Optymalizacja procedur biopsji piersi i pobierania próbek po mastektomii dla biobankowania, medycyny spersonalizowanej i zastosowań badawczych

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pobierania próbek raka piersi, zaprojektowany tak, aby zoptymalizować ich zastosowanie w biobankowaniu, medycynie spersonalizowanej i innych zastosowaniach badawczych. Szczegółowo opisano proces pobierania próbek, w tym biopsję piersi i mastektomii, koncentrując się na minimalizacji uszkodzeń tkanek i maksymalizacji jakości próbki.

Streszczenie

Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem dotykającym kobiety, szczególnie w Azji, z najwyższą zachorowalnością na Filipiny. Pomimo ciągłych starań, wiedza o biologii raka piersi pozostaje niewystarczająca, co pogłębia brak skutecznych programów przesiewowych i terminowego leczenia. W celu rozwiązania tych problemów biobanki i inne repozytoria okazów biologicznych zyskały globalną popularność. Uniwersytet Filipiński – Filipiński Szpital Ogólny (UP-PGH) utworzył biobank onkologiczny, co potwierdza realność inicjatywy wspieranej przez rząd na rzecz badań nad rakiem na Filipinach. Badanie obejmuje prospektywną obserwację 100 filipińskich pacjentek z rakiem piersi na różnych etapach choroby, wykorzystując wiedzę UP-PGH, Philippine Genome Center (PGC) oraz University of the Philippines Diliman - Institute of Biology (UPD-IB). Integruje zbieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek biologicznych wraz z kompleksowymi danymi pacjentów. Procedury obejmują ekstrakcję RNA, przygotowanie biblioteki oraz sekwencjonowanie. Dodatkowo, część pacjentów bierze udział w eksperymentie in vitro z trójwymiarową (3D) hodowlą komórek w celu przedchemioterapeutycznego badania przesiewowego. Zagregowane dane mają na celu odkrycie strategii terapeutycznych, które mogą prowadzić do spersonalizowanych metod leczenia tam, gdzie standardowe metody kliniczne są niewystarczające. Kluczowe techniki obejmują biopsję igły z igły pod sterowaniem ultrasonograficznym, skrupulatne pobieranie prawidłowej tkanki piersi oraz precyzyjne określanie procentowej liczby guzów, aby zapewnić wysokiej jakości ekstrakcję RNA, sekwencjonowanie i hodowlę komórek 3D. Badanie porusza również wyzwania napotkane w wcześniejszych przedsięwzięciach biobankowych. Ostatecznie celem tych badań jest znaczący wkład w badania nad rakiem piersi, pozycjonując się jako wzór dla badań współpracy, zakładania biobanków oraz rozwoju medycyny precyzyjnej w krajach rozwijających się, takich jak Filipiny.

Wprowadzenie

Rak piersi jest najczęstszą formą nowotworu wśród kobiet filipińskich. W Azji Filipiny wykazują jeden z najwyższych wskaźników śmiertelności z powodu raka piersi oraz najniższy stosunek śmiertelności do zachorowalności¹. Wskaźniki te mogły być znacznie ograniczone przez brak programów przesiewowych oraz terminowego i skutecznego leczenia raka piersi. W kraju rak piersi jest zazwyczaj diagnozowany w późniejszych stadiach, ponieważ większość pacjentów onkologicznych konsultuje się tylko w zaawansowanych stadiach nowotworowych. Na Filipinach, gdzie obserwuje się wysoką częstość zachorowań na raka piersi, 53% przypadków raka piersi zdiagnozowano w stadium III i IV, a tylko 2-3% w stadium I ^1,2,3. Poza promowaniem badań przesiewowych i edukacji pacjentów na temat raka piersi, badania i rozwój związany z rakiem piersi powinny być dalej rozwijane, aby zmniejszyć zachorowalność na raka piersi w kraju.

Utworzenie biobanków na całym świecie umożliwiło przyspieszenie postępu medycznego. Biobanki są wykorzystywane do przechowywania i konserwacji naukowo wartościowych okazów biologicznych na potrzeby przyszłych badań i rozwoju⁴. Od tego czasu biobanki są wykorzystywane do badań translacyjnych⁵ oraz ulepszania spersonalizowanych podejść medycznych⁶. W Azji biobanki są głównie skoncentrowane w Azji Wschodniej, zwłaszcza w Chinach, Japonii i Korei⁴. W krajach Azji o niskich i średnich dochodach, takich jak Filipiny, koncepcja biobankowości wciąż się rozwija. Biobanki na Filipinach są w większości własnością prywatnych instytucji medycznych, gdzie stan zdrowia i ekspozycji szerszej grupy demograficznej Filipin mogą nie być dobrze reprezentowane.

Utworzenie biobanku onkologicznego na Uniwersytecie Filipińskim w Manili (UPM) w Philippine General Hospital (PGH) udowodniło wykonalność utworzenia rządowego biobanku onkologicznego, który może rozwijać badania związane z nowotworem na Filipinach⁷. Opierając się na tym fundamencie poprzez wspólne działania łączące wiedzę medyczną, innowacje badawcze i politykę zdrowotną, dążymy do pozytywnej zmiany w opiece i badaniach nad rakiem piersi na Filipinach. W związku z tym konieczne jest wprowadzenie procesu biobankowania fenomenów nowotworowych oraz rozszerzone podejście, które usprawni zbieranie rozbudowanych i stratyfikowanych danych specyficznych dla pacjentów na skalę krajową. Niniejsze badanie opisuje protokół biopsji piersi oraz procedur pobierania próbek po mastektomii, koncentrując się na ich integracji z ramami biobankowania. Przewidujemy nie tylko pogłębienie wiedzy o patogenezie raka piersi w kontekście filipińskiej populacji, ale także ułatwienie opracowania precyzyjnych metod leczenia zgodnych z unikalnymi cechami genetycznymi, środowiskowymi i klinicznymi osób dotkniętych.

Protokół

Jest to prospektywne, obserwacyjne badanie z kolekcją zdeidentyfikowanych próbek biologicznych (guz i prawidłowa tkanka piersi) oraz danych kliniczno-patologicznych, leczenia i wyników od 100 filipińskich pacjentek z rakiem piersi w różnych stadiach. Jest to współpraca pomiędzy Philippine General Hospital (PGH), Philippine Genome Center (PGC) oraz Institute of Biology (IB) Uniwersytetu Filipińskiego Diliman, z których każdy ma wyznaczone zadania. Protokół został zarejestrowany w Biurze Administracji Grantów Badawczych (RGAO-2020-0933) oraz przejrzany i zatwierdzony przez Radę Etyki Badań Badawczych Uniwersytetu Filipińskiego w Manili (UPMREB) do wdrożenia na podstawie numeru etycznego UPMREB 2020-822-01. Wszystkie wykorzystywane laboratoria przestrzegają wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego obowiązujących w każdej instytucji. Rekrutacja pacjentów z PGH zapewniła zróżnicowanie i reprezentację czynników kliniczno-patologicznych, pochodzenia etnicznego oraz ekspozycji środowiskowej. Standardowa procedura operacyjna (SOP) opracowana i zweryfikowana w poprzednich projektach została wykorzystana jako ramy do pozyskiwania, pobierania, transportu i innych logistycznych rozwiązań związanych z próbkami.

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 – Schematyczny przepływ protokołu , aby podsumować przepływ protokołu oraz role każdej instytucji zaangażowanej w badanie.

1. Procedura pobierania próbki przed pobraniem piersi

1. Zidentyfikuj i przesiewaj kwalifikujących się pacjentów do włączenia do badania podczas konsultacji klinicznej lub konferencji przedoperacyjnej.
   1. Kryteria włączenia pacjentów onkologicznych
      1. Wśród nich są Filipińczyczki, kobiety w wieku 19-75 lat zdiagnozowane z rakiem piersi w stadium 1, 2 i 3 oraz filipińskie kobiety w wieku 19-70 lat z rakiem piersi w stadium 3B i 4.
      2. Uwzględnić klinicznie podejrzewane lub patologicznie zdiagnozowane przypadki inwazyjnego raka piersi w dowolnym stadium.
      3. Uwzględnić pacjentów, którzy będą poddawani leczeniu chirurgicznemu (zmodyfikowana radykalna mastektomia lub radykalna mastektomia) zarówno na początku, jak i po neoadiuwantnej chemioterapii (stadium IIIB, IIIC). Pacjenci w stadium IIIA mogą przejść operację początkową lub terapię neoadiuwantową zgodnie z zaleceniami lekarza. Dla pacjentek w IV stadium, które są gotowe poddać się biopsji igłą rdzeniową guza piersi i przyległej tkanki prawidłowej. Pacjentki w IV stadium raka piersi nie poddają się leczeniu chirurgicznemu.
      4. Uwzględnić pacjentki z rakiem piersi w III stadium, które przeszły terapię neoadiuwantantną przed rekrutacją, a także istnieje pełna historia odpowiedzi na leczenie medyczne i kliniczne.
      5. Uwzględnij pacjentów, którzy potrafią zrozumieć i podpisać świadomą zgodę.
   2. Kryteria wykluczenia pacjentów onkologicznych
      1. Wykluczyć pacjentki z wcześniejszymi lub jednoczesnymi nowotworami, w tym z wcześniejszą diagnozą raka piersi.
      2. Wyklucz pacjentów z obustronnym rakiem piersi.
      3. Wykluczyć pacjentów, którzy wcześniej przeszli neoadiuwantową radioterapię lub terapię hormonalną.
      4. Wyłącz pacjentów, którzy przeszli wcześniejszą biopsję rdzeniową lub nacięciową, gdzie nie ma zgody na powtórzenie zabiegu biopsji u tych pacjentów, którzy będą poddawani neoadiuwantnej chemioterapii (ponieważ nie można pobrać świeżej próbki guza przed chemioterapią)
      5. Wykluczać pacjentów, którzy wcześniej przeszli biopsję wycięjową bez pozostałości guza.
      6. Wykluczać pacjentów z chorobami współistniejącymi uniemożliwiającymi leczenie chirurgiczne lub neoadiuwantną chemioterapię.
   3. Kryteria wycofania
      1. Poinformuj uczestników, że mogą się wycofać w dowolnym momencie ze względów bezpieczeństwa lub innych powodów, nie wpływając na ich opiekę medyczną. To nieinterwencyjne badanie nie wpłynie na wybór leczenia przez uczestników.
2. Uzyskaj zgodę pacjenta i wypełnij formularz zbierania danych.
   UWAGA: Wyznaczony współpracownik (FIC) lub konsultant, wraz z pracownikiem naukowym uniwersytetu (URA), uzyskuje zgodę.
3. Po potwierdzeniu udziału pacjenta w badaniu uzyskaj i zweryfikowaj harmonogram zabiegu biopsji igły rdzeniowej.
4. Przeprowadzanie procedur zgodnie z wytycznymi ustalonymi i zatwierdzonymi przez Komisję Rady Etyki oraz Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego instytucji.

2. Procedura pobrania próbki piersi

UWAGA: Zobacz Rysunek 2 dla szczegółowego przebiegu procedury biopsji piersi igłowej dla pacjentów na III i IV stadium, pokazując rozkład próbek dla każdego zabiegu.

1. Przed pobraniem próbki probówki należy oznaczyć jako GB, co oznacza Genomics - Breast (badanie, w którym znajduje się próbka), xxx, czyli numer uczestnika i może mieć od 001 do 100 lub więcej, oraz litery A, C i D. Poniżej znajdują się kody literowe, które należy używać przy oznaczaniu lamp:
   A - oznacza biopsję igły rdzeniowej, tkankę nowotworową, do wysłania do PGC
   C - oznacza biopsję igły rdzeniowej, tkankę nowotworową, do biobankowania
   D - oznacza biopsję igły rdzeniowej, tkanka prawidłowa
   1. Przypisz próbki do sekwencjonowania z etykietą laboratorium: "BC" oraz dwoma dwucyfrowymi numerami próbek (np. BC01, BC21). Każda próbka ma odpowiadający kod "GB", który koreluje z kodem przypisanym podczas pobierania próbki.
2. Pobierz do dziewięciu rdzeni tkanek za pomocą pistoletu do biopsji igły o masie 14 G pod okiem USG, w przychodni, na sali operacyjnej lub w innym środowisku asepticznym.
   1. Dla każdego rdzenia pobierz próbkę piersi o długości około 2 cm w centrum guza i 1 cm od guza dla sąsiedniej tkanki prawidłowej. Od każdego uczestnika zbierz dwa rodzaje próbek: tkankę nowotworową i tkankę normalną.
   2. Każdą próbkę należy przekazać URA do umieszczenia w szalce Petriego zawierającej roztwór soli fosforanowej (PBS).
      UWAGA: W tym badaniu biopsje igłą rdzeniową wykonano wyłącznie u pacjentek z rakiem piersi w stadium III i IV. U pacjentów w III stadium biopsje igły rdzeniowe dostarczały próbek guza nieznanych chemioterapii. U pacjentów w IV stadium biopsje igły rdzeniowej stanowiły główną próbkę guza, ponieważ mastektomia nie była wykonywana. U pacjentek z rakiem piersi w stadium I i II nie wykonano biopsji igłą rdzeniową. Zamiast tego pobrano guz i sąsiednie tkanki prawidłowe z próbek mastektomii.
3. Przetnij próbki biopsji na pół, aby równomiernie rozłożyć je między badanie a analizę histopatologiczną.
   1. W przypadku tkanki nowotworowej uzyskaj do 9 rdzeni na każdego badanego pacjenta za pomocą igły 14-G.
   2. Rdzenie guzów pozyskane w szalce Petriego podziel na 2 grupy: próbki do analizy RNA (6 rdzeni) oraz próbki do biobankowania (3 rdzenie).
   3. Każdy rdzeń pokrój na dwa wzdłuż, ale jeśli jest to trudne, przetnij rdzenie na dwa poprzecznie. Użyj sterylnego ostrza, żeby przeciąć rdzenie. Wyślij połowę rdzenia tkanki do analizy RNA lub przechowaj do biobankowania. Drugą połowę rdzenia tkanki wyślij do patologii na rutynową analizę histopatologiczną.
   4. Dla tkanek normalnych uzyskaj do 3 rdzeni na pacjenta badanego za pomocą igły 14G. Użyj innej igły niż ta, która służy do pobierania tkanek nowotworowych, aby uniknąć zanieczyszczenia. W przypadkach, gdy nie jest to możliwe, najpierw pobierz prawidłowe tkanki piersi, zanim przyjmiesz tkanki nowotworowe.
   5. Umieść każdą prawidłową tkankę pobraną w szalce Petriego, podobnie jak zrobiono to z tkankami nowotworowymi, i przetnij rdzenie na pół. Rozdaj próbki do badania oraz do Oddziału Patologii w celu analizy histologicznej.
4. Po zebraniu próbek rozdziel je między probówki, zgodnie z określonym sposobem i kolejnością priorytetów.
   1. Umieść połowę rdzeni w wyznaczonym 2 mL kriovialnym roztworze stabilizującym RNA (wszystkie rdzenie do analizy RNA umieszczone razem w jednej fiolce, a wszystkie rdzenie do biobankowania w osobnej fiolce, utrzymywać próbki w niskiej temperaturze przez cały czas) i umieszczać odpowiednie połowy tych rdzeni w zwykłej fiolce/probówce próbki i utrwalać 10% neutralną buforowaną formaliną (10% NBF), do analizy histopatologicznej. Upewnij się, że dwie odpowiadające sobie półgrupy, ta trafiająca do wyznaczonego ośrodka (np. próbki wysłane do analizy RNA) oraz odpowiadający mu preparat patologiczny mają ten sam kod próbki.
5. Wypełnij formularze patologii chirurgicznej. Wraz z formularzami przekaż do patologii preparaty z patologii poddane formaliną do rutynowej histopatologii.
6. Zabezpiecz parafilmem próbki biopsji igły rdzeniowej namoczone w probówkach zawierających roztwór stabilizujący RNA (idealnie stosunek 5:1 roztworu do tkanki, czyli jeśli 0,25 cm tkanki, 1,25 mL roztworu stabilizującego RNA).
7. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, a następnie przelewaj je do ultra-niskiej zamrażarki w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Przewodnik dotyczący przechowywania zostanie omówiony w Sekcji 4 (Przechowywanie, pakowanie i transport próbek).

3. Procedura pobrania próbki mastektomii piersi

1. Postępuj zgodnie z procedurą pobierania próbek przed pobraniem piersi w Sekcji 1.
   UWAGA: Pacjenci w stadiach I, II i III zaangażowani w badanie zostaną poddani mastektomii na sali operacyjnej (OR). U pacjentów na etapach I i II mastektomia będzie wykonywana na początku, natomiast u pacjentów w stadium III mastektomia dopiero po ukończeniu 8 cykli terapii neoadiuwantum. W stadium 4 nie pobiera się próbek mastektomii. Zobacz Rysunek 3 , aby zobaczyć szczegółowy protokół pobierania próbek po mastektomii piersi, pokazujący rozkład próbek w poszczególnych procedurach.
2. Koordynuj harmonogram z współpracownikami i działem patologii. Zrób to co najmniej 2 dni przed docelową datą zabiegu. W przypadku zmian w ustalonym harmonogramie należy natychmiast poinformować odpowiednie osoby, aby uniknąć konfliktów w harmonogramie.
3. Przed pobraniem próbki przedtem oznacz probówki jako GB, czyli Genomics Breast (badanie, w którym znajduje się próbka), xxx, czyli numer uczestnika, który może mieć od 001 do 100 lub więcej, oraz litery E i F. Poniżej znajdują się kody literowe, które należy używać przy oznaczaniu lamp:
   E oznacza mastektomię, tkankę nowotworową, do wysyłki do PGC, IB oraz do biobankowania
   F - oznacza mastektomię, prawidłową tkankę
   1. Przypisz próbki przesłane do sekwencjonowania z etykietą laboratorium: "BC" oraz dwucyfrowym numerem próbki (np. BC01, BC21). Każda próbka ma odpowiadający kod "GB", który koreluje z kodem przypisanym podczas pobierania próbki.
4. Wypełniaj formularze patologii chirurgicznej podczas operacji, czekając na próbkę. Przesyłaj aktualizacje do patologa odpowiedzialnego, aby mógł przygotować się do pobrania okazów.
5. Po usunięciu i dokumentacji próbki włóż próbkę do czystej plastikowej torby na próbkę. Upewnij się, że próbka mastektomii zostanie natychmiast dostarczona do oddziału patologii w celu oceny brutkowania, aby zminimalizować czas zimna niedokrwiennego. Nie umieszczaj próbki w formalinie po złożeniu.
   UWAGA: Przykładowe zdjęcia akcji podczas mastektomii pokazano na Rysunku 4 (Reprezentatywne zdjęcia pobrania próbki podczas zabiegu mastektomii).
6. Pobieraj dwa rodzaje próbek z każdego okazu przy wyznaczeniu grubości: tkankę nowotworową i tkankę prawidłową.
   1. Tkanka nowotworowa
      1. Uzyskaj co najmniej jeden blok (najlepiej więcej) o wymiarach 1 cm × 1 cm × 1 cm tkanki nowotworowej na próbkę.
      2. Uzyskany blok tkanki pokroj dalej na dwie części, przy czym każda połowa bloku ma wymiary 1 cm × 0,5 cm × 0,5 cm. Przekażę połowę bloku tkanki do URA do biobankowania i analizy, a drugą połowę przyklejamy formaliną do rutynowej histopatologii.
      3. Równomiernie podziel pół bloku świeżej tkanki. Będzie to przeznaczone do sekwencjonowania RNA, biobankowania oraz hodowli organoidów.
      4. Do sekwencjonowania RNA: Natychmiast umieścić w schłodzonych, wcześniej oznaczonych 5 mL kriovialach, napełnionych 2,5 mL roztworem stabilizującym RNA (nie przekraczającym 30 minut, należy je cały czas przechowywać w zimze).
      5. W przypadku biobankowania: Natychmiast umieść schłodzone, oznaczone i napełnione krioviale o pojemności 5 mL z roztworem stabilizującym RNA o pojemności 2,5 mL (nie przekraczającym 30 minut, należy go cały czas przechowywać w chłodzie).
      6. W hodowli organoidów: Natychmiast umieść w schłodzonych, wcześniej oznaczonych i napełnionych stożkowych fiolkach o pojemności 15 mL z 5 ml roztworu do przechowywania tkanek oraz 0,01 mL Primocin (nie przekraczającej 30 min, należy przechowywać w zimnie przez cały czas). Zgromadzić jedną trzecią wszystkich blokad nowotworowych pobranych z różnych sekcji próbki w jednej stożkowej rurce.
   2. Tkanka prawidłowa
      1. Uzyskaj co najmniej jeden blok (najlepiej więcej) o wymiarach 1 cm × 1 cm × 1 cm prawidłowej tkanki piersi na próbkę.
      2. Uzyskany blok tkanki pokrój dalej na dwie części, przy czym każda połowa bloku ma wymiary 1 cm × 1 cm × 0,5 cm. Przekażę połowę bloku tkanki do URA do biobankowania i analizy, a drugą połowę przyklejamy formaliną do rutynowej histopatologii.
      3. Przetnij blok tkanek równomiernie na dwie części do badania. Będą one przeznaczone do sekwencjonowania RNA i biobankowania.
      4. Do sekwencjonowania RNA: Natychmiast umieść w schłodzonych, wcześniej oznaczonych kriovialach o pojemności 5 mL, napełnionych 2,5 mL kriovialami w roztworze stabilizującym RNA (nie więcej niż 30 min, utrzymuj się w niskiej temperaturze przez cały czas).
      5. Do biobankowania natychmiast umieść wcześniej schłodzone, wcześniej oznakowane i napełnione krioviale o pojemności 2,5 mL z roztworem stabilizującym RNA (nie przekraczającym 30 minut, utrzymuj w niskiej temperaturze przez cały czas).
         UWAGA: Próbki guza oznaczone literą "E" są zazwyczaj pobierane z trzech lub więcej różnych sekcji próbki. Aby uniknąć nieporozumień, próbki nowotworów przeznaczone do analizy RNA i biobankowania powinny być umieszczane w oddzielnych probówkach oznaczonych jako E1, E2, E3 itd., natomiast zbiorcze próbki nowotworów przeznaczone do hodowli komórek powinny być umieszczane w probówkach oznaczonych po prostu jako E. W przypadku próbek oznaczonych E1, E2 i E3 należy rejestrować względną pozycję/lokalizację każdej próbki tkanki względem guza (np. centrum, pozycja godziny 10).
7. Zabezpiecz parafilmem krioviale zawierające próbki pobrane podczas mastektomii.
8. Przechowuj krioviale w 4 °C przez 24 godziny, a następnie przenosi je do ultra-niskiej zamrażarki, w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
9. Spakuj stożkowy rurkę zawierającą zgromadzone bloki nowotworowe i przygotuj ją do transportu. Te blokady nowotworowe będą wykorzystywane do hodowli komórek do organoidów.

4. Przechowywanie, pakowanie i transport okazów

1. Natychmiast zabezpiecz parafilmem wszystkie krioviale zawierające guz oraz tkanki prawidłowe i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś rurki do -20 °C na około 2-4 godziny, a następnie ostatecznie przenieść je do -80 °C na czas nieokreślony, do długotrwałego przechowywania aż do transportu.
2. Zaktualizuj tracker próbek i bazę danych przed transportem próbek do analizy RNA, w tym wyniki rutynowej histopatologii i procentowe wyniki guzów, aby zapewnić tożsamość próbki.
3. Przed transportem sporządź manifest transportowy dla każdej próbki. Upewnij się, że proces pakowania jest szybki, a probówki zawierające próbki nie pozostawiają w temperaturze pokojowej (RT) przez dłuższy czas.
   1. Uszczelnij wszystkie pokrywki kriowialne parafilmem, aby zapobiec wyciekowi.
   2. Umieść wszystkie probówki w stojaku na probówki.
   3. Ustaw miernik temperatury i połóż go nad stojakiem obok rurek do transportu.
   4. Owiń tubki materiałem chłonnym, następnie folią bąbelkową i umieść przedmioty w opakowaniu. Upewnij się, że pomiar temperatury rejestruje temperaturę, a rurki są nienaruszone i ustawione pionowo przed zamknięciem przedmiotów wewnątrz worka.
   5. Połóż żelowe opakowania na dnie polistyrenowego pudełka, a następnie połóż opakowalną torbę z tubami na wierzchu żelowych opakowań. Nałóż kolejną warstwę żelowych opakowań na wierzch worka. Upewnij się, że probówki są umieszczone między żelowymi opakowaniami, aby okazy były chłodne podczas transportu.
   6. Zamknij pudełko z polistyrenu i włóż je do kartonowego pudełka transportowego. Jeśli nie ma dużego kartonowego pudełka, użyj większego pudełka z polistyrenu. Umieść gotowy manifest transportowy w woreczku strunowym i włóż go do pudełka. Rozmieszczenie przedmiotów wewnątrz pudełka pokazano na Rysunku 5.
   7. Zamknij kartonowe pudełko i umieść odpowiednią etykietę wysyłkową na zewnątrz pudełka.
4. Poinformuj odbiorcę o harmonogramie pobrania próbek oraz o tym, kiedy będzie celem wysłania próbek.
   1. Do hodowli organoidów wysyłane i wykorzystywane są wyłącznie tkanki nowotworowe pochodzące z mastektomii. Upewnij się, że są one dostarczone świeże, na mokrym lodzie i w ciągu 24 godzin od pobrania okazów. Gdy próbki zostaną spakowane, a pudełko zapieczętowane, szybko zamów kuriera do ich transportu. Upewnij się, że pudełka nie będą pozostawiane w miejscach o wysokiej temperaturze przez dłuższy czas, ponieważ gwałtowny spadek lub wzrost temperatury może zagrozić żywotności próbek.
   2. Przed przekazaniem go kurierowi zwróć uwagę na liczbę wysłanych fiolek/tub oraz godzinę opuszczenia Biobanku. Po otrzymaniu paczki upewnij się, że odbiorca zanotuje następujące informacje: czas przybycia i otrzymania w wyznaczonym ośrodku, temperaturę w momencie przyjęcia, liczbę otrzymanych fiolek/probek oraz ewentualną próbkę naruszoną
   3. Do analizy RNA sprawdź, czy próbki do przekazania zawierają odpowiedni wynik histopatologii oraz procent nowotworów z Oddziału Chirurgii Patologicznej, przed wysłaniem próbek do analizy RNA. Zidentyfikuj i wybierz blok tkanek o najwyższej zawartości guza dla każdego pacjenta, który ma być poddany ekstrakcji RNA. Transportuj tylko te z procentową zaklęciem nowotworów.
   4. Wysyłaj próbki w grupach nie więcej niż 40 osób, aby ułatwić przetwarzanie wsadowe. Wybierz dowolną kombinację tkanki nowotworowej z biopsji igły rdzeniowej lub mastektomii oraz zdrowej tkanki z mastektomii. Przeanalizuj następujące warunki, jeśli prawidłowa tkanka z biopsji igły rdzeniowej ma zostać przetransportowana:
      -Zapisany jako stadium 3, ale wynik histopatologii pokazuje stadium 4
      -Zapisany jako stadium 3, ale wynik histopatologii pokazuje postęp choroby loko-regionalny.
   5. Upewnij się, że wszystkie próbki są transportowane po mokrym lodzie. Podobnie jak procedura stosowana przy wysyłaniu próbek do hodowli komórek 3D, po zapakowaniu próbek i zapieczętowaniu pudełka natychmiast należy zamówić kuriera do transportu. Unikaj pozostawiania pudełek w miejscach o wysokiej temperaturze przez dłuższy czas, ponieważ znaczne wahania temperatury mogą zagrozić żywotności próbek.
   6. Przed przekazaniem go kurierowi zwróć uwagę na liczbę wysłanych fiolek/tub oraz godzinę opuszczenia Biobanku. Zwróć uwagę na następujące informacje po otrzymaniu paczki: czas przybycia i odbiór w wyznaczonym miejscu, temperaturę w momencie przyjęcia, liczbę otrzymanych fiolek/probek oraz ewentualną uszkodzoną próbkę (jeśli taka się znajduje).
5. Aktualizuj bazę danych wysyłanych próbek i wprowadzaj wszystkie niezbędne informacje przed dalszym przetwarzaniem próbek. Monitoruj i oceniaj bazę danych raz w tygodniu.

Wyniki

Podczas pobierania próbek podczas biopsji igły rdzeniowej, zabieg pod kierunkiem ultrasonograficznym miał ogromny wpływ na wygodę pacjenta i efektywność pracy, a także na integralność RNA próbek. Jeśli tego nie zrobimy, oczekiwane wyniki mogą nie zostać osiągnięte i pacjenci muszą wrócić do klinik, aby powtórzyć zabieg, co wydłuża pobieranie i przetwarzanie próbek.

Ponadto identyfikacja procentowej liczby guzów na próbkę, którą przeprowadził patolog odpowiedzialny, jest również ważnym krokiem ...

Dyskusja

Pomyślna implementacja tego protokołu opiera się nie tylko na precyzji technicznej, ale także na koordynacji zespołów klinicznych i badawczych, aby zapewnić spójną jakość próbek i integralność danych. Protokół ten obejmuje kilka kluczowych procedur zaprojektowanych tak, aby maksymalizować dokładność diagnostyczną i generować wysokiej jakości próbki biologiczne odpowiednie do dalszych analiz molekularnych. Kluczowe kroki obejmują biopsję igły za pomocą ultrasonografii w celu uzyskania zarówno prawidłowej, jak i nowotworow...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37% roztwór formaliny	PHILUSA Corporation	Nie ma	Wykorzystywany jako konserwant tkanek do analizy histopatologicznej
70% alkohol izopropylowy	Green Cross Inc.	Nie ma	Używany jako środek dezynfekujący
Drukarka kodów kreskowych	Zebra	GC420t	Do druku etykiet kodów kreskowych, które mają być używane w probówkach etykietujących zawierające próbki
Wybielacz	Green Cross Inc.	Nie ma	Używany jako środek dezynfekujący; do dekontaminacji narzędzi chirurgicznych
Niebieskie okłady lodowe	Gumowa Aida	1002	Do przechowywania próbek w niskich temperaturach podczas transportu
Igła do biopsji igły rdzeniowej 14-G	Bard	MN1410	Inwazyjny rurkowy instrument chirurgiczny zaprojektowany do połączenia z pistoletem do biopsji do automatycznego pobierania niewielkiej próbki tkanki ze struktury anatomicznej (biopsja), przy jednoczesnym wywoływaniu minimalnych uszkodzeń otaczających tkanek, do badania patologicznego tkanek.
Pistolet do biopsji piersi z igłą rdzeniową	Bard	MG1522	Wielokrotnego użytku narzędzie do biopsji rdzenia używane do pobierania próbek tkanek podczas biopsji igły rdzeniowej
Jednorazowa szalka Petriego 90 mm x 15 mm	Phoenix Biomedical Products	LOT: 20220206	Stosowany przy pobieraniu próbek z igłą rdzeniową podczas zanurzania tkanek w PBS
Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco (PBS)	Thermo Fisher Scientific	21600010	Zrównoważony roztwór soli stosowany w różnych zastosowaniach hodowli komórkowych, takich jak mycie komórek przed dysocjacji, transport komórek lub tkanek, rozcieńczanie komórek do liczenia oraz przygotowanie odczynników.
Kleszcze	Lokalny dostawca	Nie ma
Kimtech Science KimWipes delikatne wycieraczki zadaniowe	Kimberly Clark Professional	KC34120	4,3 x 8,4 cala. (11,0 cm x 21,3 cm); 1-warstwowy 280 Count; Do czyszczenia powierzchni, części, narzędzi i gabinetów medycznych chusteczki te łatwo czyszczą ciecze, kurz i drobne cząstki.
Rozwiązanie MACS do przechowywania tkanek	Miltenyi Biotec	130-100-008	Rozwiązanie magazynujące stosowane do optymalnego przechowywania świeżych próbek organów i tkanek
Mikropipeta	Shanghai Lichen Instrument Technology Co., Ltd.	STEM-GC-3197-Y	do pipetowania/przenoszenia cieczy w małych objętościach
Końcówki mikropipet	Tarsonowie	521100	do pipetowania/przenoszenia cieczy w małych objętościach
Parafilm	Parafilm M	5259-04LC PM996	Do szczelnego i wodoodpornego uszczelniania rur, aby zapobiec przeciekom
Primocyna 250 mg (5 x 1 mL)	InvivoGen	ANT-PM-05	Stosowany do ochrony tkanek przed skażeniem drobnoustrojami
Lodówka (4 i stopnie; C)	LG	Model: GR-Y331SLZB	Do przechowywania próbek tkanek i odczynników
Rozwiązanie RNAlater	Thermo Fisher Scientific	AM7021	Roztwór stabilizujący RNA stosowany w magazynowaniu i biobankowaniu tkanek
Stożkowa rurka o pojemności 15 mL i stożkowa;	Thermo Scientific	339650	Wykorzystywane do produkcji aliquotów odczynników/mediów wykorzystywanych do przechowywania tkanek
Sterylne 5 mL krioviale	Thermo Scientific	5000-1020	Wykorzystywane do produkcji aliquotów odczynników/mediów wykorzystywanych do przechowywania tkanek
Sterylny ostrze skalpela (#11)	Surgitech	Nie ma	Do cięcia guza i prawidłowych tkanek piersi
Nożyczki chirurgiczne (18,5 cm 7 ¼ " str)	Olten Instruments	BO-0125	Do cięcia guza i prawidłowych tkanek piersi
Pomiar temperatury	Extech Instruments	42280	Do rejestrowania temperatury i wilgotności podczas transportu próbek
Tusz tkankowy	Epredia	3120123	Do barwienia brzegów wyciętych preparatów chirurgicznych do analizy histopatologicznej
Ultra-niska zamrażarka	Haier Biomedical	DW-86L579	Do nieograniczonego przechowywania guza i prawidłowej tkanki piersi
Pojemnik na próbkę moczu 60mL	Sure Guard	0016UCS06PC	Do przechowywania tkanek do analizy histopatologicznej
Woreczki strunowe	Reynolds Consumer Products LLC		Wykorzystywane do pakowania próbek do transportu