Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67149

⸱

27 września 2024

 ,  ,  , 
1INIAV, I.P., National Institute for Agrarian and Veterinary Research, I.P., 2GREEN-IT Bioresources for Sustainability, Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa (ITQB NOVA), 3Centre for Environmental and Marine Studies (CESAM Lisboa), Biotecnologia Vegetal (BV), DBV, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 4Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes (CE3C), Biotecnologia Vegetal (BV), DBV, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 5Hercules Laboratory & Chemistry and Biochemistry Department of Science and Technology School, University of Évora

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje infekcję in vivo i in vitro nicieniami sosnówki Pinus pinaster oraz ich analizę lotną za pomocą chromatografii gazowej (GC) i GC sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS).

Streszczenie

Nicień sosnowy (PWN) to fitopasożyt, który powoduje chorobę więdnięcia sosny (PWD) u gatunków iglastych. Ten pasożytniczy nicień roślinny w dużym stopniu przyczynił się do wylesiania sosny w krajach azjatyckich, np. w Japonii, Chinach i Korei. W ciągu ostatnich dwóch dekad w Europie bardzo ucierpiały Portugalia i Hiszpania. Badania nad mechanizmami zakażenia węgorkiem sosnowca i/lub progresją PWD u wrażliwych gatunków żywicieli opierają się na kontrolowanym zakażeniu siewek sosny w warunkach szklarniowych. Technika ta jest pracochłonna i angażuje znaczne zasoby ekonomiczne i ludzkie. Dodatkowo może być podatny na zmienność, która wynika z różnorodności genetycznej związanej z niektórymi gatunkami sosny, ale także z ingerencji czynników zewnętrznych. Alternatywnie, kohodowle in vitro sosny z węgorkiem sosnowca oferują korzystniejszy system do badania zmian biochemicznych, ponieważ a) pozwalają kontrolować pojedyncze zmienne środowiskowe lub odżywcze, b) zajmują mniej miejsca, c) wymagają mniej czasu na uzyskanie oraz d) są wolne od zanieczyszczeń lub zmienności genetycznej gospodarza. Poniższy protokół szczegółowo opisuje standardowe zakażenie in vivo węgorkiem sosnowca Pinus pinaster, sosny nadmorskiej, oraz ustanowienie nowych kokultur in vitro pędów sosny z węgorkiem sosnowcem jako ulepszonej metodologii badania wpływu fitopasożytów na substancje lotne sosny. Substancje lotne indukowane węgorkiem sosnowca są ekstrahowane z sosny zakażonych in vivo i in vitro za pomocą hydrodestylacji i destylacji-ekstrakcji, a wyemitowane substancje lotne są wychwytywane przez mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME) przy użyciu technik włókien lub kolumn z upakowaniem.

Wprowadzenie

Nicień sosnowy (PWN), Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Bührer 1934) Nickle 1970, to pasożytniczy nicień roślinny, który głównie pasożytuje na gatunkach Pinus. Ten fitopasożyt jest przenoszony przez owady z rodzaju Monochamus na drzewa wrażliwych gatunków sosny podczas żerowania owada. Węgorek sosnowiec zabija drzewo, atakując jego kanały żywiczne i zmniejszając przepływ żywicy oraz uszkadzając jego tkankę naczyniową, powodując przerwy w słupie wody. Brak wody w koronach drzew wywołuje pierwsze widoczne objawy choroby więdnięcia sosny (PWD), tj. igły sosny stają się chlorotyczne po ustaniu fotosyntezy i opadają z powodu wysuszenia. Sosna generalnie reaguje na stres biotyczny i abiotyczny poprzez produkcję żywicy i związków lotnych1. Dlatego zrozumienie mechanizmów obrony sosny jest ważne dla określenia konkretnych skutków ataków węgorka sosnowca i znalezienia alternatywnych metod zwalczania szkodników2.

Obecnie, eksperymentowanie w warunkach polowych zależy od dostępności zainfekowanych sosen, potwierdzenia infekcji PWN i zmiennych warunków środowiskowych. W warunkach szklarniowych parametry te można łatwiej kontrolować; Jednak różnorodność genetyczna gospodarza staje się silnym źródłem zmienności3. Na przykład w badaniu dotyczącym odpowiedzi na oporność Pinus pinaster produkcja terpenu limonenu i kwasów żywicznych była związana z zakażeniem PWN4. Jednak ze względu na małą liczbę próbek i zmienność warunków naturalnych, wykrywalne zmiany zarejestrowano tylko dla połowy próbek. W innym badaniu, w którym wykorzystano sadzonki sosny uprawianej w szklarni, mimo że warunki środowiskowe były łatwiejsze do kontrolowania, naturalna różnorodność genetyczna sosny wywołała dużą zmienność w ekstrahowanych substancjach lotnych5. Ponieważ na substancje lotne sosny wywołane chorobą może mieć duży wpływ zmienność środowiskowa i genetyczna, zastosowanie kultur pędów in vitro jest dobrą alternatywą dla badań nad chemiczną i biochemiczną reakcją tkanki sosny na zakażenie węgorkiem sosnowca5,6. Rozmnażając genotyp rośliny in vitro, można utrzymać jej skład genetyczny i klonować w nieskończoność, co prowadzi do powstania większej liczby genetycznie identycznych osobników na mniejszej przestrzeni i w krótszym czasie niż w warunkach in vivo. Kultury te są prostym systemem roboczym działającym w łatwych do manipulowania warunkach żywieniowych i środowiskowych, dzięki czemu oferują dodatkowe korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi systemami w ocenie produkcji i emisji substancji lotnych7,8. Systemy te są szczególnie korzystne dla badań nad gatunkami drzewiastymi, które w większości przypadków wymagają znacznych zasobów, tj. drzewa docelowe są czasami zlokalizowane w trudno dostępnych miejscach, wymagają drogiego sprzętu, dedykowanej siły roboczej i dłuższych okresów analizy8. In vitro, komulacje sosny z węgorkiem sosnowca umożliwiają ocenę interakcji metabolicznych między nicieniami a rośliną na różnych etapach9. W przypadku analizy substancji lotnych jest to bardzo ważne, ponieważ techniki profilowania stały się bardzo dokładne, a niewielkie różnice w próbkowaniu mogą powodować znaczne zmiany w profilach lotnych. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC-MS) jest potężną techniką analizy substancji lotnych i umożliwia szybkie i sprawne profilowanie substancji lotnych10. Przedstawiony tutaj protokół opisuje techniki infekowania sadzonek sosny in vivo w warunkach szklarniowych oraz kultur pędów in vitro genetycznie identycznych sosen, zoptymalizowanych pod kątem ekstrakcji i profilowania indukowanych substancji lotnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uprawa nicieni sosnowych in vitro

UWAGA: Nicienie sosnowe są hodowane poprzez żywienie się grzybnią niezarodnikującego szczepu Botrytis cinerea (de Bary) Whetzel11.

  1. W przypadku rutynowej subkultury przenieść czop hodowlany (o średnicy 0,5 cm) z najbardziej zewnętrznej granicy kolonii grzybów na płytkę sterylnego agatora z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) i utrzymywać w temperaturze 25 ± 1 °C przez 7 do 10 dni lub do momentu, gdy kolonia grzybów osiągnie krawędź płytki.
    UWAGA: Do wzrostu grzybów można stosować inne rodzaje ogólnych pożywek do wzrostu grzybów.
  2. W celu uzyskania większych ilości węgorka sosnowca należy użyć B. cinerea wyhodowanego in vitro na sterylizowanym parowo, uwodnionym, certyfikowanym ekologicznym ziarnie jęczmienia (Hordeum vulgare L.). Dodaj 15 g płatków zbożowych do 15 ml ultraczystej wody w przykrytych kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 ml i wysterylizuj. Następnie zaszczepić zatyczką hodowlaną B. cinerea i utrzymywać w temperaturze 25 ± 1 °C przez 7 do 10 dni lub do momentu, gdy powierzchnia zboża zostanie w pełni skolonizowana12.
    UWAGA: Nicienie do celów badawczych można zamówić w krajowych laboratoriach referencyjnych ds. nicieni pasożytujących na roślinach.
  3. Hodowle węgorka sosnowca należy rozpocząć poprzez inokulację kultur węgorka sosnowca in vitro zawiesiną wodną węgorka sosnowca (zawierającą co najmniej 20 samców i 30 samic) i utrzymywać w ciemności w warunkach opisanych wcześniej przez 7 do 10 dni lub do momentu, gdy kolonia grzybów zostanie całkowicie zużyta, a populacja węgorka sosnowca zacznie wspinać się po ściankach płytki lub kolby (Rysunek 1). Uszczelnij płytki lub kolby folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć wysuszenia.
    UWAGA: Samice można odróżnić po klapie sromowym, długim woreczku zamacicznym i ogólnie okrągłym końcu ogona; Samce mają brzusznie zakrzywiony, spiczasty koniec ogona z charakterystycznymi kolcami13. Podczas pipetowania zawiesin węgorka sosnowca należy rozprowadzić kolonię grzybów tak, aby odpipetowana zawiesina nie tworzyła kropelek na powierzchni grzyba, zatrzymując węgorki sosnowca poprzez napięcie powierzchniowe.
  4. Wyizoluj węgorki sosnowca, spłukując ścianki kolby wodą z kranu, wylewając zawartość na ręcznik papierowy do lejka lub tacy Baermann i zanurzając w wodzie14. Po 24 do 48 godzinach żywe nicienie przeniosłyby się z zakażonego materiału do wody. Odzyskujemy je, przesiewając za pomocą sita o oczkach 38 μm15. Umyj nagromadzone PWN w pojemniku z wodą z kranu.
    UWAGA: Każdy materiał, który ma kontakt z węgorkiem sosnowcem, musi zostać odpowiednio odkażony, ponieważ jest to organizm kwarantannowy; Zwykle wystarczające jest zanurzenie w etanolu na 10 do 20 minut. Odrzucone zawiesiny wodne muszą być sterylizowane lub podgrzewane do temperatury 60 °C przez co najmniej 35 minut.
  5. Zawiesinę wodną zawierającą węgorka sosnowca należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 11 °C przez dłuższy okres przechowywania (do 2 miesięcy).

2. Sterylizacja mieszanych nicieni sosnowych w stadium życia

  1. W okapie przepływowym odpipetować objętość zawiesiny PWN zawierającej około 5000 węgorków sosnowca na sterylne sito o oczkach 38 μm i przemyć sterylną wodą.
    UWAGA: Policz nicienie pod mikroskopem lornetkowym (40x).
  2. Zanurzyć dolną połowę sita zawierającego węgorki sosnowca w 20% roztworze nadtlenku wodoru (H2O2) i mieszać ręcznie przez 15 minut.
  3. Umyj sterylne PWN, dozując sterylną wodę przez sito. Powtórz ten krok 3 razy. W ostatnim praniu przechylić sito tak, aby na granicy sita zbierały się węgorki sosnowce. Sterylną zawiesinę nicieni odzyskać przez pipetowanie 1 ml sterylnej wody na granicy sita i przechowywać w temperaturze 11 °C lub natychmiast zużyć.
    UWAGA: Powodzenie sterylizacji można ocenić, posiewając 100 μl podwielokrotności zawiesiny węgorka sosnowca w pożywce PDA i regularnie monitorując pod kątem zanieczyszczeń przez około 1 tydzień.

3. Zakażenie in vivo siewek Pinus pinaster

UWAGA: Próby inokulacji przeprowadzane są na ≥ 2-letnich siewkach P. pinaster. Drzewa można nabyć od certyfikowanych sprzedawców komercyjnych, ale można je również uprawiać w szklarni z certyfikowanych nasion.

  1. Otrzymać inokulum węgorka sosnowca zgodnie z opisem w kroku 1 i ustawić zawiesiny mieszanych węgorków sosnowca w stadium życia na 1000 węgorków sosnowca/ml, dodając wodę do zawiesiny lub czekając, aż nicienie opadną (ok. 60 min) i zmniejszając objętość poprzez dekantację wody powierzchniowej. Liczenie w temperaturze pokojowej na wklęsłym szkiełku podstawowym pod mikroskopem lornetkowym przebiega pod powiększeniem 40x.
  2. Aby rozpocząć inokulację, ręcznie usuń igły z odcinka poniżej górnych 5 cm łodygi sosny i wykonaj powierzchowne podłużne nacięcie (o długości od 0,5 do 1 cm) za pomocą wysterylizowanego skalpela16.
    UWAGA: Nacięcie wykonuje się, aby umożliwić nicieniom dostęp do wewnętrznych tkanek sosny.
  3. W strefie zranienia umieść kawałek wysterylizowanej bawełny na 0,5 ml pipetowanej zawiesiny węgorka sosnowca i przymocuj go przezroczystym paskiem, aby utrzymać wilgotność.
    UWAGA: Zawiesinę węgorka sosnowca należy energicznie mieszać między każdym szczepieniem, ponieważ nicienie szybko się uspokoją. Jeśli zawiesina wyschnie w miejscu inokulacji, zakażenie nicieniami może się nie powieść, więc odpowiednio przykryj wilgotną bawełnę.
  4. W przypadku sosny kontrolnej zawiesinę węgorka sosnowca należy zastąpić sterylną wodą.
  5. Regularnie śledź progresję PWD i oceniaj symptomatologię, określając ilościowo procent przebarwionych i zwiędłych igieł. Wynik 0 oznacza brak objawów zewnętrznych, 1 oznacza przebarwienia igieł do 25%, 2 punkty oznaczają przebarwienia igieł od 25% do 50%, 3 punkty oznaczają 50% do 75% przebarwień igieł i 4 punkty punkty przyznawane są sosnowym sosnom z całkowicie brązowymi igłami (Rysunek 2).
  6. Utrzymuj szklarnię w wilgotnych warunkach (60%-80%) i często podlewaj (utrzymuj na poziomie 70% maksymalnej zdolności zatrzymywania wody w glebie), unikając ekstremalnych temperatur, ponieważ nicienie stają się metabolicznie nieaktywne poniżej 10 °C, a rozwój może być zakłócony powyżej 30 °C.
  7. Po 20 dniach od inokulacji należy zebrać materiał roślinny do ekstrakcji substancji lotnych, przycinając sadzonki u podstawy łodygi i zamrażając (-20 °C) w brązowych papierowych torebkach. W przypadku emitowanych substancji lotnych (włókna SMPE lub wypełnione tuby) należy natychmiast pobrać próbki siewek sosny w temperaturze pokojowej5,17.

4. Zakładanie i infekowanie kultur pędów sosny in vitro

  1. Przed sterylizacją powierzchni należy umyć certyfikowane nasiona P. pinaster pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć największe zanieczyszczenia, a następnie zwykłym roztworem detergentu (1 kropla na 40 ml wody), energicznie mieszając, aby zmyć drobniejsze zanieczyszczenia.
  2. W okapie przepływowym rozpocznij sterylizację powierzchni nasion od dodania komercyjnego roztworu wybielacza (1:4, komercyjny wybielacz w wodzie z kranu), aż umyte nasiona zostaną pokryte i energicznie mieszaj przez 15 minut. Wyrzuć roztwór wybielacza i opłucz nasiona 3x wysterylizowaną wodą z kranu.
  3. Zanurz nasiona w roztworze etanolu (80%, v/v) na 15 minut z energicznym mieszaniem, wyrzuć etanol i umyj 3x wysterylizowaną ultraczystą wodą.
  4. W celu kiełkowania sosny rozbij wysterylizowane okrywy nasienne sterylną tokarką mechaniczną w okapie przepływowym, odizoluj orzeszki piniowe i umieść je w zamkniętym pojemniku ze sterylizowaną mokrą bibułą filtracyjną, aby nawodnić orzeszki piniowe przez noc6.
  5. Uwodnione orzeszki piniowe należy rozwarstwić w temperaturze 4 °C przez 7 dni, aby przerwać spoczynek i zsynchronizować kiełkowanie, a następnie utrzymać w ciemności w temperaturze 25 °C aż do wykiełkowania.
    UWAGA: Krok stratyfikacji jest opcjonalny.
  6. Przenieść aseptyczne kiełkujące sosny w zamkniętym pojemniku do 16-godzinnego fotoperiodu świetlnego w temperaturze 24 °C/18 °C i utrzymywać przez 2 tygodnie lub do momentu, gdy zacznie się rozwijać główna łodyga.
  7. W kapturze przepływowym odetnij nadziemną część sadzonki powyżej korzenia za pomocą skalpela i przenieś do wysterylizowanej pożywki Schenk i Hildebrandt (SH)18 (pH = 5,8) uzupełnionej 30 g/l sacharozy, 8 g/l agaru, 0,5 mg/l 6-benzyloaminopuryny (BAP, cytokinina) i 0,1 mg/l kwasu indolo-3-masłowego (IBA, an auxin)6, aby wywołać mnożenie mikropędów. Hodowle należy przechowywać w warunkach opisanych powyżej w komorze do hodowli in vitro.
  8. W kapturze przepływowym subkulturuj okresowo (około 4 tygodnie), przecinając tkankę kalusa u podstawy pędu (część stykająca się z pożywką hodowlaną) sterylnym skalpelem i przenosząc skupisko pędów za pomocą sterylnej pęsety na świeżą pożywkę do hodowli namnażających.
  9. W celu wydłużenia mikrołodygi przenieś mikropędy do pożywki hodowlanej SH opisanej powyżej, ale zawierającej 3 g/l węgla aktywnego zamiast fitohormonów.
    UWAGA: Węgiel aktywny adsorbuje substancje toksyczne i zapobiega nadmiernemu indukowanemu gromadzeniu fitohormonów na wyciętej tkance19.
  10. W przypadku zakażenia węgorkiem sosnowca należy przenieść wydłużone pędy na pożywkę hodowlaną SH bez fitohormonów lub węgla aktywnego i dodać 100-150 wysterylizowanych węgorków sosnowca w mieszanym stadium życia na dnie mikropędu. Utrzymuj w warunkach opisanych powyżej, aż objawy PWD zaczną być zauważalne (Rysunek 3)6.
  11. Aby zebrać materiał roślinny do ekstrakcji substancji lotnych, należy natychmiast użyć eksplantatów in vitro lub zamrozić (-20 °C) do czasu analizy. W przypadku emitowanych substancji lotnych (włókna SMPE lub wypełnione tuby) należy natychmiast przeanalizować pudełka z mikropędami.

5. Izolacja związków lotnych

UWAGA: Izolację substancji lotnych można przeprowadzić za pomocą kilku technik. W tym przypadku ekstrakcja lotna odbywa się przez hydrodestylację, przy użyciu aparatu Clevengera20, destylację-ekstrakcję, przy użyciu aparatu Likensa-Nickersona21, oraz wychwytywanie substancji lotnych w przestrzeni nad powierzchnią poprzez mikroekstrakcję do fazy stałej (SPME) przy użyciu powlekanych włókien lub wypełnionych rurek (porowaty sorbent polimerowy)22.

  1. Hydrodestylacja
    1. Użyj aparatu Clevengera do izolacji olejków eterycznych. System destylacji składa się z: a) aparatu Clevengera, b) kolby okrągłodennej lub kolby Erlenmeyera do zatrzymywania wody i materiału sosnowego, c) odpowiedniego sprzętu grzewczego oraz d) ramy nośnej do utrzymywania systemu na miejscu (Rysunek 4A).
    2. Dokładnie wyczyść szkło przed użyciem. Użyj ramy laboratoryjnej clamps, aby przymocować aparat Clevengera do ramy kratowej. Schłodzić skraplacz systemu poprzez cyrkulację wody lub użyć cyrkulatora z chłodzeniem, jeśli jest dostępny.
    3. Zarejestruj masę pędu sosny i umieść ją w kolbie okrągłodennej lub kolbie Erlenmeyera. Dostosuj ilość wody, aby upewnić się, że pojemnik nie jest wypełniony więcej niż do połowy.
    4. Umieść urządzenie grzewcze pod kolbą, sprawdź, czy nie ma wycieków i upewnij się, że wszystkie części systemu są we właściwej pozycji i przymocowane do ramy nośnej.
      UWAGA: Części łączące szkło z uziemieniem Clevenger i kolby należy dokładnie wyczyścić, odtłuścić i wysuszyć przed podłączeniem. W tym celu użyj kawałka bibuły filtracyjnej lekko zwilżonego acetonem. W tych częściach nie należy używać smaru.
    5. Wprowadzić wodę przez lejek do napełniania, znajdujący się w powrotnej rurce ukośnej w środkowej części aparatu Clevengera. Wyreguluj położenie kranu trójdrożnego tak, aby woda przepływała równomiernie w dwóch rurkach (ukośnej i z podziałką) aż do napełnienia kolby, tuż przed spływając z powrotnej rurki ukośnej do niej (patrz Rysunek 4).
    6. Włącz źródło ciepła i wyreguluj je tak, aby woda zagotowała się z szybkością destylacji 2 - 3 ml/min.
    7. Czas destylacji należy rozpocząć, gdy pierwsza kropla wody destylowanej wpadnie do rurki miarowej po prawej stronie aparatu Clevengera. Średni czas destylacji wynosi 3 h23, ale można zastosować krótsze lub dłuższe okresy destylacji zgodnie z konkretnymi wymaganiami. Olejki eteryczne znajdują się zazwyczaj w cieczy sklarowanej nad osadem, ponieważ są zwykle lżejsze niż destylowana woda aromatyczna poniżej (hydrolat).
      UWAGA: Podczas destylacji aparat Clevengera będzie gorący w dotyku.
    8. Po upływie czasu destylacji przerwij podgrzewanie i odstaw na około 10 minut, aby umożliwić zatrzymanie destylacji i gotowania. Po 10 minutach odkręć kran zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby hydrolat wypłynął, aż olejek eteryczny dotrze do wyskalowanej części. Odczytaj objętość wyizolowanego olejku eterycznego. Obliczyć wydajność w ml/g (świeżej lub suchej masie), wyrażoną w procentach (%, v/w).
    9. W przypadku olejków eterycznych o objętości poniżej 0,05 ml, najniższej podziałki w probówce z podziałką, nie można określić wydajności. Aby odzyskać olejek eteryczny, użyj destylowanego n-pentanu do przepłukania aparatu Clevengera.
    10. Aby odzyskać olejek eteryczny za pomocą destylowanego n-pentanu, po zakończeniu destylacji odczekaj około 10 do 15 minut i otwórz kran trójdrożny w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby hydrolat wypłynął z powrotnej rurki ukośnej aż do momentu tuż poniżej lejka do napełniania. Za pomocą czystego zakraplacza wprowadź destylowany n-pentan do lejka napełniającego, aż do lewej górnej strony powrotnej rurki ukośnej. Unikaj dotykania lejka do napełniania, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    11. Za pomocą butelki do mycia wody destylowanej wprowadź wodę do lejka do napełniania. n-pentan spłynie w dół do kolby destylacyjnej i odparuje wraz z ciepłem resztkowym wody wywarowej. W ten sposób przejdzie przez układ, rozpuści się i przeciągnie substancje lotne na powierzchnię hydrolatu, w rurce z podziałką. Otwórz kran trójdrożny zgodnie z ruchem wskazówek zegara do jego zwykłej pozycji.
    12. Postępować jak w ppkt 5.1.8 w celu zebrania olejku eterycznego rozpuszczonego w n-pentanie.
    13. Mieszaninę olejku eterycznego i n-pentanu należy stężyć do minimalnej objętości około 100 μl w temperaturze pokojowej pod strumieniem azotu za pomocą systemu parownika odmulającego. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
      UWAGA: Nie koncentruj się do sucha, aby uniknąć utraty lotnych związków.
  2. Destylacja-ekstrakcja
    1. Użyj aparatu Likensa-Nickersona do ekstrakcji substancji lotnych z roślin. Układ destylacyjno-ekstrakcyjny składa się z: a) aparatu Likensa-Nickersona, b) kolby okrągłodennej do przechowywania wody i materiału sosnowego (prawe ramię jednostki destylacyjnej) oraz drugiej kolby do przechowywania niemieszającego się rozpuszczalnika organicznego, takiego jak destylowany n-pentan (lewe boczne ramię jednostki destylacji), c) dwóch odpowiednich urządzeń grzewczych, d) skraplacza, oraz e) rama nośna do podtrzymywania systemu (Rysunek 4B).
      UWAGA: Użyj destylowanego w laboratorium n-pentanu, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki stabilizatorami z dodatkiem rozpuszczalnika.
    2. Zacznij od cyrkulacji wody w zabezpieczonym skraplaczu lub użyj cyrkulatora z chłodzeniem, jeśli jest dostępny.
    3. Użyj ramy laboratoryjnej clamps, aby przymocować jednostkę destylacyjno-ekstrakcyjną do ramy kratowej. Załadować kolbę okrągłodenną materiałem sosnowym, który ma być wydobyty, i dodać wodę do połowy pełnej pojemności. Mniejsza kolba okrągłodenna o pojemności 100 ml powinna być do połowy wypełniona destylowanym n-pentanem.
      UWAGA: Przed podłączeniem części łączące elementy szklane z uziemieniem muszą być dobrze oczyszczone, odtłuszczone i wysuszone. Do czyszczenia można użyć kawałka bibuły filtracyjnej, który został krótko zwilżony acetonem.
    4. Umieścić płaszcze grzewcze pod każdą kolbą. Sprawdź, czy nie ma wycieków i czy każdy element systemu jest prawidłowo umieszczony i przymocowany do ramy kraty laboratoryjnej. Włącz źródła ciepła i dostosuj je do odpowiednich temperatur wrzenia. Woda powinna wrzeć z szybkością destylacji 2-3 ml/min.
      UWAGA: Podczas procesu destylacji-ekstrakcji aparat Likensa-Nickersona będzie gorący w dotyku.
    5. Po upływie czasu destylacji należy przerwać ogrzewanie kolby z materiałem sosnowym i pozostawić n-pentan do samodzielnej destylacji przez 10 minut. Po przemianie n-pentanu w przezroczystą ciecz przerwij podgrzewanie i odstaw na około 10 minut. Zmiana koloru wskazuje, że destylat znajduje się teraz w kolbie z n-pentanem.
    6. Ekstrakt n-pentanu należy skoncentrować pod obniżonym ciśnieniem (70 - 73 mmHg) na wyparce obrotowej w temperaturze pokojowej. Przenieść częściowo skoncentrowany ekstrakt do fiolki i zagęścić go do ≈100 μl pod strumieniem azotu w parowniku odmulającym w temperaturze pokojowej. Po ekstrakcji przechowywać próbki w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
      UWAGA: Ekstrakt nie powinien być skoncentrowany do suchości, ponieważ spowoduje to utratę lotnych związków.
  3. Pobieranie próbek w przestrzeni nad powierzchnią za pomocą włókna powlekanego
    1. Konfiguracja mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) obejmuje a) ręcznie obsługiwany uchwyt SPME, b) włókno powlekane oraz c) odpowiednią podstawkę do podparcia uchwytu SPME (Rysunek 4C). W przypadku niniejszego protokołu należy użyć ręcznego systemu SPME-headspace w fiolce z włóknem pokrytym 100 μM polidimetylosiloksanem (PDMS) do wychwytywania substancji lotnych.
      UWAGA: Inne dostępne na rynku włókna posiadają powłoki o różnych właściwościach chemicznych i powinny być dobierane zgodnie z pożądanym efektem.
    2. Przed użyciem każde włókno SPME kondycjonować termicznie do 20 min w temperaturze 250 °C, zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Włóż materiał sosnowy lub część sosnową do fiolki z przezroczystego szkła i zamknij ją zakrętką z otworem z wkładką z politetrafluoroetylenu (PTFE) (przegroda). Materiał powinien znajdować się co najmniej 2 do 3 cm od górnej części fiolki, tak aby włókno nie dotykało próbki.
    4. Przeprowadzaj eksperymenty kontrolne jednocześnie z użyciem włókien SPME, pobierając próbki pustych fiolek w celu identyfikacji zanieczyszczeń systemu lub potwierdzenia braku przeniesienia z wielokrotnego użycia włókien SPME.
    5. Materiał sosnowy należy przechowywać w fiolce przez 1 godzinę przed pobraniem substancji lotnych w celu uzyskania równowagi atmosfery.
      UWAGA: Testy z SPME można przeprowadzać w temperaturze pokojowej lub w regulowanej temperaturze, umieszczając fiolki w stojaku i wkładając je do wanny Bain Marie.
    6. Dostosuj głębokość igły do przekłuwania przegrody nosowej z uchwytu SPME, aby przebić przegrodę, ale nie wchodzić w kontakt z materiałem, gdy włókno jest odsłonięte.
    7. Po wycofaniu włókna włóż igłę uchwytu przez wkładkę PTFE. Wciśnij tłok, aby odsłonić włókno. Obróć tłok zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przytrzymaj mocującą po lewej poziomej stronie rowka Z-slot24. Odsłoń włókno na 1 godzinę.
    8. Cofnij włókno, obracając tłok w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż tłok dotrze do górnej części rowka Z. Zebrane substancje lotne są teraz gotowe do bezpośredniej analizy GC i/lub GC-MS.
      UWAGA: W razie potrzeby włókna można przechowywać w temperaturze pokojowej przed analizą, ale nie dłużej niż tydzień.
  4. Pułapkowanie przestrzeni nad głową za pomocą wypełnionych rurek
    1. Przygotuj zestaw do wychwytywania substancji lotnych w przestrzeni nad powierzchnią za pomocą wypełnionych pułapek ze stali nierdzewnej, składających się z: a) systemu pompowania o przepływie masowym, b) rurki PTFE, c) filtry powietrza z węglem aktywnym, d) rurki wypełnione porowatym polimerem żywicy oraz e) worki na szkło lub politereftalan etylenu (PET) (worki do gotowania) (Rysunek 4D)25.
    2. Przechowuj materiał sosnowy w zakrytych szklanych naczyniach lub w workach PET, aby gromadzić lotne substancje lotne w przestrzeni nad głową.
      UWAGA: Należy pamiętać, że substancje lotne z powszechnego plastiku są obfite i można je wykryć w dużych ilościach za pomocą GC-MS.
    3. W przypadku systemu z zamkniętą pętlą należy podłączyć obwód w następujący sposób: a) wylot pompy do rurki PTFE, b) przewód PTFE do filtrów powietrza z węglem aktywnym, c) od filtrów powietrza do dodatkowych przewodów łączących się z naczyniami szklanymi lub workami PET z materiałem sosnowym, d) wypełnioną rurkę do wylotu naczynia szklanego lub worka PET, e) dodatkowe rurki PTFE od wylotu rurki ze stali nierdzewnej do wlotu pompy o przepływie masowym22.
      UWAGA: Porowate rury ze stali nierdzewnej wypełnione polimerami należy przed użyciem kondycjonować termicznie w urządzeniu do desorpcji termicznej zgodnie z zaleceniami producenta, np. do 15 min w temperaturze 100 °C. Należy pamiętać, że rurki mają kierunek przepływu, którego należy przestrzegać.
    4. Zbieraj substancje lotne, pompując 100 l przefiltrowanego powietrza przez system sosnowy z prędkością 0,6 l na minutę, używając pompy przepływu masowego do kontrolowania ilości i szybkości filtrowanego powietrza.
      UWAGA: Ilość i/lub przepływ powietrza w przestrzeni nadpowierzchniowej, które przepływa przez kolumnę, może wpływać na ilość uwięzionych substancji lotnych, a następnie na uzyskany chromatogram.
    5. Po zebraniu substancji lotnych zamknij zapakowane tuby na obu końcach hermetycznym nakrętkami do przechowywania. Przechowuj w temperaturze pokojowej (maksymalnie przez 1 tydzień) i analizuj tak szybko, jak to możliwe, ponieważ substancje lotne mogą ulec degradacji lub ulatniać się.
    6. Do mycia wypłucz wszystkie rurki i szkło z PTFE 70% etanolem i rozgrzej w piekarniku w temperaturze 230 °C przez co najmniej 2 godziny25.

6. Analiza profili lotnych

  1. Przeprowadzanie analizy profili lotnych za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) lub rutynowo za pomocą chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (GC-FID) w celu ilościowego określenia wcześniej zidentyfikowanych substancji lotnych.
    UWAGA: Opis metod analizy metodą GC-FID i GC-MS jest obszerny i wykracza poza cel niniejszej pracy. Zaleca się, aby czytelnik korzystał z procedur lub norm laboratoryjnych, takich jak ISO 760926, które zapewniają odpowiednie warunki operacyjne dotyczące kwantyfikacji poszczególnych składników oraz dane literaturowe dotyczące porównania dwóch metod analitycznych27.
  2. Stosować anality, które są czyste lub przenoszone w rozpuszczalniku, np. n-pentan lub n-heksan, i bezpośrednio wstrzykiwane lub adsorbowane do włókna, np. SPME, i desorbowane bezpośrednio do wtryskiwacza chromatografu lub za pomocą jednostki desorpcji termicznej (TD) połączonej z jednostką GC.
    UWAGA: Pomimo większej czułości, wyższej rozdzielczości i krótszego czasu analizy, kolumny kapilarne mają niską pojemność próbki. Tak więc, chociaż prawie wszystkie warunki pracy mogą być podobne, rodzaj analitu (czysty, w rozpuszczalniku, SPME itp.) może wymagać różnych procedur wstrzykiwania typu split / split.
  3. Przeprowadzić identyfikację składników lotnych poprzez porównanie ich wskaźników retencji, ocenionych zgodnie z ISO 7609, z widmami GC-MS z biblioteki utworzonej w laboratorium przy użyciu próbek referencyjnych, których tożsamość składnika została ustalona na podstawie RI, GC-MS i 13C-NMR, związków syntetyzowanych i wyizolowanych w laboratorium oraz dostępnych w handlu wzorców, lub, w przypadku ich braku, dostępne na rynku biblioteki widm masowych.
  4. Przedstawić wyniki za pomocą przedstawienia graficznego (chromatogramu) i profilu chromatograficznego, który wymienia względne ilości wszystkich zidentyfikowanych związków w próbce, z kolejnością ich wymywania wskazywaną przez ich wskaźniki retencji w odpowiedniej kolumnie.
  5. W przypadku dużej liczby próbek należy przeprowadzić odpowiednią analizę statystyczną w oparciu o skład chemiczny w celu interpretacji układu próbek (grupowania i/lub rozdzielania).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

PWN szybko rozmnażają się w optymalnych warunkach, a czas generacji może wynosić zaledwie 4 dni, przy czym każda samica składa w ciągu swojego życia około 80 jaj28. Stosując opisaną powyżej metodologię, można uzyskać duże ilości PWN, w zależności od wzrostu grzyba. W ciągu 8-dniowego okresu wzrostu liczebność populacji PWN może wzrosnąć 100-krotnie (Rysunek 1). Aby zwiększyć powtarzalność ilości otrzymywanych PWN, należy używać sterylizowanych PWN, ponieważ zanieczysz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia ulepszoną metodologię analizy lotnych związków w sosnie nadmorskiej zakażonej węgorkiem sosnowcem, w których zmienność środowiskowa i genetyczna jest zmniejszona i nie ma wpływu na wyniki. Wykorzystując czyste linie genotypów sosny morskiej in vitro , wyekstrahowane i wyemitowane substancje lotne mogą być analizowane jako odpowiedź gospodarza na jedno z najbardziej szkodliwych zagrożeń biotycznych dla lasów sosnowych.

Utrzymanie kultur referenc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez UE w ramach projektu PurPest na podstawie umowy o udzielenie dotacji 101060634, oraz przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), poprzez projekty NemACT, DOI 10.54499/2022.00359.CEECIND/CP1737/CT0002; NemaWAARS, DOI 10.54499/PTDC/ASP-PLA/1108/2021; CESAM UIDP/50017/2020+UIDB/50017/2020+ LA/P/0094/2020; CE3C, DOI 10.54499/UIDB/00329/2020; GREEN-IT, DOI 10.54499/UIDB/04551/2020 oraz 10.54499/UIDP/04551/2020.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sito testowe o oczkach 38Retsch60.131.000038
6-Benzyloaminopuryna (6-BAP)Duchefa BiochemieB0904
Aktywowane węglem drzewnymDuchefa BiochemieC1302
Aparat ClevengeraWINZER Laborglastechnik25-000-02
Roztwór nadtlenkuwodoru Sigma-AldrichH1009-500ML
Kwas indolo-3-masłowy (IBA)Duchefa BiochemieI0902
Aparat Likensa-NickersonaVitriLab LDA.c/IN29/32
Pojemniki okrągłe MicroboxSac O2O118/80+OD118
n-PentaneSigma-Aldrich1.00882
Folia uszczelniająca PARAFILM MMARKAHS234526B-1EA
FitoagarDuchefa BiochemieP1003
Agar ziemniaczany dekstrozaBD DIFCO213400
Ostrze skalpela nr 24Romed HollandBLADE24
Schenk & Hildebrandt Sól bazalna mediumDuchefa BiochemieS0225
Schenk & Mieszanka witamin HildebrandtDuchefa BiochemieS0411
Zespół włókien SPME Polidimetylosiloksan (PDMS)Supelco57300-U
Uchwyt na włókna SPMESupelco57330-U
SacharozaDuchefa BiochemieS0809
Tenax TA- rurki ze stali nierdzewnej kondycjonowane + zaślepioneMarkes InternationalC1-AAXX-5003

Bibliografia

  1. Back, M. A., Bonifácio, L., Inácio, M. L., Mota, M., Boa, E. Pine wilt disease: A global threat to forestry. Plant Pathol. 73 (5), 1026-1041 (2024).
  2. Mumm, R., Hilker, M. Direct and indirect chemical defence of pine against folivorous insects. Trend Plant Sci. 11 (7), 351-358 (2006).
  3. Carrasquinho, I., Lisboa, A., Inácio, M. L., Gonçalves, E. Genetic variation in susceptibility to pine wilt disease of maritime pine (Pinus pinaster Aiton) half-sib families. Annals Forest Sci. 75 (3), 85(2018).
  4. Gaspar, M. C., et al. Impact of the pinewood nematode on naturally-emitted volatiles and scCO2 extracts from Pinus pinaster branches: a comparison with P. pinea. J Supercritical Fluids. 159, 104784(2020).
  5. Rodrigues, A. M., et al. Pinus halepensis, Pinus pinaster, Pinus pinea and Pinus sylvestris essential oils chemotypes and monoterpene hydrocarbon enantiomers, before and after inoculation with the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Chem Biodiver. 14 (1), e1600153(2017).
  6. Faria, J. M. S., et al. In vitro co-cultures of Pinus pinaster with Bursaphelenchus xylophilus: a biotechnological approach to study pine wilt disease. Planta. 241 (6), 1325-1336 (2015).
  7. Espinosa-Leal, C. A., Puente-Garza, C. A., García-Lara, S. In vitro plant tissue culture: means for production of biological active compounds. Planta. 248 (1), 1-18 (2018).
  8. Bonga, J. M., von Aderkas, P. In Vitro Culture of Trees. , Springer. Netherlands, Dordrecht. (1992).
  9. Faria, J. M. S., et al. Nematotoxic and phytotoxic activity of Satureja montana and Ruta graveolens essential oils on Pinus pinaster shoot cultures and P. pinaster with Bursaphelenchus xylophilus in vitro co-cultures. Indus Crops Prod. 77, 59-65 (2015).
  10. Vallarino, J. G., et al. Acquisition of volatile compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabol. Meth Mol Biol. , 225-239 (2018).
  11. Kikuchi, T., Aikawa, T., Oeda, Y., Karim, N., Kanzaki, N. A rapid and precise diagnostic method for detecting the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal amplification. Phytopathology. 99 (12), 1365-1369 (2009).
  12. Faria, J. M. S., Barbosa, P., Bennett, R. N., Mota, M., Figueiredo, A. C. Bioactivity against Bursaphelenchus xylophilus: Nematotoxics from essential oils, essential oils fractions and decoction waters. Phytochemistry. 94, 220-228 (2013).
  13. Nickle, W. R., Golden, A. M., Mamiya, Y., Wergin, W. P. On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner &Buhrer 1934) Nickle 1970. J Nematol. 13 (3), 385-392 (1981).
  14. Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: baermann funnel modifications. J Nematol. 15 (3), 438-444 (1983).
  15. IPPC. IPPC DP 10: Bursaphelenchus xylophilus. Diagnostic protocols, International standard for phytosanitary measures. 27, 1-40 (2016).
  16. Rodrigues, A. M., Carrasquinho, I., António, C. Primary metabolite adjustments associated with pinewood nematode Resistance in Pinus pinaster. Front Plant Sci. 12, 10(2021).
  17. Gonçalves, E., et al. Effect of Monochamus galloprovincialis feeding on Pinus pinaster and Pinus pinea, oleoresin and insect volatiles. Phytochemistry. 169, September 2019 112159(2020).
  18. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian J Botany. 50 (1), 199-204 (1972).
  19. Tereso, S., et al. Improved axillary and adventitious bud regeneration from Portuguese genotypes of Pinus pinaster AIT. Propag Ornam Plants. 6 (1), 24-33 (2006).
  20. Council of Europe European Directorate for the Quality of Medicines. European Pharmacopoeia. , 241(2010).
  21. Likens, S. T., Nickerson, G. B. Detection of certain hop oil constituents in brewing products. Proc Ann Meet - Am Soc Brewing Chem. 22 (1), 5-13 (1964).
  22. Karimi, A., Gross, J. Development and validation of an innovative headspace collection technique: volatile organic compound patterns emitted by different developmental stages of Halyomorpha halys. Front Horti. 3, (2024).
  23. Koedam, A., Scheffer, J. J. C., Baerheim Svendsen, A. Comparison of isolation procedures for essential oils - II. Ajowan, Caraway, Coriander and Cumin. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung. 168 (2), 106-111 (1979).
  24. Abdulra'uf, L. B., Hammed, W. A., Tan, G. H. SPME fibers for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables: A review. Crit Rev Anal Chem. 42 (2), 152-161 (2012).
  25. Gross, J., Gallinger, J., Rid, M. Collection, identification, and statistical analysis of volatile organic compound patterns emitted by phytoplasma infected plants. Methods Mol Biol. 1875, 333-343 (2019).
  26. ISO. ISO 7609:1985 Essential Oils-Analysis by Gas Chromatography on Capillary Columns-General Method. ISO: Geneva, Switzerland. , (1985).
  27. Rubiolo, P., Sgorbini, B., Liberto, E., Cordero, C., Bicchi, C. Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review. Flav Fragr J. 25 (5), 282-290 (2010).
  28. Fielding, N. J., Evans, H. F. The pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) nickle (= B. lignicolus Mamiya and Kiyohara): An assessment of the current position. Forestry. 69 (1), 34-46 (1996).
  29. Faria, J. M. S., et al. First report on the synergistic interaction between essential oils against the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. Plants. 12 (13), 2438(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Choroba uwiądu sosnykokultura in vitroinfekcja in vivoPinus pinasterekstrakcja substancji lotnychhydrodestylacjamikroekstrakcja w fazie stałejtechniki analizy nadlotkiizolacja nicieni
Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.