Artykuł metodologiczny

Wizualizacja odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach Purkiniego za pomocą kultur organotypowych móżdżku

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 grudnia 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) są szczególnie wrażliwe na braki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Przedstawiono protokół do wizualnej oceny dynamiki odpowiedzi PC na uszkodzenie DNA, która polega na barwieniu łańcuchów poli(ADP-rybozy) związanych z białkami w kulturach organotypowych móżdżku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki Purkinjego móżdżku (PC) wykazują unikalne połączenie wysokiego tempa metabolizmu, specyficznej architektury chromatyny i rozległej aktywności transkrypcyjnej, co czyni je szczególnie podatnymi na uszkodzenia DNA. Wymaga to skutecznej odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR), aby zapobiec zwyrodnieniu móżdżku, często inicjowanym przez dysfunkcję lub utratę komputera. Godnym uwagi przykładem jest zespół niestabilności genomu, ataksja-teleangiektazja (A-T), charakteryzujący się postępującym wyczerpaniem PC i pogorszeniem stanu móżdżku. Badanie mechanizmów DDR w komputerach PC ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia szlaków prowadzących do ich degeneracji w takich zaburzeniach. Jednak złożoność izolowania i hodowli PC in vitro od dawna utrudnia wysiłki badawcze. Mysie hodowle organotypowe (plasterkowe) móżdżku stanowią realną alternatywę, ściśle naśladującą środowisko tkankowe in vivo. Jednak model ten jest ograniczony do wskaźników DDR podatnych na obrazowanie mikroskopowe. Udoskonaliliśmy protokół hodowli organotypowej, wykazując, że obrazowanie fluorescencyjne łańcuchów poli(ADP-rybozy) (PAR) związanych z białkami, szybki i wczesny wskaźnik DDR, skutecznie ujawnia dynamikę DDR w PC w tych kulturach w odpowiedzi na stres genotoksyczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integralność komórkowego DNA jest stale zagrożona przez czynniki uszkadzające DNA, głównie produkty uboczne przemiany materii, takie jak reaktywne formy tlenu, które powodują dziesiątki tysięcy uszkodzeń DNA na komórkę dziennie1. Stałe utrzymanie stabilności genomu jest niezbędne dla homeostazy komórkowej2,3. Kamieniem węgielnym tego utrzymania jest odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) - skomplikowana, warstwowa sieć sygnalizacyjna, która inicjuje określone szlaki naprawy DNA, jednocześnie starannie dostosowując wiele innych procesów komórkowych4,5. Deficyty w DDR są często objawiane jako "zespoły niestabilności genomu", charakteryzujące się niestabilnością chromosomalną, postępującym niszczeniem tkanek, upośledzonym wzrostem lub rozwojem, predyspozycją do raka i zwiększoną wrażliwością na określone czynniki uszkadzające DNA6,7,8,9. Warto zauważyć, że neurodegeneracja, która często obejmuje atrofię móżdżku, jest charakterystyczną cechą wielu zespołów niestabilności genomu7,10,11,12.

Autosomalne zaburzenie recesywne, ataksja-teleangiektazja (A-T), jest dobrze udokumentowanym przykładem zaburzenia niestabilności genomu13,14,15. Ten stan wynika z mutacji zerowych w genie ATM (A-T, zmutowanym), odpowiedzialnym za kodowanie kluczowej kinazy białkowej, ATM, która jest znana przede wszystkim jako mobilizator DDR w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB)16,17. A-T objawia się jako zaburzenie wieloukładowe, charakteryzujące się głównie postępującym zwyrodnieniem móżdżku, prowadzącym do ostrych zaburzeń motorycznych, niedoboru odporności, atrofii gonad, predyspozycji do raka i ekstremalnej wrażliwości na promieniowanie jonizujące. Hodowane komórki od osób z A-T wykazują niestabilność chromosomalną i zwiększoną wrażliwość na czynniki genotoksyczne, zwłaszcza te powodujące DSBs15,18,19. Co ważne, ATM odgrywa również rolę w naprawie innych uszkodzeń DNA, co podkreśla jego szerokie znaczenie w utrzymaniu stabilności genomu20,21,22.

Pomimo wnikliwych badań nad licznymi rolami ATM, specyficzny mechanizm prowadzący do zwyrodnienia móżdżku w A-T pozostaje tematem aktywnej dyskusji, z różnymi modelami proponowanymi w celu wyjaśnienia tego procesu23,24,25,26,27,28,29,30. Nasz model28 sugeruje, że zwyrodnienie móżdżku u pacjentów z A-T zaczyna się od dysfunkcji i ostatecznej utraty komórek Purkinjego (PC). Biorąc pod uwagę kluczową rolę ATM w zachowaniu stabilności genomu w obliczu trwających uszkodzeń DNA, komputery PC są szczególnie podatne na brak ATM. Przypisujemy tę podatność połączeniu ich wysokiej aktywności metabolicznej, charakterystycznej struktury chromatyny i rozległej aktywności transkrypcyjnej. Ostatecznie sugeruje się, że utrata funkcji PC, a co za tym idzie, ich degeneracja, jest spowodowana stochastyczną, funkcjonalną inaktywacją genów, konsekwencją wytwarzania wadliwych transkryptów28.

Badanie biologii PC w laboratorium jest utrudnione przez wyzwania związane z hodowlą izolowanych PC, ponieważ te komórki w dużym stopniu polegają na swoim naturalnym środowisku i sąsiednich komórkach do przetrwania i funkcjonowania, co czyni je niekompatybilnymi z dysocjacyjnym wzrostem kultur. Niemniej jednak PC mogą pozostać żywotne przez dłuższy czas w kulturach warstwowych tkanek. Hodowle organotypowe móżdżku, które są wycinkami tkanek zwykle pochodzącymi z móżdżki gryzonia, utrzymują organizację strukturalną tkanki i wspierają różne manipulacje eksperymentalne analogiczne do tych, które są możliwe w przypadku hodowanych komórek. Dlatego te kultury pozwalają na badania móżdżku w kontrolowanym otoczeniu31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, 41,42,43. W szczególności, w kontekście A-T, organotypowe hodowle móżdżku myszy okazały się pomocne w badaniu DDR u komputerów PC z niedoborem Atm40,41,42,43. Podczas gdy myszy z niedoborem Atm wykazują tylko subtelny fenotyp móżdżku44,45,46,47, prawdopodobnie z powodu różnic między fizjologią móżdżku człowieka i myszy, zakłada się, że role ATM są w dużej mierze zachowane u tych gatunków. Pogląd ten jest wspierany przez nasze obserwacje, że niedostateczna odpowiedź na DSB DNA w mysich komputerach PC Atm-/- jest zgodna z tą obserwowaną u innych typów komórek z niedoborem ATM i ATM oraz ludzkich40,41,42,43.

Ograniczeniem w analizowaniu reakcji PC na różne bodźce lub stresy w kulturach organotypowych jest konieczność polegania na obrazowaniu mikroskopowym przy odczytach. DDR jest zwykle badany przy użyciu masowych odczytów biochemicznych, chociaż wykorzystuje się również powszechne markery immunofluorescencyjne, takie jak śledzenie dynamiki powstawania i rozdzielczości ognisk jądrowych fosforylowanego histonu H2AX (γH2AX) i białka 53BP1, które są uważane za wskaźniki DSBs48,49. Szerszą miarą jest obrazowanie fluorescencyjne tworzenia łańcuchów poli(ADP-rybozy) (PAR) na białkach, szybka i silna wczesna reakcja na uszkodzenie DNA, szczególnie na pęknięcia nici7,50. Zmodyfikowaliśmy protokół Komulainen et al.51 do barwienia PAR w kulturach organotypowych móżdżku. Zaobserwowaliśmy wyraźną odpowiedź PAR w dużych jądrach PC. Przedstawiono tutaj nasz wyrafinowany protokół tworzenia mysich kultur organotypowych móżdżku i wizualizacji odpowiedzi PAR w stresie genotoksycznym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat materiałów, sprzętu i przeciwciał. Procedury na zwierzętach zostały zastosowane zgodnie z wytycznymi etycznymi Komisji Etyki Uniwersytetu w Tel Awiwie po zatwierdzeniu. Zabieg przeprowadza się na 10-dniowych szczeniętach myszy, niezależnie od ich płci. W razie potrzeby genotypowanie wykonuje się poprzedniego dnia przy użyciu biopsji ogona i standardowych metod. Roztwory są sterylne i przechowywane w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej; patrz tabela 1.

1. Przygotowanie kultur

UWAGA: Przeprowadź procedurę w sterylnym środowisku i zdezynfekuj powierzchnię roboczą wcześniej, używając 70% etanolu.

  1. Dodaj 1 ml BME do każdego dołka na płytkach 6-dołkowych. Za pomocą sterylnych kleszczyków umieścić pojedynczą wkładkę do hodowli komórkowej w każdym dołku i inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez co najmniej 2 godziny przed procedurą preparacji.
  2. Ustaw obszar preparacyjny w kapturze biologicznym, zawierający rozdrabniacz tkanek, płytki hodowlane 30 mm, mikroskop dwuokularowy i źródło światła.
  3. Zanurz narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu podczas całego procesu. Użyj kubka na mocz wypełnionego 70% etanolem do zanurzenia i oddzielnego kubka na mocz z 1x PBS, aby zmyć etanol przed użyciem.
  4. Do każdej sekcji (tj. dla każdego móżdżku) przygotuj dwie 30-milimetrowe płytki hodowlane wypełnione zimnym podłożem preparacyjnym i pozostaw je na lodzie.
  5. Spryskaj zwierzę 70% etanolem.
  6. Za pomocą ostrych nożyczek szybko odetnij głowę zwierzęciu. Aby odsłonić mózg, wykonaj małe nacięcie nożyczkami z dala od móżdżku. Za pomocą pęsety z zaokrąglonymi końcami delikatnie oderwij czaszkę. Usuń czaszkę na małe kawałki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki móżdżku.
  7. Natychmiast przenieś mózg do zimnego podłoża preparacyjnego lub bezpośrednio usuń móżdżek z wnętrza czaszki. Aby to zrobić, odsłoń móżdżek i oddziel korę móżdżku od pnia mózgu, odłączając trzy pary szypułek za pomocą cienkiej zakrzywionej szpatułki tęczówki. Aby zidentyfikować szypułki, spójrz od rostralnego do ogonowego: sparowane szypułki móżdżku górnego łączą śródmózgowie z każdą stroną móżdżku; Sparowane środkowe szypułki móżdżku łączą most z każdą stroną móżdżku; a sparowane dolne szypułki móżdżku łączą się z rdzeniem po obu stronach móżdżku. Gdy móżdżek jest widoczny, oddziel go od mózgu za pomocą tej samej szpatułki: wsuń szpatułkę między móżdżek, górny wzgórek i pień mózgu.
    UWAGA: Nie podejmuj specjalnego wysiłku, aby usunąć opony mózgowe, ponieważ łatwo odklejają się one po przecięciu móżdżku.
  8. Ustaw rozdrabniacz do tkanek na grubość plastra 350 μm.
  9. Przed umieszczeniem móżdżku na podstawie siekacza należy usunąć nadmiar buforu preparacyjnego z tkanki. Poprawi to przyczepność tkanki do podstawy siekacza.
  10. Umieść móżdżek na platformie tnącej w orientacji pionowej i przeprowadź krojenie przystrzałkowe o grubości plastra 350 μm. Delikatnie oddziel plastry za pomocą cienkiej szpatułki do tęczówki i włóż je do zimnego podłoża preparacyjnego.
  11. Przenieś pokrojoną tkankę z powrotem do świeżego zimnego buforu do preparacji. Użyj końcówki o pojemności 1 000 μl, aby delikatnie wprowadzić plastry tkanki do naczynia zawierającego zimny bufor do preparacji.
  12. Pod lornetką użyj dwóch zakrzywionych szpatułek tęczówki, aby ostrożnie oddzielić plastry tkanki od siebie. W przypadku kultur należy używać plastrów pochodzących z robaka móżdżku znajdującego się w przyśrodkowej strefie korowo-jądrowej narządu.
  13. Przenieść każdy wycinek tkanki na wkładkę hodowlaną za pomocą szerokiej szpatułki i przenieść każdą wkładkę z wycinkiem tkanki do dołka w 6-dołkowych płytkach zawierających wstępnie podgrzane podłoże. Pozostaw płytki w inkubatorze.
  14. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień: odessać zużytą pożywkę za pomocą sterylnej szklanej pipety, a następnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać 1 ml świeżej pożywki tak, aby końcówka pipety opierała się o ścianę studzienki. Upewnij się, że nie kierujesz strumienia pożywki na tkankę.
    UWAGA: Wycinek tkanki będzie wykazywał wygląd podobny do stanu zapalnego przez pierwsze 5-7 dni w hodowli i będzie gotowy do eksperymentów, gdy tylko zjawisko to zniknie i do 2 tygodni po założeniu hodowli.

2. Leczenie czynnikami uszkadzającymi DNA, fiksacja, barwienie i obrazowanie mikroskopowe

  1. Dodawać substancje chemiczne uszkadzające DNA bezpośrednio do pożywki hodowlanej w odpowiednich stężeniach końcowych, przez określony czas. Po okresie ekspozycji usuń chemikalia, zastępując pożywkę świeżą pożywką hodowlaną.
  2. Jeżeli odczyt DDR obejmuje barwienie PAR, dodać inhibitor glikohydrolazy poli(ADP-rybozy) (PARG) do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 10 μM, 30 minut przed utrwaleniem.
    UWAGA: Zabieg ten ma kluczowe znaczenie, ponieważ modyfikacja PAR jest krótkotrwała i stale degradowana przez PARG.
  3. Bezpośrednio przed utrwaleniem należy odessać pożywkę i zastąpić ją 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego o temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zimny bufor może spowodować oderwanie się plastrów tkanki od wkładki.
  4. Natychmiast utrwalić plastry, zastępując bufor wstępnie schłodzoną (-20 °C) mieszanką acetonu i metanolu (1:1) tak, aby plasterek tkanki był zanurzony w tej mieszance i pozostawić na 20 minut w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Możliwe jest zatrzymanie się na tym etapie i późniejsze przystąpienie do barwienia immunologicznego. W tym celu należy przemyć chusteczki 3x 0,1 M buforem fosforanowym wstępnie schłodzonym do 4 °C, upewniając się, że tkanka jest zanurzona w buforze. Tkanki mogą być teraz przechowywane w 0,1 M buforze fosforanowym do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieś plasterek tkanki do dołka na 48-dołkowej płytce.
  6. Użyj skalpela i deski do krojenia, aby usunąć marginesy wkładki, przecinając plasterek tkanki. Umieść każdą kromkę w dołku na 48-dołkowej płytce. Dodać 100 μl 0,1 M buforu fosforanowego.
  7. W celu przepuszczalności odessać bufor, dodać do studzienki 100 μl 0,1 M buforu fosforanowego zawierającego 1% Triton X-100 i pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać roztwór i dodać 100 μl roztworu blokującego (patrz tabela 1) do studzienki. Wstrząsaj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  9. Na etapie blokowania rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe lub odczynnik anty-PAR (1:800) w roztworze blokującym.
  10. Usuń roztwór blokujący (nie ma potrzeby mycia) i dodaj 100 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Stosować delikatne wstrząsanie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  11. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 0,1 M buforze fosforanowym zawierającym 0,2% Triton X-100 (1:500), minimalizując ich ekspozycję na światło.
  12. Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć plastry 3 x 5 min 0,1 M buforem fosforanowym zawierającym 0,2% Triton X-100, w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  13. Zastąp roztwór płuczący 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (rozcieńczenie 1:500). Kontynuuj delikatne wstrząsanie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności (przykryj talerze folią aluminiową).
  14. Aby przygotować roztwór DAPI, rozcieńczyć roztwór podstawowy (2 mg/ml) do 1 μg/ml w 1x PBS.
  15. Dwadzieścia minut przed końcem 2-godzinnej inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym dodać 20 μl końcowego roztworu DAPI do każdej studzienki i kontynuować wstrząsanie przez 20 minut. Odessać płyn i przemywać roztworem do przemywania przez 3 x 5 minut, delikatnie wstrząsając.
  16. Do montażu umieść chusteczkę na szkiełku mikroskopowym chusteczką skierowaną do góry, dodaj podłoże montażowe i przykryj szkłem nakrywkowym. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia przez noc w ciemności, w temperaturze pokojowej (unikaj używania podłoża montażowego zawierającego DAPI, aby zapobiec rozmyciu).
  17. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w pudełku odpornym na światło.
  18. Uchwyć obrazy mikroskopowe za pomocą mikroskopu konfokalnego i odpowiednich filtrów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje ogólny wygląd kultur organotypowych móżdżku. Górny wiersz w Rysunek 1A pokazuje foliację móżdżku, która jest utrzymywana w hodowli, podczas gdy dolny rząd pokazuje PC wybarwione dla Calbindin D-28k (zielony) i jądra neuronalne wybarwione dla NeuN (czerwony). W Rysunek 1B, astrocyty w PC (czerwone) są barwione na GFAP (zielony), pośrednie białko filamentu typu III. Rysunek 2 i Rysunek 3 pokazują barwienie PAR obserwowane po potraktowaniu tych kultur dwoma czynnikami uszkadzającymi DNA, z których oba są silnymi utleniaczami: bromianem potasu (końcowe stężenie 10 mM przez 12 godzin) i parakwatem. Odpowiedź PAR była zaznaczona w leczonych PC w błonie móżdżku w porównaniu z kontrolą.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd kultur organotypowych móżdżku myszy. (A) Górny rząd ilustruje foliację móżdżku, która jest utrzymywana w kulturze. Dolny rząd skupia się na warstwie PC. Komputery PC są wyróżnione przez Calbindin D-28k (zielony). Barwienie NeuN (czerwone) identyfikuje jądra neuronalne w różnych warstwach. (B) Bliższe spojrzenie na komputery PC (czerwony). GFAP (zielony), białko pośrednie typu III, które podkreśla astrocyty. Podziałka = 968,8 μm (A, górny rząd), 42,1 μm (A, drugi rząd), 72,7 μm (B, górny rząd), 18,2 μm (B, drugi rząd). Skróty: PC = komórki Purkinjego; GFAP = kwaśne białko fibrylarne glejowe; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Barwienie PAR w plastrze móżdżku potraktowanym bromianem potasu. Wycinek móżdżku traktowano bromianem potasu (KBrO3) - silnym utleniaczem, w końcowym stężeniu 10 mM przez 12 godzin. Podziałka = 775 μm. Skróty: PAR = poli(ADP-ryboza); DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Odpowiedź PAR w warstwach móżdżku wystawionych na działanie parakwatu, silnego producenta anionów ponadtlenkowych. (A) Ogólny widok listowia móżdżku. Zwróć uwagę na solidną odpowiedź PAR, szczególnie w komputerach PC, w porównaniu z kontrolą. (B) Bliższe badanie pokazuje odpowiedź PAR w PC i innych typach komórek. Podziałka = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Skróty: PAR = poli(ADP-ryboza); DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Roztwory i
Rozwiązanie Składniki
Podłoże preparacyjneZrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) zawierający 0,5% D-glukozy. Dodaj 0,5 ml 50% roztworu D-glukozy do 50 ml HBSS bez Mg2+ i Ca2+.
Pożywka hodowlana BMEWymieszaj 100 ml Basal Medium Eagle (BME) zawierającego czerwień fenolową, ale nie L-glutaminę lub HEPES, z 50 ml HBSS z czerwienią fenolową, 50 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 2 ml 50% D-glukozy i 1 ml 200 ml L-glutaminy. Wymieszaj i przefiltruj przez filtr 0,22 μm w sterylnym środowisku. Przechowywać w temperaturze 4 °C
Roztwór blokujący do barwienia immunologicznegoin 0.1 M Bufor fosforanowy: dodaj 0.5% Triton X-100, 10% Kozia surowica
Drugorzędowy bufor do rozcieńczania przeciwciał 0.1 M bufor fosforanowy, 0.2%Triton X-100
Bufor mycia0.1 M bufor fosforanowy, 0.2%Triton X-100
Roztwór utrwalającyActenoe:metanol (1:1 v:v)
Roztwór przepuszczalności0.1 M bufor fosforanowy, 1%Triton X-100
Rozwiązanie DAPIRoztwór podstawowy (2 mg/ml) rozcieńczony do 1 μg/ml w 1x PBS
Bufor fosforanowyPrzygotuj dwie dusze A i B (patrz niżej). Mieszać roztwory zgodnie z proporcjami określonymi poniżej, aby uzyskać 0,2 M bufor fosforanowy. Następnie rozcieńczyć 0,2 M roztwór DDW (1:1), aby uzyskać 0,1 M bufor fosforanowy (roztwór roboczy).
roztwór A (dla 0,2 M)12 g bezwodnego fosforanu sodu jednozasadowego (Na2HPO4 FW 141.96)
500 ml DDW
Roztwór B (dla 0.2 M)14.2 g bezwodnego fosforanu sodu bezwodnego (Na2HPO4 FW 141.96)
500 ml DDW
Mieszane roztwory do uzyskania 0.2 MPrzygotuj 1 l: 230 ml roztworu A i 770 ml roztworu B
0.1 M bufor fosforanowy Rozcieńczyć zmieszany roztwór DDW (1:1)

Tabela 1: Rozwiązania i ich skład.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwagi ogólne
Główną zaletą systemu hodowli organotypowej jest to, że ułatwia badania z wykorzystaniem tkanki kory móżdżku, zachowując jej organizację strukturalną przez kilka tygodni w naczyniu hodowlanym. System ten jest przydatny do przeprowadzania dogłębnych analiz morfologicznych komórek Purkinjego (PC), w tym szczegółowych badań kolców dendrytycznych i cech ultrastrukturalnych 52,53,54,55,56,57,58,59. Nasze obserwacje wskazują, że odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR) jest szczególnie aktywna w komputerach PC w tych kulturach. Jednak do głównych ograniczeń tego systemu należy ograniczony czas jego stosowania i poleganie na obrazowaniu mikroskopowym w celu monitorowania procesów komórkowych, co podkreśla ciągłą potrzebę opracowywania lub dostosowywania odpowiednich technik obrazowania.

Kolejne słowo ostrzeżenia dotyczy części móżdżku, która jest preparowana w celu przygotowania plastrów tkanki. Zaobserwowaliśmy, że różne płaty móżdżku mogą dawać kultury o wyraźnie różnej organizacji wewnętrznej i ogólnej jakości. Dlatego wolimy zakładać kultury z plastrów uzyskanych przez odcinki śródstrzałkowe robaka móżdżku. W tych plasterkach liście kory móżdżku są wygodnie widoczne.

Wskazane jest wykorzystanie wycinków tkanek uzyskanych z robaka móżdżku, które wykazują charakterystyczne foliowanie kory móżdżku. Wycinki te utrzymują swoją strukturę organizacyjną w kulturze przez kilka tygodni. Ponadto zaleca się rozpoczęcie procedur eksperymentalnych z kulturami około 7-12 dni po założeniu. Typowy eksperyment mający na celu ocenę reakcji na uszkodzenie DNA w tych kulturach polega na zainicjowaniu uszkodzenia przez napromieniowanie lub dodanie do pożywki substancji chemicznych uszkadzających DNA. Następnie utrwalanie i barwienie tkanek odbywa się w różnych odstępach czasu. Aby ocenić regenerację po uszkodzeniach spowodowanych przez chemikalia, uwzględnia się okres inkubacji w świeżej pożywce. Wskazane jest jak najszybsze rozpoczęcie długoterminowych eksperymentów, najlepiej około 7 dni po założeniu hodowli.

Kultury organotypowe móżdżku są utrzymywane w pożywce pozbawionej antybiotyków; Dlatego konieczne jest utrzymanie sterylnego środowiska podczas ich zakładania. Wiek szczeniąt, z których zbiera się móżdżek, jest krytyczny, z zalecanym zakresem 9-12 dni. Ten przedział wiekowy jest optymalny, ponieważ kora móżdżku jest wystarczająco rozwinięta do sekcji. Warto zauważyć, że u starszych zwierząt tkanki mają tendencję do przylegania do ostrza. Bardzo ważne jest, aby móżdżek był zanurzony w zimnym roztworze preparacyjnym do czasu wypreparowania.

W ciągu pierwszych 5-7 dni w hodowli wycinki tkanki mogą wykazywać objawy przypominające stan zapalny, charakteryzujące się obrzękiem i mlecznymi przebarwieniami. Atrybuty te mogą potencjalnie wpływać na pomiar parametrów fizjologicznych i skuteczność technik barwienia immunologicznego.

Zdecydowanie zaleca się, aby nie kroić móżdżku cieńszego niż 350 μm, aby uniknąć niespójności grubości podczas krojenia. Należy pamiętać, że tkanka o grubości 350 μm staje się znacznie cieńsza po 7 dniach w hodowli do około 90 μm (na podstawie pomiaru stosu Z).

Tutaj wprowadzamy barwienie PAR 7,50 do zestawu narzędzi używanych do badania DDR w komputerach PC. Odczyt ten jest szybki, czuły i oddaje dynamiczną naturę DDR, co okazuje się szczególnie przydatne w naszej analizie DDR w komputerach typu dzikiego i z niedoborem ATM. Przedstawione tutaj protokoły powinny być szczególnie korzystne dla naukowców badających zespoły niestabilności genomowej, które wpływają na móżdżek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w naszym laboratorium jest wspierana przez Fundację Badań Medycznych dr Miriam i Sheldona G. Adelson oraz Izraelskie Stowarzyszenie na rzecz Walki z Chorobą A-T.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik i sprzęt
szalka Petriego 150 x 30 cmCorning Inc.3261
szalka Petriego 35 x 10 mmCorning Inc.3294
AcetonInvitrogen25030081
AcetonSigma-Aldrich270725-1L
Samoprzylepne szkiełka mikroskopoweMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Ostrza do rozdrabniaczaTED PELLAModel TC752-1  Stylowe żyletki
BMEGIBCO41010-026 500ml. Brak L-Glut
Hodowla komórkowa wprowadzaMilliporePICM0RG50
D-GlucoseBiological Indo.02-015-1A
HBSS bez czerwieni fenolowejSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+,No Mg+
HBSS z czerwienią fenolowąSartorius02-015-1A
Surowica końska GIBCO26050088inaktywowane termicznie
kleszczyki do tęczówkiCellPathGZX-0100-00A130mm tępo ząbkowana
szpatułka do tęczówkiFST10092-12
L-glutamina (200 mM)Gibco41010026
MetanolSigma-Aldrich322412-1L
Metanol Sigma-AldrichG5767
MikroskopOlympus
Medium montażowe bezGRIGENE. Ltd, IzraelK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGDichlorek parakwatu (Viologen metylowy)
PARG-Poli(ADP-rybozy) Inhibitor glikohydrolazyTocris Bioscience, Wielka BrytaniaPDD 00017273światłoczuły 
Bufor fosforanowyBiologiczny Indo.02-018-1A
Nożyczki do tkanek
Płytki sześciodołkoweCorning CLS3516
Zapasowe krążki do krojenia TED PELLAModel 10180-01
Rozdrabniacz tkanekMcIlwainModel TC75210180-220
Pęseta, spiczasta
Miseczki moczowe
Przeciwciała
Alexa fluor 488 osioł anty królik IgG 
Invitrogen		A212061:500; wtórne AB; Wtórny bufor rozcieńczający;   Inkubacja przez 2 godziny w temperaturze pokojowej
Antyglejowy fibrylarny kwaśny protienMiliforMAB34021:1500; pierwotny ab; blokowanie; Host:mysz
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; pierwotny ab; blokowanie; gospodarz: królik 
Anty-kalbindyna-D-28KSwantCB-38A1:2000; pierwotny AB; Blokowanie 
Odczynnik anty-pan-ADP-rybozyMiliforMABE10161:800; pierwotny ab; blokowanie; inkubacja przez 2 godziny w temperaturze pokojowej
DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2'-fenylindolu)Sygnalizacja komórkowa40841:1000; wtórny bufor rozcieńczający; inkubacja przez 20 min w temperaturze pokojowej
skórnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (2010).
  3. De Almeida, L. C., Calil, F. A., Machado-Neto, J. A., Costa-Lotufo, L. V. DNA damaging agents and DNA repair: From carcinogenesis to cancer therapy. Cancer Genet. 252-253, 6-24 (2021).
  4. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: Three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a012724(2013).
  5. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis. Environ Mol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).
  6. Taylor, A. M. R., et al. Chromosome instability syndromes. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 64(2019).
  7. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair and human genetic disease. Trends Cell Biol. 32 (9), 733-745 (2022).
  8. Tiwari, V., Wilson, D. M. 3rd DNA damage and associated DNA repair defects in disease and premature aging. Am J Hum Genet. 105 (2), 237-257 (2019).
  9. Rieckher, M., Garinis, G. A., Schumacher, B. Molecular pathology of rare progeroid diseases. Trends Mol Med. 27 (9), 907-922 (2021).
  10. Qing, X., Zhang, G., Wang, Z. Q. DNA damage response in neurodevelopment and neuromaintenance. FEBS J. 290 (13), 3300-3310 (2023).
  11. Scheijen, E. E. M., Wilson, D. M. 3rd Genome integrity and neurological disease. Int J Mol Sci. 23 (8), (2022).
  12. Welch, G., Tsai, L. H. Mechanisms of DNA damage-mediated neurotoxicity in neurodegenerative disease. EMBO Rep. 23 (6), e54217(2022).
  13. Perlman, S. L., Boder Deceased, E., Sedgewick, R. P., Gatti, R. A. Ataxia-telangiectasia. Handb Clin Neurol. 103, 307-332 (2012).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: A review. Orphanet J Rare Dis. 11 (1), 159(2016).
  15. Amirifar, P., Ranjouri, M. R., Yazdani, R., Abolhassani, H., Aghamohammadi, A. Ataxia-telangiectasia: A review of clinical features and molecular pathology. Pediatr Allergy Immunol. 30 (3), 277-288 (2019).
  16. Shiloh, Y., Ziv, Y. The atm protein kinase: Regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (4), 197-210 (2013).
  17. Lee, J. H., Paull, T. T. Cellular functions of the protein kinase atm and their relevance to human disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (12), 796-814 (2021).
  18. Taylor, A. M., et al. Ataxia telangiectasia: A human mutation with abnormal radiation sensitivity. Nature. 258 (5534), 427-429 (1975).
  19. Shiloh, Y., Tabor, E., Becker, Y. Cellular hypersensitivity to neocarzinostatin in ataxia-telangiectasia skin fibroblasts. Cancer Res. 42 (6), 2247-2249 (1982).
  20. Shiloh, Y. Atm: Expanding roles as a chief guardian of genome stability. Exp Cell Res. 329 (1), 154-161 (2014).
  21. Shiloh, Y., Lederman, H. M. Ataxia-telangiectasia (a-t): An emerging dimension of premature ageing. Ageing Res Rev. 33, 76-88 (2017).
  22. Geng, A., et al. Sirt2 promotes base excision repair by transcriptionally activating ogg1 in an atm/atr-dependent manner. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5107-5120 (2024).
  23. Biton, S., Barzilai, A., Shiloh, Y. The neurological phenotype of ataxia-telangiectasia: Solving a persistent puzzle. DNA Repair (Amst). 7 (7), 1028-1038 (2008).
  24. Kanner, S., et al. Astrocytes restore connectivity and synchronization in dysfunctional cerebellar networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (31), 8025-8030 (2018).
  25. Song, X., Ma, F., Herrup, K. Accumulation of cytoplasmic DNA due to atm deficiency activates the microglial viral response system with neurotoxic consequences. J Neurosci. 39 (32), 6378-6394 (2019).
  26. Levi, H., et al. Dysfunction of cerebellar microglia in ataxia-telangiectasia. Glia. 70 (3), 536-557 (2022).
  27. Bourseguin, J., et al. Persistent DNA damage associated with atm kinase deficiency promotes microglial dysfunction. Nucleic Acids Res. 50 (5), 2700-2718 (2022).
  28. Shiloh, Y. The cerebellar degeneration in ataxia-telangiectasia: A case for genome instability. DNA Repair (Amst). 95, 102950(2020).
  29. Lai, J., et al. Atm-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia. Cell Rep. 43 (1), 113622(2024).
  30. Woolley, P. R., et al. Regulation of transcription patterns, poly(adp-ribose), and rna-DNA hybrids by the atm protein kinase. Cell Rep. 43 (3), 113896(2024).
  31. Santos, G., Barateiro, A., Brites, D., Fernandes, A. S100b impairs oligodendrogenesis and myelin repair following demyelination through rage engagement. Front Cell Neurosci. 14, 279(2020).
  32. Iskusnykh, I. Y., Fattakhov, N., Buddington, R. K., Chizhikov, V. V. Intrauterine growth restriction compromises cerebellar development by affecting radial migration of granule cells via the jamc/pard3a molecular pathway. Exp Neurol. 336, 113537(2021).
  33. Gehmeyr, J., et al. Disabling vegf-response of purkinje cells by downregulation of kdr via mirna-204-5p. Int J Mol Sci. 22 (4), 2173(2021).
  34. Wolters, A., et al. Teriflunomide provides protective properties after oxygen-glucose-deprivation in hippocampal and cerebellar slice cultures. Neural Regen Res. 16 (11), 2243-2249 (2021).
  35. Gorter, R. P., Dijksman, N. S., Baron, W., Colognato, H. Investigating demyelination, efficient remyelination and remyelination failure in organotypic cerebellar slice cultures: Workflow and practical tips. Methods Cell Biol. 168, 103-123 (2022).
  36. Lamoureux, L., et al. Non-productive infection of glial cells with sars-cov-2 in hamster organotypic cerebellar slice cultures. Viruses. 14 (6), 1218(2022).
  37. Frontzek, K., et al. A conformational switch controlling the toxicity of the prion protein. Nat Struct Mol Biol. 29 (8), 831-840 (2022).
  38. Tellios, V., Maksoud, M. J. E., Nagra, R., Jassal, G., Lu, W. Y. Neuronal nitric oxide synthase critically regulates the endocannabinoid pathway in the murine cerebellum during development. Cerebellum. 22 (6), 1200-1215 (2023).
  39. Schroder, L. J., et al. Polysialic acid promotes remyelination in cerebellar slice cultures by siglec-e-dependent modulation of microglia polarization. Front Cell Neurosci. 17, 1207540(2023).
  40. Tzur-Gilat, A., Ziv, Y., Mittelman, L., Barzilai, A., Shiloh, Y. Studying the cerebellar DNA damage response in the tissue culture dish. Mech Ageing Dev. 134 (10), 496-505 (2013).
  41. Tal, E., et al. Inactive atm abrogates dsb repair in mouse cerebellum more than does atm loss, without causing a neurological phenotype. DNA Repair (Amst). 72, 10-17 (2018).
  42. Tal, E., Shiloh, Y. Monitoring the atm-mediated DNA damage response in the cerebellum using organotypic cultures. Methods Mol Biol. 1599, 419-430 (2017).
  43. Dar, I., et al. Investigation of the functional link between atm and nbs1 in the DNA damage response in the mouse cerebellum. J Biol Chem. 286 (17), 15361-15376 (2011).
  44. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: A paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  45. Elson, A., et al. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (23), 13084-13089 (1996).
  46. Xu, Y., et al. Targeted disruption of atm leads to growth retardation, chromosomal fragmentation during meiosis, immune defects, and thymic lymphoma. Genes Dev. 10 (19), 2411-2422 (1996).
  47. Borghesani, P. R., et al. Abnormal development of purkinje cells and lymphocytes in atm mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (7), 3336-3341 (2000).
  48. Rahmanian, N., Shokrzadeh, M., Eskandani, M. Recent advances in gammah2ax biomarker-based genotoxicity assays: A marker of DNA damage and repair. DNA Repair (Amst). 108, 103243(2021).
  49. Furia, L., Pelicci, S., Scanarini, M., Pelicci, P. G., Faretta, M. From double-strand break recognition to cell-cycle checkpoint activation: High content and resolution image cytometry unmasks 53bp1 multiple roles in DNA damage response and p53 action. Int J Mol Sci. 23 (17), 10193(2022).
  50. Duma, L., Ahel, I. The function and regulation of adp-ribosylation in the DNA damage response. Biochem Soc Trans. 51 (3), 995-1008 (2023).
  51. Komulainen, E., et al. Parp1 hyperactivity couples DNA breaks to aberrant neuronal calcium signalling and lethal seizures. EMBO Rep. 22 (5), e51851(2021).
  52. Hendelman, W. J., Aggerwal, A. S. The purkinje neuron: I. A golgi study of its development in the mouse and in culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1063-1079 (1980).
  53. Aggerwal, A. S., Hendelman, W. J. The purkinje neuron: Ii. Electron microscopic analysis of the mature purkinje neuron in organotypic culture. J Comp Neurol. 193 (4), 1081-1096 (1980).
  54. Hendelman, W. J., Jande, S. S., Lawson, D. E. Calcium-binding protein immunocytochemistry in organotypic cultures of cerebellum. Brain Res Bull. 13 (1), 181-184 (1984).
  55. Seil, F. J., Herndon, R. M., Tiekotter, K. L., Blank, N. K. Reorganization of organotypic cultures of mouse cerebellum exposed to cytosine arabinoside: A timed ultrastructural study. J Comp Neurol. 313 (2), 193-212 (1991).
  56. Tauer, U., Volk, B., Heimrich, B. Differentiation of purkinje cells in cerebellar slice cultures: An immunocytochemical and golgi em study. Neuropathol Appl Neurobiol. 22 (4), 361-369 (1996).
  57. Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. J Vis Exp. (61), 3637(2012).
  58. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. The plasma membrane ca2+-atpase2 (pmca2) is involved in the regulation of purkinje cell dendritic growth in cerebellar organotypic slice cultures. Neural Plast. 2013, 321685(2013).
  59. Sherkhane, P., Kapfhammer, J. P. Chronic pharmacological blockade of the na(+) /ca(2+) exchanger modulates the growth and development of the purkinje cell dendritic arbor in mouse cerebellar slice cultures. Eur J Neurosci. 46 (5), 2108-2120 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

DNA Damage ResponsePurkinje CellsCerebellar Organotypic CulturesAtaxia TelangiectasiaATM DeficiencyFluorescent ImagingPoly ADP RiboseGenome InstabilityProtein CorrelationCalbindin Staining

Powiązane artykuły