Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67125

⸱

13 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Organoidy naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) podsumowują różnorodność typów komórek i złożoną architekturę ludzkich sieci naczyniowych. Ten trójwymiarowy (3D) model ma znaczny potencjał w modelowaniu patologii naczyń krwionośnych i badaniach przesiewowych leków in vitro. Pomimo najnowszych osiągnięć, kluczowym wyzwaniem technicznym pozostaje powtarzalne wytwarzanie organoidów o stałej jakości, co ma kluczowe znaczenie dla dalszych testów i zastosowań. W tym miejscu przedstawiono zmodyfikowany protokół, który poprawia zarówno jednorodność, jak i odtwarzalność wytwarzania organoidów naczyniowych. Zmodyfikowany protokół obejmuje wykorzystanie mikrostudzienek i koktajlu CEPT (chroman 1, emricasan, poliaminy i zintegrowany inhibitor odpowiedzi na stres, trans-ISRIB) w celu poprawy tworzenia ciał zarodków i przeżywalności komórek. Zróżnicowane, dojrzałe organoidy naczyniowe wygenerowane przy użyciu tego protokołu charakteryzują się całościową mikroskopią immunofluorescencyjną 3D w celu analizy ich morfologii i złożonego unaczynienia. Protokół ten umożliwia produkcję wysokiej jakości organoidów naczyniowych w skalowalny sposób, potencjalnie ułatwiając ich wykorzystanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków.

Wprowadzenie

Modele mikrofizjologiczne in vitro, w tym systemy organoidowe i tkanka na chipie, pojawiły się w ciągu ostatniej dekady1,2,3. Te trójwymiarowe (3D) systemy pochodzące z komórek ludzkich rozwiązują problemy związane z konwencjonalnymi dwuwymiarowymi (2D) hodowlami komórkowymi i modelami zwierzęcymi, takimi jak brak wielu składników w mikrośrodowisku fizjologicznym i różnice genetyczne między gatunkami. Zapewniają one więcej wglądów fizjologicznych i są bardziej odpowiednie do modelowania chorób i badań przesiewowych leków niż modele konwencjonalne. Wśród modeli mikrofizjologicznych udowodniono, że organoidy pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) skutecznie rekapitulują cechy architektoniczne rodzimych tkanek ludzkich i zostały opracowane w celu naśladowania różnych narządów ludzkich, w tym mózgu4,5, kidney6, liver7,8 i retina9. W tym przypadku skupiamy się szczególnie na generowaniu organoidów naczyniowych z hiPSC i nakreślamy uproszczony protokół, który ma na celu zminimalizowanie różnic między różnymi próbkami i partiami organoidów, poprawiając w ten sposób ogólną odtwarzalność.

Unaczynienie odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu fizjologicznej homeostazy we wszystkich organach ludzkich. Tworzenie się układu krwionośnego obejmuje procesy waskulogenezy i angiogenezy, koordynowane poprzez interakcje między komórkami śródbłonka i ściany (np. perycytów i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych) i pod wpływem różnych bodźców10. Penninger, Wimmer i współpracownicy opracowali pierwszą metodę generowania organoidów naczyniowych11,12, która naśladuje te dwa procesy. Dzięki organoidom wygenerowanym tą metodą, ich group12 i us13,14 wykazały potencjał organoidów naczyniowych w modelowaniu nieprawidłowego funkcjonowania naczyń krwionośnych w chorobach. Na przykład w naszych ostatnich pracach13,14 zaobserwowano różne fenotypy, takie jak kiełkowanie naczyń krwionośnych i różnice w składzie komórek ściennych, między organoidami naczyniowymi naśladującymi chorobę a ich dzikimi odpowiednikami. Przykłady te podkreślają, że model organoidów naczyniowych może służyć jako platforma do badań przesiewowych leków, naśladując nieprawidłowe funkcjonowanie naczyń krwionośnych związane z chorobą.

Zbudowany na początkowym procesie generowania organoidów naczyniowych works11,12, przedstawiono poprawiony protokół, który obejmuje użycie mikrostudzienki w celu ułatwienia tworzenia jednorodnego ciała zarodkowego (EB), co jest krytycznym czynnikiem minimalizującym często obserwowane różnice w tej samej partii generacji organoidów. Dodatkowo, koktajl CEPT, połączenie chromanu 1, emricasanu, poliamin i zintegrowanego inhibitora odpowiedzi na stres (trans-ISRIB)15, jest stosowany w celu poprawy żywotności hiPSC i zróżnicowanych komórek podczas procesu tworzenia EB. Modyfikacja ta ma na celu głównie zmniejszenie różnic między różnymi próbkami i partiami organoidów. Jednolite organoidy naczyniowe można wytworzyć za pomocą tego około dwutygodniowego protokołu, w którym indukowana jest waskulogeneza, aby pomóc śródbłonkowi zorganizować się w prymitywne sieci kanalikowe w dniu 1, a następnie indukcja angiogenezy w dniu 5 w celu rozwinięcia złożonych sieci naczyniowych w organoidach. W dniach 12-15 wygenerowane organoidy powinny wykazywać dojrzałe sieci naczyniowe składające się zarówno ze śródbłonka, jak i komórek ściennych.

Protokół

Rysunek 1 przedstawia przegląd kroków związanych z tym protokołem. Szczegółowe informacje dotyczące odczynników i materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów. Zaleca się, aby wszystkie podłoża zostały wstępnie podgrzane w temperaturze 37 °C przed użyciem, chyba że określono inaczej. Wszystkie materiały i materiały do hodowli komórkowych powinny być albo autoklawowane, albo sterylne, a obsługa komórek powinna odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo wartość pH mieszanki kolagenu I należy dokładnie dostosować do pH 7,3, aby uniknąć ewentualnych problemów z krzepnięciem.

1. Konserwacja ludzkiego iPSC

  1. Rozmrozić ekstrakt z macierzy błony podstawnej na lodzie, delikatnie wstrząsnąć butelką, aby wymieszać roztwór, a następnie przygotować 0,5 ml porcji w 1,5 ml probówek do mikrowirówek za pomocą pipety P1000 i wstępnie schłodzonych końcówek. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
  2. Rozmrozić jedną porcję ekstraktu z matrycy (0,5 ml) na lodzie. Wymieszać z 49,5 ml wstępnie schłodzonego podłoża DMEM/F12 w probówce o pojemności 50 ml. Rozprowadź mieszaninę do każdego dołka (1,5 ml / dołek) na płytkach 6-dołkowych, a następnie delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że płynny roztwór pokrywa całą studzienkę. Uszczelnij płytki folią parafinową i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  3. Przygotować pożywkę rozszerzającą hiPSC zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przygotować porcje kompletnego podłoża (40 ml/probówkę) i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.
  4. Umieścić wstępnie pokrytą płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę przed hodowlą hiPSC.
  5. Ogrzać pożywkę ekspandującą hiPSC (40 ml) w temperaturze 37 °C i przygotować pożywkę wysiewającą hiPSC zgodnie z opisem w tabeli 2.
  6. Przenieść pokrytą płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C do komory bezpieczeństwa biologicznego. Zastąp podłoże w powlekanej płytce podłożem wysiewającym hiPSC (1 ml/dołek).
  7. Rozmrażać kriokonserwowaną fiolkę z hiPSC z kriozbiornika w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę.
  8. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodaj 5 ml pożywki DMEM/F12, a następnie odwiruj przy 100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania komórek.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1,5 ml pożywki wysiewającej hiPSC. Delikatnie zawiesić komórki w probówce o pojemności 15 ml.
  10. Podaniec 10 μl zawiesiny komórek i wymieszać z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Przenieść mieszaninę 10 μl na szkiełko hemacytometryczne i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
  11. Zamontuj szkiełko na uchwycie i włóż je do automatycznego licznika komórek. Poczekaj, aż instrument znajdzie ostrość lub ręcznie wyreguluj ostrość, naciskając przycisk ostrości +/- na ekranie. Następnie użyj ustawienia domyślnego i naciśnij przycisk Przechwyć. Użyj odczytu gęstości komórek NA ŻYWO jako stężenia zawiesiny hiPSC przygotowanej z kroku 1.9.
  12. Wysiew 2 × 105 komórek w każdym dołku i upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience.
  13. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i po 24 godzinach zastąpić pożywkę pożywką ekspandującą hiPSC (1,5 ml/dołek).
  14. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną zbieg 80%. Rutynowo sprawdzaj morfologię komórki i wielkość kolonii, aby upewnić się, że nie dochodzi do spontanicznego różnicowania. Odrzuć kulturę i uruchom ponownie z nową partią hiPSC, jeśli obserwuje się rozległe (>5%) spontaniczne różnicowanie.

2. Formacja EB (Dzień 0)

  1. W dniu 0 przygotować i ogrzać pożywkę DMEM/F12, pożywkę wysiewającą hiPSC i roztwór do oddzielania komórek w temperaturze 37 °C przez 20-30 min.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej i dodać wstępnie podgrzany roztwór do odrywania komórek (1,5 ml/dołek). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-7 minut.
  3. Przenieś płytkę do szafy bezpieczeństwa biologicznego, postukaj w płytkę, aby odłączyć kolonie hiPSC i rozbić agregaty.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 4,5 ml pożywki DMEM/F12. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół za pomocą pięciokrotnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby zdysocjować komórki w zawiesinę jednokomórkową. Unikaj generowania bąbelków.
  5. Wirować przy 100 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu zebrania komórek.
  6. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki z 1 ml pożywki wysiewającej hiPSC za pomocą pipety P1000.
  7. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Przenieść 10 μl mieszaniny na szkiełko hemacytometryczne i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Zamontuj szkiełko na uchwycie i włóż je do automatycznego licznika komórek. Po tym, jak przyrząd znajdzie ostrość, naciśnij przycisk Capture i użyj odczytu gęstości komórek NA ŻYWO, aby określić stężenie zawiesiny hiPSC.
  8. Zasiej komórki na płytce mikrodołkowej o okrągłym dnie o bardzo niskim przyleganiu o gęstości 2,7 × 105 komórek / dołek, aby uzyskać 500-1,000 komórek na EB.
  9. Dodaj 2 ml pożywki wysiewającej hiPSC do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  10. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.

3. Różnicowanie naczyń krwionośnych (Dzień 1 - 5)

  1. W dniu 1 przygotować pożywkę do indukcji mezodermy (MIM) zgodnie z opisem w Tabeli 3 i Tabeli 4 i podgrzać ją w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Pożywka MIM musi być przygotowana na świeżo.
  2. Użyj pipety P200, aby ostrożnie zassać pożywkę z płytki mikrodołkowej, nie naruszając EB na dnie.
  3. Powoli dodawaj 2,5 ml MIM za pomocą pipety P200. Hodować EB w MIM w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.
  4. W dniu 3 delikatnie zastąp pożywkę podgrzanym, świeżo przygotowanym 2,5 ml pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych 1 (VDM1, Tabela 5) bez naruszania EB na dnie mikrostudzienki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 2 dni.

4. Osadzanie hydrożelu (Dzień 5)

  1. Przygotować mieszaninę kolagenu I zgodnie z opisem w Tabeli 6. Umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie i dodaj następnie roztwór kolagenu I,H2O, 10× pożywkę DMEM/F12, wodorowęglan sodu i HEPES. Dokładnie wymieszaj, delikatnie potrząsając tubką. Dodawać kroplami 1 M roztwór NaOH, potrząsając zmieszanym roztworem, aby dostosować wartość pH do 7,3 i sprawdzić wartość pH mieszaniny za pomocą pH-metru.
    UWAGA: Wszystkie roztwory należy przed użyciem wstępnie schłodzić na lodzie. Procedurę należy cały czas wykonywać na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodanie roztworu NaOH ma kluczowe znaczenie i konieczna jest szybka dyspersja w celu uzyskania jednorodnego roztworu, aby uniknąć miejscowego utwardzania kolagenu I. Objętość NaOH może się różnić w zależności od liczby partii użytego roztworu kolagenu I. Nie pipetować energicznie do mieszania, ponieważ naprężenia ścinające mogą spowodować niepożądane utwardzenie wstępne.
  2. Przygotować mieszaninę kolagenu I i macierzy błony podstawnej zgodnie z opisem w Tabeli 7. Dodać 1,25 ml matrycy błony podstawnej do 5 ml mieszaniny kolagenu I przygotowanej z kroku 4.1. Delikatnie wymieszać roztwór, potrząsając probówką.
  3. Umieść 12-dołkową płytkę na lodzie na 2 minuty.
  4. Powoli dodawaj mieszaninę kolagenu I-macierzy błony podstawnej do 12-dołkowej płytki (1,5 ml / dołek) za pomocą końcówek o szerokim otworze. Upewnij się, że mieszanina jest równomiernie rozprowadzona.
  5. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 2 godziny w celu zestalenia pierwszej warstwy hydrożelu.
  6. Pozostałą mieszaninę kolagenu I i macierzy błony podstawnej należy przechowywać na lodzie do późniejszego wykorzystania.
  7. Przenieś agregaty ~60 komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i schładzaj probówkę na lodzie przez 5 minut. Ostrożnie usuń pożywkę za pomocą końcówki do pipety P200.
    UWAGA: Rozpocznij ten krok 1.5 godziny po kroku 4.5.
  8. Kroplami dodaj 1,5 ml mieszanki kolagenu I-błona podstawna do agregatów i delikatnie wymieszaj je za pomocą końcówek do pipet P200 o szerokim otworze.
  9. Przenieść płytkę z pierwszą warstwą hydrożelu z inkubatora (krok 4.5) do komory bezpieczeństwa biologicznego.
  10. Dodać 1,5 ml zawiesiny kruszywa na utwardzoną warstwę. Delikatnie potrząśnij płytą, aby równomiernie rozprowadzić kruszywa. Unikaj generowania bąbelków.
  11. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 2 godziny.
  12. Przygotować podłoże do różnicowania naczyniowego 2 (VDM2; Tabela 8) i podgrzać podłoże w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut przed użyciem.
  13. Dodać 2 ml VDM2 do każdej studzienki i hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  14. Zmieniaj podłoże co 3 dni na podgrzany, świeżo przygotowany VDM2.
    UWAGA: (Opcjonalnie) Organoidy naczyniowe można uwolnić z mieszaniny żelu poprzez usunięcie żelu za pomocą igły strzykawki. Organoidy naczyniowe pobrane z żelu mogą być utrzymywane pojedynczo w 96-dołkowej płytce z VDM2 (200 μL/dołek). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.

5. 3D Test immunofluorescencyjny

  1. Organoidy naczyniowe powinny osiągnąć dojrzałość mniej więcej w 13 dniu. W przypadku organoidów zatopionych w hydrożelu należy ostrożnie odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS trzy razy (za każdym razem 10 minut). W przypadku organoidów pobranych z żelu (po kroku 4.14) należy zebrać 6-10 organoidów w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml, odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS trzykrotnie (10 minut każdy).
  2. Dodać 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do próbki i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc z uszczelnieniem warstwy parafinowej.
  3. Usunąć roztwór PFA i przemyć próbkę 2 ml PBS cztery razy (za każdym razem 15 minut).
  4. Dodać 2 ml buforu blokującego (tabela 9) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  5. Usunąć bufor blokujący i dodać 1,5 ml przeciwciał pierwszorzędowych (informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów; przeciwciała należy rozcieńczyć w buforze blokującym). Inkubować próbkę z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 4 °C przez 2 dni, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: Zaleca się rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (CD31, PDGFRβ i ERG1) w buforze blokującym w stosunku 1:400 (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów).
  6. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemywać 2 ml PBST przez 1 godzinę sześć razy.
  7. Dodać 2 ml przeciwciał drugorzędowych (informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli Materiałów; przeciwciała należy rozcieńczyć w PBST). Owinąć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 dni, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: Zaleca się rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego w PBST w stosunku 1:1000 (więcej informacji znajduje się w Tabeli materiałów). Trzymaj płytkę z dala od światła podczas inkubacji, a następnie umyj ją od tego etapu.
  8. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć 2 ml TBST sześć razy (za każdym razem 1 godzina). Dodać DAPI (1 μg/ml) do buforu do płukania używanego na ostatnim etapie płukania, jeśli konieczne jest barwienie jąder.
  9. W przypadku tych organoidów zatopionych w żelu pokrój żel na 4 części i ostrożnie przenieś je szpatułką do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml. W przypadku odzyskanych organoidów należy usunąć bufor do płukania.
  10. Użyj chusteczek, aby wchłonąć pozostały roztwór bez dotykania żelu lub organoidów.
  11. Dodać 2 ml rozpuszczalnego w wodzie odczynnika do oczyszczania tkanek (współczynnik załamania światła = 1,49) do każdej probówki. Próbki inkubować z odczynnikiem czyszczącym w temperaturze pokojowej w ciemności, aż organoidy staną się przezroczyste (zwykle przez noc). Nie potrząsaj próbkami.
  12. Ostrożnie przenieść organoidy z odczynnikiem czyszczącym na środek naczynia ze szklanym dnem za pomocą szpatułki.
  13. Przykryj organoidy lub kawałek żelu szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 24 mm × 24 mm.
  14. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aż będzie płaskie, a następnie umieść próbki na szklanym dnie.
  15. Usuń zbędny odczynnik czyszczący z naczynia i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
  16. Do obrazowania 3D należy użyć mikroskopu konfokalnego z obiektywem 10×. Użyj skanowania kafelków i skanowania stosu Z, aby uzyskać obrazy organoidów w całości.

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia schemat tego protokołu, w tym kluczowe komponenty wykorzystane na każdym etapie. Różnicowanie rozpoczęło się od formowania ciałek zarodkowych (EB), po których nastąpiła indukcja mezodermy i specyfikacja linii naczyniowej (Rysunek 1B-D). Agregaty z czasem stawały się większe i mniej sferyczne. Organoidy zaczęły wykazywać nieregularne krawędzie w 5. dniu. Po osadzeniu w mieszaninie kolagenu I i macierzy błony podstawnej, komórki śródbłonka naczyniowego oraz perycyty zaczęły kiełkować i przerastać, tworząc złożone sieci naczyniowe już w 7. dniu (Rysunek 1E). Ponieważ głównym celem tej zmodyfikowanej metody jest zminimalizowanie różnic między różnymi partiami generowanymi, zmierzyliśmy rozmiar EB z dwóch niezależnych partii; zarówno pomiary rozmiarów, jak i analiza statystyczna potwierdziły spójność i jednorodność uzyskanych wyników przy zastosowaniu tej metody (Rysunek 1F).

Aby potwierdzić różnicowanie naczyniowe, organoidy zebrano w 5. dniu przed zatopieniem i zabarwiono markerami naczyniowymi, w tym CD31, ERG1 i PDGFRβ. Organoidy wykazywały ekspresję CD31, ERG1 i PDGFRβ (Rysunek 2), co wskazuje na obecność komórek śródbłonka naczyniowego i pericytów.

Po przejrzyszczaniu tkanek sieci naczyniowe przeanalizowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej preparatów całych (Rycina 3A). Dojrzałe organoidy barwiono na CD31, ERG1 i PDGFRβ w 17. dniu (Rycina 3B, próbka w bloku żelu) oraz w 28. dniu (Rycyna 3C; próbkę wyjęto z bloku żelu i hodowano indywidualnie na płytce 96-dołkowej; należy zauważyć, że po wyjęciu z bloku żelu sieć naczyniowa na krawędziach owinęła sferoidy zamiast rozszerzać się promieniście).

Hodowla iPSC do sieci naczyniowej; schemat, obrazy A-E z eksperymentami, wykres F z wynikami wielkości ciał embrioidalnych (EB).
Rysunek 1: Generowanie organoidów naczyniowych. (A) Schemat etapów i harmonogram generowania organoidów naczyniowych. (B-E) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów naczyniowych na różnych etapach. Paski skali: 100 µm. (F) Analiza statystyczna wielkości EB z dwóch różnych partii generowania EB przy użyciu metody mikrootworów przedstawionej w niniejszej pracy. Do generowania EB wykorzystano 1 000 komórek na mikrootwór, a dla partii 1 i 2 odpowiednio n = 42 i n = 40. Istotność przedstawiono jako ns, brak istotności statystycznej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej struktur komórkowych, analiza lokalizacji białek, wynik eksperymentu.
Rycina 2: Immunobarwienie organoidów naczyniowych przed zatopieniem w żelu. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne organoidów barwionych markerami śródbłonkowymi (A) CD31 (zielony) i (B) ERG1 (zielony), a także (C) markerem perycytów, PDGFRβ (zielony). Jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (niebieski). Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Konfiguracja urządzenia do spektroskopii, mikroskopia fluorescencyjna komórek, obrazowanie wolumetryczne 3D struktury komórek.
Rycina 3: Charakterystyka immunofluorescencyjna sieci naczyniowej w organoidach naczyniowych. (A) Reprezentatywny obraz przedstawia osadzone w żelu organoidy naczyniowe w szalkach szklanych po procesie klarowania tkanek. Organoidy były przezroczyste, lecz widoczne w świetle UV o długości fali 385 nm. (B) Reprezentatywny obraz 3D całego preparatu (whole-mount) organoidu naczyniowego w 17. dniu. Organoid naczyniowy został zabarwiony DAPI (niebieski), markerem komórek śródbłonkowych naczyń CD31 (zielony) oraz markerem perycytów PDGFRβ (magenta). (C) Reprezentatywne obrazowanie 3D całego preparatu odzyskanego organoidu naczyniowego w 28. dniu, zabarwionego markerami śródbłonkowymi CD31 (czerwony) i ERG1 (zielony). Paski skali: 150 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

pożywka do ekspansji hiPSC500 ml
podłoże podstawowe mTeSR Plus400 ml
suplement mTeSR Plus100 ml
Gentamycyna (50 mg/ml)1 ml

Tabela 1: Skład pożywki do ekspansji hiPSC.

pożywka do wysiewu hiPSC20 mL
pożywka do ekspansji PSC20 mL
Chroman 1 (100 µM)10 µL
Emricasan (1 mM)30 µL
suplement poliaminowy (1000x)20 µL
trans-ISRIB (1 mM)14 µL

Tabela 2: Skład medium do wysiewu hiPSC.

pożywka N2B27100 ml
DMEM/F-12, dodatek GlutaMAX48,6 ml
pożywka NeuroBasal48,6 ml
suplement GlutaMAX (100x)0,5 ml
Roztwór nieessentialnych aminokwasów do MEM (NEAA, 100x)0,5 ml
2-merkaptoetanol (1000x)0,1 ml
Gentamycyna (50 mg/mL)0,1 ml
suplement N2 (100x)0,5 ml
suplement B27 bez witaminy A (50x)1 ml
Heparyna, 4 kU/mL0,1 ml

Tabela 3: Skład pożywki N2B27.

pożywka do indukcji mezodermy (MIM)3 ml
pożywka N2B273 ml
BMP4 (100 ng/µL)0.9 µL
CHIR99021 (12 mM)3 µL

Tabela 4: Skład pożywki do indukcji mezodermy (MIM).

Pożywka do różnicowania naczyniowego 1 (VDM1)3 ml
pożywka N2B273 ml
Forsklin (12 mM)0.5 µL
VEGFA (100 ng/µL)3 µL

Tabela 5: Skład medium do różnicowania naczyniowego 1 (VDM1).

mieszanina kolagenu I5 ml
Kolagen I (3,61 g/ml)2,77 ml
pożywka 10x DMEM/F120,5 ml
Węglan sodu, 7,5%0,5 ml
HEPES, 1 M0,5 ml
H2O0,73 ml
NaOH, 1M75 µL

Tabela 6: Skład mieszaniny kolagenu I.

Mieszanina kolagenu I i macierzy błony podstawnej6,5 ml
mieszanina kolagenu typu I5 mL
Matrigel (10 mg/ml)1,5 ml

Tabela 7: Skład mieszaniny kolagenu typu I i macierzy błony podstawnej.

Pożywka do różnicowania naczyniowego 2 (VDM2)5 mL
DMEM/F-12, dodatek GlutaMAX™3,67 ml
Gentamycyna (50 mg/ml)5 µL
Roztwór nieessentialnych aminokwasów do MEM (NEAA, 100X)50 µL
2-merkaptoetanol (1000x)5 µL
Heparyna, 4 kU/ml5 µL
Zamiennik surowicy KnockOut0,75 ml
płytki surowicy wołowej0,5 ml
VEGFA (100 ng/µL)5 µL
FGF2 (100 ng/µL)5 µL

Tabela 8: Skład pożywki do różnicowania naczyniowego 2 (VDM2).

Bufor blokujący50 ml
Surowica osła2,5 ml
Tween 200,25 ml
Triton X-1000,25 ml
Roztwór deoksycholanu sodu (1%, m/v)0,5 ml
bufor fosforanowy w soli fizjologicznej (PBS)46,5 ml

Tabela 9: Skład buforu blokującego do immunobarwienia.

Dyskusja

Opisany protokół obejmuje dwie kluczowe modyfikacje w celu uzyskania jednorodnego i powtarzalnego wytwarzania wysokiej jakości organoidów naczyniowych. Pierwszą modyfikacją jest zastosowanie płytki mikrodołkowej, aby umożliwić lepszą kontrolę jednorodności EB. Jako punkt wyjścia do różnicowania naczyń krwionośnych, wielkość EB ma kluczowe znaczenie, ponieważ reguluje los komórek macierzystych i skuteczność różnicowania w kierunku różnych linii. Różnice w wielkości EB zwykle prowadzą do niejednorodnych organoidów o niespójnej strukturze i organizacji16,17. Konwencjonalna metoda generowania EB poprzez podnoszenie kolonii hiPSC 11,12 utrudnia kontrolowanie liczby komórek dla poszczególnych EB i zwykle prowadzi do niejednorodnego tworzenia EB. W tym protokole hiPSC są dysocjowane do zawiesiny pojedynczej komórki i ponownie agregowane w mikrodołkach16,18. Dostosowując liczbę komórek wysiewu, można zoptymalizować rozmiar EB, aby zapewnić spójne i skuteczne różnicowanie mezodermalne. Do wysiewu mikrostudzienek używa się 500-1,000 komórek, co pozwala uzyskać stosunkowo małe EB (o średnicy 100-200 μm). Metoda ta może w powtarzalny sposób generować jednolite EB o pożądanych rozmiarach z partii na partię (Rysunek 1F) i między różnymi liniami komórkowymi13. Od dnia 0 morfologia EB zmieniała się z czasem podczas różnicowania: kształt staje się mniej kulisty, a powierzchnia staje się bardziej szorstka (ryc. 1), ale objętość nie zwiększa się znacząco. Morfologia naczyń krwionośnych 3D zależy od gęstości osadzenia i rozmiarów osadzonych organoidów. Zbyt duże (>500 μm) organoidy zwykle powodują niewystarczające różnicowanie komórek naczyniowych, podczas gdy zbyt małe organoidy mają zwykle słabo rozwinięte unaczynienie.

Drugą modyfikacją jest włączenie koktajlu CEPT w celu poprawy żywotności hiPSC podczas tworzenia EB. Żywotność komórek ma kluczowe znaczenie oprócz jakości kolonii hiPSC podczas tego procesu. Kiedy hiPSC są dysocjowane do zawiesiny pojedynczej komórki, zwykle dodaje się inhibitor ROCK Y27632 w celu poprawy żywotności komórek. Wykazano jednak, że Y27632 jest nieoptymalny dla hiPSC o niskiej gęstości i może powodować niepożądane naprężenia błonowe, podczas gdy koktajl CEPT (składający się z chromanu 1, emricasanu, poliamin i trans-ISRIB) może znacznie zmniejszyć stres komórkowy i poprawić żywotność podczas tego procesu tworzenia EB z hiPSC o mniejszej gęstości15.

Przed osadzeniem organoidów w żelu, organoidy są utrzymywane w płytce mikrodołka, a zmiana podłoża powinna być delikatna, aby uniknąć ewentualnych zakłóceń. Lepiej byłoby użyć pipety o pojemności 200 μl do zmiany pożywki przez pierwsze 5 dni. Wszystkie podłoża używane do wytwarzania organoidów naczyniowych muszą być wstępnie podgrzane przed użyciem. Zwłaszcza po zatopieniu żelu zastosowanie zimnych mediów może częściowo upłynnić macierz błony podstawnej i wpłynąć na niszę hydrożelową 3D do tworzenia sieci naczyniowej. Gęstość osadzenia i równomierne rozmieszczenie organoidów są również krytycznymi czynnikami tworzenia sieci naczyniowej. Gęste osadzanie organoidów może potencjalnie prowadzić do nadmiernej fuzji sieci naczyniowych, podczas gdy niska gęstość osadzania może prowadzić do niewystarczającego tworzenia sieci. Wysiewanie 60-80 organoidów na studzienkę i delikatne przesuwanie płytki w przód iw tył natychmiast po dodaniu ich do pierwszej warstwy żelu 3D może lepiej rozprowadzić te organoidy.

Protokół ten może być dalej modyfikowany dla różnych zastosowań. Na przykład wskazówki bariery krew-mózg (BBB) mogą być stosowane w celu dalszego powstrzymywania komórek śródbłonka naczyń krwionośnych przed tworzeniem interfejsu BBB 19,20,21,22,23,24,25. Skład hydrożelu 3D można również dostosować. Na przykład fibryna i witronektyna są powszechnie stosowane do tworzenia sieci naczyniowych in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. Macierz błony podstawnej bez kolagenu I może być używana do osadzania, co może uprościć proces osadzania i dostarczać różnych bodźców mechanicznych.

Chociaż organoidy naczyniowe wygenerowane w wyniku tego protokołu mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania chorób lub badań przesiewowych leków, jednym z ograniczeń jest to, że organoidy te rekapitulują głównie naczynia włosowate z kilkoma większymi naczyniami. W przypadku badań koncentrujących się na większych naczyniach generowanie organoidów może wymagać dodatkowych bodźców mechanicznych 24,31,32,33. Połączenie organoidów naczyniowych z recyrkulacją, taką jak przeszczep zwierzętom34 lub urządzenia mikro-/makrofluidyczne z pompami perfuzyjnymi33, może potencjalnie rozwiązać ten problem.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie techniczne ze strony Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource of Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia, częściowo przez NIH Center Grant (P30CA013696). Praca ta jest wspierana przez NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). Rysunek 1A został utworzony przy użyciu BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152rozpuszcza się w 0,25 ml 50% glicerolu,  przechowywać w temperaturze -20 stopni; C przez okres do 1 roku, stosunek rozcieńczenia do stosowania: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147rozpuszcza się w 0,25 ml 50% glicerolu,  przechowywać w temperaturze -20° C przez okres do 1 roku, stosunek rozcieńczenia do stosowania: 1:1000
suplement B27 minus witamina A (50x)Gibco12587010rozmrozić w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania
BMP4ProSpecCYT-081rozpuszcza się w sterylnym ddH2O w stężeniu 100 ng / &mikro; L, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° Przeciwciało C
CD31 abcamab28364Stosunek rozcieńczenia: 1:400
WirówkaEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10przygotować roztwór podstawowy przy 12 mM za pomocą DMSO i przechowywać w temperaturze -20 ° C przez okres do 1 roku.
Chroman 1Tocris7163/10przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 &mikro; M z DMSO i przechowywać w temperaturze -20 ° C przez okres do 1 roku.
Kolagen I Corning40236
NikonAXRMP/Ti2
Corning Elplasia PlatesCorning4441
Countess II FL automatyczny licznik komórekThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, suplement GlutaMAXGibco10565018
DMEM/F-12, proszekGibco12500062przygotować 10x roztwór podstawowy z biograde ddH2O i wysterylizować go 0,2 &mikro; m filtr. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGwytwarza roztwór podstawowy w temperaturze 1 mM za pomocą DMSO i przechowuje w temperaturze -20 & stopni; C przez okres do 1 roku.
Przeciwciało ERGCell Singali Technology97249współczynnik rozcieńczenia: 1:400
Surowica bydlęca płodu - PremiumAtlanta BiologicalsS11150rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C  i podwielokrotność, przechowywać w  -20 &stopni; C przez okres do pięciu lat lub przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do miesiąca
FGF2ProSpecCYT557rozpuścić w sterylnym ddH2O w stężeniu 100 ng/&mikro; L, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 ° C
Fluorodish Cell Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
ForskolinaTocris Bioscience1099rozpuścić w DMSO w stężeniu 12 mM, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 &; C
Gentamycyna (50 mg/ml)Gibco15710064
GlutaMAX suplement (100x)Gibco35050061
Heparyna, 100 kUMiliporeSigma375095100KUrozpuścić w sterylnym ddH2O w stężeniu 4 kU/ml
HEPES (1 M)Gibco15630080
InkubatorThermo Scientific13998123
Zamiennik serum do nokautowaniaGibco10828028rozmrożenie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20° C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80° C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (NEAA, 100x)Gibco11140050
Biologia molekularna Klasa WaterCorning46000CV
mTeSR plus zestawSTEMCELL Technologies1001130rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20° C, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania
suplementu N2 (100x)Gibco17502048rozmrażanie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20° C, unikać cyklu zamrażania i rozmrażania
Roztwór NaOH (1 M)Cytiva  HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121rozpuszczone w 10 ml sterylnego ddH2O, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do dwóch tygodni
paraformaldehyd, 20%Mikroskopia elektronowa Sciences15713Srozcieńczony PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ przeciwciałoR& StosunekAF385: 1:400
suplement poliaminowy (1000x)Sigma-AldrichP8483
Odczynnik klarujący Rapiclear, 1,49SUNJIN LABRC149001
Wodorowęglan sodu (7,5%)Gibco25080094
Deoksycholan sodu monohydratThermofisherJ6228822rozpuścić z ddH2O do uzyskania 1% (wag./v) roztworu podstawowego
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10przygotować roztwór podstawowy w temperaturze 1 mM z DMSO i przechowywać w temperaturze -20° C przez okres do 1 roku.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116rozpuszcza się w sterylnym ddH2O w stężeniu 100 ng/&mikro; L, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20° Z
Mikroskop konfokalny rozcieńczenia D

Bibliografia

  1. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  2. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
  3. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3d tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Bio. 7 (3), 211-224 (2006).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3d culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  6. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  7. Koike, H., et al. Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut-midgut boundary. Nature. 574 (7776), 112-116 (2019).
  8. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  9. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26 (2), 215-224 (2008).
  10. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  11. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  12. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  13. He, S., et al. Mapping morphological malformation to genetic dysfunction in blood vessel organoids with 22q11.2 deletion syndrome. Biorxiv. , (2021).
  14. He, S., et al. Human vascular organoids with a mosaic akt1 mutation recapitulate proteus syndrome. Biorxiv. , (2024).
  15. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  16. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565(2008).
  17. Hwang, Y. -S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of wnt5a and wnt11. Proc Natl Acad Sci. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  18. Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using aggrewell plates. Methods Mol Biol. 946, 523-533 (2013).
  19. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 783-791 (2012).
  20. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. Star Protoc. 2 (2), 100563(2021).
  21. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Sci Adv. 3 (11), e1701679(2017).
  22. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  23. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  24. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 8 (1), 5168(2018).
  25. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Sci Adv. 4 (10), eaat5847(2018).
  26. Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
  27. Kim, J., et al. Engineering of a biomimetic pericyte-covered 3d microvascular network. PLoS ONE. 10 (7), e0133880(2015).
  28. Kosyakova, N., et al. Differential functional roles of fibroblasts and pericytes in the formation of tissue-engineered microvascular networks in vitro. Biorxiv. , (2019).
  29. Whisler, J. A., Chen, M. B., Kamm, R. D. Control of perfusable microvascular network morphology using a multiculture microfluidic system. Tissue Eng Part C Methods. 20 (7), 543-552 (2013).
  30. Haase, K., Kamm, R. D. Advances in on-chip vascularization. Regen Med. 12 (3), 285-302 (2017).
  31. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic models of vascular functions. Annu Rev Biomed Eng. 14 (1), 205-230 (2012).
  32. Boerckel, J. D., Uhrig, B. A., Willett, N. J., Huebsch, N., Guldberg, R. E. Mechanical regulation of vascular growth and tissue regeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), E674-E680 (2011).
  33. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255(2019).
  34. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy naczynioweludzkie iPSCr nicowanie organoid whodowla w mikrowidokachkoktajl CEPTimmunofluorescencja 3Dklarowanie tkanekmikroskopia arkuszowamodelowanie chor b
Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.