnij robaki i hoduj je w temperaturze 20 ° C przez 3 dni, aż osiągną stadium L4.

2. Ekstrakcja surowych feromonów płciowych od jednodniowych dziewiczych samic (Rysunek 1A)

UWAGA: Stosujemy wcześniej ustalony protokół24 do ekstrakcji feromonów płciowych od jednodniowych dziewiczych zmutowanych samic C. elegans i samic WT C. remanei.

  1. Przygotowanie dorosłych samic
    1. Wybierz i odizoluj około 200 samic L4 stage fog-2 na 1 dzień przed ekstrakcją feromonów. Aby upewnić się, że zbierane są tylko dziewicze samice, należy ostrożnie oddzielić te samice L4 fog-2 według płci i rozprowadzić je na trzech oddzielnych płytkach OP50 NGM o średnicy 6 cm. Umieść niewielką ilość bakterii OP50 na środku każdej płytki.
      UWAGA: Rozłóż 200 żeńskich robaków L4 na trzech oddzielnych płytkach, aby uniknąć ryzyka przypadkowego wprowadzenia męskiego robaka na płytkę. Jeśli samiec zostanie wybrany, prawdopodobnie kojarzy się z wieloma samicami, co spowoduje, że większość samic zostanie zapłodniona następnego dnia, kiedy osiągną dorosłość. Zapłodnione samice nie wydzielają lotnych feromonów płciowych do momentu wyczerpania plemników, co wpływa na wyniki ekstrakcji. Ograniczone źródło pożywienia ogranicza hermafrodyty do mniejszego obszaru w środku talerza, minimalizując szansę na ucieczkę z talerza w okresie izolacji.
  2. Proces ekstrakcji
    1. W dniu ekstrakcji (1. dzień dojrzałości reprodukcyjnej, 3 dni po uwolnieniu robaków z zatrzymania L1) wybierz i wyizoluj 100 dziewiczych, jednodniowych samic fog-2 do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml buforu M9. Przemyć samice 5x buforem M9 w celu zminimalizowania skażenia bakteryjnego i inkubować je w 100 μl buforu M9 przez 6 godzin w temperaturze 20 °C, aby umożliwić produkcję i akumulację feromonów w pożywce.
    2. Przeprowadzić podobny proces ekstrakcji dla samic C. remanei, używając tylko 15-20 samic w stadium L4 wyizolowanych dzień przed ekstrakcją na trzy płytki, a następnego dnia inkubować pięć dziewiczych samic w 100 μl buforu M9 przez 6 godzin w temperaturze 25 °C (optymalna temperatura wzrostu dla C. remanei)58.
      UWAGA: Samice C. remanei wytwarzają większą ilość lotnych feromonów płciowych w porównaniu z samicami C. elegans. Dlatego tylko pięć samic wystarcza do ekstrakcji 100 μl surowego lotnego feromonu płciowego.
  3. składowanie
    1. Odwiruj próbki o masie 15 000 × g przez 30-60 s w celu osadzenia robaków. Ostrożnie przenieść pipetowaną supernatant (zawierający feromony) do czystej probówki i wyrzucić probówkę zawierającą osad robaka. Wyizolowany supernatant należy przechowywać do kolejnych testów chemoatrakcyjności.
      UWAGA: Surowy ekstrakt z lotnych feromonów płciowych może być przechowywany przez co najmniej 1 rok w temperaturze -80 °C w probówce mikrowirówkowej owiniętej parafilmem w celu zminimalizowania parowania.
  4. Kontrola jakości
    1. Przed zastosowaniem ekstraktu należy przeprowadzić test kontroli jakości z udziałem samców N2 lub samców him-5 w celu sprawdzenia jego chemoatrakcyjności (patrz punkt 4).

3. Duża ilość surowej ekstrakcji feromonów płciowych z 6-dniowych dziewiczych hermafrodytów (Rysunek 1A)

  1. Kultura robaków
    1. Aby uzyskać około 20 ml surowego feromonu płciowego C. elegans, zsynchronizuj dwadzieścia 10 cm płytek NGM zawierających zdrowe dorosłe robaki C. elegans (zmutowane N2 lub daf-22) przy użyciu wyżej wymienionego protokołu wybielania, a następnie przemyj je 5x buforem M9.
      UWAGA: Ten proces przygotowuje wystarczającą ilość zarodków do ekstrakcji feromonów. N2: Standardowy szczep WT C. elegans, który wytwarza zarówno rozpuszczalne w wodzie feromony askarozydowe, jak i nieascarozydowe lotne feromony płciowe. Mutant daf-22: Mutant pozbawiony zdolności do wytwarzania wielu feromonów askarozydowych, co czyni go pomocnym w badaniu nieascarozydowych lotnych feromonów płciowych w izolacji.
    2. Aby zsynchronizować robaki na etapie L1, obracaj zarodki w buforze M9 przez 12-15 godzin, aby zatrzymać rozwój. Przenieś zatrzymane robaki L1 na 10-centymetrowe płytki hodowlane NGM wysiane bakteriami OP50 w celu wzrostu i rozwoju.
    3. Aby zminimalizować obecność samców na płytkach hermafrodytów, sprawdź płytki 2 dni po uwolnieniu robaka, na etapie L4 i usuń wszelkie zaobserwowane samce (bardzo rzadko).
    4. Po trzech dniach rozwoju poszukaj zarodków wskazujących, że robaki osiągnęły dojrzałość reprodukcyjną.
      UWAGA: zmutowane samicemgły-2 C. elegans i samice WT C. remanei nie nadają się do ekstrakcji lotnych feromonów płciowych masowo. Zmutowane C. elegans i C. remanei z mutacją mgły-2 mają wysoki odsetek samców w swoich populacjach, a samce stale kojarzą się z samicami. Zapłodnione samice nie wytwarzają lotnych feromonów płciowych. Obecność samców komplikuje ekstrakcję tych związków.
  2. Mycie robaków i separacja zarodków
    1. Kilkakrotnie przemyć zarodki buforem M9 i pozwolić im się uspokoić (1 g sedymentacji), aż większość dorosłych osobników znajdzie się na dnie probówki; powtórzyć 5-7 razy. Pozostawić probówki do mikrowirówek na kilkuminutowym spoczynku w stojaku na kilka minut, aby ułatwić sedymentację dorosłych robaków i umożliwić oddzielenie populacji dorosłych robaków od zarodków, które pozostają zawieszone w supernatancie.
    2. Odpipetuj oddzielone dorosłe osobniki i przenieś je na nowe płytki NGM z nasionami OP50.
    3. Powtarzaj ten proces mycia przez 5-6 dni, aby wyczerpać plemniki.
      UWAGA: Do ekstrakcji lotnych feromonów płciowych należy używać hermafrodytów, które mają 5-6 dni. Ten czas zapewnia, że ich plemniki prawdopodobnie zostaną wyczerpane, ponieważ hermafrodyty z dostępnymi plemnikami nie wytwarzają lotnych feromonów płciowych. Liczne martwe lub niewyklute zarodki na płytce w 5 lub 6 dniu wskazują odpowiedni czas na rozpoczęcie ekstrakcji feromonów.
  3. Ekstrakcja feromonów płciowych
    1. Ekstrahować feromon płciowy zgodnie z opisem w sekcji 1 z modyfikacjami.
    2. Zamiast dodawać 100 samic C. elegans na 100 μl, dodaj bufor M9 w oparciu o końcową objętość osadu robaka. Dodać 1 ml buforu M9 na 50 μl zapakowanych robaków.
  4. Kontrola jakości i homogenizacja
    1. Partie testowe w ramach kontroli jakości wyekstrahowanych feromonów przy użyciu testu chemoprzyciągania z samcami N2 lub samcami HIM-5 (patrz punkt 4).
    2. Wymieszaj wszystkie partie, aby uzyskać jednorodny, surowy, lotny feromon płciowy do eksperymentów, które wymagają dużej ilości feromonu, takich jak badania przesiewowe lub eksperymenty mikroprzepływowe. Surowy ekstrakt z feromonów płciowych należy przechowywać przez co najmniej 1 rok w temperaturze -80 °C w probówkach o pojemności 50 ml owiniętych parafilmem, aby zminimalizować parowanie.
  5. Metoda miareczkowania oparta na teście chemoatrakcyjności do standaryzacji surowego ekstraktu z feromonów płciowych
    1. Przeprowadzić test miareczkowania, testując seryjne rozcieńczenia każdego ekstraktu feromonów zarówno na samcach C. elegans WT N2, jak i him-5. Określ najwyższe rozcieńczenie (najniższe stężenie), które konsekwentnie wywołuje silną i powtarzalną odpowiedź chemotaksji w szczepach kontrolnych.
    2. Przygotować serię rozcieńczeń z każdego surowego ekstraktu (np. 1:2, 1:4, 1:8 itd.) w buforze M9.
    3. Testy chemotaksji
      1. Wykonać standaryzowane testy chemotaksji (patrz sekcja 4) przy użyciu każdego rozcieńczenia na referencyjnym szczepie samców. Wykonaj trzy powtórzenia, aby zapewnić odtwarzalność. Porównaj optymalne rozcieńczenia w różnych partiach ekstrakcyjnych, aby ocenić spójność stężenia feromonów.
        UWAGA: Ustanawia to punkt odniesienia do oceny bioaktywności każdego ekstraktu. W standardowym teście chemoatrakcyjności feromonów płciowych oryginalne nierozcieńczone ekstrakty zostaną wykorzystane do kolejnych eksperymentów, przy czym miareczkowanie będzie służyć jako etap kontroli jakości w celu zapewnienia stałej aktywności feromonów między partiami. Seria rozcieńczeń może być dostosowana w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych. Biorąc pod uwagę, że standardowy protokół ekstrakcji konsekwentnie daje nasycone surowe ekstrakty feromonowe, test miareczkowania w celu standaryzacji ekstraktu może nie być konieczny w przypadku większości eksperymentów. Zaleca się stosowanie tej samej partii surowego feromonu płciowego w całym zestawie powiązanych eksperymentów, aby zachować spójność i zminimalizować zmienność aktywności feromonów.

4. Test chemoatrakcyjności lotnych feromonów płciowych

UWAGA: Test chemoatrakcyjności lotnych feromonów płciowych został zaadaptowany z wcześniej ustalonych metod stosowanych w innych badaniach nad chemoatrakcyjnością24,29,59,60,61. Modyfikacje te zostały wdrożone w celu optymalizacji czułości i swoistości testu w wykrywaniu reakcji na lotne feromony płciowe. To zindywidualizowane podejście zwiększa możliwość zastosowania testu do określonych potrzeb badawczych.

  1. Obserwuj płytki hodowlane codziennie, aż dorosłe samice / hermafrodyty będą obfite. Zdrowie robaków wpływa na ich reakcję na feromon płciowy.
  2. Przygotowanie go-5 samców
    1. Wykorzystaj standardowy protokół wybielania, aby zsynchronizować robaki him-5. Po synchronizacji umyj robaki 5x buforem M9. Wyizolować samce L4 dzień przed testem; następnie przenieść jednodniowe dorosłe samce robaków z ich płytek nasiennych i przepłukać je w buforze M9 przed testem. Umieść je na niewysiewanych płytkach NGM przed testem, aby wyeliminować resztki bakterii i zapobiec interferencji z żywnością podczas testu.
      UWAGA: Nie głodź robaków dłużej niż godzinę przed testem, ponieważ może to zmienić ich stan wewnętrzny i wpłynąć na wyniki testu chemoatrakcyjności feromonów płciowych. Dlatego, jeśli zamierzasz przeprowadzić więcej niż 10 testów w ciągu jednego dnia, wymieniaj próbki robaków co godzinę. Ponadto należy wielokrotnie przełączać się między jednym testem eksperymentalnym a jednym testem kontrolnym.
  3. Przygotowanie płytek do oznaczania chemoatrakcyjności agarowej
    1. Przygotuj płytki do oznaczania chemoatrakcyjności z 1,5% agarem, 25 mM NaCl, 1,5 mM Tris-base i 3,5 mM Tris-Cl, zgodnie z opisem w odpowiedniej literaturze24.
    2. Podgrzej agar w roztworze chemoatrakcyjności za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż do całkowitego rozpuszczenia. Pozostaw roztwór do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Użyj pipety, aby równomiernie rozprowadzić roztwór agaru chemoattraction na szalkach Petriego: wlej 30 ml do każdej 10-centymetrowej szalki i 20 ml do każdej 6-centymetrowej szalki.
    4. Po przelaniu roztworu agaru chemoattraction na szalki Petriego, pozostaw pokrywki otwarte w czystym miejscu na co najmniej 40 minut, aby powierzchnia agaru lekko wyschła. Gdy powierzchnia odpowiednio wyschnie, zamknij pokrywki.
      UWAGA: Ten czas schnięcia może się różnić w zależności od wilgotności i temperatury środowiska laboratoryjnego.
  4. Przechowywanie płytek i przygotowanie do testu wstępnego
    1. Przygotowane płytki testowe należy zapakować i przechowywać w chłodni do 1 tygodnia. Przed użyciem wyjmij talerze z chłodni i pozwól im zaaklimatyzować się do temperatury pokojowej przez ponad godzinę. Otwórz pokrywki, aby resztki wilgoci odparowały z agaru na 20 minut przed testem w czystym miejscu, upewniając się, że na powierzchni nie ma widocznej wody przed wykonaniem testu.
  5. Projekt eksperymentalny i test chemoatrakcyjności
    1. Aby przeprowadzić test chemoatrakcyjności, zaznacz trzy wyraźne plamki na pokrywie i spodniej stronie szalki Petriego lub użyj szablonu wydrukowanego na przezroczystym papierze z tworzywa sztucznego umieszczonego pod szalką lub dołączonego do mikroskopu preparacyjnego. Oznaczenia te obejmują środkową kropkę (•) jako punkt początkowy dla robaków, znak plus (+) dla miejsca doświadczalnego (2 μl feromonu płciowego na wieczku i 2 μl 1 M azydku sodu na płytce) oraz znak minus (-) dla punktu kontrolnego (2 μl buforu M9 na wieczku i 2 μl 1 M azydku sodu) (Rysunek 2A). Dostosuj odległość między tymi znakami w zależności od wielkości naczynia i konkretnych potrzeb eksperymentalnych. Zazwyczaj, dla 6 cm szalek Petriego, należy ustalić stałą odległość 1,5 cm od punktu początkowego do każdej substancji badanej dla badań kontroli pozytywnej.
  6. Szczegółowe kroki do wykonania testu (Rysunek 2)
    1. Nanieść 2 μl 1 M azydku sodu na każde miejsce doświadczalne i kontrolne na płytce.
    2. Wybierz 20 zdrowych i swobodnie poruszających się samców robaków za pomocą zbieracza robaków. Jednocześnie wypuść 20 samców robaków w punkcie początkowym pod mikroskopem preparacyjnym.
    3. Szybko dodaj 2 μl feromonu płciowego i 2 μl buforu M9 odpowiednio do miejsc doświadczalnych i kontrolnych na pokrywie.
    4. Delikatnie zamknij pokrywę i umieść płytkę testową w cichym, stabilnym temperaturowo miejscu obok mikroskopu.
    5. Po 30 minutach oceń test, licząc liczbę robaków w każdym miejscu.
      UWAGA: Proces zbierania 20 robaków nie powinien trwać dłużej niż 1-2 minuty, aby zapobiec wysychaniu wcześnie zebranych robaków i niezdrowemu rozwojowi, co może wpłynąć na wyniki. Cały proces od zerwania samców do zamknięcia pokrywy powinien zająć od 2 do 5 minut.
  7. Badania przesiewowe w kierunku kontroli dodatniej
    1. Przetestuj samce robaków w 1000-krotnie rozcieńczonym roztworze diacetylu (rozpuszczonym w 10% etanolu i 90% buforze M9), aby potwierdzić ich reakcję na chemotaksję. Oceń wyniki testu chemoatrakcyjności 30 minut po rozpoczęciu testu. Oceniaj robaki, które są sparaliżowane w wyznaczonych miejscach na podstawie ich lokalizacji: "C" dla tych w miejscu kontrolnym i "E" dla tych w miejscu eksperymentalnym. Robaki w żadnym z tych miejsc nie powinny być oznaczone jako "N" (Rysunek 2C).
    2. Aby obliczyć wskaźnik chemoatrakcyjności (C.I.), użyj następującego wzoru:
      figure-protocol-1
    3. Wybierz tylko próbki męskie o wskaźniku chemotaksji ≥ 0,4 (CI, patrz Rysunek 2C). Użyj samca z tej samej partii do kolejnego testu feromonów płciowych.
      UWAGA: Przeprowadź trzy oddzielne testy, z których każde obejmuje 20 robaków, aby zapewnić spójność i wiarygodność wyników eksperymentalnych. Trzy testy są zazwyczaj wystarczające do wywnioskowania spójności.

5. Wytyczne dotyczące czasu i punktacji dla testu chemoatrakcyjności

  1. Oceń reakcję chemoatrakcyjną robaków na podstawie ich ostatecznej lokalizacji. Oceń liczbę robaków w każdym miejscu po zakończeniu testu, zwykle 30 minut po jego rozpoczęciu.
    UWAGA: Stosowanie azydku sodu w miejscach eksperymentalnych i kontrolnych paraliżuje przybywające robaki, ułatwiając dokładną ocenę. Większość samców WT N2 i him-5 jest w stanie zlokalizować źródło feromonów w ciągu 6-8 minut na 6-centymetrowej płytce z zachowaniem odległości 1,5 cm.
  2. Aby uchwycić defekty skuteczności chemotaksji, zwłaszcza w celu wykrycia subtelnych defektów, rozważ monitorowanie testu w regularnych odstępach czasu 3-5 min.
    UWAGA: Ta częsta obserwacja pozwala na udokumentowanie czasu, w którym robaki docierają do miejsc testowych. Tak szczegółowe śledzenie może ujawnić przypadki, w których robaki wykazują zmniejszoną skuteczność chemotaksji, a mimo to udaje im się dotrzeć do miejsca testowego w oknie badania.

6. Opcjonalne modyfikacje

  1. Aby uzyskać lepszą ocenę chemotaksji, należy użyć kamery umieszczonej nad płytką, aby zarejestrować trajektorie robaków w całym teście.
    UWAGA: Ta modyfikacja umożliwia kompleksową analizę ich wzorców ruchowych, zapewniając głębszy wgląd w zachowanie i trajektorię chemoprzyciągania (Rysunek 3).

7. Analiza danych

  1. Punktacja i obliczanie wskaźnika chemoatrakcyjności (CI)
    1. Wykonaj kroki 4.7.1 i 4.7.2.
  2. Wykres czasu przyjazdu
    1. Aby uzyskać bardziej kompleksową analizę testów chemoatrakcyjności, rozważ monitorowanie testu w odstępach 3-5 minut lub zastosowanie kamery umieszczonej nad płytką w celu zarejestrowania trajektorii robaków w całym teście.
      UWAGA: Podejścia te pozwalają nie tylko na ocenę czasów przybycia robaków w miejscach projektowych, ale także na porównanie średnich czasów przybycia i analizę rozkładu tych czasów.
  3. Wideoanaliza trajektorii i wizualizacja danych
    UWAGA: Aby przeanalizować wzorce ruchu C. elegans podczas testów chemoatrakcyjności, zapisz i wyodrębnij trajektorie (patrz Tabela materiałów) i dalszą analizę (Rysunek 3).
    1. Skonfiguruj system nagrywania.
    2. Zainicjuj nowe nagranie i uzyskaj dostęp do okna ustawień nagrywania.
    3. Zdefiniuj żądane parametry nagrywania:
      1. Prefiks pliku: wybierz opisową nazwę plików wideo (np. "experiment1_").
      2. Liczba klatek na sekundę (FPS): Wybierz odpowiednie klatki na sekundę, aby uchwycić ruch robaka (np. 7,5 kl./s dla robaków na płycie agarowej i 30 kl./s dla robaków pływających).
      3. Czas trwania: Ustaw długość nagrania w sekundach (np. 1,800 s [30 min] w przypadku masowego testu chemoatrakcyjności).
    4. Zoptymalizuj jakość obrazu: Dostosuj intensywność oświetlenia, aby upewnić się, że robaki są wyraźnie widoczne na tle, i dostosuj ostrość, aby uzyskać ostry obraz robaków.
    5. Aby przygotować płytkę do oznaczania, należy najpierw dozować roztwór kontrolny na wyznaczone miejsce kontrolne. Następnie ostrożnie podnieś robak(i) i delikatnie wypuść je na środek płytki. Gdy robak(i) się usiądą, nałóż roztwór feromonów płciowych na wyznaczone miejsce doświadczalne.
    6. Ustaw płytkę: Ostrożnie umieść płytkę zawierającą robaki na środku pola nagrywania, aby zmaksymalizować obszar przechwytywania.
    7. Aby zmniejszyć stres u robaków podczas testów chemotaksji, rozważ następujące dwa podejścia .
      1. W przypadku testu na pojedynczym robaku umieść robaka na płytce testowej i pozwól mu się zaaklimatyzować przez 5 minut przed wprowadzeniem roztworu feromonów płciowych w wyznaczonej odległości (pozycja oparta na bieżącej lokalizacji robaka).
        UWAGA: Minimalizuje to obsługę i zapewnia robakowi czas na dostosowanie się do nowego środowiska.
      2. Masowy test chemoatrakcyjny: Pozwól robakom osiąść i naturalnie rozproszyć się na płytce przez 5 minut. Po tym okresie aklimatyzacji wprowadź roztwór feromonu w wyznaczonej ustalonej pozycji. Podczas analizy po nagraniu wideo zmierz początkową odległość każdego robaka od feromonu i odpowiednio je pogrupuj w celu dalszej analizy.
    8. Procedura analizy wideo
      1. Import i konfiguracja: Zaimportuj nagrane wideo do oprogramowania. Skonfiguruj informacje o sekwencji (np. liczbę klatek na sekundę); Określ skalę obrazowania (piksele na jednostkę miary).
      2. Regulacja obrazu: Aby zoptymalizować wykrywanie robaków, dostosuj próg wykrywania, aż zielona etykieta ściśle obrysuje robaki bez wychwytywania szumów tła lub artefaktów. Dodatkowo zastosuj algorytmy wygładzania tła, aby zredukować szumy i nierówności obrazu, zwiększając kontrast między robakami a tłem. Eksperymentuj z różnymi poziomami wygładzania, aby znaleźć optymalną równowagę między redukcją szumów a zachowaniem szczegółów robaka.
        UWAGA: Idealny próg powinien obejmować większość ciała każdego robaka, wykluczając jednocześnie obce elementy.
      3. Optymalizacja parametrów wykrywania: Wybierz reprezentatywnego robaka, aby automatycznie wygenerować parametry wykrywania. Sprawdź dokładność wykrywania, sprawdzając wizualnie 5-10 losowych klatek. Jeśli wykrywanie jest niezadowalające, należy ręcznie poprawić parametry wykrywania, w razie potrzeby ponownie sprawdzić ustawienia regulacji obrazu i kontynuować śledzenie, gdy wykrycie będzie niezawodne.
      4. Korekta i naprawa trajektorii śledzenia: Po zakończeniu procesu automatycznego śledzenia wykonaj ręczną korektę wygenerowanych trajektorii. Jeśli podczas korekty zostaną znalezione niespójności, użyj funkcji naprawy, aby skorygować trajektorię i wykonaj następujące operacje: Połącz: Połącz segmenty trajektorii, którym nieprawidłowo przypisano różne identyfikatory, ale należą do tej samej osoby. Split: Oddzielne segmenty trajektorii, którym nieprawidłowo przypisano ten sam identyfikator, ale należą do różnych osób.
        UWAGA: Celem jest zapewnienie, że każdy unikalny identyfikator (numer) jest konsekwentnie przypisany do tej samej osoby przez cały okres śledzenia.
        Przykład: Jeśli robak jest oznaczony jako "3" przez pewien okres, poczym błędnie oznaczony jako "7" przez kolejny okres, funkcja naprawy połączy te dwa segmenty pod identyfikatorem "3". I odwrotnie, jeśli dwa robaki są oznaczone jako "12" przez pewien czas, funkcja naprawy podzieli ten segment na dwie oddzielne trajektorie, z których każda ma unikalny identyfikator. Dzięki starannej korekcie i zastosowaniu niezbędnych napraw można znacznie poprawić dokładność i wiarygodność danych śledzenia.
      5. Wizualizacja i eksport wyników: Wykorzystaj oprogramowanie do wizualizacji i podstawowej analizy. Eksportuj dane jako pliki CSV w celu dalszej analizy za pomocą preferowanych narzędzi lub kodu. Ta metoda zapewnia podstawowy kod (patrz https://github.com/edmondztt/pheromone-traj-analysis.git) do wizualizacji trajektorii ruchu robaka w oparciu o pięć kluczowych parametrów (Rysunek 3). Czas: Postęp trajektorii, oznaczony kolorami wskazującymi upływ czasu od rozpoczęcia eksperymentu. Odległość do feromonu: Odległość między robakiem a źródłem feromonu w każdym punkcie czasowym. Prędkość: Prędkość robaka w każdym punkcie, która wskazywała również zdarzenia skręcania i zatrzymywania. Prostoliniowość: Jak prosta jest ścieżka robaka. Poprawność kierunkowa: Jak bardzo ruch robaka jest wyrównany z kierunkiem, w którym znajduje się cel feromonowy? Ten kod zapewnia podstawową wizualizację do zrozumienia zachowania robaka i może być dostosowywany i rozszerzany w celu głębszej analizy.
        UWAGA: To zaawansowane podejście stanowi kompleksową alternatywę dla tradycyjnego indeksu chemoatrakcyjności poprzez szczegółowe określenie trajektorii nawigacji robaków w odpowiedzi na feromony płciowe. Pozwala na zrozumienie wzorców ruchowych bez polegania na arbitralnych punktach końcowych nawigacji i określania okna czasowego, oferując głębszy wgląd w dynamikę behawioralną testu. Dane zostały uśrednione w ciągu 20 klatek, które można dostosować w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych, aby odfiltrować ruch spowodowany skręceniem ciała.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza trajektorii wadliwego szczepu do percepcji feromonów płciowych w teście chemoatrakcyjności
Ten test chemoatrakcyjności niezawodnie rozróżnia dzikie i zmutowane szczepy C. elegans w ich reakcji na lotne feromony płciowe. Udane eksperymenty z samcami him-5 konsekwentnie wykazują silną chemotaksję w kierunku źródła feromonów. Znajduje to odzwierciedlenie w wysokim wskaźniku chemotaksji (CI) (Rysunek 2), często przekraczający 0,5, wskazujący na silną preferencję dla źródła feromonów. I odwrotnie, eksperymenty z mutantem receptora feromonowego srd-1 konsekwentnie dają negatywne wyniki. CI dla samców srd-1 wynosi zazwyczaj około zero24. Potwierdza to zdolność testu do wykrywania braku odpowiedzi chemotaktycznej.

W nieoptymalnych eksperymentach wiele czynników może wpływać na wyniki. Na przykład niewystarczające stężenie feromonów może prowadzić do słabych odpowiedzi u samców him-5, podczas gdy zanieczyszczenie lub niewłaściwe obchodzenie się z nimi może powodować nieprzewidywalne ruchy w obu szczepach. Scenariusze te skutkują niższymi wartościami CI dla samców him-5 i potencjalnie mylącymi wartościami niezerowymi dla samców srd-1. W związku z tym pomyślne wdrożenie tego protokołu charakteryzuje się wyraźnym rozróżnieniem wskaźników chemotaksji między szczepami typu dzikiego i zmutowanego, wspieranym przez analizę trajektorii wizualnie potwierdzającą różnice behawioralne (Rysunek 3). Analiza danych powinna obejmować statystyczne porównania wartości CI, aby upewnić się, że obserwowane różnice są znaczące.

Demonstracja analizy i wizualizacji danych testu chemoatrakcyjności opartego na wideo
Pomyślne wyniki testów: Rysunek 3 przedstawia silną reakcję chemotaktyczną samców him-5 na lotny feromon płciowy. Trajektorie oznaczone kolorami ujawniają (A) koszt czasu, (B) odległość: rosnącą bliskość źródła feromonów w miarę upływu czasu, potwierdzając przyciąganie robaków. (C) prędkość: zmienne prędkości wzdłuż trajektorii, dostarczające wglądu w dynamikę reakcji chemotaktycznych. (D) prostoliniowość: jak bezpośrednio robaki poruszają się w kierunku źródła feromonów. Im prostsza ścieżka, tym bardziej wydajny i ukierunkowany jest ich ruch w odpowiedzi na atraktant chemiczny. (E) Poprawność kierunku: Pokazuje to zdolność robaków do dokładnej orientacji i poruszania się w kierunku źródła feromonu, chemicznego atraktantu. Zasadniczo mierzy, jak dobrze robaki mogą wyczuć gradient chemiczny i poruszać się po nim, aby dotrzeć do celu.

Spadek prędkości do zera zazwyczaj oznacza zatrzymanie się lub skręt. Połączenie informacji o prędkości z danymi dotyczącymi prostoliniowości może pomóc w identyfikacji zdarzeń skręcania. W szczególności zdarzenie skrętu jest wskazane, gdy prędkość spada do zera, a prostoliniowość jest również bardzo niska. Natomiast eksperymenty z mutantami z wadami sensorycznymi lub te przeprowadzone w nieoptymalnych warunkach (np. niskie stężenie feromonów, niewłaściwe zagęszczenie robaków) mogą przynieść różne wyniki.

Porównując trajektorie i określając ilościowo parametry, takie jak kierunkowość, prędkość i prostoliniowość, badacze mogą uzyskać wgląd w mechanizmy leżące u podstaw chemotaksji. Udane eksperymenty z wyraźnymi, ukierunkowanymi trajektoriami w kierunku źródła feromonów potwierdzają zdolność testu do wykrywania atrakcyjnych bodźców. I odwrotnie, brak takich wzorców w kontrolach ujemnych lub zmutowanych szczepach potwierdza specyficzność testu i jego zdolność do identyfikacji wad sensorycznych. Oparty na wideo masowy test chemoatrakcyjny, jak pokazano w Rysunek 3, zapewnia potężne narzędzie do analizowania szczegółów zachowania chemotaksji robaków. Analizując indywidualne trajektorie, naukowcy mogą odkryć nie tylko obecność lub brak przyciągania, ale także różnicę w reakcji, oferując głębsze zrozumienie leżących u podstaw genetycznych i neuronalnych mechanizmów rządzących chemotaksją.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg procesu ekstrakcji surowych feromonów płciowych. Surowy feromon płciowy jest ekstrahowany z zsynchronizowanych jednodniowych dziewiczych zmutowanych samic mgły-2 C. elegans i samic WT C. remanei, gdzie robaki są synchronizowane, myte, izolowane i inkubowane w buforze M9 w celu produkcji feromonów. Wyekstrahowany supernatant zawierający feromony jest przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku w celu wykorzystania w testach chemoprzyciągania, z testami kontroli jakości przeprowadzanymi przy użyciu samców N2 lub him-5 w celu sprawdzenia atrakcyjności. W przypadku ekstrakcji na dużą skalę z 6-dniowych dziewiczych hermafrodytów C. elegans, robaki są synchronizowane i myte wielokrotnie przez 6 dni, przy czym feromony płciowe są ekstrahowane podobnie, ale modyfikowane w oparciu o objętość granulek robaków i mieszane jednorodnie do użytku eksperymentalnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test chemoatrakcyjności lotnych feromonów płciowych i obliczanie indeksu chemoatrakcyjności. (A) Ten test polega na przygotowaniu samców WT N2 lub him-5 za pomocą standardowego protokołu synchronizacji wybielacza, testując ich reakcję na pozytywną substancję kontrolną przed testem chemoatrakcyjności lotnych feromonów płciowych. Eksperyment obejmuje oznaczenie płytek jako miejsc kontrolnych i testowych oraz użycie odsunięcia sodu do unieruchomienia robaków w tych miejscach w celu dokładnej oceny. Wyniki są zwykle oceniane 30 minut po rozpoczęciu eksperymentu (sygnalizowane zamknięciem pokrywy). (B) Widok z boku zestawu do oznaczania chemoatrakcyjności z dwiema wyraźnymi odległościami. C) Obliczenia C.I. i interpretacja. CI jest ilościową miarą atrakcyjności lub odpychania bodźca testowego. CI waha się od 1, co wskazuje na silne przyciąganie, do -1, wskazując na silne odpychanie. Niska wartość C.I. może wynikać z dwóch scenariuszy: albo małej liczby robaków zarówno w miejscu doświadczalnym, jak i kontrolnym, albo równego rozmieszczenia robaków między tymi dwoma miejscami. (D) Wskaźniki chemoatrakcyjności dla samców him-5 i srd-1 C. elegans w odpowiedzi na lotne feromony płciowe samic C. remanei i C. elegans. Samce o różnym pochodzeniu genetycznym różnie reagują na bodziec feromonów płciowych. Samce HIM-5 wykazują reakcję na oba feromony, przy czym znacznie wyższy wskaźnik dla feromonów samic C. remanei. W przeciwieństwie do tego, samce zmutowanego szczepu chemoreceptora srd-1 nie wykazują odpowiedzi na żaden z feromonów w tej analizie. p < 0,01. Skróty: WT = typ dziki; CI = indeks chemoatrakcyjności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza trajektorii samców him-5 w odpowiedzi na lotny feromon płciowy. Rysunek ten ilustruje wzorce ruchowe samców robaków him-5 podczas testu chemoatrakcyjności z lotnym bodźcem feromonów płciowych. Poszczególne trajektorie są oznaczone kolorami, aby reprezentować (A) Czas: Progresja trajektorii w trakcie eksperymentu. Kolor reprezentuje czas, który upłynął od rozpoczęcia testu. (B) Odległość od feromonu: Odległość od źródła feromonu w każdym punkcie czasowym. (C) Prędkość: Prędkość ślimaka w każdym punkcie. (D) Prostoliniowość: Bezpośredniość drogi przebytej przez robaka. (E) Poprawność kierunku: Wyrównanie ruchu z kierunkiem źródła feromonów. We wszystkich trzech przypadkach samce robaków z powodzeniem dotarły do miejsca, w którym znajduje się feromon. Dane zostały uśrednione w ciągu 20 klatek, aby odfiltrować ruch spowodowany skręceniem ciała. Doświadczenia przeprowadza się na 10-centymetrowej szalce Petriego i stosuje się metodę wideo-testu chemoatrakcyjności masowej (patrz sekcja 7.3.7.2 protokołu), o której mowa w niniejszym protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia solidną metodologię ekstrakcji lotnych feromonów płciowych z C. elegans, wraz z ustanowieniem solidnego testu chemoatrakcyjności w celu pomiaru męskich reakcji chemoatrakcyjności. Dodatkowe informacje można znaleźć w podręczniku użytkownika WormLab (patrz Spis materiałów); Podstawowy kod do wizualizacji trajektorii ruchu robaka znajduje się w sekcji 7.3.8.5 protokołu. Dla wyniku ważnych jest kilka kluczowych kroków w protokole. Po pierwsze, staranna synchronizacja populacji robaków jest niezbędna do kontrolowania wieku i stanu rozrodczego, zapewniając skuteczną ekstrakcję lotnych feromonów płciowych od dziewiczych samic lub hermafrodytów zubożonych w plemniki29,34. Po drugie, konieczne jest powtarzanie etapów mycia, aby dokładnie usunąć bakterie, minimalizując zanieczyszczenie, które mogłoby zakłócać sygnalizację feromonów w kolejnych testach chemotaksji. Następnie wybór parametrów testu, takich jak stężenie atraktantu, rozmiar płytki i czas trwania testu, może mieć wpływ na wyniki i musi być dostosowany do konkretnych celów eksperymentalnych.

Dokładne czasy schnięcia i stałe odstępy między miejscami testowymi mają kluczowe znaczenie dla wiarygodnych wyników testów chemotaksji. Mokre płytki znacząco wpływają na wskaźnik chemotaksji. Jeśli na powierzchni agaru pozostanie warstwa wody, siły kapilarne mogą uwięzić robaki w punkcie początkowym. Może to utrudniać ich ruch, prowadząc do fałszywie ujemnych wyników testu. Co więcej, wydłużony czas schnięcia stanowi inne wyzwanie dla tych zwolnionych później. W miarę wysychania płytki lotne składniki feromonów odparowują i dyfundują, tworząc mniej wyraźny gradient stężeń. Utrudnia to później uwolnionym robakom zlokalizowanie docelowego feromonu, nawet jeśli mogą się później swobodnie poruszać. Dlatego upewnij się, że płytki są wystarczająco suche, aby wyeliminować wilgoć powierzchniową, która mogłaby wpłynąć na wyniki eksperymentu.

Objętość roztworu agaru dodawanego do płytek musi być dostosowana do szczególnych wymagań doświadczenia, zapewniając optymalne warunki testu. Grubość warstwy agaru, regulowana poprzez zmianę ilości roztworu agaru wlewanego do naczynia. Zazwyczaj krótsza odległość między atraktantem a płytką agarową prowadzi do bardziej wiarygodnych wyników. I odwrotnie, większa odległość może pomóc w wyeliminowaniu skutków składników nielotnych, zapewniając jaśniejszą ocenę wpływu lotnego atraktantu. Grubość agaru może być dostosowana do konkretnych potrzeb doświadczalnych, jak pokazano na rysunku 2B.

Proces zbierania 20 robaków nie powinien przekraczać 1-2 minut, aby zapobiec wysychaniu wcześnie zebranych robaków i niezdrowemu rozwojowi, co mogłoby wpłynąć na wyniki. Upewnij się, że robaki są jednocześnie uwalniane na płytkę testową, aby zapobiec przypadkowemu przemieszczaniu się robaków wcześnie uwolnionych zbyt daleko od punktu początkowego. Opóźnienia na tym etapie mogą prowadzić do zmiennych pozycji startowych w próbach, co skutkuje nieuczciwymi porównaniami. Cały proces od zerwania samców do zamknięcia pokrywy powinien zająć od 2 do 5 minut.

Dostosuj odstępy między miejscami doświadczalnymi/kontrolnymi a punktem początkowym na płytce testowej zgodnie z rozmiarem płytki i szczegółowymi celami eksperymentu. Zwiększenie odległości między plamkami może sprawić, że test będzie trudniejszy, co jest korzystne dla wykrywania subtelnych efektów. I odwrotnie, zmniejszenie odległości tworzy bardziej solidny test testowy, który podkreśla poważne wady.

Rozwiązywanie problemów może być konieczne w różnych punktach protokołu. Jeśli wyekstrahowany feromon nie wywołuje odpowiedzi chemotaksji, należy dokładnie sprawdzić wiek i status reprodukcyjny samic źródłowych i hermafrodytów. Tylko dziewicze samice lub hermafrodyty zubożone w plemniki będą wytwarzać feromon docelowy. Ze względu na wysoką skuteczność krycia samców C. elegans , obecność nawet pojedynczego samca na płytce izolacyjnej samicy L4 może drastycznie wpłynąć na wyniki. Dodatkowo należy zapewnić kontrolę zanieczyszczenia bakteryjnego w całym procesie ekstrakcji. Chociaż ten protokół ekstrakcji oferuje prosty sposób na uzyskanie surowych lotnych feromonów płciowych, ma pewne ograniczenia. Surowy ekstrakt z feromonów może zawierać śladowe ilości innych cząsteczek sygnałowych, co utrudnia ostateczne wyizolowanie konkretnych efektów działania samego feromonu płciowego. Funkcjonalne składniki lotnego feromonu płciowego nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Chociaż nie zgłoszono żadnej funkcjonalnej różnicy między feromonami płciowymi jednodniowych dziewiczych samic a sześciodniowymi hermafrodytami, nie można wykluczyć subtelnej różnicy.

W teście chemoatrakcji niski wskaźnik chemotaksji może wskazywać na problem ze zdrowiem lub etapem rozwoju badanych samców. Aby zapewnić optymalne wyniki, należy używać zdrowych, jednodniowych dorosłych samców hodowanych w temperaturze 20 °C na czystej płytce OP50 bez zanieczyszczeń. Nagłe zmiany temperatury z niższych temperatur przechowywania (takich jak 15 °C) do 20 °C mogą negatywnie wpływać na zachowanie chemoprzyciągania przez okres do trzech pokoleń. W celu uzyskania najlepszych praktyk należy pozwolić szczepom niedawno rozmrożonym lub przechowywanym w niższych temperaturach przystosować się do temperatury 20 °C przez ponad trzy pokolenia przed użyciem. Chociaż zaleca się izolowanie badanych samców na etapie L4 w dniu poprzedzającym dzień testu, nie jest to bezwzględnie konieczne. Wstępna ekspozycja na dorosłe hermafrodyty nie wpływa znacząco na wyniki testu chemoatrakcyjności. Jednodniowe hermafrodyty nie wytwarzają lotnych feromonów płciowych ze względu na istnienie plemników własnych. W związku z tym izolację męską L4 można pominąć podczas przeprowadzania badań przesiewowych na dużą skalę. Jednak w przypadku badań dotyczących konkretnie skutków wcześniejszych doświadczeń krytych lub innych powiązanych badań, konieczne jest wyizolowanie samców w stadium L4 1 dzień przed dniem testu.

Mutacja him-5 u C. elegans powoduje wysoką częstość występowania samców ze względu na zwiększony wskaźnik nondysjunkcji chromosomu X podczas mejozy u rodzica samców. W ten sposób system chemosensoryczny samców wymagany do chemotaksji jest nadal nienaruszony. Ułatwia to pozyskanie dużej liczby samców do testu. W związku z tym samce him-5 wykazują silną chemotaksję porównywalną z samcami WT N2, co czyni je odpowiednią kontrolą w testach chemotaksji feromonów płciowych.

Uwagi dodatkowe:
Zamiennik azydku sodu: Można uniknąć azydku sodu używanego do paraliżowania robaków podczas nagrywania wideo. Zamiast tego użyj kropli roztworu M9, aby tymczasowo unieruchomić robaki, chociaż napięcie powierzchniowe jest wystarczające do testu opartego na wideo.

Zagęszczenie robaków: Ogranicz liczbę robaków na talerzu, aby uniknąć przeludnienia i utrzymać optymalne warunki. Przepełnienie wpłynie na analizę po nagraniu wideo, ponieważ program będzie miał trudności z identyfikacją robaków, jeśli nakładają się one na siebie. Na szalkę Petriego o średnicy 6 cm zaleca się maksymalnie 20 robaków, a na szalkę o średnicy 10 cm – 100 robaków.

Tradycyjne testy chemoatrakcyjności oferują proste podejście, wymagające minimalnego wysiłku w celu uzyskania danych. Chociaż testy te zapewniają szybki przegląd odpowiedzi na chemotaksję, wychwytują tylko punkt końcowy złożonej odpowiedzi behawioralnej. Ogranicza to ich zdolność do ujawniania szczegółów percepcji feromonów i reakcji lokomotorycznej. Natomiast zaawansowana analiza trajektorii zapewnia wgląd w indywidualne i zbiorowe wzorce ruchu. Takie podejście ujawnia różnice pominięte przez same miary oparte na punktach końcowych. Umożliwiając szczegółową eksplorację szczegółowych wzorców kinetycznych i zmienności odpowiedzi w badanych populacjach, metoda ta znacznie poszerza naszą wiedzę na temat mechanizmów chemosensorycznych. Podkreśla to możliwość zastosowania testu do różnych pytań badawczych i podkreśla znaczenie uwzględniania indywidualnej zmienności w projekcie eksperymentalnym.

Metodologia ta oferuje ramy do badania lotnych feromonów płciowych u C. elegans. Może ułatwić odkrywanie genów związanych z syntezą, wydzielaniem i percepcją lotnych feromonów płciowych, pogłębiając naszą wiedzę na temat komunikacji chemicznej na poziomie obwodów molekularnych i neuronalnych. Dodatkowo, test chemoatrakcyjności i analiza danych trajektorii mogą być wykorzystane do zbadania innych chemoatraktantów u C. elegans.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni dr Tingtao Zhou za zaprojektowanie i napisanie kodu dla wizualizacji trajektorii używanych w naszej analizie. Prace te były wspierane przez fundusze: R01 NS113119 (PWS), stypendium Chen Senior Postdoc Fellowship oraz Tianqiao and Chrissy Chen Institute for Neuroscience.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm szalka PetriegoSokół25373-100Bakteriologiczna szalka Petriego Sokół 100 x 15 mm
6 cm szalka PetriegoFalcon25373-085Bakteriologiczna szalka Petriego Sokół 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)CGC
WirówkaEppendorf5418  Każda marka powinna działać.
Płytki testowe chemoatrakcyjnościDomowy roztwórN/A1,5% agar, 25 mM NaCl, 1,5 mM Tris-base i 3,5 mM Tris-Cl
CholesterolAlfa Aesar57-88-5
Mikroskop preparacyjnyLeica LeicaMZ75  Każda marka powinna działać.
E. Coli OP50CGC
EtanolKoptec64-17-5
fog-2(q71) (JK574)CGC
him-5(e1490)(CB4088)CGC
Wybielacz domowyClorox Koncentrat wybielacza bakteriobójczego  Bufor wybielacza
M9Domowy roztwórN/A3 g KH2PO4, 11,3 g Na2HPO4,7H2O, 5 g NaCl, H2O do 1 l. Sterylizować w autoklawie. Dodać 1 ml 1 M MgSO4 po schłodzeniu do temperatury pokojowej.
Siarczan magnezu, bezwodny, proszekMacronM1063-500GM-EA
Kuchenka mikrofalowaTOSHIBAN/A  Każda marka powinna działać.
N2CGC
NaOHSigma-aldrichS318-31 M
roztwór płytek NGMRoztwór domowej robotyNie dotyczy2,5 g peptonu, 18 g agaru, 3 g NaCl, H2O do 1 L. Sterylizować w autoklawie. Po zakończeniu autoklawu (2 godziny) poczekaj, aż temperatura pożywki spadnie do 65 °C. Umieść na płycie grzejnej na 65 & deg; C i wymieszać. Następnie dodaj następujące ilości, odczekując 5 minut między nimi, aby uniknąć krystalizacji: 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml K3PO4 (1 M, pH = 6), 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu).
ParafilmBemis13-374-10Bemis Parafilm M Laboratoryjna folia do pakowania
PeptoneVWR97063-324
Pomoc do pipetDrummond Scientific 4-000-100  Każda marka powinna działać.
Papier plastikowy OctagoWodoodporny sitodruk Atramentowa przezroczysta foliahttps://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Chlorek potasuSigma-aldrichSLBP2366V
Fosforan potasuSpectrum7778-77-0
PipetaEppendorfSKU: EPPR4331; MFG#:2231300006 20 - 200 &mikro; L, 100 - 1000 &mikro; L, każda marka powinna działać.
RotatorLabnetKod produktu: LI-H5500  Labnet H5500 Mini wałek laboratoryjny z dwukierunkowym rotatorem. Każda marka powinna działać.
Chlorek soduVWR7647-14-5
fosforan sodu dwuzasadowySigma-aldrichSLCG3888
Tris-baseSigma-aldrich77-86-1
Tris-Cl Roche1185-53-1
TryptonVWR97063-390
VortexPrzemysł naukowyVortex-Genie 2  Każda marka powinna działać.
System WormLab MBF BioscienceN/A https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpickerdomowej roboty Nie dotyczywykonane z platynowych i szklanych końcówek pipet

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chemoreception in Alphysia californica. Iii. Evidence for pheromones influencing reproductive behavior. Behav Biol. 20 (2), 235-243 (1977).">Audesirk, T. E. Chemoreception in Alphysia californica. Iii. Evidence for pheromones influencing reproductive behavior. Behav Biol. 20 (2), 235-243 (1977).
  2. Queen and young larval pheromones impact nursing and reproductive physiology of honey bee (Apis mellifera) workers. Behav Ecol Sociobiol. 68 (12), 2059-2073 (2014).">Traynor, K. S., Le Conte, Y., Page, R. E. Jr Queen and young larval pheromones impact nursing and reproductive physiology of honey bee (Apis mellifera) workers. Behav Ecol Sociobiol. 68 (12), 2059-2073 (2014).
  3. Pheromones, growth and behaviour. Ciba Found Study Group. 35, 144-170 (1970).">Cowley, J. J., Wise, D. R. Pheromones, growth and behaviour. Ciba Found Study Group. 35, 144-170 (1970).
  4. Pheromones in primate reproduction and social behavior. Adv Behav Biol. 11, 131-155 (1974).">Epple, G. Pheromones in primate reproduction and social behavior. Adv Behav Biol. 11, 131-155 (1974).
  5. Possibilities of using insectistatics and pheromones in pest control. Naturwissenschaften. 62 (6), 272-282 (1975).">Levinson, H. Z. Possibilities of using insectistatics and pheromones in pest control. Naturwissenschaften. 62 (6), 272-282 (1975).
  6. Manipulating sex pheromones for insect suppression. Environ Lett. 8 (1), 41-59 (1975).">Roelofs, W. Manipulating sex pheromones for insect suppression. Environ Lett. 8 (1), 41-59 (1975).
  7. Pheromones and mammalian reproduction. Oxf Rev Reprod Biol. 6, 266-302 (1984).">Marchlewska-Koj, A. Pheromones and mammalian reproduction. Oxf Rev Reprod Biol. 6, 266-302 (1984).
  8. Neuroendocrinology briefings 11: Pheromones and reproduction. J Neuroendocrinol. 12 (11), 1045-1046 (2000).">Keverne, E. B. Neuroendocrinology briefings 11: Pheromones and reproduction. J Neuroendocrinol. 12 (11), 1045-1046 (2000).
  9. The role of pheromones and biostimulation in animal reproduction. Anim Reprod Sci. 65 (3-4), 157-170 (2001).">Rekwot, P. I., Ogwu, D., Oyedipe, E. O., Sekoni, V. O. The role of pheromones and biostimulation in animal reproduction. Anim Reprod Sci. 65 (3-4), 157-170 (2001).
  10. The joy of sex pheromones. EMBO reports. 14 (10), 874-883 (2013).">Gomez-Diaz, C., Benton, R. The joy of sex pheromones. EMBO reports. 14 (10), 874-883 (2013).
  11. Insect sex pheromones. Adv Pest Control Res. 8, 57-126 (1968).">Shorey, H. H., Gaston, L. K., Jefferson, R. N. Insect sex pheromones. Adv Pest Control Res. 8, 57-126 (1968).
  12. Pheromones and behavior in mice. Acta Neurol Psychiatr Belg. 69 (7), 529-538 (1969).">Bruce, H. M. Pheromones and behavior in mice. Acta Neurol Psychiatr Belg. 69 (7), 529-538 (1969).
  13. Role of a volatile female sex pheromone in stimulating male courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 18 (1), 159-164 (1970).">Shorey, H. H., Bartell, R. J. Role of a volatile female sex pheromone in stimulating male courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 18 (1), 159-164 (1970).
  14. Evidence of aggregation-sex pheromone use by longhorned beetles (coleoptera: Cerambycidae) species native to Africa. Environ Entomol. 48 (1), 189-192 (2019).">Bobadoye, B., et al. Evidence of aggregation-sex pheromone use by longhorned beetles (coleoptera: Cerambycidae) species native to Africa. Environ Entomol. 48 (1), 189-192 (2019).
  15. Sex pheromones in bacteria. Nature. 275 (5682), 692-694 (1978).">Saunders, J. R. Sex pheromones in bacteria. Nature. 275 (5682), 692-694 (1978).
  16. Identification of a sex pheromone from a spider. Science. 260 (5114), 1635-1637 (1993).">Schulz, S., Toft, S. Identification of a sex pheromone from a spider. Science. 260 (5114), 1635-1637 (1993).
  17. Identification of the sex pheromone of the guernsey carpet beetle, Anthrenussarnicus mroczkowski (coleoptera: Dermestidae). J Chem Ecol. 19 (5), 971-983 (1993).">Finnegan, D. E., Chambers, J. Identification of the sex pheromone of the guernsey carpet beetle, Anthrenussarnicus mroczkowski (coleoptera: Dermestidae). J Chem Ecol. 19 (5), 971-983 (1993).
  18. Multiple genes encoding pheromones and a pheromone receptor define the b beta 1 mating-type specificity in Schizophyllum commune. Genetics. 146 (2), 541-551 (1997).">Vaillancourt, L. J., Raudaskoski, M., Specht, C. A., Raper, C. A. Multiple genes encoding pheromones and a pheromone receptor define the b beta 1 mating-type specificity in Schizophyllum commune. Genetics. 146 (2), 541-551 (1997).
  19. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-22 (2013).">Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-22 (2013).
  20. A sexually conditioned switch of chemosensory behavior in C. elegans. PLoS One. 8 (7), e68676(2013).">Sakai, N., et al. A sexually conditioned switch of chemosensory behavior in C. elegans. PLoS One. 8 (7), e68676(2013).
  21. Neurobiology of chemical communication. Mucignat-Caretta, C. , CRC Press. (2014).">Sengupta, S., Smith, D. P. How Drosophila detect volatile pheromones: signaling, circuits, and behavior. Neurobiology of chemical communication. Mucignat-Caretta, C. , CRC Press. (2014).
  22. Photoaffinity probes for nematode pheromone receptor identification. Org Biomol Chem. 18 (1), 36-40 (2019).">Zhang, Y. K., Reilly, D. K., Yu, J., Srinivasan, J., Schroeder, F. C. Photoaffinity probes for nematode pheromone receptor identification. Org Biomol Chem. 18 (1), 36-40 (2019).
  23. Dynamic regulation of adult-specific functions of the nervous system by signaling from the reproductive system. Curr Biol. 29 (23), 4116-4123.e3 (2019).">Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Dynamic regulation of adult-specific functions of the nervous system by signaling from the reproductive system. Curr Biol. 29 (23), 4116-4123.e3 (2019).
  24. SRD-1 in AWA neurons is the receptor for female volatile sex pheromones in C. elegans males. EMBO Rep. 20 (3), e46288(2019).">Wan, X., et al. SRD-1 in AWA neurons is the receptor for female volatile sex pheromones in C. elegans males. EMBO Rep. 20 (3), e46288(2019).
  25. Sensory experience and sensory activity regulate chemosensory receptor gene expression in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (20), 11032-11038 (2001).">Peckol, E. L., Troemel, E. R., Bargmann, C. I. Sensory experience and sensory activity regulate chemosensory receptor gene expression in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (20), 11032-11038 (2001).
  26. Neuromodulatory state and sex specify alternative behaviors through antagonistic synaptic pathways in. C. elegans. Neuron. 75 (4), 585-592 (2012).">Jang, H., et al. Neuromodulatory state and sex specify alternative behaviors through antagonistic synaptic pathways in. C. elegans. Neuron. 75 (4), 585-592 (2012).
  27. Sensory regulation of male mating behavior in Caenorhabditis elegans. Neuron. 14 (1), 79-89 (1995).">Liu, K. S., Sternberg, P. W. Sensory regulation of male mating behavior in Caenorhabditis elegans. Neuron. 14 (1), 79-89 (1995).
  28. Why are there males in the hermaphroditic species Caenorhabditis elegans. Genetics. 160 (3), 983-994 (2002).">Chasnov, J. R., Chow, K. L. Why are there males in the hermaphroditic species Caenorhabditis elegans. Genetics. 160 (3), 983-994 (2002).
  29. The species, sex, and stage specificity of a Caenorhabditis sex pheromone. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (16), 6730-6735 (2007).">Chasnov, J. R., So, W. K., Chan, C. M., Chow, K. L. The species, sex, and stage specificity of a Caenorhabditis sex pheromone. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (16), 6730-6735 (2007).
  30. Natural sensory context drives diverse brain-wide activity during C. elegans mating. Cell. 184 (20), 5122-5137.e17 (2021).">Susoy, V., et al. Natural sensory context drives diverse brain-wide activity during C. elegans mating. Cell. 184 (20), 5122-5137.e17 (2021).
  31. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).">Barriere, A., Felix, M. A. High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations. Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).
  32. Natural variation of outcrossing in the hermaphroditic nematode Pristionchus pacificus. BMC Evol Biol. 9, 75(2009).">Click, A., Savaliya, C. H., Kienle, S., Herrmann, M., Pires-Dasilva, A. Natural variation of outcrossing in the hermaphroditic nematode Pristionchus pacificus. BMC Evol Biol. 9, 75(2009).
  33. Outcrossing and the maintenance of males within C. elegans populations. J Hered. 101 (suppl_1), S62-S74 (2010).">Anderson, J. L., Morran, L. T., Phillips, P. C. Outcrossing and the maintenance of males within C. elegans populations. J Hered. 101 (suppl_1), S62-S74 (2010).
  34. Communication between oocytes and somatic cells regulates volatile pheromone production in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 17905-17910 (2014).">Leighton, D. H., Choe, A., Wu, S. Y., Sternberg, P. W. Communication between oocytes and somatic cells regulates volatile pheromone production in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 17905-17910 (2014).
  35. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).">White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  36. A single-neuron chemosensory switch determines the valence of a sexually dimorphic sensory behavior. Curr Biol. 28 (6), 902-914.e5 (2018).">Fagan, K. A., et al. A single-neuron chemosensory switch determines the valence of a sexually dimorphic sensory behavior. Curr Biol. 28 (6), 902-914.e5 (2018).
  37. Mate searching in Caenorhabditis elegans: A genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24 (34), 7427-7434 (2004).">Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. Mate searching in Caenorhabditis elegans: A genetic model for sex drive in a simple invertebrate. J Neurosci. 24 (34), 7427-7434 (2004).
  38. Sexual attraction: Sex-specific wiring of neural circuitry. Curr Biol. 22 (22), R953-R956 (2012).">Frady, E. P., Palmer, C. R., Kristan, W. B. Jr Sexual attraction: Sex-specific wiring of neural circuitry. Curr Biol. 22 (22), R953-R956 (2012).
  39. Two preputial gland-secreted pheromones evoke sexually dimorphic neural pathways in the mouse vomeronasal system. Front Cell Neurosci. 13, 455(2019).">Liu, Q., et al. Two preputial gland-secreted pheromones evoke sexually dimorphic neural pathways in the mouse vomeronasal system. Front Cell Neurosci. 13, 455(2019).
  40. Pheromone sensing regulates Caenorhabditis elegans lifespan and stress resistance via the deacetylase sir-2.1. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5522-5527 (2013).">Ludewig, A. H., et al. Pheromone sensing regulates Caenorhabditis elegans lifespan and stress resistance via the deacetylase sir-2.1. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5522-5527 (2013).
  41. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).">Golden, J. W., Riddle, D. L. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218 (4572), 578-580 (1982).
  42. Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans. Nat Chem Biol. 3 (7), 420-422 (2007).">Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans. Nat Chem Biol. 3 (7), 420-422 (2007).
  43. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).">Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433 (7025), 541-545 (2005).
  44. A potent dauer pheromone component in Caenorhabditis elegans that acts synergistically with other components. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14288-14292 (2008).">Butcher, R. A., Ragains, J. R., Kim, E., Clardy, J. A potent dauer pheromone component in Caenorhabditis elegans that acts synergistically with other components. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14288-14292 (2008).
  45. Counteracting ascarosides act through distinct neurons to determine the sexual identity of C. elegans pheromones. Curr Biol. 27 (17), 2589-2599.e3 (2017).">Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Counteracting ascarosides act through distinct neurons to determine the sexual identity of C. elegans pheromones. Curr Biol. 27 (17), 2589-2599.e3 (2017).
  46. Sex pheromones of C. elegans males prime the female reproductive system and ameliorate the effects of heat stress. PLoS Genet. 11 (12), e1005729(2015).">Aprison, E. Z., Ruvinsky, I. Sex pheromones of C. elegans males prime the female reproductive system and ameliorate the effects of heat stress. PLoS Genet. 11 (12), e1005729(2015).
  47. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).">Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  48. Ascaroside expression in Caenorhabditis elegans is strongly dependent on diet and developmental stage. PLoS One. 6 (3), e17804(2011).">Kaplan, F., et al. Ascaroside expression in Caenorhabditis elegans is strongly dependent on diet and developmental stage. PLoS One. 6 (3), e17804(2011).
  49. A shortcut to identifying small molecule signals that regulate behavior and development in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (19), 7708-7713 (2009).">Pungaliya, C., et al. A shortcut to identifying small molecule signals that regulate behavior and development in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (19), 7708-7713 (2009).
  50. A modular library of small molecule signals regulates social behaviors in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10 (1), e1001237(2012).">Srinivasan, J., et al. A modular library of small molecule signals regulates social behaviors in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10 (1), e1001237(2012).
  51. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).">Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  52. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).">Choe, A., et al. Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes. Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).
  53. Comparative metabolomics reveals biogenesis of ascarosides, a modular library of small-molecule signals in C. elegans. J Am Chem Soc. 134 (3), 1817-1824 (2012).">Von Reuss, S. H., et al. Comparative metabolomics reveals biogenesis of ascarosides, a modular library of small-molecule signals in C. elegans. J Am Chem Soc. 134 (3), 1817-1824 (2012).
  54. Sex-specific mating pheromones in the nematode panagrellus redivivus. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20949-20954 (2012).">Choe, A., et al. Sex-specific mating pheromones in the nematode panagrellus redivivus. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20949-20954 (2012).
  55. Nematode-trapping fungi eavesdrop on nematode pheromones. Curr Biol. 23 (1), 83-86 (2013).">Hsueh, Y. P., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Sternberg, P. W. Nematode-trapping fungi eavesdrop on nematode pheromones. Curr Biol. 23 (1), 83-86 (2013).
  56. Early pheromone experience modifies a synaptic activity to influence adult pheromone responses of C. elegans. Curr Biol. 27 (20), 3168-3177.e3 (2017).">Hong, M., et al. Early pheromone experience modifies a synaptic activity to influence adult pheromone responses of C. elegans. Curr Biol. 27 (20), 3168-3177.e3 (2017).
  57. Feeding state regulates pheromone-mediated avoidance behavior via the insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 37 (15), e98402(2018).">Ryu, L., et al. Feeding state regulates pheromone-mediated avoidance behavior via the insulin signaling pathway in Caenorhabditis elegans. EMBO J. 37 (15), e98402(2018).
  58. Basic demography of Caenorhabditis remanei cultured under standard laboratory conditions. J Nematol. 40 (3), 167(2008).">Diaz, S. A., Lindström, J., Haydon, D. T. Basic demography of Caenorhabditis remanei cultured under standard laboratory conditions. J Nematol. 40 (3), 167(2008).
  59. WormBook : the online review of C.elegans biology. , 1-29 (2006).">Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook : the online review of C.elegans biology. , 1-29 (2006).
  60. elegans chemotaxis assay. JoVE: J Vis Exp. (74), e50069(2013).">Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. JoVE: J Vis Exp. (74), e50069(2013).
  61. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).">Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sex Pheromone ExtractionChemoattraction AssayCaenorhabditis ElegansVolatile PheromoneChemotaxis AssayMale AttractionPheromone QuantificationWorm SynchronizationTrajectory AnalysisNematode Communication

Related Articles