Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67160

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Streszczenie

Komórki chondroprogenitorowe (CPC), ostatnio zidentyfikowane jako odrębna subpopulacja, wykazują obiecujące cechy ze względu na swoje właściwości mezenchymalne, zwiększoną chondrogenezę i ograniczone cechy przerostowe. Wzbogacenie komórek progenitorowych uzyskuje się poprzez różnicową adhezję fibronektyny i testy eksplantatywne oparte na migracji, przy czym chondroprogenitory pochodzące z testu adhezji fibronektyny (FAA-CP) i chondroprogenitory migracyjne (MCP) wykazują większy potencjał w porównaniu z chondrocytami. W tym artykule zagłębiamy się w szczegóły izolowania komórek pochodzących z chrząstki rezydentnej, a mianowicie chondrocytów i chondroprogenitorów. Podczas gdy cenne spostrzeżenia z badań nad chondrocytami przyczyniają się do naszego zrozumienia naprawy chrząstki, ciągłe wysiłki są ukierunkowane na wykorzystanie chondroprogenitorów i zbadanie ich potencjału jako alternatywnego podejścia terapeutycznego. Ponadto ten artykuł metodologiczny zawiera szczegółowy protokół krok po kroku izolowania trzech określonych typów komórek z chrząstki: chondrocytów, FAA-CP i MCP. Postępując zgodnie ze znormalizowanymi procedurami, protokół ten ułatwia pomyślną ekstrakcję tych podtypów komórek. Opierając się na szeroko zakrojonych badaniach, artykuł koncentruje się na skomplikowanych technikach stosowanych do izolowania różnych podzbiorów i zoptymalizowanych warunków hodowli wymaganych do ekspansji i utrzymania ich kultur. Metodologia obejmuje enzymatyczną izolację chondrocytów pochodzących z ludzkiej chrząstki stawowej, różnicową adhezję fibronektyny po sekwencyjnym trawieniu enzymatycznym oraz testy eksplantatywne oparte na migracji w celu uzyskania komórek rezydujących w chrząstce.

Wprowadzenie

Pojawienie się terapii regeneracyjnej opartej na komórkach stanowi znaczące podejście do leczenia dolegliwości związanych z chrząstkami, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) i wady chrzęstne1. Zaburzenia te, charakteryzujące się rozpadem lub uszkodzeniem chrząstki w stawach, stanowią poważne wyzwanie podczas leczenia. Samonaprawa chrząstki stawowej jest ograniczona ze względu na jej architekturę tętniaka, unaczynienie i niską aktywność mitotyczną2.

Najczęściej wykorzystywanymi komórkami do regeneracji tkanki chrzęstnej są Mezenchymalne Komórki Macierzyste (MSC) i chondrocyty3. Jednak kilka badań wykazało ograniczenia w używaniu tych komórek do regeneracji4. Ograniczenia te obejmują końcowe różnicowanie chondrocytów podczas przedłużonej ekspansji in vitro w celu osiągnięcia wymaganej liczby komórek oraz skłonność do przerostu MSC. Czynniki te mogą prowadzić do powstania tkanki naprawczej z nieoptymalną kombinacją chrząstki włóknistej i szklistej 5,6,7,8.

Odkrycie komórek chondroprogenitorowych (CPC) powstało w wyniku poszukiwania alternatywnych komórek w chrząstce stawowej9. Wzbudziły one ogromne zainteresowanie ze względu na ich podobieństwo do MSCs i ich doskonały potencjał chondrogeniczny, a wszystko to przy jednoczesnym wykazywaniu zmniejszonej hipertrofii - niezbędnej kombinacji, poszukiwanej 10,11. W przeciwieństwie do chondrocytów, te populacje progenitorowe wykazują zwiększoną aktywność replikacyjną i telomerazy, a także zwiększoną ekspresję neurogennego białka homologicznego locus notch 1 (NOTCH-1) i czynnika transkrypcyjnego SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Istnieją dwie standardowe metody izolowania CPC zgłaszane zarówno z chrząstki, jak i łąkotki, w tym jedna oparta na ekspresji ich receptora integrynowego (CD49e/CD29), wyizolowana za pomocą testu adhezji fibronektyny - Chondroprogenitors pochodzące z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs), a druga oparta na ich zwiększonym potencjale migracyjnym z eksplantatów chrząstki - Migratory Chondroprogenitors (MCPs)11,13,16,17,18,19. Liczne badania in vitro wykazują chondrogenną wyższość i zmniejszoną przerost zarówno FAA-CPC, jak i MCP w porównaniu z chondrocytami i szpikiem kostnym (BM)-MSCs20,21,22,23.

Ostatnie badania in vitro porównujące FAA-CPC z MCP wykazały zwiększoną zdolność do regeneracji chrząstki u tej drugiej populacji przodków w normalnych warunkach tlenowych24. Te optymistyczne wyniki badań in vitro wskazują na regenerację podobną do szklistej rośliny, zachęcając do dalszych eksperymentów in vivo. Niemniej jednak doniesiono, że obie populacje CPC skutecznie naprawiają i regenerują chrząstkę w chorobie zwyrodnieniowej stawów i innych zaburzeniach chrzęstno-kostnych w modelach zwierzęcych25,26,27,28,29.

Nasze laboratorium aktywnie przyczyniło się do standaryzacji technik izolacji CPC i porównania ich cech fenotypowych z chondrocytami i MSC. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół wyjaśniający etapy związane z izolacją i hodowlą komórek rezydujących w chrząstce, a mianowicie chondrocytów, FAA-CPC i MCP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół został zatwierdzony i jest zgodny z odpowiednimi przepisami i wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (Komitetu ds. Badań i Etyki). Po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, ludzkie stawy piszczelowo-udowe są pobierane od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) (wynik radiologiczny Kellgrena-Lawrence'a 4)30, którzy wymagają całkowitej wymiany stawu kolanowego w ramach leczenia. Stawy pacjentów z jakimikolwiek objawami nowotworów, infekcji lub zapalnego zapalenia stawów (takich jak reumatoidalne zapalenie stawów lub dna moczanowa) zostały wykluczone z badania. Zapewnia się, że wszystkie procedury są przeprowadzane w sterylnych warunkach, zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi przez cały proces eksperymentalny.

1. Uzyskanie stawów piszczelowo-udowych

  1. Pozyskanie stawów kolanowych (stawów piszczelowo-udowych) od dawców ludzkich wymagających amputacji powyżej kolana w ramach leczenia lub od osób z chorobą zwyrodnieniową stawów IV stopnia30 (dowody radiologiczne wskazujące na znaczne zmniejszenie przestrzeni stawowej w przypadku stwardnienia chrzęstnego) poddanych całkowitej wymianie stawu kolanowego.
    UWAGA: Upewnij się, że uzyskano świadomą zgodę od pacjentów zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Zapewnienie przestrzegania zasad Komisji Etyki i Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.
  2. Wyklucz wszelkie stawy wykazujące objawy infekcji lub stanu zapalnego.

2. Przetwarzanie zebranych jointów

  1. Pobrane stawy piszczelowo-udowe umieścić w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w sterylnych warunkach.
  2. Przygotuj sterylny obszar pod maską, umieszczając sterylny podkład. Zebrane jointy przenieść na podkładkę.
  3. Ustabilizuj przecięte stawy piszczelowo-udowe, trzymając kość podchrzęstną z chrząstką skierowaną w górę.
  4. Za pomocą ostrza skalpela (nr 22) w ciągu 1-2 godzin od uzyskania stawu należy pobrać prostokątne wióry chrząstki z obszarów nieobciążających dla pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.
  5. Pobrać odcinki chrząstki o wymiarach 8 mm x 10 mm od warstwy powierzchownej do warstwy głębszej.
  6. Umyj plastry chrząstki 1x roztworem PBS i umieść je na szalce Petriego zawierającej 1-2 ml zwykłego podłoża DMEM.
  7. Zmiel ładnie plastry chrząstki do rozmiaru mniejszego niż 1 mm x 1 mm x 1 mm za pomocą ostrza skalpela (nr 22).
    UWAGA: Upewnij się, że plastry chrząstki lub mielona chrząstka nie wysychają; umieścić je w pożywce hodowlanej lub PBS pozbawionym surowicy.

3. Izolacja chondrocytów

  1. Umieść zmieloną chrząstkę w pionowej kolbie T-25 zawierającej 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle F12 (DMEM-F12) firmy Dulbecco z 0,15% kolagenazą typu II do trawienia enzymatycznego. Pozostawić kolbę w spokoju przez 12-14 godzin w inkubatorze CO2 , zapewniając standardowe warunki hodowli31.
    UWAGA: Należy użyć zwykłej pożywki DMEM-F12 bez śladów surowicy, ponieważ surowica dezaktywuje działanie enzymatyczne.
  2. Po nocnym trawieniu przenieś pożywkę zawierającą uwolnione komórki do świeżej, sterylnej probówki wirówkowej zawierającej równą objętość DMEM-F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), używając sitka komórkowego do oddzielenia komórek od resztek. Uwolnione komórki to "chondrocyty".
  3. Odwirować przefiltrowane komórki z prędkością 1200 x g przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Otrzymany osad należy rozpuścić w 1 ml pożywki i policzyć uwolnione żywe komórki za pomocą testu wykluczającego błękit trypanowy.
  5. Załaduj chondrocyty do kolby T-25 o stężeniu 10 000 komórek/cm² i rozwiń do wymaganej liczby pasaży za pomocą DMEM-F12 zawierającego 10% FBS. Dodatkowe składniki w pożywce to kwas askorbinowy (62 μg/ml), L-glutamina (2,5 mM/l), penicylina-streptomycyna (100 j.m./ml) i amfoterycyna-B (2 μg/ml).
  6. Odświeżaj pożywkę co 3 dni i zbieraj komórki podczas konfluencji za pomocą 0,125% trypsyny zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).

4. Izolacja chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs)

  1. 12 godzin przed uwolnieniem chondrocytów przygotuj 10 ml 1x PBS zawierającego 1 mM MgCl2 (10 μL) i 1 mM CaCl2 (10 μL) oraz 100 μL Fibronektyny (10 μL/mL)32.
  2. Pokryj wymaganą liczbę dołków płytki 6-dołkowej (1,5 ml/9,3cm2) za pomocą przygotowanego roztworu.
  3. Szczelnie zamknij płytkę i wstaw do lodówki na noc w temperaturze 4 °C.
  4. Dodatkowo należy uzyskać wióry chrzęstne w sposób podobny do opisanego w przypadku izolacji chondrocytów (kroki 2.1-2.5).
  5. Poddaj wióry chrząstki sekwencyjnemu trawieniu enzymatycznemu przez noc (0,2% pronazy przez 3 godziny; a następnie 0,04% kolagenazy typu II przez 12 godzin) w wytrząsającej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C w celu uzyskania pojedynczych chondrocytów.
  6. Następnego dnia wyjmij z lodówki 6-dołkową płytkę pokrytą fibronektyną i usuń nadmiar Fibronectin.
    UWAGA: Nadmiar fibronektyny należy usuwać powoli i delikatnie, nie naruszając powłoki na dnie studzienki. Obecność MgCl2 (10 μL) i 1 mM CaCl2 ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia przyczepienia komórek.
  7. Dodaj 2-3 ml zwykłego podłoża DMEM-F12 do powlekanych studzienek.
  8. Uwolnione chondrocyty należy wysiać w powlekanych studzienkach o gęstości obciążenia 4000 komórek/studzienkę i pozostawić płytkę w spokoju na okres 20 minut.
  9. Po inkubacji usuń nadmiar pożywki i nieprzylegających komórek. Dodaj 2-3 ml standardowej pożywki wzrostowej używanej do chondrocytów (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Utrzymuj przylegające komórki w standardowych warunkach hodowli przez 10-12 dni, aby uzyskać klony CPC (kolonie >32 komórek).
  11. Izolować za pomocą 0,125% trypsyny-EDTA przez 180 s, ponownie platerować klony w stosunku 1 klon/5 cm² i rozszerzać wzbogacone poliklonalne CP do wymaganej konfluencji. Uzyskane komórki są określane jako "FAA-CPC".
  12. Hodowla komórek dalej w pożywce DMEM-F12 + 10% FBS + transformujący czynnik wzrostu beta 2 (TGFβ2: 1 ng / ml) + czynnik wzrostu fibroblastów (FGF2: 5 ng / ml).
    UWAGA: Inkubacja komórek na płytkach pokrytych fibronektyną nie powinna przekraczać 20 minut, ponieważ chondrocyty mogą również zacząć przylegać. Podczas 20-minutowego okresu adhezji podłoże musi być pozbawione surowicy. Następnie komórki, które przylegają do klonów, należy wyhodować w pożywce zawierającej dodatkowo FBS. Klony muszą być odizolowane tylko po upewnieniu się, że każdy klon ma więcej niż 32 komórki; Ma to na celu uniknięcie wzmacniaczy tranzytowych. Dalsza ekspansja klonów po trypsynizacji powinna obejmować dodatkowe wymienione czynniki wzrostu. Gęstość obciążenia 4000 chondrocytów/9,3cm2 płytki pokrytej fibronektyną, po 20-minutowej inkubacji, po której następuje płukanie, powoduje adhezję łącznie 80-100 komórek. Spośród nich około 20 klonów będzie rosło i osiągnie podwojenie populacji o 5 w ciągu 10-12 dni.

5. Izolacja migrujących chondroprogenitorów

  1. Ogolić eksplantaty chrząstki (10 mm x 5 mm x 1 mm ) z pobranego stawu stawowego i umieścić je na sterylnej 6-dołkowej płytce zawierającej pożywkę DMEM-F12 z 10% FBS i 10 mM Glutamax (2-3 eksplantaty/studzienkę)33.
  2. Pozostawić płytkę z eksplantatami w spokoju przez 48 godzin w inkubatorze CO2 utrzymywanym w temperaturze 37 °C.
  3. Po 2 dniach przenieś eksplantaty do probówki wirówkowej zawierającej 10 ml 0,1% roztworu kolagenazy w celu trawienia enzymatycznego. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 2 h.
    UWAGA: Eksplantaty należy przepłukać 1x PBS przed trawieniem enzymatycznym, ponieważ śladowe ilości surowicy mogą dezaktywować działanie enzymu. Do mycia zanurz eksplantaty na szalce Petriego wypełnionej 2-3 ml 1x PBS; Ma to również na celu zapewnienie braku zanieczyszczenia uwolnionymi chondrocytami. Obchodzenie się z eksplantatami musi być ograniczone do minimum, a to ma na celu uniknięcie stresu u przodków, którzy rozpoczęli migrację.
  4. Po strawieniu przepłucz eksplantaty 1x PBS i umieść je z powrotem w tych samych dołkach płytki zawierającej świeże pożywki DMEM-F12 z 10% FBS i 10 mM pożywki Glutamax.
  5. Utrzymywać płytkę w standardowych warunkach hodowli w inkubatorze. Obserwuj migrację chondroprogenitorów w kolejnych dniach.
  6. Po osiągnięciu sub konfluencji zbierz MCP, używając 0,125% trypsyny zawierającej EDTA.
  7. Rozbuduj MCP za pomocą standardowego podłoża rozszerzalnego, które zawiera DMEM-F12, który zawiera 10% FBS i 10 mM Glutamaxu.

6. Charakterystyka fenotypowa chondrocytów, FAA-CP i MCP

  1. Analiza cytometryczna przepływowa (FACS)
    UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w przypadku analizy FACS zebranych grup komórek.
    1. Trypsynizować komórki zgodnie ze standardowym protokołem przy użyciu 0,125% trypsyny i odwirować przy 1200 x g, 5 min, temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
    2. Wyrzuć supernatant, umyj i ponownie zawieś osad za pomocą 1x PBS.
    3. Przenieść zawiesinę do oznaczonych probówek dla FACS.
    4. Podzielić zawiesinę równo na dwie probówki: "niebarwioną" probówkę, która działa jako kontrola (zawiesina komórek bez przeciwciała) i "barwione" probówki, które działają jako testy (zawiesina komórek z przeciwciałem).
    5. Postępuj zgodnie z kartą danych technicznych poszczególnych przeciwciał/markerów klastra różnicowania (CD) do barwienia. Przeciwciała do porównania obejmują CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (dodatnie markery ekspresji); CD34-PE, CD45-FITC i CD14-FITC (markery wyrażeń ujemnych)34,35; CD166-BB515 i CD146-PE (potencjalne markery chondrogenne)36,37.
      UWAGA: Markery CD są wrażliwe na światło. Aby upewnić się, że kroki są wykonywane w ciemności.
    6. Inkubować zawiesinę komórkową z przeciwciałem przez 30 minut w ciemności.
    7. Po barwieniu dodać 1 ml 1x PBS do probówek i odwirować w temperaturze 1200 x g, 5 min, w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.
    8. Odrzucić trzy czwarte supernatantu. Zawiesić osad w pozostałej zawartości sklarowanego osadu przez delikatne rozcieranie.
    9. Przejdź do analizy FACS.

7. qRT-PCR

UWAGA: analiza ekspresji genów qRT-PCR obejmuje ocenę kolagenu typu I (COL1A1), kolagenu typu X (COL10A1) i czynnika transkrypcyjnego związanego z Runt (RUNX2) dla ekspresji przerostowej oraz SOX-9, Aggrekanu (ACAN) i kolagenu typu II (COL2A1) dla chondrogenezy.

  1. Wyodrębnij RNA z grup komórkowych za pomocą dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Po ekstrakcji oceń stosunek A260/A280 i stężenie RNA.
  3. Wykorzystaj 280 ng wyekstrahowanego RNA do budowy komplementarnego DNA (cDNA).
  4. Rozpocznij qRT-PCR za pomocą Sybr Green, każda reakcja zawiera końcowe stężenie 7 ng cDNA na termocyklerze.
  5. Znormalizuj względną ekspresję mRNA każdego genu do referencyjnego genu porządkowego GAPDH (ΔCt).
  6. Oblicz względną ekspresję każdego genu za pomocą techniki 2-ΔΔCt, porównując wartość ΔCt każdego pojedynczego genu z wartością FAA-CP (ΔΔCt)37.

8. Różnicowanie wieloliniowe

UWAGA: Komercyjnie dostępne podłoża różnicujące indukują różnicowanie trójliniowe na linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne.

  1. W celu różnicowania adipogennego, komórki nasienne o gęstości obciążenia 1000 komórek/cm2 na płytce do hodowli komórkowej i hodowli przy użyciu pożywki do różnicowania adipogennego (zmiana pożywki - raz na 3 dni) do subkonfluencji 80% przez 3 tygodnie.
  2. W celu różnicowania osteogennego i chondrogennego postępuj zgodnie z 28-dniowym systemem hodowli granulek38.
  3. Odwirować 0,5 x 106 komórek przy 400 x g przez 12 minut w temperaturze 37 °C w celu utworzenia osadów i zainicjowania różnicowania za pomocą pożywki do różnicowania osteogennego i chondrogennego.
  4. Zamocuj, osadź i pokrój granulki w celu potwierdzenia barwienia (krok 9).

9. Barwienie potwierdzające

  1. W przypadku komórek linii adipogennej utrwal komórki buforowaną formaliną, przemyj i wybarwij czerwienią olejową O (0,5%). Wybarwić również kontrole (hodowane na standardowym podłożu DMEM z 10% FBS).
  2. Obserwuj pod mikroskopem i uzyskaj obrazy.
  3. W przypadku zróżnicowanych komórek linii osteogennej zabarwić czerwienią alizarynową (2%).
    UWAGA: Dla chondrogennych komórek zróżnicowanych stosuje się wiele protokołów barwienia potwierdzającego.
  4. Barwienie Alcian Blue: Zabarwić utrwalone komórki błękitem Alcian przez 5 minut i przeciwbarwić neutralną czerwienią.
  5. W celu oceny zawartości glikozaminoglikanu (GAG) należy wykonać barwienie Safraniną O: Wybarwić szkiełka żelazną hematoksyliną Wiegerta, a następnie inkubować z kwaśnym alkoholem (1%), szybkim zielonym roztworem (0,05%), kwasem octowym (1%) i roztworem Safraniny O (1%).
  6. Barwienie błękitem toluidyny: Barwić szkiełka błękitem toluidynowym (0,1%) przez 5 minut.
  7. Barwienie PicroSirius Red: Zabarwić szkiełka barwnikiem Picrosirius Red (0,1%) i przeciwbarwić barwnikiem Hematoxyliny.
    UWAGA: Po zabarwieniu odwodnić szkiełka za pomocą stopniowanego alkoholu i oczyścić za pomocą ksylenu. Zamontuj szkiełka za pomocą mocowania Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX), obserwuj je pod mikroskopem i uzyskuj obrazy.
  8. W celu barwienia immunohistochemicznego (kolagen typu II) chondrogennego zróżnicowanego osadu, należy poddać skrawki osadu enzymatycznemu pobraniu antygenu przy użyciu enzymów pronazy (1 mg / ml) i hialuronidazy (2,5 mg / ml).
  9. Inkubować skrawki z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-kolagenowym typu II, a następnie drugorzędowym przeciwciałem anty-mysim znakowanym 1:250 HRP.
  10. Zabarwić szkiełka chromogenem 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) i przeciwbarwić je za pomocą Hematoksyliny.
  11. Obserwuj pod mikroskopem i rób obrazy.

10. Określanie zawartości GAG/DNA

  1. Trawić zróżnicowane chondrogenne osady przy użyciu roztworu papainy i cysteiny w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.
  2. Oszacuj stężenie DNA za pomocą odczynnika Picrogreen38 i uzyskaj intensywność fluorescencji na długościach fal - wzbudzenie: 480 nm, emisja: 520 nm za pomocą czytnika płytek ELISA.
  3. Oceń całkowitą zawartość GAG za pomocą metody barwnika błękitu dimetylometylenowego38.
  4. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 525 nm za pomocą czytnika płytek ELISA.
  5. Znormalizuj wartości GAG do wartości DNA i oblicz całkowity stosunek GAG/DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z 86,9 mg plasterków chrząstki uzyskano 1,72 x 105 komórek chondrocytów. Po wysianiu chondrocyty szybko przylegają, wykazując początkowo zaokrąglony wygląd przypominający bruk, a następnie przechodzą w stan fibroblastyczny w miarę dalszej ekspansji (Rysunek 1 A,B). Wysianie tych chondrocytów na płytki z fibronektyną zazwyczaj skutkuje 2% adhezją, przy czym każda komórka ulega wzrostowi klonalnemu (Rysunek 2 C,D), osią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Potencjalna regeneracja chrząstki stawowej, zawierającej tkankę szklistą, może być osiągnięta poprzez optymalizację jej dwóch natywnych typów komórek: chondrocytów i chondroprogenitorów. Podczas gdy szeroko zakrojone badania nad chondrocytami dostarczyły cennych informacji na temat ich roli w naprawie chrząstki, pytania o naturę zregenerowanej tkanki skłoniły do podjęcia wysiłków na rzecz poprawy ich fenotypu i zbadania alternatywnych terapii3. Chondroprogenitory, zidentyfikowane jako stosunkowo n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Pani Bhavini Krishnan i Pani Merin Mary Zachariah za ich wkład intelektualny oraz Centrum Badań nad Komórkami Macierzystymi (jednostka inStem Bengaluru), Wydziałowi Fizjologii, Chrześcijańskiemu Kolegium Medycznemu, Vellore, za wsparcie infrastrukturalne. Trwające projekty są wspierane przez Departament Biotechnologii (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Rząd Indii, Radę Badań Naukowych i Inżynieryjnych (CRG/2022/004277), Rząd Indii oraz Granty na Badania Płynów, Christian Medical College, Vellore.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ostrze 22-skalpelowe SZKLANA VAN
płytka 6-dołkowa CORNING3516
Alcian BlueTHERMO SCIENTIFICJ6012
Alizarin Czerwony SIGMA130223
Amfoterycyna-B (2 μ g/ml).GIBCO15240062
Kwas askorbinowy (62 μ g/mL)SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX cytometr przepływowy Oprogramowanie BECKMANCOULTER CYTExpert Wersja 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH  C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE
CD106-APCBD BIOSCIENCE
CD14-FITCBD BIOSCIENCE
CD29-APCBD BIOSCIENCE
CD34-PEBD BIOSCIENCE
348057 CD45-FITCBD BIOSCIENCE
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC  MACS 130/100337
CD49E-PEBD BIOSCIENCE
CD73-PEBD BIOSCIENCE
CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Licznik komórekDE NOVIXCell Drop BF
Sitko do komórekHIMEDIATCP024
WirówkaBECKMAN COULTERAllegra X-30R
Inkubator CO2 THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Kolagen typu X (COL10A1), czynnik transkrypcyjny związany z runt (RUNX2), czynnik transkrypcyjny SRY-Box 9 (SOX-9), agrekan (ACAN) i kolagen typu II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIA
Kolagenaza typu IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
CZYTNIK PŁYTEK ELISAMOLEKULARNECzytnik SpectraMax i3x
Fast GreenFISHER SIENTIFIC2353459
Płodowa surowica bydlęcaGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronektyna (10 &mikro; L/mL)SIGMA ALDRICHF1141
System syntezy pierwszej niciTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
HematoxylinQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Olej czerwony OSIGMA1320065
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)GIBCO10010023
termocykler PCR Termocykler APPLIED BIOSYSTEMSQuantstudio 12K Flex 
Penicylina-streptomycyna (100 j.m./ml)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Przeciwciało pierwszorzędowe (mysi kolagen typu II)DSHBDSHB II II6B3
PronaseROCHE10165913103
Quant-iT Odczynnik do badania DSNATHERMO SCIENTIFICP7589
LodówkaELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranin OQUALIGENSQ39962
Przeciwciało wtórne (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, koniugat HRP)THERMO SCIENTIFIC31430
Kąpiel wodna REMI
StemPro Kolba GIBCO1007201, A1007001 i A1007101
T-25 CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Niebieski EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Kultura tkankowa PetridishTARSONS960010
Błękit toluidynowyQUALIGENS2040
Błękit tryfanowy GIBCO15250061
Trypsyna EDTAGIBCO25200072
561443 551147 555397 559883 347463 555617 550257 URZĄDZENIA Zestawy wyróżniające

Bibliografia

  1. Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials. J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).
  2. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. The basic science of articular cartilage. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  3. Brittberg, M. Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review. Annals of Joint. 3 (0), (2018).
  4. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  5. Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC. Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).
  6. Fernandez-Moure, J. S., et al. Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis. Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).
  7. Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review. J Orthop Surg Res. 12, 39(2017).
  8. Zha, K., et al. Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application. NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).
  9. Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).
  10. Dowthwaite, G. P., et al. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population. J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).
  11. Williams, R., et al. Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PloS One. 5 (10), e13246(2010).
  12. Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. Cartilage. , (2020).
  13. Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential. Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).
  14. Fellows, C. R., et al. Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence. Sci Rep. 7, 41421(2017).
  15. Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage. Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).
  16. Korpershoek, J. V., et al. Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering. Int J Mol Sci. 22 (16), 8614(2021).
  17. Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966(2022).
  18. Koelling, S., et al. Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis. Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).
  19. Seol, D., et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury. Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).
  20. Xue, K., et al. Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue. Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).
  21. McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse. Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).
  22. Elsaesser, A. F., et al. Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies. Cell & Biosci. 6, 11(2016).
  23. Batschkus, S., et al. Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry. Ann Anat. 212, 4-10 (2017).
  24. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11, 23685(2021).
  25. Vinod, E., et al. Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model. J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).
  26. Xue, K., et al. Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering. J Trans Med. 17 (1), 104(2019).
  27. Carluccio, S., et al. Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies. Cells. 9 (4), E1052(2020).
  28. Wang, R., et al. Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93(2020).
  29. Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds. Cells. 10 (12), 3536(2021).
  30. Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. Radiological assessment of osteo-arthrosis. Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).
  31. Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy. Acta Histochem. 122 (6), 151588(2020).
  32. Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage. Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).
  33. Vinod, E., et al. Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage. Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. Cartilage. , (2017).
  36. Dicks, A., et al. Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66(2020).
  37. Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. Cartilage. , (2021).
  38. Vinod, E., et al. Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors. Sci Rep. 11 (1), 23685(2021).
  39. Vinod, E., et al. Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells. PloS One. 18 (4), e0285106(2023).
  40. Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage. Arthritis Res Ther. 15 (5), R119(2013).
  41. Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration. Acta Histochem. 123 (4), 151713(2021).
  42. Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models. J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja chondrocytówkomórki chondroprogenitoroweeksplant chrząstkitrawienie enzymatycznechrząstka stawowahodowla komórkowawłaściwości mezenchymalnetrypsyna EDTA
Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.