Wydajne przetwarzanie komórek pomocniczych pęcherzyków T migdałków i analiza funkcjonalna za pomocą wielowymiarowej cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pobierania i przetwarzania próbek migdałków, fenotypowania za pomocą wysokowymiarowej spektralnej cytometrii przepływowej oraz przeprowadzania analiz bez nadzoru.

Streszczenie

T pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) są podzbiorem komórek pomocniczych T CD4⁺, które pomagają w przełączaniu izotypów komórek B, tworzeniu centrum rozrodczego (GC), hipermutacji somatycznej i dojrzewaniu powinowactwa, pomagając w ten sposób w organizowaniu adaptacyjnych humoralnych odpowiedzi immunologicznych w wtórnych tkankach limfatycznych podczas infekcji, autoimmunizacji i szczepienia. Zrozumienie rozwoju i funkcji komórek Tfh ma kluczowe znaczenie dla projektowania skutecznych szczepionek i opracowywania ukierunkowanych strategii leczenia chorób obejmujących tę populację. Ludzkie komórki migdałków są dostępnymi narządami limfatycznymi błony śluzowej. Dają one wyjątkową możliwość profilowania odrębnych populacji immunologicznych, takich jak komórki Tfh i GC, badania interakcji międzykomórkowych, oceny dynamicznych funkcji komórkowych i odkrywania ich mechanizmów regulacyjnych na poziomie narządów. Ponadto hodowle in vitro komórek migdałków są proste w obróbce i umożliwiają ocenę biologii komórek Tfh w różnych warunkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania, izolacji, konserwacji i hodowli ludzkich komórek migdałków. Opisujemy również dwa zoptymalizowane panele spektralnej cytometrii przepływowej przeznaczone do dogłębnej charakterystyki komórek Tfh. Wreszcie, na przykładzie leczenia inhibitorem białka fosfatazy 2A (PP2A), pokazujemy skuteczność i moc nienadzorowanych analiz danych z wysokowymiarowej cytometrii przepływowej, skutecznie odkrywając różnice wywołane leczeniem w skali wielowymiarowej.

Wprowadzenie

T pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) są odrębnym podzbiorem limfocytów T pomocniczych CD4⁺, które są niezbędne do tworzenia i funkcjonowania centrów rozrodczych (GC) oraz produkcji przeciwciał limfocytów B. Komórki Tfh pochodzą z naiwnych limfocytów T CD4 ⁺ poprzez interakcje z komórkami prezentującymi antygen oraz integrację czynników wewnętrznych i zewnętrznych, w tym sygnalizacji receptora limfocytów T, interakcji kostymulujących z komórkami B, cytokinami i chemokinami¹. Komórki Tfh eksprymują CXCR5 i PD-1, które kierują ich położeniem w GC lub w jego pobliżu. BCL-6 jest głównym czynnikiem transkrypcyjnym krytycznym dla rozwoju, utrzymania i funkcji Tfh^1,2. Komórki Tfh odgrywają kluczową rolę w narastaniu humoralnej odpowiedzi immunologicznej, szczególnie w odpowiedziach na szczepionki oraz w obronie przed patogenami bakteryjnymi i wirusowymi. Nieprawidłowe odpowiedzi komórek Tfh są związane z różnymi zaburzeniami, w tym chorobami autoimmunologicznymi, niedoborem odporności i potencjalnie niektórymi formami raka^3,4,5,6. Zrozumienie ich funkcji i regulacji jest zatem ważne dla opracowania skutecznych strategii szczepień i terapii⁷.

W przeciwieństwie do innych komórek pomocniczych T CD4⁺, takich jak Th1, Treg i Th17, dla których systemy różnicowania in vitro są dobrze ugruntowane⁸, komórki Tfh są bardziej skomplikowane do zbadania, ponieważ ich rozwój obejmuje dynamiczne interakcje międzykomórkowe i wyspecjalizowane struktury anatomiczne⁷. W związku z tym badania nad komórkami Tfh w dużej mierze opierały się na fenotypowaniu ex vivo ludzkich obwodowych krążących komórek Tfh (cTfh) oraz modelach mysich in vivo. Badanie regulacji określonych cząsteczek na komórkach Tfh jest zatem trudne, szczególnie w przypadku ludzkich komórek Tfh⁹. W związku z tym dogłębne badanie ex vivo komórek Tfh pochodzących z tkanek limfoidalnych jest niezbędne do lepszego zrozumienia ludzkich komórek Tfh.

Migdałki, jako wtórne narządy limfoidalne, zawierają unikalne populacje komórek, które nie są obecne we krwi obwodowej, takie jak komórki pre-Tfh (CXCR5^intPD-1^int CD4⁺) i GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺), które odgrywają kluczową rolę w tworzeniu GCs. Co więcej, migdałki podniebienne są jednymi z najczęściej usuwanych tkanek w operacjach pediatrycznych i są łatwo dostępne, co czyni je nieocenionym źródłem tkanek ludzkich do badania złożonych mechanizmów immunologicznych obejmujących komórki Tfh. Ponieważ znajdują się w górnych drogach oddechowych, głównym miejscu infekcji wirusowych dróg oddechowych, migdałki stanowią korzystną tkankę do badania odpowiedzi immunologicznych na takie infekcje wirusowe. Na przykład nasze laboratorium wcześniej scharakteryzowało komórki Tfh w migdałkach i migdałkach gardłowych dzieci, które przeszły rekonwalescencję po COVID-19 i porównało te tkanki z tymi z niezakażonych grup kontrolnych¹⁰. W tym miejscu przedstawiamy nasz protokół przetwarzania i przechowywania komórek migdałków. Używając jako przykładu migdałków traktowanych inhibitorem PP2A, szczegółowo opisujemy, jak scharakteryzować te komórki za pomocą wielowymiarowej spektralnej cytometrii przepływowej i analizować dane za pomocą analizy bez nadzoru.

Protokół

Kodeks Etyczny Światowego Stowarzyszenia Lekarzy (Deklaracja Helsińska) był przestrzegany we wszystkich badaniach na ludziach w tym badaniu. Próbki migdałków ludzkich uzyskano od pacjentów z przerostem grudeczki adenotonsillarnej powodującym zaburzenia oddychania podczas snu lub obturacyjny bezdech senny, pochodzące z Oddziału Otolaryngologii Dziecięcej, Children's National Hospital, Washington, DC, USA. Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) w Children's National Hospital (numer protokołu IRB 00009806). Świadoma zgoda została podpisana przez rodziców lub opiekunów wszystkich włączonych uczestników, a zgoda została uzyskana od małoletnich uczestników w wieku 7 lat i starszych.

1. Pobieranie migdałków ludzkich oraz izolacja i przechowywanie pojedynczych komórek

1. Izolacja pojedynczych komórek migdałków
   1. Pobieranie próbek chirurgicznych
      1. Pobrać migdałki od pacjentów poddawanych tonsillektomii i zebrać świeże fragmenty tkanek na sali operacyjnej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 25-35 ml lodowato zimnego sterylnego podłoża migdałkowego: RPMI uzupełnionego 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,05 mg/ml gentamycyny, 10 mM glutaminy i mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej (100 jednostek/ml streptomycyny, 100 jednostek/ml penicyliny, i 0,25 μg/ml amfoterycyny B).
         UWAGA: Migdałki w powyższej pożywce mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc i przetwarzane następnego dnia. Minimalną utratę żywotności komórek odnotowano przy przechowywaniu przez noc w porównaniu z przetwarzaniem tego samego dnia (Rysunek 1A). Migdałki mogą być również wysyłane w nocy na lodzie.
   2. Obróbka migdałków
      UWAGA: Wszystkie podłoża, i narzędzia chirurgiczne muszą być sterylne, a izolacja komórek migdałków powinna być wykonywana na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
      1. Umieścić migdałki na plastikowym naczyniu do hodowli komórek o średnicy 60 mm zawierającym 5 ml schłodzonej pożywki migdałkowej. Praca na lodzie. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek lub skalpela ostrożnie usuń wszelkie widoczne skrzepy krwi, tłuszcz i tkankę łączną (Rysunek 1B, C).
      2. Przenieś migdałki do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm z 5 ml lodowatego podłoża migdałkowego. Pokrój kawałki migdałków na 3-5 mm fragmenty.
      3. Przygotować nowe naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm z 10 ml zimnej pożywki migdałkowej i umieścić w nim sitko do komórek o średnicy 70 μm.
      4. Przenieść fragmenty migdałków do sitka i rozbić je za pomocą końcówki tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml przez sitko.
      5. Zebrać pożywkę zawierającą komórki na zewnątrz sitka w naczyniu i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      6. Dodaj dodatkowe 10 ml pożywki migdałkowej do naczynia z sitkiem, rozbij fragmenty migdałków tłokiem i zbierz pożywkę do stożkowej probówki. W przypadku dużych migdałków powtórz ten krok jeszcze 2-3 razy, aż w sitku pozostaną tylko fragmenty tkanki łącznej. Pozostałe chusteczki i zużyte płytki należy umieścić w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i w odpadach medycznych.
      7. Napełnij stożkową rurkę o pojemności 50 ml do góry pożywką migdałkową.
      8. Wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Wydłużenie wirowania do 20 minut może zwiększyć wydajność.
      9. Usunąć supernatant przez ostrożne odsysanie lub pipetowanie i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) w temperaturze pokojowej (RT) w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 35 ml schłodzonego PBS, aby zapobiec dalszej lizie. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      10. Przemyć raz 50 ml schłodzonego PBS i odwirować. Zawiesić za pomocą 10 ml PBS i przecedzić komórki przez plastikowe sitko o pojemności 70 μm. Policz komórki.
2. Kriokonserwacja komórek migdałków
   1. Przygotować pożywkę zamrażającą (90% inaktywowany termicznie FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)).
      UWAGA: Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
   2. Odwirować zawiesinę komórek (etap 1.1.2.10) w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek za pomocą pożywki zamrażającej.
      UWAGA: Zalecamy zamrożenie komórek w gęstości 10 × 10⁶ do 50 × 10⁶ komórek/ml pożywki do zamrażania¹¹.
   3. Podwielokrotność 0,5-1 ml zawiesiny komórkowej do sterylnych kriowialiów. Zamrozić fiolki w pojemnikach do zamrażania o kontrolowanej szybkości w temperaturze -80 °C. W ciągu jednego tygodnia przenieść fiolki do zbiornika zawierającego ciekły azot w celu długotrwałego przechowywania.
3. Rozmrażanie zamrożonych komórek
   UWAGA: Podejście do rozmrażania sekwencyjnego i rozcieńczania, do którego odwołuje się protokół przygotowania próbki do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, opisano poniżej¹². Inne metody rozmrażania mogą również działać, ale znaleźliśmy większą żywotność komórek przy tym podejściu w porównaniu z natychmiastowym umieszczeniem komórek w ciepłym buforze rozmrażania (Rysunek 1D). Bufor do mycia można przygotować z wyprzedzeniem. Bufor do rozmrażania składa się z buforu do przemywania oraz 0,1 mg/ml DNazy I (DNazę I należy dodać tuż przed rozpoczęciem rozmrażania). Wydłużenie czasu wirowania do 1 min/ml (dla probówek 15 ml) jest opcjonalne w celu zwiększenia wydajności komórek.
   1. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 37 °C. Rozgrzać rozmrożenie i przepłukać bufor w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wszystkie płukanie komórek odbywa się w RT.
   2. Rozmrażać kriowiale w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty natychmiast po wyjęciu z magazynu. Unikać całkowitego zanurzania fiolki w łaźni wodnej. Wyjąć fiolkę z łaźni wodnej, gdy pozostaje widoczny mały kryształek lodu.
   3. Delikatnie przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Przepłucz kriowial 0,5 ml wstępnie podgrzanego buforu do rozmrażania i dodaj płukanie kropla po kropli (1 kropla co 5 s) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, delikatnie potrząsając probówką do wymieszania.
   4. Rozcieńczyć komórki sekwencyjnie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, stopniowo dodając 2 ml, a następnie 4 ml pożywki z czasem oczekiwania ~1 min między dodaniami. Dodawaj pożywkę w ilości 1 ml co 3-5 s do probówki, delikatnie mieszając, aby wymieszać.
   5. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Usunąć supernatant, zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu do rozmrażania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   7. Dodać 10 ml buforu do przemywania (bez DNazy I). Ponownie odwirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przemyć jeszcze raz: usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml buforu do płukania. Wirować przy 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm. Ponownie odwirować przez 5 minut w temperaturze 400 × g w temperaturze pokojowej i policzyć komórki. Zawiesić w pożywce hodowlanej.

2. Pomiar ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych i czynników transkrypcyjnych po leczeniu ex vivo

UWAGA: Tutaj szczegółowo opisujemy naszą metodę charakterystyki fenotypowej komórek Tfh migdałków przy użyciu dwóch paneli wysokowymiarowej cytometrii przepływowej. Biorąc pod uwagę, że aktywność PP2A jest niezbędna dla optymalnej ekspresji białka BCL-6 i różnicowania Tfh⁴, ilustrujemy naszą ocenę utrzymania i funkcjonalności komórek Tfh poprzez badanie komórek migdałków traktowanych inhibitorem PP2A kantarydyną (CAN).

1. Barwienie metodą cytometrii przepływowej
   1. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych
      UWAGA: Inkubacje wykonywane są w ciemności. Odczynniki, przeciwciała i ich odpowiednie ilości na studzienkę użytą w obu panelach są wymienione w Tabeli Materiałów. Aby ocenić degranulację limfocytów T, przeciwciało anty-CD107a jest dodawane na etapie leczenia, aby zminimalizować wyniki fałszywie ujemne spowodowane jego internalizacją¹³.
      1. Płytka 2 × 10⁶ komórek migdałków z 200 μl pożywki hodowlanej (1 × 10⁷ komórek/ml) w 96-dołkowej studzience na dnie U z następującymi ilościami inhibitora PP2A CAN przez 16 godzin: kontrola nośnika, 3 μM i 6 μM.
         UWAGA: CAN rozpuszczono w 0,1 M z 1% DMSO.
      2. Dodaj monenzynę (0,7 μl / ml), brefeldynę (1:1 000), octan mirystynianu forbolu (50 ng / ml, PMA), jonomycynę (1 000 ng / ml) i 2 μl anty-CD107a do każdej studzienki przez 2,5 godziny w inkubatorze 5% CO₂ w temperaturze 37 ^oC. Całkowita objętość kultury wynosi 200 μl na studzienkę.
      3. Odwirować przeciwciała barwiące w temperaturze ~16 000 × g przez 3-5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów przeciwciał. Przygotować mieszaninę przeciwciał powierzchniowych dla etapu 2.1.1.8, który obejmuje wszystkie przeciwciała powierzchniowe z wyjątkiem receptorów chemokin, Brilliant Stain Buffer Plus i buforu FACS (objętość każdego z nich podana w tabeli materiałów, całkowita 112 μl mieszaniny na reakcję).
      4. Po zakończeniu 2,5 godziny w hodowli, przemyć komórki 2x 200 μl lodowatego PBS przez odwirowanie przy 400 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Pomiędzy płukaniami odrzucić supernatant poprzez szybkie odwrócenie płytki. Wykonaj barwienie na tej samej płycie.
      5. Inkubować komórki w 100 μL/basenik rozcieńczonego w 1:800 LIVE/DEAD Blue barwnika w PBS przez 15 minut w temperaturze suchej. Przemyć 2x 200 μL buforu FACS.
      6. Ponownie zawiesić komórki za pomocą True Stain Monocyte Blocker (5 μL blokera monocytów + 45 μL buforu FACS na studzienkę) na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Sekwencyjnie dodawać przeciwciała receptora chemokiny bezpośrednio do reakcji barwienia (najpierw anty-CXCR3 i anty-CCR7 przez 10 minut każdy, a następnie mieszanina anty-CXCR5 i anty-CCR6 wraz z 10 μL Brilliant Stain Buffer Plus przez 5 minut w temperaturze pokojowej). Dobrze wymieszać po każdym dodaniu, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z objętościami przeciwciał.
      8. Dodać powierzchniową mieszaninę przeciwciał przygotowaną w kroku 2.1.1.3 bezpośrednio do reakcji barwienia i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Całkowita objętość barwienia na reakcję wynosi 180 μL: 50 μl blokera monocytów w buforze (patrz krok 2.1.1.6) + 18 μl przeciwciał przeciwko receptorowi chemokiny (patrz etap 2.1.1.7) + 112 μl powierzchniowej mieszaniny przeciwciał (patrz etap 2.1.1.3).
      9. Przemyć 2x 200 μL zimnego buforu FACS.
      10. Ponownie zawiesić komórki i inkubować z 80 μl/basenik buforu utrwalającego na bazie paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      11. Dodaj 160 μl 1x buforu permeabilacyjnego do każdej studzienki, która już zawiera bufor utrwalający. Odwirować płytkę o stężeniu 400 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i przemyć 1x 200 μl buforu permeabilizacyjnego.
      12. Przygotuj mieszankę przeciwciał przeciwko cytokinom wewnątrzkomórkowym (ICS), która zawiera przeciwciała przeciwko cytokinom, Brilliant Stain Buffer Plus i bufor do permeabilizacji (całkowita objętość 50 μL/dołek, tabela materiałów). Inkubować komórki z tą wewnątrzkomórkową mieszanką przeciwciał cytokinowych w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      13. Przemyć 2x 200 μl/dobrze buforem przepuszczalnym. Zawiesić w 200 μl/studzienkę buforu FACS.
      14. Przechowuj wybarwione komórki w temperaturze 4 °C w ciemności i uzyskaj dane na spektralnym cytometrze przepływowym w ciągu 24 godzin, aby zminimalizować utratę intensywności barwienia¹⁴.
   2. Barwienie jądrowych czynników transkrypcyjnych
      1. Hodować komórki za pomocą CAN, jak w kroku 2.1.1.1 (bez stymulacji komórek).
      2. Dodać przeciwciało anty-ludzkie CD40 (0,5 μg/ml) do pożywki hodowlanej i hodować z komórkami przez 15 minut przed rozpoczęciem barwienia. Jeśli komórki są stymulowane, dodaj to przeciwciało 15 minut przed rozpoczęciem stymulacji, aby zapobiec internalizacji CD40L po aktywacji^15,16.
      3. Odwirować przeciwciała barwiące i przygotować powierzchniową mieszaninę przeciwciał podobną do kroku 2.1.1.3: przeciwciała powierzchniowe w tabeli materiałów, 10 μL/studzienkę Brilliant Stain Buffer Plus i 54,1 μL/studzienkę buforu FACS.
         UWAGA: Całkowita objętość barwienia na studzienkę wynosi 180 μl: 50 μl blokera monocytów w buforze + 13 μl przeciwciał receptora chemokiny + 117 μl powierzchniowej mieszaniny przeciwciał.
      4. Umyj komórki i wykonaj barwienie LIVE/DEAD Blue oraz barwienie powierzchni i mycie jak w krokach 2.1.1.5-2.1.1.8.
         UWAGA: Przeciwciało anty-CXCR3 nie jest zawarte w tym panelu.
      5. Napraw komórki za pomocą 80 μl buforu utrwalającego jądrowy czynnik transkrypcyjny z zestawu barwiących FoxP3 / czynnik transkrypcyjny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      6. Przemyć komórki buforem do permeabilizacji, jak w kroku 2.1.1.11.
      7. Przygotuj wewnątrzkomórkową mieszaninę przeciwciał przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu (TF), która zawiera przeciwciała przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu wymienione w tabeli materiałów, 10 μl Brilliant Stain Buffer Plus i 16 μl buforu permeabilizacji (całkowita objętość 40 μL/studzienkę). Inkubować komórki z tą mieszanką przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      8. Przemyć i pobrać na cytometr spektralny jak w krokach 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Nienadzorowana analiza danych z wysokowymiarowej cytometrii przepływowej

UWAGA: Oprogramowanie, pakiety i ich wersje używane do analizy są wymienione w Tabeli Materiałów. Zrzuty ekranu z kroków od 3.2 do 3.4 znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Przykładowe skrypty z kroków 3.5 do 3.7 znajdują się wPliku uzupełniającym 2 i Pliku uzupełniającym 3, kroki od 3.8 do 3.9 znajdują się w Pliku uzupełniającym 4 i Pliku uzupełniającym 5. Nieprzetworzone pliki ICS i nieprzetworzone pliki TF dla skryptów są dostępne odpowiednio w pliku uzupełniającym 6 i pliku uzupełniającym 7.

1. Otwórz obszar roboczy oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, w którym przechowywane są pliki ".fcs" i zakończ bramkowanie, jak pokazano na Rysunek 1E.
2. Kliknij prawym przyciskiem myszy węzeł docelowy (w tym przypadku limfocyty T CD4⁺). Wybierz opcję Wybierz równoważne węzły.
3. Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy węzeł docelowy. Wybierz opcję Eksportuj/łącz populacje.
4. Poczekaj na otwarcie okna Populations: Export or Concatenate (Populacje: Eksport lub Konkatenacja), wybierz wartości kanału CSV i wybierz miejsce docelowe dla eksportowanych plików. Uwzględnij wszystkie komórki w polu Uwzględnij zdarzenia i wybierz pozycję Wszystkie parametry kompensowane w polu Parametry. Rozwiń okno Opcje zaawansowane, wpisz prefiks, aby zmienić nazwy plików, a następnie kliknij przycisk eksportuj, aby wyeksportować pliki do folderu docelowego (wyeksportuj jeden plik .csv dla każdej próbki).
5. Odczytaj wyeksportowane pliki "*.csv" za pomocą R (po jednym dla każdej próbki). Przypisz identyfikator próbki do każdej komórki i połącz komórki ze wszystkich próbek w jedną ramkę danych.
6. Dodawanie lub scalanie metadanych (dodatkowych informacji o próbkach) do ramki danych.
7. Losowo zmniejsz próbkowanie równej liczby komórek na próbkę do następnej analizy. Ten krok jest opcjonalny.
   UWAGA: W tym przykładzie 8,000 limfocytów T CD4 ⁺ pobrano próbki z całkowitej liczby limfocytów T CD4 ⁺ każdego stanu, co stanowi co najmniej 1/7 całkowitej liczby limfocytów T CD4 ⁺.
8. Utwórz obiekt Seurat: interpretuje wartości kanału dla markerów przeciwciał jako poziomy ekspresji genów podczas tworzenia obiektu Seurat.
   1. Utwórz obiekt Seurat z ramką danych wygenerowaną w kroku 3.6. Pomiń krok NormalizeData i zapisz je bezpośrednio jako test "danych".
   2. Z panelu przepływu wybierz znaczniki powierzchni, które mają być używane jako obiekty zmienne w klastrowaniu nienadzorowanym.
   3. Uruchom ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP jako standardowy potok wprowadzony z Seurat, z wyjątkiem NormalizeData step¹⁷.
   4. Dostosuj parametr rozdzielczości w kroku FindClusters, aby zmodyfikować liczbę klastrów, zapewniając, że dokładniej odzwierciedlają one podstawowy kontekst biologiczny.
9. Korzystaj z narzędzi do wizualizacji, takich jak DimPlot i FeaturePlot kompatybilnych z pakietem Seurat. W przypadku porównywania grup, które zawierają wiele prób na grupę, należy obliczyć procent każdej grupy dla każdego pacjenta i przeprowadzić porównania statystyczne. Następnie użyj modeli matematycznych do bardziej zaawansowanych analiz statystycznych¹⁰.

Wyniki

Aby porównać ogólną żywotność komórek, przecięliśmy migdałek na trzy podobne części i przetworzyliśmy je za pomocą naszego protokołu pod trzema warunkami: (1) przetwarzanie tego samego dnia, (2) przechowywanie przez noc w temperaturze 4 °C i (3) przechowywanie przez noc na lodzie. Żywotność między tymi trzema warunkami była dość podobna, bez żadnej znaczącej różnicy (Rysunek 1A). Oceniliśmy również wpływ procesu rozmrażania na żywotność komórek. Zastosowana przez nas metoda rozmrażania kroplowego skut...

Dyskusja

W przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień, że świeże migdałki powinny być przetwarzane w ciągu 3 godzin po operacji¹⁹, stwierdziliśmy, że świeże próbki migdałków mogą zachować swoją żywotność, gdy są przechowywane w temperaturze 4 °C i przetwarzane w ciągu 24 godzin. Aby zoptymalizować żywotność komórek z tkanki migdałków po rozmrożeniu z magazynowania ciekłego azotu, przyjęliśmy metodę rozmrażania kroplami zalecaną w sekwencjonowaniu pojedynczych komórek, gdzie bardzo ceni się wysoką żywotnoś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maszyny i instrumenty
3 mL Plastikowa strzykawka	BD	309657
96 Well U Bottom Plate	Thermo Scientific	163320
1,2 mL Fiolki kriogeniczne	Corning	430487
Sitko do komórek 70 i mikro; m Nylon	Falcon	352350
Naczynie do hodowli komórkowych (60 mm)	VWR	10062-890
Wirówka	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 Cyfrowa kąpiel wodna MyBath 2L	Benchmark	B2000-2
Drobne nożyczki - Sharp	FST	14060-11
Plastikowe futerały na instrumenty	FST	20830-05
Spektralny cytometr przepływowy, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Kleszcze o standardowym wzorze	FST	11000-13
Standardowe kleszcze	FST	11000-20
Analizator żywotności komórek Vi-cell Blu	Beckman Coulter	C19201
Odczynniki
0,5 M EDTA pH 8,0	Jakość Biologia	351-027-101
2-merkaptoetanol	Gibco	21985-023
ACK bufor lizujący	Gibco	A10492-01
Mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybicza (zawiesina penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B, 100x)	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385
Kantarydyna	Sigma	C7632-25MG
Bufor utrwalający Cytofix	BD	554655
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAaza I	Roche	10104159001
Płod Surowica bydlęca (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny	eBioscience	00-5523-00
Gentamycyna (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Jonomycyna	Sigma	I0634-1mg
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Paraformaldehyd 16% roztwór, klasa EM (PFA)	Mikroskopia elektronowa   Nauka	15710	Rozcieńczony PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Pojemniki do zamrażania o kontrolowanej szybkości	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-glutamina)	Gibco	11875-085
Pirogronian sodu (100 mM)	Gibco	11360-070
Bloker monocytów True-Stain	BioLegend	426103
Buffers
Culture medium			10% inaktywowany termicznie FBS (VWR), 2 nM glutamina, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 1% penicylina/ streptomycyna, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES, 1% aminokwasów endogennych w RPMI (+L-glutamina)
Bufor			2 mM EDTA i 2% inaktywowany termicznie FBS w PBS
Pożywka			90% inaktywowany termicznie FBS i 10%
		do rozmrażania	Bufor płuczący + 0,1 mg/ml DNaseI
Pożywka			migdałkowaRPMI uzupełniony o 5% inaktywowany termicznie FBS, 10 mM glutaminy, 0,05 mg/ml gentamycyny, 1% mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybiczą   (penicylina, streptomycyna i amfoterycyna B).
Bufor			RPMI (+L-glutamina) uzupełniony o 10%  inaktywowany termicznie FBS i 10 mM HEPES
przeciwciała i inne regenty do panelu cytokin
Biotyna anty-ludzka CD107a (LAMP-1) Przeciwciało	BioLegend	328604	2 μ L w 200 μ L kompletna pożywka hodowlana na basenik. Przeciwciało to dodawano do komórek podczas stymulacji PMA/jonomycyny.
Live Dead barwienie	100 μ L mix na studzienkę
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L w 100 μ L PBS na studzienkę.
blok monocytów	50 μ L mieszaniny na studzienkę
Bufor blokujący monocyty	BioLegend	426103	5 μ L Bloker monocytów True Stain i 45 μ Bufor L FACS na basen
powierzchniowe przeciwciała dla panelu cytokin
receptorów			i mu; L/dobrze
Anty-ludzki CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anty-ludzki CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anty-ludzki CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anty-ludzki CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	18 μ Mieszaj L na studzienkę dla receptorów chemokin; Dodać skierowany do komórek z buforem
< silny > inna mieszanina przeciwciał powierzchniowych< / strong>			mu; L/dobrze
Anty-ludzki CD103-BUV661	BD	749993	2.5
Anty-ludzki CD14-Iskra Niebieski 550	BioLegend	367148	2.5
Anty-ludzki CD19-Iskra NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anty-ludzki CD25-BB515	BD	564467	10
Anti-human CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-human CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-human CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-human CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-human CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anty-ludzki CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anty-ludzki CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anty-ludzki CD69-BUV563	BD	748764	1
Anty-ludzki CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anty-ludzki FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anty-ludzki HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-human PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-human-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
Bufor			61
			112 μ L mieszaniny na basenik dla innych przeciwciał powierzchniowych; Dodać bezpośrednio do buforu blokowego monocytów (50 μ L) i mieszanina receptorów chemokiny (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L ogółem na studzienkę)
wewnątrzkomórkowe przeciwciała cytokinowe dla panelu cytokin			μ L/dobrze
Anty-ludzki Granzyme B-PE	BD		561142 1
Anty-ludzki IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
Anty-ludzki IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anty-ludzki IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anty-ludzki IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anty-ludzki IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anty-ludzka perforyna-APC	BioLegend	353312	2.5
Anty-ludzki TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0,1
Anty-IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0,25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1x bufor przepuszczalny	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ Mieszanina L na dołek)
Przeciwciała i inni regenci do panelu czynników transkrypcyjnych< / strong>
CD40 Przeciwciało, anty-ludzkie	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 i mu; g/ml pożywki do stężenia roboczego
barwienie żywych trupów	100 μ L mix na studzienkę
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L w 100 μ L PBS na studzienkę.
Bufor blokujący monocyty	BioLegend	426103	5 μ L Bloker monocytów True Stain i 45 μ Bufor L FACS na basena
przeciwciała powierzchniowe dla panelu czynników transkrypcyjnych
receptory chemokine mix			μ L/dobrze
Anty-ludzki CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anty-ludzki CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anty-ludzki CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	13 μ Mieszanina L na studzienkę
< silną > inną mieszaninę przeciwciał powierzchniowych< / strong>			μ L/dobrze
Anty-ludzki 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
Anty-ludzki CD14-Iskra Niebieski 550	BioLegend	367148	2.5
Anty-ludzki CD19-Iskra NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anty-ludzki CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anty-ludzki CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
Anty-ludzki CD3-BV510	BioLegend		344828 2.5
Anty-ludzki CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anty-ludzki CD4-Pacific Niebieski	BioLegend	317423	1
Anty-ludzki CD40L-PE	BD		15
Anty-ludzki CD45RA-BUV395	BD	740315	0,6
Anty-ludzki CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anty-ludzki CD69-BUV650	BioLegend		310934 2.5
Anty-ludzki CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anty-ludzki HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anty-ludzki ICOS-BUV563	BD		741421 1.2
Anty-ludzki OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-human PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-human-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
bufor			54.1
			117  μ L mieszaniny na basenik dla innych przeciwciał powierzchniowych; Dodać bezpośrednio do bloku monocytów  bufor (50 μ L) i mieszanina receptorów chemokiny (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L łącznie na basenik)
przeciwciała czynnika transkrypcyjnego dla panelu czynnika transkrypcyjnego	μ L/dobrze
Anty-ludzki T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anty-ludzki Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anty-ludzki FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anty-ludzki GATA3-BB700	BD	566642	2
Anty-ludzki Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0,4
Anty-ludzki Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x bufor permeabilizacyjny	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L mieszanina na dołek
Oprogramowanie i pakiety do analizy bez nadzoru
	Software/package	Version	Source
1	data.table	1.16.2	The Comprehensive R Archive
Network 2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	mapa do oszukiwania	1.0.12	Kompleksowa sieć archiwów R
4	R	4.3.2	Kompleksowa sieć archiwów R
5	readxl	1.4.3	Kompleksowa sieć archiwów R
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	Kompleksowa sieć archiwów R
8	SeuratData	0.2.2.9001	Kompleksowa sieć archiwów R
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	Kompleksowa sieć archiwów R
11	viridis	0.6.5	Kompleksowa sieć archiwów R