Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wydajne przetwarzanie komórek pomocniczych pęcherzyków T migdałków i analiza funkcjonalna za pomocą wielowymiarowej cytometrii przepływowej

957 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67188

⸱

11 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pobierania i przetwarzania próbek migdałków, fenotypowania za pomocą wysokowymiarowej spektralnej cytometrii przepływowej oraz przeprowadzania analiz bez nadzoru.

Streszczenie

T pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) są podzbiorem komórek pomocniczych T CD4+, które pomagają w przełączaniu izotypów komórek B, tworzeniu centrum rozrodczego (GC), hipermutacji somatycznej i dojrzewaniu powinowactwa, pomagając w ten sposób w organizowaniu adaptacyjnych humoralnych odpowiedzi immunologicznych w wtórnych tkankach limfatycznych podczas infekcji, autoimmunizacji i szczepienia. Zrozumienie rozwoju i funkcji komórek Tfh ma kluczowe znaczenie dla projektowania skutecznych szczepionek i opracowywania ukierunkowanych strategii leczenia chorób obejmujących tę populację. Ludzkie komórki migdałków są dostępnymi narządami limfatycznymi błony śluzowej. Dają one wyjątkową możliwość profilowania odrębnych populacji immunologicznych, takich jak komórki Tfh i GC, badania interakcji międzykomórkowych, oceny dynamicznych funkcji komórkowych i odkrywania ich mechanizmów regulacyjnych na poziomie narządów. Ponadto hodowle in vitro komórek migdałków są proste w obróbce i umożliwiają ocenę biologii komórek Tfh w różnych warunkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania, izolacji, konserwacji i hodowli ludzkich komórek migdałków. Opisujemy również dwa zoptymalizowane panele spektralnej cytometrii przepływowej przeznaczone do dogłębnej charakterystyki komórek Tfh. Wreszcie, na przykładzie leczenia inhibitorem białka fosfatazy 2A (PP2A), pokazujemy skuteczność i moc nienadzorowanych analiz danych z wysokowymiarowej cytometrii przepływowej, skutecznie odkrywając różnice wywołane leczeniem w skali wielowymiarowej.

Wprowadzenie

T pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) są odrębnym podzbiorem limfocytów T pomocniczych CD4+, które są niezbędne do tworzenia i funkcjonowania centrów rozrodczych (GC) oraz produkcji przeciwciał limfocytów B. Komórki Tfh pochodzą z naiwnych limfocytów T CD4 + poprzez interakcje z komórkami prezentującymi antygen oraz integrację czynników wewnętrznych i zewnętrznych, w tym sygnalizacji receptora limfocytów T, interakcji kostymulujących z komórkami B, cytokinami i chemokinami1. Komórki Tfh eksprymują CXCR5 i PD-1, które kierują ich położeniem w GC lub w jego pobliżu. BCL-6 jest głównym czynnikiem transkrypcyjnym krytycznym dla rozwoju, utrzymania i funkcji Tfh1,2. Komórki Tfh odgrywają kluczową rolę w narastaniu humoralnej odpowiedzi immunologicznej, szczególnie w odpowiedziach na szczepionki oraz w obronie przed patogenami bakteryjnymi i wirusowymi. Nieprawidłowe odpowiedzi komórek Tfh są związane z różnymi zaburzeniami, w tym chorobami autoimmunologicznymi, niedoborem odporności i potencjalnie niektórymi formami raka3,4,5,6. Zrozumienie ich funkcji i regulacji jest zatem ważne dla opracowania skutecznych strategii szczepień i terapii7.

W przeciwieństwie do innych komórek pomocniczych T CD4+, takich jak Th1, Treg i Th17, dla których systemy różnicowania in vitro są dobrze ugruntowane8, komórki Tfh są bardziej skomplikowane do zbadania, ponieważ ich rozwój obejmuje dynamiczne interakcje międzykomórkowe i wyspecjalizowane struktury anatomiczne7. W związku z tym badania nad komórkami Tfh w dużej mierze opierały się na fenotypowaniu ex vivo ludzkich obwodowych krążących komórek Tfh (cTfh) oraz modelach mysich in vivo. Badanie regulacji określonych cząsteczek na komórkach Tfh jest zatem trudne, szczególnie w przypadku ludzkich komórek Tfh9. W związku z tym dogłębne badanie ex vivo komórek Tfh pochodzących z tkanek limfoidalnych jest niezbędne do lepszego zrozumienia ludzkich komórek Tfh.

Migdałki, jako wtórne narządy limfoidalne, zawierają unikalne populacje komórek, które nie są obecne we krwi obwodowej, takie jak komórki pre-Tfh (CXCR5intPD-1int CD4+) i GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4+), które odgrywają kluczową rolę w tworzeniu GCs. Co więcej, migdałki podniebienne są jednymi z najczęściej usuwanych tkanek w operacjach pediatrycznych i są łatwo dostępne, co czyni je nieocenionym źródłem tkanek ludzkich do badania złożonych mechanizmów immunologicznych obejmujących komórki Tfh. Ponieważ znajdują się w górnych drogach oddechowych, głównym miejscu infekcji wirusowych dróg oddechowych, migdałki stanowią korzystną tkankę do badania odpowiedzi immunologicznych na takie infekcje wirusowe. Na przykład nasze laboratorium wcześniej scharakteryzowało komórki Tfh w migdałkach i migdałkach gardłowych dzieci, które przeszły rekonwalescencję po COVID-19 i porównało te tkanki z tymi z niezakażonych grup kontrolnych10. W tym miejscu przedstawiamy nasz protokół przetwarzania i przechowywania komórek migdałków. Używając jako przykładu migdałków traktowanych inhibitorem PP2A, szczegółowo opisujemy, jak scharakteryzować te komórki za pomocą wielowymiarowej spektralnej cytometrii przepływowej i analizować dane za pomocą analizy bez nadzoru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Kodeks Etyczny Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (Deklaracja Helsińska) był przestrzegany we wszystkich badaniach na ludziach w tym badaniu. Próbki migdałków ludzkich uzyskano od pacjentów z przerostem grudeczki adenotonsillarnej powodującym zaburzenia oddychania podczas snu lub obturacyjny bezdech senny, pochodzące z Oddziału Otolaryngologii Dziecięcej, Children's National Hospital, Washington, DC, USA. Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) w Children's National Hospital (numer protokołu IRB 00009806). Świadoma zgoda została podpisana przez rodziców lub opiekunów wszystkich włączonych uczestników, a zgoda została uzyskana od małoletnich uczestników w wieku 7 lat i starszych.

1. Pobieranie migdałków ludzkich oraz izolacja i przechowywanie pojedynczych komórek

  1. Izolacja pojedynczych komórek migdałków
    1. Pobieranie próbek chirurgicznych
      1. Pobrać migdałki od pacjentów poddawanych tonsillektomii i zebrać świeże fragmenty tkanek na sali operacyjnej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 25-35 ml lodowato zimnego sterylnego podłoża migdałkowego: RPMI uzupełnionego 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,05 mg/ml gentamycyny, 10 mM glutaminy i mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej (100 jednostek/ml streptomycyny, 100 jednostek/ml penicyliny, i 0,25 μg/ml amfoterycyny B).
        UWAGA: Migdałki w powyższej pożywce mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc i przetwarzane następnego dnia. Minimalną utratę żywotności komórek odnotowano przy przechowywaniu przez noc w porównaniu z przetwarzaniem tego samego dnia (Rysunek 1A). Migdałki mogą być również wysyłane w nocy na lodzie.
    2. Obróbka migdałków
      UWAGA: Wszystkie podłoża, i narzędzia chirurgiczne muszą być sterylne, a izolacja komórek migdałków powinna być wykonywana na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
      1. Umieścić migdałki na plastikowym naczyniu do hodowli komórek o średnicy 60 mm zawierającym 5 ml schłodzonej pożywki migdałkowej. Praca na lodzie. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek lub skalpela ostrożnie usuń wszelkie widoczne skrzepy krwi, tłuszcz i tkankę łączną (Rysunek 1B, C).
      2. Przenieś migdałki do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm z 5 ml lodowatego podłoża migdałkowego. Pokrój kawałki migdałków na 3-5 mm fragmenty.
      3. Przygotować nowe naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm z 10 ml zimnej pożywki migdałkowej i umieścić w nim sitko do komórek o średnicy 70 μm.
      4. Przenieść fragmenty migdałków do sitka i rozbić je za pomocą końcówki tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml przez sitko.
      5. Zebrać pożywkę zawierającą komórki na zewnątrz sitka w naczyniu i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      6. Dodaj dodatkowe 10 ml pożywki migdałkowej do naczynia z sitkiem, rozbij fragmenty migdałków tłokiem i zbierz pożywkę do stożkowej probówki. W przypadku dużych migdałków powtórz ten krok jeszcze 2-3 razy, aż w sitku pozostaną tylko fragmenty tkanki łącznej. Pozostałe chusteczki i zużyte płytki należy umieścić w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i w odpadach medycznych.
      7. Napełnij stożkową rurkę o pojemności 50 ml do góry pożywką migdałkową.
      8. Wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Wydłużenie wirowania do 20 minut może zwiększyć wydajność.
      9. Usunąć supernatant przez ostrożne odsysanie lub pipetowanie i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) w temperaturze pokojowej (RT) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 35 ml schłodzonego PBS, aby zapobiec dalszej lizie. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      10. Przemyć raz 50 ml schłodzonego PBS i odwirować. Zawiesić za pomocą 10 ml PBS i przecedzić komórki przez plastikowe sitko o pojemności 70 μm. Policz komórki.
  2. Kriokonserwacja komórek migdałków
    1. Przygotować pożywkę zamrażającą (90% inaktywowany termicznie FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)).
      UWAGA: Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    2. Odwirować zawiesinę komórek (etap 1.1.2.10) w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek za pomocą pożywki zamrażającej.
      UWAGA: Zalecamy zamrożenie komórek w gęstości 10 × 106 do 50 × 106 komórek/ml pożywki do zamrażania11.
    3. Podwielokrotność 0,5-1 ml zawiesiny komórkowej do sterylnych kriowialiów. Zamrozić fiolki w pojemnikach do zamrażania o kontrolowanej szybkości w temperaturze -80 °C. W ciągu jednego tygodnia przenieść fiolki do zbiornika zawierającego ciekły azot w celu długotrwałego przechowywania.
  3. Rozmrażanie zamrożonych komórek
    UWAGA: Podejście do rozmrażania sekwencyjnego i rozcieńczania, do którego odwołuje się protokół przygotowania próbki do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, opisano poniżej12. Inne metody rozmrażania mogą również działać, ale znaleźliśmy większą żywotność komórek przy tym podejściu w porównaniu z natychmiastowym umieszczeniem komórek w ciepłym buforze rozmrażania (Rysunek 1D). Bufor do mycia można przygotować z wyprzedzeniem. Bufor do rozmrażania składa się z buforu do przemywania oraz 0,1 mg/ml DNazy I (DNazę I należy dodać tuż przed rozpoczęciem rozmrażania). Wydłużenie czasu wirowania do 1 min/ml (dla probówek 15 ml) jest opcjonalne w celu zwiększenia wydajności komórek.
    1. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 37 °C. Rozgrzać rozmrożenie i przepłukać bufor w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wszystkie płukanie komórek odbywa się w RT.
    2. Rozmrażać kriowiale w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty natychmiast po wyjęciu z magazynu. Unikać całkowitego zanurzania fiolki w łaźni wodnej. Wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, gdy pozostaje widoczny mały kryształek lodu.
    3. Delikatnie przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Przepłucz kriowial 0,5 ml wstępnie podgrzanego buforu do rozmrażania i dodaj płukanie kropla po kropli (1 kropla co 5 s) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie potrząsając probówką do wymieszania.
    4. Rozcieńczyć komórki sekwencyjnie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, stopniowo dodając 2 ml, a następnie 4 ml pożywki z czasem oczekiwania ~1 min między dodaniami. Dodawaj pożywkę w ilości 1 ml co 3-5 s do probówki, delikatnie mieszając, aby wymieszać.
    5. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć supernatant, zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu do rozmrażania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    7. Dodać 10 ml buforu do przemywania (bez DNazy I). Ponownie odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Przemyć jeszcze raz: usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml buforu do płukania. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm. Ponownie odwirować przez 5 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej i policzyć komórki. Zawiesić w pożywce hodowlanej.

2. Pomiar ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych i czynników transkrypcyjnych po leczeniu ex vivo

UWAGA: Tutaj szczegółowo opisujemy naszą metodę charakterystyki fenotypowej komórek Tfh migdałków przy użyciu dwóch paneli wysokowymiarowej cytometrii przepływowej. Biorąc pod uwagę, że aktywność PP2A jest niezbędna dla optymalnej ekspresji białka BCL-6 i różnicowania Tfh4, ilustrujemy naszą ocenę utrzymania i funkcjonalności komórek Tfh poprzez badanie komórek migdałków traktowanych inhibitorem PP2A kantarydyną (CAN).

  1. Barwienie metodą cytometrii przepływowej
    1. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych
      UWAGA: Inkubacje wykonywane są w ciemności. Odczynniki, przeciwciała i ich odpowiednie ilości na studzienkę użytą w obu panelach są wymienione w Tabeli Materiałów. Aby ocenić degranulację limfocytów T, przeciwciało anty-CD107a jest dodawane na etapie leczenia, aby zminimalizować wyniki fałszywie ujemne spowodowane jego internalizacją13.
      1. Płytka 2 × 106 komórek migdałków z 200 μl pożywki hodowlanej (1 × 107 komórek/ml) w 96-dołkowej studzience na dnie U z następującymi ilościami inhibitora PP2A CAN przez 16 godzin: kontrola nośnika, 3 μM i 6 μM.
        UWAGA: CAN rozpuszczono w 0,1 M z 1% DMSO.
      2. Dodaj monenzynę (0,7 μl / ml), brefeldynę (1:1 000), octan mirystynianu forbolu (50 ng / ml, PMA), jonomycynę (1 000 ng / ml) i 2 μl anty-CD107a do każdej studzienki przez 2,5 godziny w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 oC. Całkowita objętość kultury wynosi 200 μl na studzienkę.
      3. Odwirować przeciwciała barwiące w temperaturze ~16 000 × g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów przeciwciał. Przygotować mieszaninę przeciwciał powierzchniowych dla etapu 2.1.1.8, który obejmuje wszystkie przeciwciała powierzchniowe z wyjątkiem receptorów chemokin, Brilliant Stain Buffer Plus i buforu FACS (objętość każdego z nich podana w tabeli materiałów, całkowita 112 μl mieszaniny na reakcję).
      4. Po zakończeniu 2,5 godziny w hodowli, przemyć komórki 2x 200 μl lodowatego PBS przez odwirowanie przy 400 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Pomiędzy płukaniami odrzucić supernatant poprzez szybkie odwrócenie płytki. Wykonaj barwienie na tej samej płycie.
      5. Inkubować komórki w 100 μL/basenik rozcieńczonego w 1:800 LIVE/DEAD Blue barwnika w PBS przez 15 minut w temperaturze suchej. Przemyć 2x 200 μL buforu FACS.
      6. Ponownie zawiesić komórki za pomocą True Stain Monocyte Blocker (5 μL blokera monocytów + 45 μL buforu FACS na studzienkę) na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Sekwencyjnie dodawać przeciwciała receptora chemokiny bezpośrednio do reakcji barwienia (najpierw anty-CXCR3 i anty-CCR7 przez 10 minut każdy, a następnie mieszanina anty-CXCR5 i anty-CCR6 wraz z 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus przez 5 minut w temperaturze pokojowej). Dobrze wymieszać po każdym dodaniu, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z objętościami przeciwciał.
      8. Dodać powierzchniową mieszaninę przeciwciał przygotowaną w kroku 2.1.1.3 bezpośrednio do reakcji barwienia i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Całkowita objętość barwienia na reakcję wynosi 180 μL: 50 μl blokera monocytów w buforze (patrz krok 2.1.1.6) + 18 μl przeciwciał przeciwko receptorowi chemokiny (patrz etap 2.1.1.7) + 112 μl powierzchniowej mieszaniny przeciwciał (patrz etap 2.1.1.3).
      9. Przemyć 2x 200 μL zimnego buforu FACS.
      10. Ponownie zawiesić komórki i inkubować z 80 μl/basenik buforu utrwalającego na bazie paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      11. Dodaj 160 μl 1x buforu permeabilacyjnego do każdej studzienki, która już zawiera bufor utrwalający. Odwirować płytkę o stężeniu 400 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i przemyć 1x 200 μl buforu permeabilizacyjnego.
      12. Przygotuj mieszankę przeciwciał przeciwko cytokinom wewnątrzkomórkowym (ICS), która zawiera przeciwciała przeciwko cytokinom, Brilliant Stain Buffer Plus i bufor do permeabilizacji (całkowita objętość 50 μL/dołek, tabela materiałów). Inkubować komórki z tą wewnątrzkomórkową mieszanką przeciwciał cytokinowych w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      13. Przemyć 2x 200 μl/dobrze buforem przepuszczalnym. Zawiesić w 200 μl/studzienkę buforu FACS.
      14. Przechowuj wybarwione komórki w temperaturze 4 °C w ciemności i uzyskaj dane na spektralnym cytometrze przepływowym w ciągu 24 godzin, aby zminimalizować utratę intensywności barwienia14.
    2. Barwienie jądrowych czynników transkrypcyjnych
      1. Hodować komórki za pomocą CAN, jak w kroku 2.1.1.1 (bez stymulacji komórek).
      2. Dodać przeciwciało anty-ludzkie CD40 (0,5 μg/ml) do pożywki hodowlanej i hodować z komórkami przez 15 minut przed rozpoczęciem barwienia. Jeśli komórki są stymulowane, dodaj to przeciwciało 15 minut przed rozpoczęciem stymulacji, aby zapobiec internalizacji CD40L po aktywacji15,16.
      3. Odwirować przeciwciała barwiące i przygotować powierzchniową mieszaninę przeciwciał podobną do kroku 2.1.1.3: przeciwciała powierzchniowe w tabeli materiałów, 10 μL/studzienkę Brilliant Stain Buffer Plus i 54,1 μL/studzienkę buforu FACS.
        UWAGA: Całkowita objętość barwienia na studzienkę wynosi 180 μl: 50 μl blokera monocytów w buforze + 13 μl przeciwciał receptora chemokiny + 117 μl powierzchniowej mieszaniny przeciwciał.
      4. Umyj komórki i wykonaj barwienie LIVE/DEAD Blue oraz barwienie powierzchni i mycie jak w krokach 2.1.1.5-2.1.1.8.
        UWAGA: Przeciwciało anty-CXCR3 nie jest zawarte w tym panelu.
      5. Napraw komórki za pomocą 80 μl buforu utrwalającego jądrowy czynnik transkrypcyjny z zestawu barwiących FoxP3 / czynnik transkrypcyjny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      6. Przemyć komórki buforem do permeabilizacji, jak w kroku 2.1.1.11.
      7. Przygotuj wewnątrzkomórkową mieszaninę przeciwciał przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu (TF), która zawiera przeciwciała przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu wymienione w tabeli materiałów, 10 μl Brilliant Stain Buffer Plus i 16 μl buforu permeabilizacji (całkowita objętość 40 μL/studzienkę). Inkubować komórki z tą mieszanką przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      8. Przemyć i pobrać na cytometr spektralny jak w krokach 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Nienadzorowana analiza danych z wysokowymiarowej cytometrii przepływowej

UWAGA: Oprogramowanie, pakiety i ich wersje używane do analizy są wymienione w Tabeli Materiałów. Zrzuty ekranu z kroków od 3.2 do 3.4 znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Przykładowe skrypty z kroków 3.5 do 3.7 znajdują się wPliku uzupełniającym 2 i Pliku uzupełniającym 3, kroki od 3.8 do 3.9 znajdują się w Pliku uzupełniającym 4 i Pliku uzupełniającym 5. Nieprzetworzone pliki ICS i nieprzetworzone pliki TF dla skryptów są dostępne odpowiednio w pliku uzupełniającym 6 i pliku uzupełniającym 7.

  1. Otwórz obszar roboczy oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, w którym przechowywane są pliki ".fcs" i zakończ bramkowanie, jak pokazano na Rysunek 1E.
  2. Kliknij prawym przyciskiem myszy węzeł docelowy (w tym przypadku limfocyty T CD4+). Wybierz opcję Wybierz równoważne węzły.
  3. Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy węzeł docelowy. Wybierz opcję Eksportuj/łącz populacje.
  4. Poczekaj na otwarcie okna Populations: Export or Concatenate (Populacje: Eksport lub Konkatenacja), wybierz wartości kanału CSV i wybierz miejsce docelowe dla eksportowanych plików. Uwzględnij wszystkie komórki w polu Uwzględnij zdarzenia i wybierz pozycję Wszystkie parametry kompensowane w polu Parametry. Rozwiń okno Opcje zaawansowane, wpisz prefiks, aby zmienić nazwy plików, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby wyeksportować pliki do folderu docelowego (wyeksportuj jeden plik .csv dla każdej próbki).
  5. Odczytaj wyeksportowane pliki "*.csv" za pomocą R (po jednym dla każdej próbki). Przypisz identyfikator próbki do każdej komórki i połącz komórki ze wszystkich próbek w jedną ramkę danych.
  6. Dodawanie lub scalanie metadanych (dodatkowych informacji o próbkach) do ramki danych.
  7. Losowo zmniejsz próbkowanie równej liczby komórek na próbkę do następnej analizy. Ten krok jest opcjonalny.
    UWAGA: W tym przykładzie 8,000 limfocytów T CD4 + pobrano próbki z całkowitej liczby limfocytów T CD4 + każdego stanu, co stanowi co najmniej 1/7 całkowitej liczby limfocytów T CD4 +.
  8. Utwórz obiekt Seurat: interpretuje wartości kanału dla markerów przeciwciał jako poziomy ekspresji genów podczas tworzenia obiektu Seurat.
    1. Utwórz obiekt Seurat z ramką danych wygenerowaną w kroku 3.6. Pomiń krok NormalizeData i zapisz je bezpośrednio jako test "danych".
    2. Z panelu przepływu wybierz znaczniki powierzchni, które mają być używane jako obiekty zmienne w klastrowaniu nienadzorowanym.
    3. Uruchom ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP jako standardowy potok wprowadzony z Seurat, z wyjątkiem NormalizeData step17.
    4. Dostosuj parametr rozdzielczości w kroku FindClusters, aby zmodyfikować liczbę klastrów, zapewniając, że dokładniej odzwierciedlają one podstawowy kontekst biologiczny.
  9. Korzystaj z narzędzi do wizualizacji, takich jak DimPlot i FeaturePlot kompatybilnych z pakietem Seurat. W przypadku porównywania grup, które zawierają wiele prób na grupę, należy obliczyć procent każdej grupy dla każdego pacjenta i przeprowadzić porównania statystyczne. Następnie użyj modeli matematycznych do bardziej zaawansowanych analiz statystycznych10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby porównać ogólną żywotność komórek, podzieliliśmy migdałek na trzy podobne fragmenty i przetworzyliśmy je zgodnie z naszym protokołem w trzech wariantach: (1) przetworzenie w tym samym dniu, (2) przechowywanie przez noc w temperaturze 4 °C oraz (3) przechowywanie przez noc w lodzie. Żywotność w tych trzech wariantach była bardzo zbliżona, bez żadnych istotnych różnic (Rycina 1A). Oceńaliśmy również wpływ procesu rozmrażania na żywotność komórek. Zastosowana przez nas metoda rozmrażania kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień, że świeże migdałki powinny być przetwarzane w ciągu 3 godzin po operacji19, stwierdziliśmy, że świeże próbki migdałków mogą zachować swoją żywotność, gdy są przechowywane w temperaturze 4 °C i przetwarzane w ciągu 24 godzin. Aby zoptymalizować żywotność komórek z tkanki migdałków po rozmrożeniu z magazynowania ciekłego azotu, przyjęliśmy metodę rozmrażania kroplami zalecaną w sekwencjonowaniu pojedynczych komórek, gdzie bardzo ceni się wysoką żywotnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Wydział Badań Wewnętrznych NIAID, NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Maszyny i instrumenty
3 mL Plastikowa strzykawkaBD309657
96 Well U Bottom PlateThermo Scientific163320
1,2 mL Fiolki kriogeniczneCorning430487
Sitko do komórek 70 i mikro; m NylonFalcon352350
Naczynie do hodowli komórkowych (60 mm)VWR10062-890
WirówkaThermo ScientificSorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 Cyfrowa kąpiel wodna MyBath 2LBenchmarkB2000-2
Drobne nożyczki - SharpFST14060-11
Plastikowe futerały na instrumentyFST20830-05
Spektralny cytometr przepływowy, AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Kleszcze o standardowym wzorzeFST11000-13
Standardowe kleszczeFST11000-20
Analizator żywotności komórek Vi-cell Blu Beckman CoulterC19201
Odczynniki
0,5 M EDTA pH 8,0Jakość Biologia351-027-101
2-merkaptoetanolGibco21985-023
ACK bufor lizującyGibcoA10492-01
Mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybicza (zawiesina penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B, 100x)Gibco15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD566385
KantarydynaSigmaC7632-25MG
Bufor utrwalający CytofixBD554655
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418-250ml
DNAaza IRoche10104159001
Płod Surowica bydlęca (FBS)VWR97068-085
FoxP3/zestaw barwiących czynnik transkrypcyjnyeBioscience00-5523-00
Gentamycyna (50 mg/ml)Gibco15750-060
GolgiplugBD555029
GolgiSTOPBD554724
HEPES (1 M)Gibco15630-080
JonomycynaSigma  I0634-1mg
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030-081
MEM NEAA (100x)Gibco11140-050
Paraformaldehyd 16% roztwór, klasa EM (PFA)Mikroskopia elektronowa
  Nauka		15710Rozcieńczony PBS
PBS, pH 7,4Gibco10010072
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140-122
Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)SigmaP8139-1mg
Pojemniki do zamrażania o kontrolowanej szybkościMilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+L-glutamina)Gibco11875-085
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360-070
Bloker monocytów True-StainBioLegend426103
Buffers
Culture medium10% inaktywowany termicznie FBS (VWR),
2 nM glutamina,
0,055 mM 2-merkaptoetanol,
1% penicylina/ streptomycyna,
1 mM pirogronianu sodu,
10 mM HEPES,
1% aminokwasów endogennych
w RPMI (+L-glutamina)
Bufor2 mM EDTA i 2% inaktywowany termicznie FBS w PBS
Pożywka90% inaktywowany termicznie FBS i 10%
do rozmrażaniaBufor płuczący + 0,1 mg/ml DNaseI
PożywkamigdałkowaRPMI uzupełniony o 5% inaktywowany termicznie FBS,
10 mM glutaminy,
0,05 mg/ml gentamycyny,
1% mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybiczą
  (penicylina, streptomycyna i amfoterycyna B).
BuforRPMI (+L-glutamina) uzupełniony o 10%  inaktywowany termicznie FBS i 10 mM HEPES
przeciwciała i inne regenty do panelu cytokin 
Biotyna anty-ludzka CD107a (LAMP-1) PrzeciwciałoBioLegend3286042 μ L w 200 μ L kompletna pożywka hodowlana na basenik.
Przeciwciało to dodawano do komórek podczas stymulacji PMA/jonomycyny.
Live Dead barwienie100 μ L mix na studzienkę
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0,125 μ L w 100 μ L PBS na studzienkę. 
blok monocytów50 μ L mieszaniny na studzienkę
Bufor blokujący monocytyBioLegend4261035 μ L Bloker monocytów True Stain i 45 μ Bufor L FACS na basen
powierzchniowe przeciwciała dla panelu cytokin
receptorówi mu; L/dobrze 
Anty-ludzki CCR6-BV711BioLegend3534361
Anty-ludzki CCR7-BV421BioLegend3532081
Anty-ludzki CXCR3-PE-Cy5BD5511285
Anty-ludzki CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
           18 μ Mieszaj L na studzienkę dla receptorów chemokin;
Dodać skierowany do komórek z buforem
< silny > inna mieszanina przeciwciał powierzchniowych< / strong>mu; L/dobrze 
Anty-ludzki CD103-BUV661BD7499932.5
Anty-ludzki CD14-Iskra Niebieski 550BioLegend3671482.5
Anty-ludzki CD19-Iskra NIR 685BioLegend3022702.5
Anty-ludzki CD25-BB515 BD56446710
Anti-human CD27- Super Bright 436Thermo62-0279-425
Anti-human CD3-BV510BioLegend3448282.5
Anti-human CD38 APC-Fire810BioLegend3035501
Anti-human CD4 CF YG584CytekR7-200412.5
Anti-human CD45RA-BUV395BD7403150.6
Anty-ludzki CD56-BUV737BD6127663.5
Anty-ludzki CD57-FITCBioLegend3596041.2
Anty-ludzki CD69-BUV563BD7487641
Anty-ludzki CD8-BUV805BD6128891.2
Anty-ludzki FAS-BB700BD5665420.6
Anty-ludzki HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anti-human PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-human-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
Bufor61
                                         112 μ L mieszaniny na basenik dla innych przeciwciał powierzchniowych;
Dodać bezpośrednio do buforu blokowego monocytów (50 μ L) i mieszanina receptorów chemokiny (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L ogółem na studzienkę)
wewnątrzkomórkowe przeciwciała cytokinowe dla panelu cytokinμ L/dobrze 
Anty-ludzki Granzyme B-PEBD561142 1
Anty-ludzki IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
Anty-ludzki IL17A-BV605BioLegend5123261
Anty-ludzki IL2-BV650BioLegend5003343
Anty-ludzki IL21- Alexa Fluor 647BD56049310
Anty-ludzki IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
Anty-ludzka perforyna-APCBioLegend3533122.5
Anty-ludzki TNFa-PE-Cy7BioLegend5029300,1
Anty-IFNγ-Pacific BlueBioLegend5025221
SAv-BUV615BD6130130,25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1x bufor przepuszczalny eBioscience00-5523-0019.15
         (50 μ Mieszanina L na dołek)
Przeciwciała i inni regenci do panelu czynników transkrypcyjnych< / strong>
CD40 Przeciwciało, anty-ludzkieMiltenyi Biotec130-094-1330,5 i mu; g/ml pożywki do stężenia roboczego
barwienie żywych trupów100 μ L mix na studzienkę
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0,125 μ L w 100 μ L PBS na studzienkę. 
Bufor blokujący monocytyBioLegend4261035 μ L Bloker monocytów True Stain i 45 μ Bufor L FACS na basena
przeciwciała powierzchniowe dla panelu czynników transkrypcyjnych
receptory chemokine mixμ L/dobrze 
Anty-ludzki CCR6-BV711BioLegend3534361
Anty-ludzki CCR7-BV421BioLegend3532081
Anty-ludzki CXCR5-BV750BD7471111
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
           13 μ Mieszanina L na studzienkę
< silną > inną mieszaninę przeciwciał powierzchniowych< / strong>μ L/dobrze 
Anty-ludzki 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182.5
Anty-ludzki CD14-Iskra Niebieski 550BioLegend3671482.5
Anty-ludzki CD19-Iskra NIR 685BioLegend3022702.5
Anty-ludzki CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422.5
Anty-ludzki CD25-PE-Cy5BioLegend3026085
Anty-ludzki CD3-BV510BioLegend344828 2.5
Anty-ludzki CD38-APC-Fire810BioLegend3035501
Anty-ludzki CD4-Pacific NiebieskiBioLegend3174231
Anty-ludzki CD40L-PEBD15
Anty-ludzki CD45RA-BUV395BD7403150,6
Anty-ludzki CD56-BUV737BD6127663.5
Anty-ludzki CD69-BUV650BioLegend310934 2.5
Anty-ludzki CD8-BUV805BD6128891.2
Anty-ludzki HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
Anty-ludzki ICOS-BUV563BD741421 1.2
Anty-ludzki OX40-APCBioLegend3500085
Anti-human PD1-BV785BioLegend3299291.2
Anti-human-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
bufor54.1
               117  μ L mieszaniny na basenik dla innych przeciwciał powierzchniowych;
Dodać bezpośrednio do bloku monocytów  bufor (50 μ L) i mieszanina receptorów chemokiny (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L łącznie na basenik)
przeciwciała czynnika transkrypcyjnego dla panelu czynnika transkrypcyjnegoμ L/dobrze 
Anty-ludzki T-bet-BV605BioLegend6448174
Anty-ludzki Bcl6-PE-CF594BD5624014
Anty-ludzki FoxP3-Alexa Fluor 488BD5608871.6
Anty-ludzki GATA3-BB700BD5666422
Anty-ludzki Ki67-Alexa Fluor 700BD5612770,4
Anty-ludzki Rorgt-Alexa Fluor 647BD5636202
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
1 x bufor permeabilizacyjny eBioscience00-5523-0016
                           40 μ L mieszanina na dołek
Oprogramowanie i pakiety do analizy bez nadzoru
Software/packageVersionSource
1data.table1.16.2The Comprehensive R Archive
Network 2FlowJO10.9.0Becton, Dickinson and Company
3mapa do oszukiwania1.0.12Kompleksowa sieć archiwów R
4R4.3.2Kompleksowa sieć archiwów R
5readxl1.4.3Kompleksowa sieć archiwów R
6Rstudio2023.12.1+402Posit PBC
7Seurat5.1.0Kompleksowa sieć archiwów R
8SeuratData0.2.2.9001Kompleksowa sieć archiwów R
9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0Kompleksowa sieć archiwów R
11viridis0.6.5Kompleksowa sieć archiwów R
wzorcowe FACS zamrażająca bufor DMSO płuczący mieszanki chemokinowych bloku monocytów FACS < silne> 557299 FACS

Bibliografia

  1. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  2. Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
  3. Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
  4. Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
  5. Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
  6. Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
  7. Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
  8. Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
  9. Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
  10. Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
  11. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  12. 10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
  13. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  14. Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
  15. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  16. Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
  17. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  18. Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
  19. Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
  20. Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
  21. Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
  22. Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
  23. Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
  24. Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kom rek migda k wcytometria spektralnakom rki o rodka rozmna aniaodporno adaptacyjnahodowla in vitroinhibitor PP2Aanaliza oddzia ywa mi dzykom rkowychizotyp kom rek B

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.