Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67200

⸱

3 stycznia 2025

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Medical University of South Carolina, 2Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, 3Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

Autorzy korespondencyjni: Leonardo M. R. Ferreira <ferreirl@musc.edu>

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Streszczenie

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) zmieniła oblicze leczenia raka, prowadząc do rekordowych wskaźników remisji w wcześniej nieuleczalnych nowotworach hematologicznych. Sukcesy te wzbudziły zainteresowanie adaptacją platformy CAR do niewielkiego, ale kluczowego podzbioru limfocytów T CD4 + odpowiedzialnych głównie za regulację i hamowanie odpowiedzi immunologicznej, limfocytów T regulatorowych (Treg). Zdolność do przekierowania aktywności immunosupresyjnej limfocytów Treg na dowolny cel zewnątrzkomórkowy ma ogromne implikacje dla tworzenia terapii komórkowych w chorobach autoimmunologicznych, odrzucaniu przeszczepów narządów i chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi. Tutaj szczegółowo opisujemy metodologie izolacji limfocytów Treg w dobrej wierze z ludzkiej krwi obwodowej, modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów Treg z wykorzystaniem lentiwirusa lub wspomaganego przez CRISPR / Cas9 knock-in przy użyciu dostarczania szablonu homologicznej naprawy ukierunkowanej (HDR) za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem oraz ekspansji ex vivo stabilnych ludzkich Treg CAR. Na koniec opisujemy ocenę stabilności fenotypowej ludzkiego CAR Treg i funkcji supresyjnej in vitro, co zapewnia wgląd w to, jak ludzkie Treg CAR będą się zachowywać w zastosowaniach przedklinicznych i klinicznych.

Wprowadzenie

Terapie limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CAR) zrewolucjonizowały leczenie nowotworów hematologicznych, osiągając niezwykle wysokie wskaźniki remisji w wcześniej nieuleczalnych nowotworach1,2. Zachęcające wczesne wyniki z wykorzystaniem limfocytów CAR T w leczeniu glejaka3,4,5 podkreślają wszechstronność technologii CAR i jej przyszły potencjał w zakresie zwalczania szerokiego zakresu nowotworów złośliwych. W miarę jak naukowcy badają dalsze zastosowania CAR, limfocyty T regulatorowe (Treg) okazały się obiecującym typem komórek. Tregi odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy immunologicznej i regulacji odpowiedzi immunologicznej poprzez kilka mechanizmów, w tym sekwestrację IL-2, wydzielanie cytokin immunosupresyjnych i modulowanie komórek prezentujących antygen6,7.

Dzięki technologii CAR, Tregi mogą być wykorzystywane do leczenia odrzucenia przeszczepu narządu, chorób autoimmunologicznych i zaburzeń zapalnych, takich jak alergie i astma6,8,9. Przeciwciała Treg CAR mogą prowadzić do znacznej poprawy wyników leczenia i jakości życia pacjentów poprzez ograniczenie stosowania leków immunosupresyjnych, które hamują działanie układu odpornościowego jako całości i wiążą się ze szkodliwymi skutkami ubocznymi10,11. Modele przedkliniczne wykazały obiecujące wyniki w translacji technologii CAR na limfocyty Treg, z udanymi zastosowaniami w chorobach takich jak cukrzyca typu 1, stwardnienie rozsiane, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i nieswoiste zapalenie jelit9,12,13,14,15. W klinice prowadzone są obecnie badania nad limfocytami Treg CAR w celu zapobiegania odrzuceniu przeszczepu narządów litych16.

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodologię generowania ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR). Protokół ten polega na izolowaniu limfocytów Treg z ludzkiej krwi obwodowej i genetycznej modyfikacji ich przy użyciu technik takich jak transdukcja lentiwirusowa i precyzyjne wbijanie genów przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 i wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Opisujemy również ocenę stabilności fenotypowej i funkcji supresyjnej tych zmodyfikowanych limfocytów Treg, które są kluczowymi krokami w celu walidacji ich potencjału terapeutycznego17,18,19. Takie podejście usprawnia projektowanie i wczesne testowanie terapii CAR Treg, które mają potencjał do rozszerzenia transformacyjnego wpływu terapii limfocytami T CAR na regulację układu odpornościowego. Dzieląc się naszą metodologią, mamy nadzieję zainspirować do dalszych badań i innowacji w rozwijającej się przestrzeni terapii CAR Treg9,20.

Protokół

1. Izolacja ludzkich komórek Treg

  1. Przetwarzanie leukopaku
    1. Przenieść zawartość leukopaku do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Dodać równą objętość soli fosforanowej w buforze Dulbecco (DPBS) + 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), delikatnie mieszając pipetą.
    2. Wirować przy 300 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Ostrożnie odessać supernatant. Resuspendować pellet komórkowy w 2 mL DPBS + 2% FBS. Za pomocą pipety dodać do zawiesiny komórkowej 8 mL roztworu chlorku amonu w stosunku 4:1, wymieszać przez delikatne odwracanie probówki i inkubować na lodzie przez 15 min w celu lizy pozostałych erytrocytów.
    3. Wirować przy 300 × g przez 10 min w RT. Ostrożnie odessać supernatant. Dodać 30 mL DPBS + 2% FBS w celu wypłukania komórek. Wirować wypłukane komórki przy 150 × g przez 10 min w RT (bez hamowania). Ostrożnie odessać supernatant. Resuspendować pellet komórkowy w 30 mL DPBS + 2% FBS.
    4. Policzyć wyizolowane mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) przy użyciu błękitu trypanowego w stosunku 1:1.
      1. Ze względu na wysoką koncentrację komórek, początkowo rozcieńczyć 10 µL komórek w stosunku 1:100 za pomocą DPBS; następnie zmieszać 10 µL komórek rozcieńczonych 1:100 z 10 µL roztworu błękitu trypanowego, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:1. Podczas korzystania z automatycznego licznika komórek, skorygować liczbę komórek, aby odzwierciedlić 200-krotne rozcieńczenie, mnożąc raportowaną koncentrację przez 100, ponieważ większość liczników zakłada 2-krotne rozcieńczenie. Przewidywana wydajność to 1-2,5 × 109 PBMC z 1/10 leukopaku.
  2. Izolacja limfocytów T CD4+ (selekcja negatywna)
    1. Odwirować 108-109 PBMC przy 500 × g przez 5 min w RT i resuspendować w buforze do separacji komórek (DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS) do stężenia 5 × 107 komórek/mL.
      UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą liczbę ludzkich Treg do modyfikacji genetycznej, zaleca się rozpoczęcie procesu od 1 × 109 PBMC.
    2. Przeprowadzić separację magnetyczną zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do wzbogacania limfocytów T CD4+.
    3. Określić liczbę wyizolowanych limfocytów T CD4+, licząc je przy użyciu błękitu trypanowego (10 µL komórek + 10 µL błękitu trypanowego).
  3. Izolacja limfocytów T CD8+ (selekcja negatywna)
    1. Wirować 5 × 107 PBMC przy 500 × g przez 5 min w RT. Resuspendować w buforze do separacji komórek (DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS) do stężenia 5 × 107 komórek/mL.
      UWAGA: Zaleca się rozpoczęcie procesu od 5 × 107 PBMC, aby uzyskać 2-5 × 106 limfocytów T CD8+.
    2. Przeprowadzić separację magnetyczną zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do wzbogacania limfocytów T CD8+.
    3. Określić liczbę wyizolowanych limfocytów T CD8+, licząc je przy użyciu błękitu trypanowego (10 µL komórek + 10 µL błękitu trypanowego).
  4. Sortowanie komórek Treg za pomocą FACS (fluorescence-assisted cell sorting)
    1. Wyizolować limfocyty T CD4+ zgodnie z opisem w kroku 1.2 i przechowywać je przez noc w DPBS z 2% FBS w temperaturze 4 °C (minimalna utrata liczby komórek i żywotności) w celu przeprowadzenia sortowania FACS następnego dnia. Określić liczbę limfocytów T CD4+ z kroku 1.2, licząc je przy użyciu błękitu trypanowego (10 µL komórek + 10 µL błękitu trypanowego).
    2. Wirować komórki CD4+ przy 500 × g przez 5 min. Resuspendować komórki w 200 µL DPBS.
    3. Na każde 1 × 106 komórek dodać 1 µL przeciwciał anty-ludzkich CD4 FITC, 1 µL anty-ludzkich CD25 APC oraz 1 µL anty-ludzkich CD127 PE. Delikatnie wymieszać na wortexie i inkubować w ciemnej lodówce w 4 °C przez 30 min.
    4. Wypłukać komórki 10 mL DPBS z 2% FBS. Wirować przy 500 × g przez 5 min. Delikatnie resuspendować zabarwione komórki w DPBS z 2% FBS do stężenia 1,5 × 107 komórek/mL. Jest to zalecana koncentracja komórek do sortowania metodą FACS.
    5. Przepuścić zabarwoną zawiesinę komórkową przez filtr 40 µm do probówek do FACS, a następnie przechowywać probówki na lodzie.
    6. Przygotować probówki do zbierania o pojemności 15 mL zawierające 3 mL medium RPMI10 i umieścić na lodzie.
      UWAGA: Medium to składa się z podstawowego medium RPMI1640, 10% FBS, 1x penicyliny-streptomycyny, 1x L-alanyl-L-glutaminy, 1x nieessentialnych aminokwasów, 1x pirogronianu sodu i 1x HEPES.
    7. Wyselekcjonować regulacyjne limfocyty T (Treg) CD4+CD25highCD127- oraz konwencjonalne limfocyty T (Tconv) CD4+CD25lowCD127+ za pomocą FACS, jak pokazano na Rysunku 1A.
    8. Określić wydajność i żywotność komórek, a następnie przystąpić do dalszych analiz lub aktywacji limfocytów T.

2. Aktywacja limfocytów T

  1. Policzyć izolowane limfocyty T za pomocą błękitu trypanu (10 µL komórek + 10 µL błękitu trypanu).
  2. Przemyć 25 µL kulek anti-CD3/CD28 (106 kulek) na każde 1 × 106 uzyskanych limfocytów T, zachowując stosunek kulek do limfocytów T wynoszący 1:1. Kuleczki anti-CD3/CD28 przemywać poprzez dodanie DPBS, inkubację na magnesie przez 3 min i usunięcie rozcieńczonego buforu kulek anti-CD3/CD28, który może być toksyczny dla komórek.
  3. Zdjąć probówkę z magnesu i resuspender przemyte kulki w medium RPMI10, aby uzyskać stężenie 1 × 106 kulek/1 mL RPMI10.
  4. Resuspender limfocyty T z kuleczkami anti-CD3/CD28 w medium RPMI10 w stężeniu 1 × 106 limfocytów T/mL. Następnie dodać 1 000 IU/mL IL-2 do komórek Treg, 100 IU/mL IL-2 do komórek CD4+ Tconv oraz 300 IU/mL IL-2 do limfocytów CD8+ T.
  5. Kulturować limfocyty T w zagęszczeniu 1 × 106 komórek na studzienkę w płytce 24-dołkowej, stosując różne ilości kuleczek anti-CD3/CD28 oraz IL-2. Płytkę 24-dołkową umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  6. Ekspandować aktywowane limfocyty T przez 9–12 dni w obecności IL-2 aż do momentu ich wykorzystania w eksperymentach lub ponownej aktywacji kuleczkami anti-CD3/CD28 w celu dalszej ekspansji. Wymieniać medium co 2–3 dni, dodając IL-2 przy każdej wymianie medium. Podczas ekspansji utrzymywać gęstość komórek Treg na poziomie od 5 × 105 do 1 × 106 komórek na mL, monitorując ją poprzez liczenie komórek lub inspekcję wizualną przed pasażowaniem.

3. Transdukcja lentiwirusowa ludzkich komórek Treg

  1. Resuspenduj i policz komórki Tregs 48 h po aktywacji. Wirować przy 500 ×g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Resuspenduj komórki Tregs w pożywce RPMI10 w stężeniu 1,25 × 106 komórek/mL z dodatkiem 1 000 IU/mL IL-2.
  2. Podgrzej wstępnie wirówkę do 32 °C.
  3. Rozmroź na lodzie konstrukt CAR zawierający lentiwirusa.
    UWAGA: Jednorazowe aliquoty lentiwirusa, zawierające ilość wystarczającą do transdukcji 2,5 × 105 komórek przy MOI równym 1, przechowujemy w temperaturze -80 °C.
  4. Dodaj każdą alikwotę lentiwirusa do 2,5 × 105 komórek Tregs w 200 µL w probówce do mikrocentryfugi, gdzie każda probówka odpowiada jednej reakcji. Przeprowadź spinokulację przy 1 000 × g przez 1 h w 32 °C.
  5. Przenieś każdą 200 µL reakcję do płytki 24-dołkowej. Upewnij się, że medium całkowicie pokrywa dno dołka. Inkubuj płytkę 24-dołkową z transdukowanymi komórkami Tregs w inkubatorze do hodowli tkankowych przez noc (16-18 h). Uzupełnij każdą studzienkę do objętości 2 mL pożywką RPMI10, tak aby końcowe stężenie IL-2 wynosiło 1 000 IU/mL.
  6. Kontynuuj ekspansję transdukowanych komórek Tregs przez 9-12 dni po aktywacji, dzieląc komórki i uzupełniając je świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką RPMI10 oraz IL-2 w razie potrzeby (co 2-3 dni). Optymalne stężenie komórek wynosi 5 × 105-1 × 106 komórek/mL.
  7. Oceń wydajność modyfikacji genetycznej za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Rysunku 2.
    UWAGA: Nasze lentiwirusowe konstrukty CAR zawierają znacznik Myc na N-końcu genu CAR oraz gen reporterowy GFP połączony z genem CAR peptydem 2A, co pozwala na kwantyfikację wydajności transdukcji bez barwienia przeciwciałami (GFP) oraz potwierdzenie ekspresji CAR na powierzchni komórki (znacznik Myc). Wydajność modyfikacji genetycznej oceniamy 5 dni po transdukcji. Wydajność transdukcji może wahać się od 30% do 70% w zależności od dawcy i zastosowanego konstruktu CAR. W razie potrzeby można przeprowadzić sortowanie komórek CAR+.
  8. Upewnij się, że zmodyfikowane komórki Tregs ukończyły cykl aktywacji (9-12 dni) i odpoczywały przez 24 h w obecności IL-2 przed wykorzystaniem w jakichkolwiek eksperymentach.

4. CRISPR/Cas9-pośredni knock-in genu w ludzkich komórkach Treg

  1. Resuspender komórki Treg i przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml 48 h po aktywacji. Inkubować zawiesinę komórkową w magnesie przez 3 min.
  2. Podczas przebywania w magnesie przenieść komórki w medium za pomocą pipety do nowej probówki. Kuleczki anty-CD3/CD28 pozostaną przyczepione do ścianek probówki. Pozostawić oczyszczone z kuleczek komórki Treg w medium RPMI10 na 2 h po usunięciu kuleczek, aby mogły zregenerować się po stresie wywołanym procesem usuwania, co zwiększy późniejszą wydajność transdukcji oraz przeżywalność po elektroporacji.
  3. Policz Treg po usunięciu kulek przy użyciu błękitu trypanu.
  4. Podgrzej wstępnie pożywkę z obniżoną zawartością surowicy bez FBS do 37 °C.
  5. Przygotować płytkę 6-dołkową, wlewając do każdego dołka 2,5 ml pożywki RPMI10. bez antybiotykami (penicyliną i streptomycyną) oraz IL-2 w stężeniu 1000 IU/ml na studzienkę. Płytkę uprzednio podgrzać do 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  6. Rozmrozić na lodzie matrycę HDR (naprawy sterowanej homologią) CAR zawierającą wirusa adeno-zależnego (AAV).
    UWAGA: Przechowujemy jednorazowe alikwoty zawierające ilość AAV wystarczającą do zainfekowania 4 × 106 komórki przy MOI wynoszącym 20 000 w temperaturze -80 °C.
  7. Wirować Tregs przy 500 × g przez 5 min. Po zlaniu supernatantu resuspendować komórki w podgrzanym medium z obniżoną zawartością surowicy w stężeniu 4 × 107 komórek/ml
  8. Przenieś komórki w określonych ilościach do 100 µL w probówkach wirówkowych o niskim wiązaniu białek o pojemności 1,5 ml. Do każdej próbki dodać CAR AAV z zachowaniem MOI na poziomie 20 000 i resuspender. Probówki z reakcją inkubować w inkubatorze do hodowli tkanek przez 1 h.
  9. Podczas 1-godzinnej inkubacji przygotować i złożyć kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) CRISPR/Cas9 poprzez powolne dodawanie 8.3 µL białka Cas9 (stok 1 mg/ml) do 2.5 µL sgRNA celującego w locus genu TRAC (100 µM (roztwór zapasowy) dla stosunku molowego Cas9 do sgRNA wynoszącego 1:1 i całkowitej objętości RNP wynoszącej 10.8 µL na próbkę. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół. Inkubować mieszaninę RNP przez 15 min w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: Kompleksy RNP mogą pozostać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
  10. Napełnić nową probówkę do elektroporacji (probówkę E) 3 ml buforu do elektroporacji o wysokiej osmolarności. Włożyć napełnioną probówkę E do stacji pipetującego systemu elektroporacji, aż do usłyszenia kliknięcia. Ustawić parametry elektroporacji na 2 200 V, 20 ms, 1 impuls w systemie do elektroporacji.
  11. Po zakończeniu 1-godzinnej inkubacji z AAV, odwiruj komórki z AAV przy 300 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 100 µL buforu do resuspensji komórek dostarczonego w zestawie z systemem do elektroporacji na każdą próbkę.
    UWAGA: Należy pracować sprawnie i nie pozostawiać komórek w buforze dłużej niż przez 15 min. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
  12. Dodaj 10.8 µL kompleksu RNP na próbkę. Wymieszać dokładnie pipetą, nie tworząc pęcherzyków powietrza.
  13. Wstaw a 100 µL zamocuj końcówkę do elektroporacji, dociskając pipetę do drugiego stopnia, aby otworzyć zacisk. Umieść górną część pipety w końcówce do elektroporacji, aż zacisk pewnie zazębi się z trzpieniem montażowym tłoka. Stopniowo zwolnij przycisk, utrzymując nacisk na pipetę, aby upewnić się, że końcówka przylega ściśle i bez szczelin.
  14. Naciśnij tłok pipety do pierwszego stopnia i zanurz końcówkę do elektroporacji w mieszaninie komórek i RNP. Delikatnie pobierz próbkę do pipety, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
    UWAGA: Podczas elektroporacji wewnątrz końcówki nie mogą znajdować się pęcherzyki powietrza.
  15. Wprowadź pionowo pipetę z zamocowaną końcówką do elektroporacji zawierającą próbkę do probówki E Tube, aż do usłyszenia dźwięku kliknięcia. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.
  16. Należy potwierdzić, że wprowadzono optymalne ustawienia dla ludzkich komórek Treg (2 200 V, 20 ms, 1 impuls) i naciśnij Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia. na ekranie dotykowym, aby przeprowadzić elektroporację komórek.
  17. Należy poczekać, aż obraz pojawi się na ekranie dotykowym Gotowe Po zakończeniu elektroporacji ostrożnie wyjmij pipetę i niezwłocznie przenieś próbkę do przygotowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 2,5 ml podgrzanego, wolnego od antybiotyków medium RPMI10 z dodatkiem 1000 IU/mL IL-2 w każdym dołku. Powtórz czynność dla pozostałych próbek. Delikatnie kołysz płytką w ruchach liniowych (z lewej do prawej, z góry na dół), aby zapewnić równomierny rozkład komórek w każdym dołku, a następnie umieść ją w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: Ponowne wykorzystanie końcówki do elektroporacji jest dopuszczalne do 3 razy, pod warunkiem użycia tych samych komórek i kompleksu RNP. Przed policzeniem komórek lub jakimikolwiek innymi działaniami, takimi jak opcjonalne dodanie wzmacniacza HDR, należy zastosować 30-minutowy okres regeneracji.
  18. Następnego dnia, po 16–18 h, należy wymienić medium na medium zawierające antybiotyki, policzyć elektroporowane komórki Treg przy użyciu błękitu trypanu i hodować w temperaturze 106 komórek/ml z dodatkiem 1 000 IU/ml IL-2. Należy kontynuować namnażanie elektroporowanych komórek Treg poprzez pasażowanie komórek i uzupełnianie świeżego medium RPMI10 oraz IL-2 zgodnie z opisem w punkcie 2.6.
  19. Przechowywać próbki w lodzie do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
    1. Przygotuj kontrole kompensacji jednobarwnej i zastosuj je do pliku eksperymentalnego.
    2. Najpierw odczytaj niezbarwioną próbkę, aby dostosować wzmocnienia FSC i SSC w taki sposób, aby populacja limfocytów znajdowała się w środku wykresu kropkowego „All events”.
    3. Ustaw strategię bramkowania dla limfocytów: od wykluczenia debris i singletów, przez komórki żywe, aż do populacji CD4.+ komórki, przedstawione w Rycina 3C.
  20. Ocena wydajności modyfikacji genów za pomocą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Nasze konstrukty AAV CAR zawierają, oprócz ram homologii locus TRAC, gen reporterowy skróconego receptora czynnika wzrostu naskórka (EGFRt) połączony z genem CAR za pomocą peptydu 2A, jak pokazano w Rycina 3Wydajność wprowadzania genu (knock-in) określa się poprzez barwienie powierzchniowe na CD3, którego brak wskazuje na utratę ekspresji TCR na powierzchni i tym samym na skuteczne celowanie w locus TRAC za pomocą CRISPR/Cas9, oraz na EGFRt, którego ekspresja świadczy o pomyślnej integracji transgenu CAR. Treg z wprowadzonym genem CAR są CD3-EGFRt+ komórki. Wydajność modyfikacji genów oceniamy 5 dni po elektroporacji.
  21. Należy upewnić się, że zmodyfikowane Treg ukończyły cykl aktywacji (9–12 dni) i spoczywały przez 24 h w obecności braku IL-2 przed wykorzystaniem ich w jakichkolwiek doświadczeniach.

5. Aktywacja ludzkich CAR Treg

  1. Ustawienie kokultury (Dzień 0)
    1. Zebrać linię komórek docelowych wykazujących ekspresję antygenu CAR do probówki stożkowej.
      UWAGA: Jako komórki docelowe do aktywacji CAR Treg stosujemy komórki K562, ludzką linię komórkową białaczki szpikowej, która nie wykazuje ekspresji HLA, CD80 i CD86. Rodzime komórki K562 służą jako kontrola negatywna, a komórki K562 wykazujące ekspresję antygenu CAR są używane do aktywacji CAR Tregs17,21.
    2. Naświetlać linie komórek docelowych dawką 4 000 rad w irradiatorze do Cezu-137 lub promieniowania rentgenowskiego. W przypadku braku dostępu do irradiatora przeprowadzić obróbkę mitycomyną C, aby zatrzymać proliferację komórek przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji antygenów powierzchniowych w komórkach docelowych22.
    3. Jeśli nie zostało to zrobione wcześniej, usunąć kuleczki z CAR Tregs poprzez resuspensję CAR Tregs związanych z kuleczkami anty-CD3/CD28 i przeniesienie ich do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Inkubować zawiesinę komórkową w magnesie przez 3-5 min. Gdy komórki wciąż znajdują się w magnesie, przenieść je w medium za pomocą pipety do nowej probówki; kuleczki anty-CD3/CD28 pozostaną przyczepione do ścianki probówki.
    4. Wyznaczyć stężenia naświetlonych komórek docelowych i oczyszczonych z kuleczek CAR Treg przy użyciu błękitu trypanu.
    5. Wirować naświetlone komórki docelowe i CAR Tregs z prędkością 500 × g przez 5 min. Resuspender w podgrzanym RPMI10 do stężenia 106 komórek/mL w oddzielnych probówkach. Dodać IL-2 do CAR Tregs do osiągnięcia stężenia 2 000 IU/mL.
      UWAGA: Taka ilość IL-2 zostanie rozcieńczona dwukrotnie po połączeniu CAR Tregs z komórkami docelowymi, co da końcowe stężenie IL-2 wynoszące 1 000 IU/mL.
    6. W płytce 96-dołkowej o okrągłym dnie przeprowadzić kokulturę 1 × 105 CAR Tregs (100 µL) z 1 × 105 (100 µL) naświetlonych komórek docelowych negatywnych pod kątem antygenu CAR (kontrola negatywna aktywacji), 1 × 105 (100 µL) naświetlonych komórek docelowych pozytywnych pod kątem antygenu CAR (doświadczenie) lub 2,5 µL kuleczek anty-CD3/CD28 (kontrola pozytywna aktywacji) i 97,5 µL medium RPMI10. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 48 h.
      UWAGA: Końcowa objętość na dołek wynosi 200 µL. Należy upewnić się, że każdy wariant posiada trzy powtórzenia.
  2. Odczyt z cytometrii przepływowej
    1. Jeśli nie użyto czytnika płytek, resuspender zawartość każdego dołka z 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie i przenieść do probówek FACS. Wirować przy 500 x g przez 5 min. Odlać nadsącz i delikatnie wymieszać pellet komórkowy w wortexie.
    2. Przygotować główną mieszaninę przeciwciał do cytometrii przepływowej: 100 µL/próbka zawierającą DPBS, anty-ludzkie CD4 PE/Cy7 1:200, anty-ludzkie CD71 PE 1:100 oraz Ghost Viability Dye BV510 1:2000.
      UWAGA: Ten panel sprawdza się dobrze, jeśli gen reporterowy CAR jest GFP. Jeśli gen reporterowy koduje białko powierzchniowe wymagające barwienia przeciwciałami, takie jak EGFRt, można zastosować na przykład przeciwciało sprzężone z FITC.
    3. Pipetować 100 µL głównej mieszaniny przeciwciał do każdej próbki, delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 min w lodówce w temperaturze 4 °C.
    4. Przepłukać 500 µL DPBS, wirując przy 500 × g przez 5 min. Resuspender pellet komórkowy w 200 µL DPBS.
    5. Przechowywać próbki w lodzie do analizy metodą cytometrii przepływowej.
      1. Przygotować kontrole kompensacji dla pojedynczych barwników i zastosować je do pliku z przepływem z doświadczenia.
      2. Odczytać niebarwione próbki, aby dostosować wzmocnienie SSC i FSC tak, aby populacja limfocytów znajdowała się na środku wykresu kropkowego „All events”.
      3. Ustalić strategię bramkowania (gating) limfocytów na komórki pojedyncze (bez debris), następnie na komórki żywe, a potem na komórki CD4+, zgodnie z przedstawieniem na Rysunku 3C (użyto różnych fluoroforów).
      4. Odczytać próbki przy szybkości zdarzeń około 1 500 zdarzeń/s, aby ocenić aktywację Treg.
        UWAGA: Oczekiwanym wynikiem jest zwiększenie ekspresji powierzchniowej CD71 w CAR Tregs w obecności antygenu CAR, co pokazano na Rysunku 4. Jeśli w obecności antygenu CAR nie zaobserwowano zwiększenia ekspresji, może to świadczyć o występowaniu sygnałowania tonicznego.

6. Stabilność ludzkich CAR Treg

  1. Przygotowanie i ekspansja kokultury (dni 0-9)
    1. Przygotować kokultury w celu aktywacji CAR Tregs zgodnie z opisem w kroku 5.1.
    2. Po 48 h przenieść kokulturę z każdego dołka okrągłodنnej płytki 96-dołkowej do dołka płytki 24-dołkowej zawierającej uprzednio podgrzane 2 mL medium RPMI10 z 1 000 IU/mL IL-2, aby umożliwić ekspansję komórek.
    3. Dodać świeże, podgrzane medium RPMI10 z 1 000 IU/mL IL-2 i w razie potrzeby rozdzielić komórki do dodatkowych płytek 24-dołkowych.
  2. Odczyt z cytometrii przepływowej
    1. Resuspendować i przenieść zawartość każdej powtórki do probówki stożkowej 15 mL lub 50 mL. Określić stężenia komórek.
    2. Przenieść od 5 × 105 do 1 × 106 komórek do probówki do FACS dla każdej powtórki. Wirować przy 500 × g przez 5 min.
    3. Przygotować master mix przeciwciał do cytometrii przepływowej do barwienia powierzchniowego: 100 µL/próbkę zawierające DPBS, przeciwciało anti-human CD4 PE/Cy7 1:200, anti-human CD25 APC 1:200 oraz Ghost Viability Dye BV510 1:2000. W razie potrzeby dołączyć przeciwciało sprzężone z FITC dla białka reporterowego CAR.
    4. Odlać nadsącz z kroku 6.2.2 i delikatnie wymieszać osad komórkowy na vortexie. Pipetować 100 µL master mixu przeciwciał do barwienia powierzchniowego do każdej probówki FACS. Krótko wymieszać na vortexie i inkubować w lodówce w 4 °C przez 30 min w ciemności.
    5. Korzystając z zestawu buforów do barwienia czynników transkrypcyjnych, przygotować bufor do fiksacji i permeabilizacji, dodając 3 objętości rozcieńczalnika do fiksacji/permeabilizacji do 1 objętości koncentratu do fiksacji/permeabilizacji. Każda próbka wymaga 100 µL buforu do fiksacji i permeabilizacji.
    6. Przemyć komórki barwione powierzchniowo 500 µL DPBS. Wirować przy 500 × g przez 5 min i odlać nadsącz. Pipetować 100 µL przygotowanego buforu do fiksacji i permeabilizacji do każdej probówki. Krótko wymieszać na vortexie i pozostawić do fiksacji w 4 °C przez 30-60 min w ciemności.
    7. Korzystając z zestawu buforów do barwienia czynników transkrypcyjnych, przygotować 1x bufor do permeabilizacji, dodając 9 objętości wody destylowanej do 1 objętości 10x koncentratu buforu do permeabilizacji. Każda próbka wymaga 1 000 µL buforu do permeabilizacji do przemywania i 100 µL buforu do permeabilizacji do barwienia przeciwciałami skierowanymi przeciwko białkom wewnątrzkomórkowym.
    8. Przemyć ufiksowane/permeabilizowane komórki, dodając 500 µL 1x buforu do permeabilizacji. Wirować przy 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
    9. Przygotować master mix przeciwciał do barwienia wewnątrzkomórkowego z 1x buforem do permeabilizacji, przeciwciałem anti-human FOXP3 eFluor 450 1:50, anti-human HELIOS PE 1:50 oraz anti-human CTLA-4 PerCP-e710 1:50. Każda próbka będzie wymagać 100 µL master mixu przeciwciał.
      UWAGA: Ten panel działa, jeśli gen reporterowy CAR jest GFP lub jeśli białko reporterowe CAR (np. EGFRt) jest barwione przeciwciałem sprzężonym z FITC.
    10. Odlać nadsącz z kroku 6.2.8. Dodać 100 µL master mixu przeciwciał do barwienia wewnątrzkomórkowego, krótko wymieszać na vortexie i inkubować w RT przez 30 min w ciemności.
    11. Przemyć zbarwione, ufiksowane/permeabilizowane komórki, dodając 500 µL 1x buforu do permeabilizacji. Wirować przy 500 × g przez 5 min. Odlać nadsącz, resuspendować osad komórkowy w 300 µL DPBS i przechowywać na lodzie.
    12. Analizować metodą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Rysunku 5. Oczekiwanym wynikiem jest to, że większość CAR Tregs będzie komórkami FOXP3+HELIOS+. Jako kontrolę negatywną dla barwienia FOXP3 i HELIOS zastosować komórki CD4+ Tconv.

7. Supresja ludzkich CAR Treg

  1. Barwienie komórek T responder (Tresp) barwnikiem śledzącym i aktywacja nocna
    1. Zebrać rozszerzone komórki CAR Treg, świeżo izolowane komórki Tconv CD4+ oraz świeżo izolowane komórki T CD8+ do oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 15 mL i usunąć kuleczki anti-CD3/CD28, jeśli nie zostało to jeszcze zrobione.
    2. Przygotować napromieniowane komórki docelowe wykazujące ekspresję antygenu CAR zgodnie z opisem w kroku 5.1.
    3. Wyznaczyć stężenia nieaktywowanych komórek T oraz napromieniowanych komórek docelowych.
    4. Połączyć 5 × 106 komórek Tconv CD4+ z 5 × 106 komórkami T CD8+ (stosunek 1:1). Są to komórki T responder (Tresp), które mają zostać zahamowane przez CAR Treg w analizie. Wirować komórki Tresp przy 500 × g przez 5 min w RT. Ostrożnie odpiessować supernatant i resuspendować komórki Tresp w 1 mL DPBS.
    5. Dodać 1 mL barwnika CellTrace Violet (CTV) o stężeniu 5 mM zrekonstytuowanego w DMSO do 107 komórek Tresp w 1 mL DPBS, aby uzyskać końcowe stężenie 5 µM CTV. Inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 20 min. Po 10 min delikatnie wymieszać na wortexie, aby redystrybuować osiadły CTV.
    6. Przemyć 9 mL podgrzanej pożywki kompletnej RPMI10. Wirować przy 500 × g przez 5 min. Resuspendować w 5 mL podgrzanej pożywki kompletnej RPMI10.
    7. Wyznaczyć stężenie oznakowanych CTV komórek Tresp. Dodać 5 × 104 nieaktywowanych komórek Tresp oznakowanych CTV w 200 µL pożywki RPMI10 do 3-6 studzienek okrągłodennej płytki 96-dołkowej jako kontrole minimalnej proliferacji.
    8. Aktywować oznakowane CTV komórki Tresp kuleczkami anti-CD3/CD28 w stosunku 1:10 kuleczek do komórek Tresp bez IL-2 w pożywce RPM10. Rozdzielić 106 oznakowanych CTV komórek Tresp w 1 mL pożywki RPMI10 na każdą studzienkę płytki 24-dołkowej i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowej przez noc.
    9. Równolegle pozyskać 106 CAR+ Treg. Ilość ta pokrywa powtórzenia dla czterech stosunków CAR Treg:Tresp (1:1, 1:2, 1:4, 1:8), przy 5 × 104 komórkach docelowych na studzienkę okrągłodennej płytki 96-dołkowej, jako: 5 × 104 × 3 + 2,5 × 104 × 3 + 1,25 × 104 × 3 + 0,625 × 104 × 3 = 2,81 × 105 CAR Treg, dla dwóch warunków aktywacji CAR Treg: napromieniowane komórki docelowe ujemne pod kątem antygenu CAR (kontrola negatywna, brak aktywacji) oraz napromieniowane komórki docelowe dodatnie pod kątem antygenu CAR (eksperyment, aktywacja CAR).
    10. Połączyć 3 × 105 CAR Treg z 3 × 105 napromieniowanymi komórkami ujemnymi pod kątem antygenu CAR (stosunek 1:1) oraz 3 × 105 CAR Treg z 3 × 105 napromieniowanymi komórkami docelowymi dodatnimi pod kątem antygenu CAR (stosunek 1:1) w dwóch oddzielnych probówkach stożkowych 15 mL i wirować przy 500 × g przez 5 min w RT. Ostrożnie odpiessować supernatant.
    11. Resuspendować osad w każdej probówce z kroku 7.1.10 w 600 µL podgrzanej pożywki RPMI10. Daje to 200 µL dla każdego z powtórzeń dla stosunku Treg:Tresp 1:1. Wykonać rozcieńczenia seryjne na okrągłodennej płytce 96-dołkowej w następujący sposób:
      1. Z przygotowanych 600 µL zawiesiny Treg + komórek docelowych pipetować 200 µL zawiesiny komórkowej do każdej z 3 studzienek o stosunku 1:1.
      2. Dodać 100 µL podgrzanej pożywki kompletnej RPMI10 do każdej z pustych studzienek o stosunku 1:2, 1:4 i 1:8.
      3. Dla każdego z powtórzeń pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej ze studzienek 1:1 do powiązanych studzienek o stosunku 1:2.
      4. Dla każdego z powtórzeń pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej ze studzienek 1:2 do powiązanych studzienek o stosunku 1:4.
      5. Dla każdego z powtórzeń pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej ze studzienek 1:4 do powiązanych studzienek o stosunku 1:8.
      6. Pipetować pozostałe 100 µL zawiesiny komórkowej ze studzienek o stosunku 1:8 do pojemnika na odpady.
        UWAGA: Każda studzienka powinna zawierać 100 µL zawiesiny komórkowej z 5 × 104 (1:1), 2,5 × 104 (1:2), 1,25 × 104 (1:4) lub 0,625 × 104 (1:8) komórek CAR Treg oraz równą liczbę napromieniowanych komórek docelowych.
  2. Współinkubacja komórek CAR Treg i Tresp
    1. Po 16-18 h od aktywacji zebrać aktywowane komórki Tresp z płytki 24-dołkowej do probówki stożkowej i usunąć kuleczki anti-CD3/CD28 za pomocą magnesu.
    2. Wyznaczyć liczbę oczyszczonych z kuleczek komórek Tresp oznakowanych CTV.
    3. Przemyć i wirować 2 × 106 komórek Tresp przy 500 × g przez 5 min. Ostrożnie odpiessować supernatant. Resuspendować komórki w 4 mL pożywki kompletnej RPMI10.
    4. Dodać 100 µL zawiesiny komórek T (5 × 104 komórek T) do każdej studzienki z CAR Treg, a także do 3-6 studzienek zawierających tylko 100 µL pożywki RPMI10 jako kontrole maksymalnej proliferacji. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 72 h.
      UWAGA: Okrągłodenna płytka 96-dołkowa zawiera teraz 3-6 studzienek z samymi nieaktywowanymi komórkami Tresp (kontrola minimalnej proliferacji), 3-6 studzienek z samymi aktywowanymi komórkami Tresp (kontrola maksymalnej proliferacji) oraz aktywowane komórki Tresp w obecności malejącej liczby CAR Treg.
  3. Odczyt cytometryczny
    1. Resuspendować i przenieść zawartość każdej studzienki okrągłodennej płytki 96-dołkowej do opisanej probówki FACS. Alternatywnie przenieść do płytki V-bottom 96-dołkowej, jeśli dostępny jest cytometr z trybem odczytu płytek. Wirować przy 500 × g przez 5 min.
    2. W międzyczasie przygotować master mix przeciwciał z DPBS, anti-human CD4 PE/Cy7 1:200 oraz anti-human CD8 PerCP 1:200. Każda próbka będzie wymagała 100 µL master mixu przeciwciał.
    3. Delikatnie wymieszać osad komórkowy na wortexie. Pipetować 100 µL master mixu przeciwciał do każdej probówki FACS. Krótko wymieszać na wortexie i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min w ciemności.
    4. Przemyć 500 µL DPBS. Przemyć 2x 100 µL DPBS w przypadku użycia płytki V-bottom 96-dołkowej. Wirować przy 500 × g przez 5 min. Odlać supernatant, resuspendować osad komórkowy w 200 µL DPBS i przechowywać probówki na lodzie w ciemności.
    5. Analizować za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Rysunku 6. Oczekiwanym wynikiem jest: same nieaktywowane komórki Tresp (minimalna proliferacja) wykazujące jednolity wysoki pik fluorescencji CTV, same aktywowane komórki Tresp wykazujące wiele pików intensywności CTV, z których jeden odpowiada każdemu podziałowi komórkowemu (maksymalna proliferacja), oraz aktywowane komórki T CD4+ i CD8+ w obecności aktywowanych CAR Treg wykazujące redukcję liczby i wysokości pików CTV, a tym samym spadek proliferacji.
    6. Obliczyć supresję zależną od komórek Treg w następujący sposób:
      Równanie procentowej supresji dla analizy proliferacji komórek; formuła stosowana w badaniach immunologicznych.
      UWAGA: W przypadku korzystania z oprogramowania FlowJo można również zastosować modelowanie proliferacji komórek do obliczenia indeksu podziału (DI) dla każdej próbki i obliczyć procent supresji, używając DI zamiast procentu proliferujących komórek w powyższej formule.

Wyniki

Opisany tutaj protokół zapewnia usprawnioną i zestandaryzowaną procedurę oceny nowych konstruktów chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) w ludzkich limfocytach T regulatorowych (Tregs), w celu stworzenia żywych terapii chorób autoimmunologicznych, choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, odrzucania przeszczepów narządowych oraz alergii. Rysunek 1 przedstawia sposób uzyskiwania wysokiej czystości ludzkich Tregs z krwi obwodowej za pomocą FACS (Rysunek 1A), co oceniono na podstawie wysokich poziomów czynników transkrypcyjnych linii Treg, FOXP3 i HELIOS, po ekspansji ex vivo (Rysunek 1B).

Przedstawiamy dwie metody modyfikacji genetycznej ludzkich komórek Tregs: transdukcję lentiwirusową (Rysunek 2) oraz knock-in genu za pomocą CRISPR/Cas9 (Rysunek 3), obie charakteryzujące się wysoką wydajnością. Korzystamy z usług zewnętrznych w celu syntezy konstruktów szkieletowych lentiwirusa oraz produkcji i miareczkowania lentiwirusa, który następnie jest transportowany do naszego laboratorium i przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Możliwe jest jednak również generowanie lentiwirusa we własnym zakresie poprzez transfekcję komórek HEK293T plazmidami CAR i plazmidami pakującymi, a następnie miareczkowanie w komórkach Jurkat z wykorzystaniem cytometrii przepływowej, zgodnie z opisem w innej publikacji17. W przypadku knock-in genu celujemy w locus stałego regionu receptora limfocytów T alfa (TRAC) przy użyciu Cas9 i pojedynczego przewodzącego RNA (sgRNA), co według naszych oraz innych badań skutkuje wysoką wydajnością edycji13,23, a następnie wprowadzamy transgen CAR, dostarczany w formie nieintegrującego się wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) z ramionami homologii specyficznymi dla locus TRAC. Wykazano, że strategia ta prowadzi do bardziej jednolitej i spójnej ekspresji CAR u różnych dawców krwi w konwencjonalnych limfocytach T23, unikając jednocześnie potencjalnego ryzyka onkogennego związanego z losową integracją genomową przy użyciu lentiwirusa. Wykorzystany tutaj AAV został wyprodukowany i wymiareczkowany przez zewnętrznego dostawcę i dostarczony do naszego laboratorium, gdzie był przechowywany w -80 °C do momentu użycia. Niemniej jednak możliwe jest wytwarzanie AAV we własnym zakresie przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych konstruktem AAV i plazmidami pakującymi AAV jako komórek producentów oraz dostępnych komercyjnie zestawów do oczyszczania i miareczkowania AAV, zgodnie z opisem w innych pracach13,24.

Aby zaprezentować nasz protokół testowania wielu CAR w ludzkich komórkach Treg, wykorzystaliśmy uznaną konstrukcję CD19 CAR i stworzyliśmy warianty o różnych architekturach sygnałowych, zawierające łańcuch CD3delta lub CD3epsilon zamiast typowego łańcucha CD3zeta25, lub posiadające mutacje w znanych motywach sygnałowych CD2826. Rycina 4 przedstawia stopień aktywacji, mierzony ekspresją powierzchniową CD71 (receptora transferyny), różnych komórek CD19 CAR Treg po wspólnej inkubacji z napromieniowanymi komórkami K562 wykazującymi ekspresję CD19. Komórki K562 są powszechnie wybierane jako komórki docelowe w testach aktywacji limfocytów T ze względu na łatwość hodowli i transdukcji lentiwirusowej oraz brak HLA, CD80 i CD86, co zapobiega wystąpieniu tła wynikającego z aktywacji endogennego TCR lub receptorów kostymulujących przez niemodyfikowane komórki21,27.

Alternatywnie można zastosować kulki magnetyczne sprzężone z białkiem docelowym CAR w celu aktywacji CAR Treg28. Brak sygnału kostymulującego przekazywanego przez CAR, wynikający albo z całkowitego braku domeny CD28 (konstrukt Zeta), albo z dezaktywacji wszystkich trzech znanych motywów sygnałowych CD28 (konstrukt CD28(xxx)zeta), prowadził do niższej ekspresji CD71 niż w przypadku CD28zeta CD19 CAR (Rycina 4). Bardzo ważnym parametrem dla skuteczności i bezpieczeństwa terapii CAR Treg jest stabilność Treg, ponieważ komórki Treg mogą utracić funkcję supresyjną i przekształcić się w prozapalne limfocyty T podczas przedłużonej hodowli ex vivo lub ekspozycji na środowiska zapalne in vivo29,30. Zastosowanie naszego protokołu pozwala utrzymać pozytywną ekspresję FOXP3 oraz HELIOS – złotego standardu tożsamości Treg – w ludzkich CAR Treg po izolacji, modyfikacji genetycznej, ekspansji poliklonalnej i aktywacji za pomocą CAR (Rycina 5). Warto zaznaczyć, że do analizy próbek poddanych wewnątrzkomórkowemu barwieniu przeciwciałami użyliśmy spektralnego cytometru przepływowego w celu uzyskania większej intensywności sygnału i rozdzielczości. Na koniec w Rycynie 6 przedstawiamy test immunologiczny służący do oceny funkcji ludzkich CAR Treg. Konwencjonalne limfocyty T są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w celu śledzenia ich proliferacji za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie są aktywowane. Te aktywowane limfocyty T odpowiadające (Tresp) są następnie współinkubowane z aktywowanymi CAR Treg w różnych stosunkach Treg:Tresp. Im większa liczba CAR Treg, tym mniejsza proliferacja komórek Tresp, co stanowi bezpośredni miernik funkcji supresyjnej CAR Treg. Co ciekawe, wymiana łańcucha CD3 lub zmutowanie domeny CD28 w CAR miało jedynie niewielki wpływ na zapośredniczoną przez CAR Treg supresję proliferacji limfocytów T in vitro (Rycina 6), co jest zgodne z wynikami raportowanymi przez inne grupy31,32.

Analiza cytometrii przepływowej, rozkład Treg vs Tconv, CD25-CD127, FOXP3-HELIOS, schemat sortowania komórek.
Rycina 1: Izolacja ludzkich limfocytów T regulatorowych. (A) Strategia bramkowania podczas sortowania komórek wspomaganego fluorescencją (FACS) w celu izolacji limfocytów T regulatorowych i konwencjonalnych limfocytów T z limfocytów T CD4+ wzbogaconych magnetycznie z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Wykres przedstawia ekspresję CD25 i CD127, gdzie Tregs zidentyfikowano jako komórki CD25highCD127-, a Tconv jako komórki CD25lowCD127+. (B) Barwienie wewnątrzkomórkowe izolowanych populacji komórek analizowane metodą cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia tożsamości komórkowej na podstawie ekspresji FOXP3 i HELIOS. Tregs zazwyczaj wykazują wysoką ekspresję FOXP3 i HELIOS, które są czynnikami transkrypcyjnymi linii Treg. Komórki Tconv wykazują minimalną ekspresję obu markerów, co potwierdza ich fenotyp konwencjonalnych limfocytów T. (C) Strategia bramkowania w celu oceny stabilności Treg po transdukcji CAR. Skróty: Treg = limfocyt T regulatorowy; Tconv = konwencjonalny limfocyt T; FSC-A = pole powierzchni szczytu rozproszenia przedniego; SSC-A = pole powierzchni szczytu rozproszenia bocznego; CAR = chimeryczny receptor antygenowy; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy kropkowe Myc-tag vs GFP przed i po sortowaniu komórek.
Rycina 2: Generowanie CAR Tregs za pomocą transdukcji lentiwirusowej. Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej przedstawiający ekspresję powierzchniową CAR (Myc-tag) oraz ekspresję genu reporterowego GFP w komórkach Treg po transdukcji lentiwirusem Myc-tag-CD19CAR-2A-GFP (A) przed i (B) po sortowaniu komórek wspomaganym fluorescencją. Skróty: Treg = regulatorowa limfocyt T; CAR = chimeryczny receptor antygenowy; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat cytometrii przepływowej pokazujący ekspresję CD3 i EGFRt w próbce z knock-in w porównaniu do próbki mock, bramkowanie limfocytów.
Rycina 3: Generowanie CAR Tregów za pomocą knock-in zapośredniczonego przez CRISPR/Cas9. (A) Wykres kropkowy cytometrii przepływowej Tregów poddanych elektroporacji kompleksem RNP CRISPR/Cas9 celującym w locus TRAC, wraz z AAV zawierającym gen Myc-tag-CD19CAR-2A-EGFRt jako matrycę do naprawy kierowanej homologią. Ekspresję CAR, wskazaną przez ekspresję genu reporterowego EGFRt, analizowano w połączeniu z utratą ekspresji CD3 w celu pomiaru knock-in CAR w locus TRAC. (B) Kontrolny wykres kropkowy cytometrii przepływowej Tregów poddanych elektroporacji mock bez kompleksu CRISPR-RNP i AAV, wykazujący brak reportera EGFRt i obecność CD3. (C) Strategia bramkowania w celu oceny wydajności knock-in w Tregach. Skróty: Treg = limfocyt T regulatorowy; FSC-A = obszar piku rozproszenia przedniego; SSC-A = obszar piku rozproszenia bocznego; CAR = chimeryczny receptor antygenowy; RNP = rybonukleoproteina; AAV = wirus adeno-zależny; EGFRt = skrócony receptory czynnika wzrostu naskórka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Cytometria przepływowa ekspresji CD71 i wykres słupkowy; schematy receptorów CD28-CD3Z z mutantami CD28.
Rycina 4: Aktywacja CAR Treg z różnymi konstruktami CAR. (A) Histogramy cytometrii przepływowej reprezentujące ekspresję powierzchniową CD71, marker aktywacji limfocytów T, na CAR Tregach 48 h po aktywacji komórkami docelowymi — naświetlonymi komórkami K562 wykazującymi ekspresję CD19. Każdy kolor reprezentuje Tregi transdukowane innym konstruktem CD19 CAR zawierającym różne domeny sygnalizacyjne łańcucha CD3 — CD28zeta, CD28delta, CD28epsilon — lub zmutowane kostymulacyjne domeny CD28 — CD28(x23)zeta, CD28(1x3)zeta, CD28(12x)zeta, CD28(xxx)zeta — gdzie „x” oznacza miejsce mutacji tyrozyny na fenyloalaninę w obrębie trzech motywów sygnalizacyjnych CD28 (1. motyw wiązania PI3K, 2. motyw wiązania ITK, 3. motyw wiązania LCK). UT służą jako kontrola negatywna. (B) Średnia intensywność fluorescencji CD71 w aktywowanych CAR Tregach. Wartości reprezentują powtórzenia techniczne reprezentatywnych eksperymentów. Słupki reprezentują średnią ± SD, a istotność statystyczną obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z testem Tukey HSD. *, p < 0.05, ***, p < 0.001, w porównaniu z CAR Treg CD19 CD28zeta. (C) Schemat konstruktów CAR zawierających różne mutacje w kostymulacyjnej domenie sygnalizacyjnej CD28. (D) Schemat konstruktów CAR zawierających różne domeny sygnalizacyjne łańcucha CD3. Skróty: Treg = regulacyjny limfocyt T; CAR = chimeryczny receptor antygenowy; UT = nietransdukowany; MFI = średnia intensywność fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dane z cytometrii przepływowej, HELIOS vs. FOXP3, porównanie CAR Treg, CD3/28 Treg, CD3/28 Tconv.
Rycina 5: Stabilność tożsamości CAR Treg po aktywacji CAR. Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej obrazujące wewnątrzkomórkową ekspresję FOXP3 i HELIOS, kluczowych markerów tożsamości Treg, w komórkach Treg 9 dni po aktywacji (A) za pomocą CAR CD19 z zastosowaniem celu, napromianianych komórek K562 wykazujących ekspresję CD19, lub (B) za pomocą TCR i CD28 z użyciem kulek anti-CD3/28. (C) Komórki Tconv aktywowane kulkami CD3/28 zostały uwzględnione jako negatywna kontrola barwienia dla FOXP3 i HELIOS. Skróty: Treg = regulatorna komórka T; Tconv = konwencjonalna komórka T; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy cytometrii przepływowej, analiza supresji limfocytów T CD4+/CD8+, histogramy, dane eksperymentalne.
Rysunek 6: Funkcja immunosupresyjna CAR Treg z różnymi konstruktami CAR. (A) Reprezentatywny histogram cytometrii przepływowej proliferacji znakowanych CTV komórek CD4+ Tresp współhodowanych z aktywowanymi CAR Treg CD19 CD28zeta w różnych stosunkach Treg do Tresp (1:1, 1:2, 1:4 i 1:8). (B) Procentowa supresja proliferacji komórek CD4+ Tresp przez Tregs wyposażone w CAR CD19 z mutantami domeny CD28 lub alternatywnymi domenami sygnalizacyjnymi CD3. (C) Reprezentatywny histogram cytometrii przepływowej proliferacji znakowanych CTV komórek CD4+ Tresp współhodowanych z aktywowanymi CAR Treg CD19 CD28zeta w różnych stosunkach Treg do Tresp. (D) Procentowa supresja proliferacji komórek CD8+ Tresp przez Tregs wyposażone w CAR CD19 z mutantami domeny CD28 lub alternatywnymi domenami sygnalizacyjnymi CD3. Wartości reprezentują powtórzenia techniczne reprezentatywnych eksperymentów. Słupki reprezentują średnią ± SD, a istotność statystyczną obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z testem Tukey HSD *, p < 0.05, **, p < 0.01, ***, p < 0.001, ****, p < 0.0001, w porównaniu z CAR Treg CD19 CD28zeta. (E) Strategia bramkowania w celu oceny supresji komórek Tresp przez CAR Treg. Skróty: Treg = limfocyt T regulatorowy; CAR = chimeryczny receptor antygenowy; CTV = Cell Trace Violet; Tresp = odpowiadające limfocyty T.Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia usprawnioną i kompleksową metodologię generowania i oceny ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (CAR Treg). Sukces technologii CAR w leczeniu nowotworów hematologicznych zainspirował jej zastosowanie w immunosupresyjnym podzbiorze limfocytów T, Treg. W przeciwieństwie do konwencjonalnych limfocytów T, limfocyty Treg hamują odpowiedź immunologiczną, oferując potencjalne metody leczenia stanów wynikających z niepożądanej odporności, takich jak choroba autoimmunologiczna, odrzucenie przeszczepu narządu, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi i alergie9. Wykorzystanie CAR Treg umożliwia terapię specyficzną dla antygenu, posiadając potencjał uniknięcia skutków ubocznych związanych z lekami immunosupresyjnymi o szerokim spektrum działania11. W tym miejscu opisujemy protokoły in vitro w celu walidacji stabilności i funkcji linii Treg podczas inżynierii z CAR. Chociaż nie zostało to omówione w tym artykule, myszy z niedoborem odporności NSG dają możliwość przetestowania funkcji ludzkiego CAR Treg in vivo w modelach choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i przeszczepu narządów13,14, co jest ważnym krokiem przed translacją na ludzi.

Krytyczny krok w tym protokole polega na wyizolowaniu i oczyszczeniu limfocytów Treg z ludzkiej krwi obwodowej, przy użyciu sekwencyjnej separacji magnetycznej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu uzyskania wysokiej czystości limfocytów Treg CD4 + CD25o wysokiej zawartościCD127. Jakość izolacji limfocytów Treg ma kluczowe znaczenie, ponieważ bezpośrednio wpływa na skuteczność terapeutyczną limfocytów Treg CAR. Należy bezwzględnie unikać zanieczyszczenia konwencjonalnymi limfocytami T (Tconv), ponieważ mogą one namnażać się szybciej niż limfocyty Treg, zwłaszcza przy wysokich stężeniach IL-2 (1000 IU / ml). Inne opublikowane metodologie obejmują dodanie rapamycyny do protokołu ekspansji Treg w celu selektywnego ograniczenia ekspansji Tconv przy minimalnym wpływie na ekspansję Treg33. Magnetyczna negatywna selekcja limfocytów T CD4 + jest stosowana w celu skrócenia czasu trwania FACS, co jest mniej łagodne dla komórek niż izolacja magnetyczna nietkniętych komórek. Co więcej, selekcja negatywna zachowuje epitop CD4 do barwienia przeciwciał. Etapy te są kluczowe ze względu na niską częstotliwość Treg we krwi obwodowej (1% PBMC, 3-8% limfocytów T CD4+ ).

Opisano tutaj dwie metody modyfikacji genetycznej ludzkich limfocytów Treg: transdukcję lentiwirusową i knock-in za pośrednictwem genu CRISPR/Cas9. Transdukcja lentiwirusowa zapewnia skuteczne dostarczanie genów, a lentiwirus jest łatwiejszy do wytworzenia. Wiąże się to jednak z losową integracją genomową i zmienną liczbą kopii genów na komórkę. W przeciwieństwie do tego, CRISPR/Cas9 i HDR pozwalają na edycję genomu w precyzyjnej lokalizacji (w naszym przypadku locus TRAC) oraz, jeśli celuje w region genomowy TCR, pojedynczą kopię genu na komórkę (tylko jeden allel TCR może być celowany na komórkę T ze względu na wykluczenie alleli TCR34). Jednak elektroporacja, stosowana do dostarczania CRISPR/Cas9 RNP, jest bardziej destrukcyjna dla komórek niż dodanie lentiwirusa do pożywki i wirowanie, wymagając więcej limfocytów Treg na początku (4 × 106 Treg do elektroporacji za pomocą końcówki do elektroporacji 100 μl w porównaniu z zaledwie 2,5 × 105 Treg do transdukcji lentiwirusowej w 24-dołku) i skutkuje niższą ekspansją CAR Treg (zwykle 20-70 razy między dniem transdukcji lentiwirusa i dzień oceny funkcjonalnej).

Przedstawiono tutaj trzy testy porównawcze do oceny inżynierii ludzkiego CAR Treg: aktywacja, stabilność i tłumienie. Oceniamy aktywację CAR Treg w obecności komórek docelowych wykazujących ekspresję antygenu CAR, mierząc regulację w górę CD71, receptora transferyny. Chociaż CD69 i CD25 są również markerami aktywacji, CD71 został wybrany ze względu na jego stabilną ekspresję po aktywacji przez różne dni w porównaniu z przejściową ekspresją CD6935. CD25 ma niski zakres dynamiki w limfocytach Treg ze względu na wysoki podstawowy poziom tej cząsteczki. Badanie stabilności ma kluczowe znaczenie, ponieważ limfocyty Treg mogą przekształcić się w fenotyp efektorowy pod wpływem przedłużonej ekspansji ex vivo, wielu rund aktywacji lub pewnych stanów zapalnych, które mogą przeciwdziałać pożądanym efektom immunosupresyjnym29,30. Protokół ten ocenia stabilność fenotypową CAR Treg 9 dni po aktywacji za pośrednictwem CAR, ponieważ jest to typowy czas trwania cyklu aktywacji ludzkich limfocytów T. Jednak ważne może być przyjrzenie się dalszym punktom czasowym, ponieważ w przypadku niektórych dawców limfocyty Treg nie są w pełni wypoczęte i kontynuują ekspansję do 12 dni po stymulacji. Ponadto ważna może być ocena wpływu wielokrotnych cykli aktywacji na stabilność CAR Treg. Wykorzystujemy jednoczesną ekspresję FOXP3 i HELIOS jako cechę charakterystyczną stabilności Treg. Włączenie HELIOS jest kluczowe, ponieważ u ludzi komórki Tconv zwiększają poziom FOXP3 po aktywacji36.

Test supresji ocenia funkcję immunosupresyjną limfocytów CAR Treg, mierząc podział limfocytów T CD4 + i CD8 + poprzez śledzenie fluorescencji CellTrace Violet (CTV). Czułość tego testu i zależność od dawcy wymagają starannej konfiguracji i rozwiązywania problemów. Parametry, które można ustalić przed zastosowaniem limfocytów Treg CAR, których liczba może być czynnikiem ograniczającym, obejmują określenie, jak szybko znakowane limfocyty T namnażają się dla określonego dawcy oraz optymalny stosunek kulek anty-CD3 / CD28 do limfocytów T dla danego dawcy i partii kulek 17,28,37.

Wyzwaniem w inżynierii ludzkich TROG CAR jest zmienność między dawcami w obfitości Treg, skuteczności manipulacji genetycznej, ekspansji i funkcji immunosupresyjnej. Zmienność tę można przypisać specyficznym dla dawcy różnicom genetycznym i środowiskowym oraz zwiększonej wrażliwości limfocytów Treg podczas pracy in vitro w porównaniu z komórkami Tconv, co może wpływać na odtwarzalność i skalowalność procesu wytwarzania i testowania ludzkich limfocytów CAR Treg. Szczegółowo opisując ten protokół i jego niuanse tutaj, staramy się umożliwić innym badaczom powtórzenie i rozwinięcie naszych ustaleń, posuwając naprzód dziedzinę terapii CAR Treg. Przyszłe badania powinny koncentrować się na opracowywaniu CAR dla nowych celów, dostosowywaniu sygnalizacji CAR do specyficznych potrzeb limfocytów Treg, badaniu niewirusowych systemów dostarczania, pogłębianiu naszej wiedzy na temat mechanizmów supresji CAR Treg oraz rozszerzaniu zastosowania tej technologii na różne choroby o podłożu immunologicznym.

Oświadczenia

LMRF jest wynalazcą i otrzymał tantiemy z patentów na zmodyfikowane komórki odpornościowe oraz konsultuje się z Guidepoint Global i McKesson. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

LMRF jest finansowany przez Human Islet Research Network (HIRN) Emerging Leader in Type 1 Diabetes grant U24DK104162-07, American Cancer Society (ACS) Institutional Research Grant IRG-19-137-20, South Carolina Clinical and Translational Research (SCTR) Pilot Project Discovery Grant 1TL1TR001451-01, Diabetes Research Connection (DRC) Grant IPF 22-1224 oraz Swim Across America Grant 23-1579. RWC jest wspierany przez grant szkoleniowy w zakresie nauk komórkowych, biochemicznych i molekularnych T32GM132055 oraz stypendium Hollings Cancer Center Lowvelo Graduate Fellowship. Badanie to było częściowo wspierane przez Flow Cytometry and Cell Sorting Shared Resource, Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina (P30 CA138313). Specjalne podziękowania dla dr Qizhi Tang z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF) za uprzejme podarowanie zmutowanych plazmidów CAR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wirus związany z adenowirusem ( AAV)Charles River Laboratories
CAR z ekspresją docelową komórek K562, np. CD19-K562
promiennik
Anty-ludzki CD8 PerCP (klon SK1)Biolegend344708
Anti-human CD4 PE / Cy7 (klon SK3)Biolegend344612
DynaMag-15ThermoFisher12301D
Ghost BV510 barwnik żywotności Komórki TONBO13-0870-T100
K562Kolekcja kultur typu amerykańskiegoCCL-243
0,5 M EDTA, pH 8,0Gibco 
1 M HEPESGibco15630080
roztwór chlorku amonuSTEMCELL Technologies7850
Anty-ludzki CD127 PE (klon hIL-7R-M21)BD Biosciences557938
Anty-ludzki CD25 APC (klon BC96)Biolegend 302610
Anty-ludzki CD4 FITC (klon SK3)Biolegend 
Anty-ludzki CD71 PE (klon SK1)Biolegend334106
Anty-ludzki CD8 PerCP (klon SK1)Biolegend 
Anty-ludzki CTLA-4 PerCP-e710ThermoFisher46-1529-42
Anty-ludzki EGFR APC (klon AY13)Biolegend352905
Anty-ludzki FOXP3 eFluor 450ThermoFisher48-4776-42
Anty-ludzki HELIOS PEBiolegend137216
Ca2+ oraz Mg2+ wolne Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) Gibco14190144
Licznik komórek (automatyczny licznik komórek TC20)komórek Bio-Rad
Bio-Rad1450016
CellTrace Zestaw do proliferacji komórek fioletowychThermoFisherC34571
Probówki DNA LoBindEppendorf22431021
Magnes Easy 50 EasySep STEMCELL Technologies18002
Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T EasySep CD4+STEMCELL Technologies19052
Zestaw do wzbogacania limfocytów T EasySep Human CD8+STEMCELL Technologies19053
Magnes EasySep STEMCELL Technologies18000
eBioscience Zestaw do barwienia czynnikiem transkrypcyjnym Foxp3ThermoFisher00-5523-00
Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego z zatrzaskiem z sitkiem do komórek, 5 mlFisher Scientific08-771-2340μ m
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140079
Cytometr przepływowyBeckman CoulterCytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2
Aktywowany fluorescencją sortownik komórekBD BiosciencesFACS Sortownik komórek Aria III
GlutaMAXGibco35050061
Ludzka ekspansja i aktywacja komórek T CD3/28 DynabeadsGibco11131D
System transfekcji Invitrogen NeonThermoFisher10431915
System transfekcji Invitrogen Neon 100 μ L ZestawThermoFisher10114334
LentivirusVectorBuilder
MEM Roztwór aminokwasów endogennych Przeciwciało Gibco11140050
Myc Tag A647 (klon 9B11)Technologie sygnalizacji komórkowej2233S
Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicyThermoFisher31985062
roztwór penicyny-streptomycynyGibco15140122
Rekombinowana ludzka interleukina-2 (rhIL-2)Peprotech200-02
RPMI 1640 podłoże, bez glutaminy Gibco11875093
Pirogronian soduGibco11360070
Cytometr spektralny przepływowyCytekNorthern
Lights TRAC gRNASynthegoSequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoFisherA36496
Roztwór błękitu trypanowego Sigma T8154-100ML
1/10 LeukopakSTEMCELL Technologies200-00921-2 miliardy PBMC
cezu-137 Magnes 15575020344604344707Szkiełka do liczenia 1450102

Bibliografia

  1. Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Choi, B. D., et al. Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma. N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).
  4. Brown, C. E., et al. Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial. Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).
  5. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  6. Ghobadinezhad, F., et al. The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease. Front Immunol. 13, 1075813(2022).
  7. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  8. Sakaguchi, S., et al. Regulatory T cells and human disease. Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).
  9. Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. Next-generation regulatory T cell therapy. Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).
  10. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).
  11. Sawitzki, B., et al. Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials. Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).
  12. Spanier, J. A., et al. Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice. J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).
  13. Muller, Y. D., et al. Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance. Front Immunol. 12, 686439(2021).
  14. MacDonald, K. G., et al. Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor. J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).
  15. Boardman, D. A., et al. Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD. J Autoimmun. 134, 102961(2023).
  16. Schreeb, K., et al. Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation. Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).
  17. Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors. Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).
  18. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).
  19. Bender, C., et al. A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes. Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).
  20. Ferreira, L. M. Conference report: Advanced Therapies Week 2023. Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).
  21. Cochrane, R. W., et al. How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy. Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).
  22. Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures. J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).
  23. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  24. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  25. Velasco Cardenas, R. M., et al. Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells. Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).
  26. Boomer, J. S., Green, J. M. An enigmatic tail of CD28 signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).
  27. Suhoski, M. M., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).
  28. Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. Transduction of human T cell subsets with lentivirus. Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).
  29. Bailey-Bucktrout, S. L., et al. Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response. Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).
  30. Nakagawa, H., et al. Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).
  31. Dawson, N. A. J., et al. Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells. Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).
  32. Rana, J., et al. CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII. Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).
  33. Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin. Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).
  34. Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal. J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).
  35. Samarasinghe, S., et al. Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy. Blood. 115 (2), 396-407 (2010).
  36. Voss, K., et al. FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death. Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).
  37. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

CAR Tregsizolacja Tregtransdukcja lentiwirusowaedycja CRISPR Cas9wirusy towarzyszące adenowirusomekspansja ex vivocytometria przepłyewowasupresja immunologiczna
Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.