Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.
Artykuł metodologiczny
Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zapisy oparte na wieloelektrodach krzemowych są coraz bardziej popularne do badania aktywności neuronalnej w rozdzielczości czasowej potencjałów czynnościowych w wielu obszarach mózgu. Jednak rejestrowanie aktywności neuronalnej z głębokich struktur ogonowych, takich jak pień mózgu, za pomocą sond wielokanałowych pozostaje wyzwaniem. Istotnym problemem jest znalezienie trajektorii wprowadzania sondy, która pozwala uniknąć dużych naczyń krwionośnych, takich jak zatoka żylna strzałkowa górna i zatoka żylna poprzeczna. Uszkodzenie tych dużych żył może spowodować rozległe krwawienie, uszkodzenie leżącej poniżej tkanki mózgowej i potencjalnie śmierć. Podejście to opisuje celowanie w struktury pnia mózgu poprzez sprzężenie współrzędnych przednich z podejściem kątowym, co pozwala sondzie rejestrującej penetrować mózg poniżej struktur naczyniowych wysokiego ryzyka. W porównaniu z podejściem ściśle pionowym, podejście kątowe maksymalizuje liczbę obszarów mózgu, które mogą być celowane. Korzystając z tej strategii, brzuszno-boczny szary okołowodociągowy (vlPAG), region pnia mózgu związany ze snem REM, może być odtwarzalnie i niezawodnie dostępny w celu uzyskania jednojednostkowych, wieloelektrodowych zapisów u myszy z głową przed i podczas znieczulenia sewofluranem. Możliwość rejestrowania aktywności neuronalnej w vlPAG i otaczających jądrach z wysoką rozdzielczością czasową jest krokiem naprzód w zrozumieniu związku między snem REM a znieczuleniem.
Wprowadzenie
Nagrania oparte na wieloelektrodach krzemowych stają się coraz bardziej popularne do pomiaru aktywności neuronalnej w wielu obszarach mózgu z rozdzielczością pojedynczego potencjału czynnościowego1,2,3,4. W ciągu ostatniej dekady technologia nagrywania o dużej gęstości znacznie się rozwinęła. Obecne elektrody rejestrujące na bazie krzemu mogą pomieścić dużą liczbę kanałów, światłowody i urządzenia rejestrujące elektrokortykografię (ECoG)5,6. Co więcej, chroniczne wszczepianie tych elektrod pozwala na długoterminowe zapisy7,8.
Pomimo najnowszych osiągnięć technologicznych, celowanie w głębokie struktury ogonowe, takie jak pień mózgu, za pomocą wielokanałowych sond, pozostaje wyzwaniem. Podczas celowania w struktury pnia mózgu, takie jak brzuszno-boczna szarość okołoakwedukcyjna (vlPAG), jedną z istotnych przeszkód jest zidentyfikowanie trajektorii sondy, która omija główne naczynia krwionośne, np. zatokę żylną strzałkową górną i zatokę żylną poprzeczną. Uszkodzenie tych dużych żył może spowodować rozległe krwawienie, uszkodzenie leżącej poniżej tkanki mózgowej, a nawet śmierć9,10. Proponujemy celowanie w struktury pnia mózgu od współrzędnych przednich pod kątem, co pozwoli sondzie rejestrującej przeniknąć do mózgu poniżej takich struktur naczyniowych wysokiego ryzyka (patrz Rysunek 1). To podejście kątowe, w porównaniu z podejściem pionowym, maksymalizuje liczbę obszarów mózgu dostępnych do nagrywania. Dodatkowo, w warunkach eksperymentalnych, w których pożądane są zapisy ECoG, kątowe podejście przednie zapewnia większą powierzchnię czaszki dostępną do implantacji gogli ECoG, ponieważ okno kraniotomii do wprowadzenia sondy jest umieszczone bardziej do przodu10,11.
Identyfikacja konkretnych grup komórek i obwodów odpowiedzialnych za wywołane znieczuleniem zmiany snu REM pozostaje głównym celem badań nad anestezjologią. W związku z tym celem było powtarzalne i niezawodne uzyskanie dostępu do vlPAG - regionu pnia mózgu związanego ze snem REM - w celu uzyskania pojedynczych, wieloelektrodowych zapisów u myszy z unieruchomieniem głowy przed i podczas znie12,13. W poprzednich badaniach wykorzystano pomiary elektrofizjologicznego potencjału pola lokalnego (LFP) vlPAG u obudzonych myszy w celu zidentyfikowania zmian stanu neuronalnego związanych ze znieczuleniem14,15. Jednak pomiary LFP są przede wszystkim wrażliwe na aktywność synaptyczną, a nie potencjały czynnościowe, w obrębie rejestrowanego obszaru16. W związku z tym wiedza na temat tego, w jaki sposób środki znieczulające bezpośrednio wpływają na wzorce aktywności neuronalnej wytwarzane przez neurony vlPAG, jest ograniczona. W tym miejscu opisano metodę uzyskiwania nagrań pojedynczych neuronów o dużej gęstości z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Metodę tę można również dostosować do rejestrowania aktywności pojedynczych neuronów z różnych innych głębokich i tylnych struktur pnia mózgu.
Protokół
Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wirginii (Charlottesville, Wirginia). Wykorzystano pięć samców myszy C57BL/6J w wieku 3-7 miesięcy, o wadze 25-30 g. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego tutaj sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Założenie płyty głównej i zestawu słuchawkowego
- Wykonaj zestaw słuchawkowy ECoG, przylutowując drut ze stali nierdzewnej pokrytej perfluoroalkoksy (PFA) do 3-pinowego złącza header (Rysunek 2A).
- Zidentyfikuj współrzędne wstawienia na podstawie stereotaktycznego atlasu17. Wykorzystanie twierdzenia Pitagorasa do obliczenia kąta i głębokości wsunięcia sondy - szczególnie gdy w literaturze jest niewiele informacji - jest rozsądnym punktem wyjścia (Rysunek 1)18.
UWAGA: Ostatecznie współrzędne zostaną dostosowane metodą prób i błędów. Do wycelowania w vlPAG u dorosłych myszy użyto następujących współrzędnych: przednio-tylna (AP) -3,6 mm, przyśrodkowo-boczna (ML) +0,5 mm, grzbietowo-brzuszna (DV) -4 mm. Sonda została włożona pod kątem 20° (AP). - Wywołaj znieczulenie ogólne, umieszczając mysz w komorze indukcyjnej (1,5%-3% izofluranu w tlenie). Po znieczuleniu umieść mysz w ramce stereotaktycznej, umieszczając nos zwierzęcia w stożku nosowym i stabilizując głowę za pomocą prętów na głowę.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki. Stosować system kontroli temperatury, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
- Nałóż krem do depilacji lub ogol sierść na skórę głowy, a następnie zdezynfekuj jodonem i 70% alkoholem. Stosuj technikę aseptyczną "tylko końcówki", aby utrzymać sterylne pole operacyjne.
- Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
- Podawać środek przeciwbólowy: karprofen 2,5 mg/kg, podawany podskórnie z tyłu w plecy.
- Wykonaj nacięcie skóry głowy o średnicy 5 mm, aby usunąć okrągły fragment skóry nad kośćmi ciemieniowymi i potylicznymi. Delikatnie usuń opony mózgowe, zeskrobując je ostrzem skalpela.
- Użyj ostrza skalpela, aby przeciąć przyczepy mięśniowe i odsłonić kości ciemieniowe i potyliczne19. W razie potrzeby zastosuj nadtlenek wodoru, aby zatamować krwawienie i osuszyć powierzchnię czaszki. Bardzo ważne jest, aby nałożyć cement dentystyczny i żywicę na suchą czaszkę, aby uzyskać silne wiązanie.
- Najpierw zidentyfikuj punkty orientacyjne bregma i lambda na skull20. Następnie wyreguluj pozycję stożka nosa, aby wyrównać przednią i tylną pozycję czaszki, upewniając się, że różnica wysokości między dwoma punktami orientacyjnymi nie przekracza 100 μm.
- Aby wyrównać przyśrodkowo-boczne położenie czaszki, wybierz dwa przeciwległe punkty między bregmą a lambdą, każdy 1 mm od szwu strzałkowego i sprawdź ich poziom. Jeśli różnica wysokości między nimi wynosi więcej niż 100 μm, dostosuj przyśrodkowo-boczne położenie czaszki, manipulując prętami na głowę.
- Zmierz odległość między bregmą a lambdą i porównaj ją z odległością podaną w atlasie stereotaktycznym Franklina-Paxinosa (zwykle 4,2 mm)17. Użyj różnicy między zmierzonymi i zgłoszonymi odległościami, aby proporcjonalnie przeskalować współrzędne AP. Zaznacz współrzędne kraniotomii na czaszce wysterylizowanym ołówkiem.
UWAGA: Jeśli zmierzona odległość bregma-lambda różni się od 4,2 mm, współrzędne należy przeskalować proporcjonalnie. Wszystkie współrzędne AP podane w atlasie stereotaktycznym odpowiadają znormalizowanej odległości bregma-lambda. Ponieważ rozmiar czaszki myszy jest zmienny, ważne jest, aby odpowiednio dostosować współrzędne. - Za pomocą stereotaktycznego mikromanipulatora umieść płytkę główną bezpośrednio na szwie lambda i przymocuj ją do czaszki, nakładając cement dentystyczny na płytę głowy i wokół niej (Rysunek 3A,B). Odczekaj co najmniej 10 minut, aż cement wyschnie.
- Wywierć otwory na zadziory (o średnicy 0,5 mm) na dwie elektrody korowe (korę czołową i ciemieniową) oraz na jedną, która będzie służyć jako elektroda referencyjna (móżdżek). Umieść odizolowane końce (0,5 mm) powlekanych elektrod z drutu srebrnego w otworach na zadziory i zabezpiecz żywicą aktywowaną światłem ultrafioletowym.
- Całkowicie pokryj powlekane druty ze stali nierdzewnej cementem dentystycznym, aby żaden drut nie był odsłonięty. Przykryj spód i boki zestawu słuchawkowego cementem dentystycznym, aby był mocno osadzony. Upewnij się, że szwy bregma i lambda pozostają widoczne po zamocowaniu zestawu słuchawkowego na miejscu (Rysunek 2B).
- Pozwól myszy dojść do siebie przez co najmniej 7 dni, codziennie badaj zwierzę i miejsce operacji pod kątem wszelkich nieprawidłowości. W razie potrzeby należy podać leki przeciwbólowe (karprofen 2,5 mg/kg mc., podskórnie).
2. Umieszczanie i nagrywanie sondy krzemowej
- Przyzwyczaj mysz do urządzenia rejestrującego i utrwalaj głowę (co najmniej 1,5 godziny w dwóch oddzielnych dniach) (Rysunek 2D).
- W dniu nagrania umieść mysz w komorze anestezjologicznej (izofluran 1,5%-3% w tlenie).
- Ustaw mysz w ramce stereotaktycznej, wyreguluj stożek nosa i paski na głowę zgodnie z opisem w 1.3. Utrzymuj znieczulenie (izofluran 1,5%-3% tlenu) przez cały czas operacji stereotaktycznej. Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy i utrzymuj odpowiednią temperaturę ciała.
- Zidentyfikuj bregmę i lambdę, upewniając się, że różnica wysokości między tymi dwoma anatomicznymi punktami orientacyjnymi nie przekracza 100 μm.
- Znajdź i zaznacz obliczone współrzędne na czaszce sterylnym ołówkiem, a następnie utwórz kontur okna kraniotomii 2 mm x 2 mm wokół współrzędnych.
- Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
- Użyj wiertła szybkoobrotowego, aby stworzyć okienko kraniotomii 2 mm x 2 mm. Zastosuj 0,5-1 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu. Usunąć oponę twardą za pomocą igły strzykawkowej i drobnych kleszczyków.
UWAGA: Uważaj na główne naczynia krwionośne (zatoka strzałkowa górna, zatoka poprzeczna), aby uniknąć nadmiernego krwawienia (Ryc. 3). - Użyj wiertła szybkoobrotowego, aby utworzyć oddzielny otwór na elektrodę odniesienia sondy krzemowej, zwykle ~1-2 mm od okna czaszki.
- Nałóż 0,2 ml kleju silikonowego o niskiej toksyczności na czaszkę, aby całkowicie uszczelnić kraniotomię, za pomocą dołączonego aplikatora.
- Pozwól myszy dojść do siebie przez około 1 godzinę.
- Przymocuj głowę myszy do urządzenia rejestrującego elektrofizjologię za pomocą płyty czołowej i (Rysunek 2D).
- Pokryj trzpień sondy krzemowej barwnikiem fluorescencyjnym DiI (1:4 DiI:Etanol), aby trajektorię sondy można było zrekonstruować po eksperymencie.
- Zamontuj sondę na manipulatorze i ustaw żądany kąt. Do namierzania vlPAG zastosowano kąt PP 15-20°.
- Opuść sondę rejestrującą na powierzchnię mózgu w środku okna czaszki. Najpierw ręcznie włóż sondę na głębokość ~300 μm. Po włożeniu na tę głębokość powoli automatycznie opuść sondę (np. 200 μm/min) na docelową głębokość, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki21 (Rysunek 2C).
UWAGA: Początkowo zalecane jest ręczne włożenie sondy. Ręczne wkładanie sondy zapewnia możliwość zatrzymania i cofnięcia sondy w przypadku jej wygięcia przy pierwszym włożeniu. Gdy sonda całkowicie wniknie w tkankę, generalnie można bezpiecznie kontynuować opuszczanie sondy w trybie automatycznym. - Nałóż olej mineralny na powierzchnię mózgu w oknie kraniotomii, aby zapobiec wysuszeniu.
- Pozwól sondzie nagrywającej osiąść na 10 minut po włożeniu.
- Rejestruj dane z sondy krzemowej i ECoG z częstotliwością 30 kHz za pomocą kontrolera nagrywania Intan.
- 1-2 godziny po nagraniu użyj techniki perfuzji przezsercowej, aby utrwalić mózg w 4% paraformaldehyde22.
UWAGA: Ze względu na cement usunięcie rostralnej części czaszki może być trudne. Dlatego lepiej jest wyciąć mózg poprzez usunięcie grzbietowych części czaszki. - Odetnij głowę myszy, przetnij skórę wzdłuż linii środkowej po stronie grzbietowej, od szyi do dolnej szczęki. Usuń mięśnie i tkanki przyczepione do czaszki, odetnij dolną szczękę, aby ułatwić dostęp do mózgu.
- Jeśli perfuzja zostanie wykonana prawidłowo, mózg powinien się nieco skurczyć, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca, aby włożyć cienkie nożyczki w grzbietową część otworu wielkiego. Wykonaj jedno cięcie przyśrodkowe, jedno boczne i jedno przeciwległe, o wielkości około 1 mm, w kości potylicznej.
- Ostrożnie usuń grzbietową część czaszki za pomocą kleszczy okulistycznych. Zacznij od kości potylicznej, usuń wszystkie fragmenty czaszki, aż cała grzbietowa część mózgu zostanie odsłonięta.
- Wsuń mikroszpatułkę pod mózg, zaczynając od opuszki węchowej, aby zgarnąć mózg.
- Po perfuzji i usunięciu mózg może być przechowywany w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24-48 godzin.
3. Histologia do rekonstrukcji trajektorii sondy
- Podziel mózg na sekcje koronalne o długości 70 μm za pomocą wibratomu.
- Zamontuj sekcje na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego DAPI, które barwi jądra komórkowe. Nakryj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci.
- Zobrazuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dostosuj kontrast/jasność tak, aby ścieżki sondy były wyraźnie widoczne. Upewnij się, że wynikowe rozmiary plików obrazów tiff są mniejsze niż 10 MB, aby kody MATLAB działały płynnie. Zrekonstruuj ścieżki sondy za pomocą kodu MATLAB23.
4. Analiza danych elektrofizjologicznych
- Analizuj zarejestrowane sygnały neuronowe z sondy krzemowej za pomocą oprogramowania do wykrywania i automatycznego sortowania w trybie off-line (Kilosort)24.
- Ręcznie klasyfikuj wykryte klastry za pomocą Phy jako wiele lub pojedyncze jednostki25. Klasyfikuj klastry jako pojedyncze jednostki, gdy mają fizjologiczny kształt fali szczytowej, pokazują okres refrakcji w korelogramie krzyżowym i normalny rozkład amplitudy.
- Zaimportuj dane pojedynczej jednostki do MATLAB i analizuj23.
Wyniki
Pięciu samcom myszy C57BL/6J wszczepiono zestaw ECoG oraz płytkę mocującą do głowy (Rysunek 4A). Po rekonwalescencji myszy przyzwyczajano do unieruchomienia głowy oraz do zestawu do rejestracji elektrofizjologicznej podczas dwóch 1,5-godzinnych sesji w oddzielne dni (Rysunek 4B). Następnie wykonano okno kraniotomii o wymiarach 2 mm x 2 mm (Rysunek 4C), a w stanie czuwania przy unieruchomionej głowie myszy wprowadzono sondę krzemową (Rysunek 4D). Wykorzystano dwa rodzaje sond krzemowych UCLA: (1) 64 M: sonda jednoelementowa z 64 elektrodami oraz (2) 256 ANS: sonda czteroelementowa z 256 elektrodami. Sewofluran i tlen podawano za pomocą maski nosowej przymocowanej do zestawu elektrofizjologicznego. Poziomy tlenu i sewofluranu monitorowano co 5 min za pomocą analizatora gazów w układzie. Po perfuzji przezsercowej pobrano mózg (Rysunek 4E) i oceniono trajektorię sondy (Rysunek 4F). Zarejestrowane potencjały czynnościowe poddano następnie kuracji w celu uzyskania danych z pojedynczych jednostek (Rysunek 4G).
Wykonano pięć pomiarów, w których rozmieszczenie sondy zweryfikowano za pomocą dostępnych algorytmów rekonstrukcji sond opracowanych w programie MATLAB23. Dzięki zastosowaniu tych algorytmów każda elektroda sondy krzemowej została zlokalizowana w konkretnej strukturze mózgu, co pozwoliło na uzyskanie trójwymiarowego obrazu rozmieszczenia sondy w mózgu (Rysunek 5). Algorytmy rekonstrukcji te powiązano z markerami immunohistochemicznymi, aby dodatkowo potwierdzić trajektorie sondy (Rysunek 6). Następnie dane dopasowano do wyselekcjonowanych pojedynczych jednostek (Rysunek 7).
W sumie zarejestrowano 64 pojedyncze neurony, z czego 13 znajdowało się w vlPAG. Pozostałe 51 neuronów znajdowało się w pobliskich jądrach: śródmózgowiu, jądrze siateczkowym śródmózgowia, jądrze przytrochlearznym, jądrze klinowatym, boczno-grzbietowym jądrze przymostkowym, jądrze parabrachialnym oraz górnych mieszkach móżdżku. Aktywność wyładowań neuronów u każdej myszy przedstawiono na mapach ciepła (Rysunek 7). Myszkę 3 wykluczono z analizy z powodu słabej jakości rejestracji pojedynczych jednostek. Większość zarejestrowanych neuronów wykazała spadek częstotliwości wyładowań podczas znieczulenia sewofluranem.
Średnią częstotliwość wyładowań neuronów vlPAG porównano dla każdej myszy w 5-minutowym okresie bazowym (tj. od 10. do 15. minuty rejestracji) oraz w ciągu 5 minut podawania sewofluranu (tj. od 40. do 45. minuty rejestracji). Aktywność vlPAG była znacząco obniżona (Rysunek 8A), a ponadto spadek ten był spójny dla wszystkich neuronów vlPAG (Rysunek 8B).
Rycina 1: Obliczanie współrzędnych stereotaktycznych dla wprowadzenia sondy. Panel lewy: Wykorzystanie geometrii do obliczenia kąta podejścia przy wprowadzaniu sondy. Zidentyfikowano następujące elementy trójkąta prostokątnego: (a) głębokość DV struktury docelowej od powierzchni mózgu (uzyskana z atlasu stereotaktycznego), (b) odległość między współrzędną AP przy założeniu ściśle pionowego zejścia a współrzędną AP struktury docelowej. Panel prawy: Znając wartości (a) i (b), można zastosować twierdzenie Pitagorasa, aby obliczyć kąt AP (β) oraz długość (c) wprowadzenia sondy. Do celowania w vlPAG zastosowano następujące współrzędne: (AP) -3.6 mm, (ML) +0.5 mm, (DV) -4 mm. Zastosowano kąt AP (β) wynoszący 20°. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Implantacja płytki czaszkowej i rejestracja pojedynczych jednostek. (A) Umieszczenie przewodów zestawu ECoG podczas implantacji. (B) Widok z góry na czaszkę myszy po implantacji zestawu ECoG i płytki czaszkowej. (C) Trzpienie sondy krzemowej wprowadzone do mózgu.(D) Mysz z unieruchomioną głową podczas rejestracji za pomocą sondy krzemowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Lokalizacja okna czaszkowego w odniesieniu do głównych naczyń krwionośnych. Schematyczny rysunek układu naczyniowego na powierzchni mózgu myszy z zaznaczonymi zatoką strzałkową górną i zatoką poprzeczną. Biały kwadrat wskazuje położenie okna czaszkowego, a czerwona kropka reprezentuje punkt wprowadzenia sondy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Schemat doświadczenia. Pięciuu samców myszy C57BL/6J wszczepiono zestaw ECoG oraz płytkę głowową (A). Po rekonwalescencji myszy oswajano z unieruchomieniem głowy i układem rejestrującym (B). Następnie wykonano kraniotomię (C) i wprowadzono sondę krzemową u budzącej się myszy w pozycji z unieruchomioną głową. Lotne środki znieczulające oraz tlen podawano za pomocą stożka nosowego (D). Po rejestracji pobrano mózg (E) i poddano go analizie z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych w celu zrekonstruowania trajektorii sondy (F). Zarejestrowane potencjały czynnościowe wyselekcjonowano następnie do postaci danych z pojedynczych jednostek (G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Model 3D mózgu z zrekonstruowanymi ścieżkami sond. Każda prosta kolorowa linia reprezentuje trajektorię sondy. Każda kropka oznacza miejsce występowania barwnika DiI widocznego na koronalnych przekrojach mózgu. Trajektoria sondy została zrekonstruowana dla każdego ramienia sondy krzemowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 6: Rekonstrukcja post hoc rozmieszczenia sond w obrębie vlPAG. Reprezentatywne coronalne przekroje mózgu dla każdej badanej myszy (1-5) barwione DAPI (niebieski), pokazujące ślady sond ((DiI, czerwony, zaznaczone zielonymi strzałkami) wraz z obrysem regionów mózgu. Pasek skali: 500 µm. Rejestracje u myszy 1-3 przeprowadzono za pomocą jednoramiennych sond krzemowych (tj. 64 kanałów), natomiast u myszy 4 i 5 zastosowano czteroramienne sondy krzemowe (tj. 256 kanałów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 7: Zagregowana aktywność wyładowań przed i w trakcie znieczulenia sewofluranem.Mapy ciepła przedstawiają liczbę wygenerowanych potencjałów czynnościowych przez 64 pojedyncze neurony w interwałach minutowych. Pojedyncze neurony przypisano do struktur pochodzenia na podstawie rekonstrukcji trajektorii sondy. Biała przerywana linia oznacza początek podawania sewofluranu, n = 4 myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 8: Zniesienie wyładowań neuronów vlPAG podczas anestezji sewofluranem. (A) Średnia liczba potencjałów czynnościowych generowanych przed i w trakcie anestezji dla każdej myszy. (B) Liczba potencjałów czynnościowych generowanych przez poszczególne neurony vlPAG (B). Parzysty test t-studenta, odpowiednio **P = 0.0036, P = 0.0053. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 9: Przykład tego, jak nierówne rozmieszczenie płytki głownej może wpłynąć na trajektorię sondy. (A) Nierówne rozmieszczenie płytki głównej na głowie myszy. (B,C) Trójwymiarowa rekonstrukcja mózgu myszy z wyrenderowaną trajektorią sondy, w której występuje niezamierzony kąt przyśrodkowo-boczny spowodowany nierównym rozmieszczeniem płytek głównych na głowie myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Jądra pnia mózgu pośredniczą w podstawowych funkcjach, takich jak oddychanie, świadomość i sen 26,27,28. Lokalizacja pnia mózgu (głęboka i tylna) stanowi wyzwanie w badaniu jego aktywności neuronalnej in vivo przy użyciu standardowych technik. Tutaj przedstawiono kątowe podejście przednie, aby umożliwić powtarzalny zapis pojedynczej jednostki u myszy z głową.
Staranne włożenie wieloelektrodowej sondy krzemowej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójnego celowania w struktury pnia mózgu związane ze snem REM, przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia głównych naczyń krwionośnych. Wymagany jest znaczny stopień finezji, koncentracji i cierpliwości, aby ustalić najlepsze współrzędne i trajektorię wejścia13.
Ze względu na kątową trajektorię sondy i odległość wymaganą do namierzenia głębokich struktur, nawet drobne niespójności we współrzędnych i położeniu płyty czołowej prawdopodobnie spowodują pominięcie docelowej struktury. Konieczne jest, aby Bregma i Lambda znajdowały się na tym samym poziomie podczas implantacji płyty czołowej i aby odległość między nimi była dokładnie zmierzona. Warto zauważyć, że ponieważ operacje są wykonywane na ramie stereotaktycznej, a nagrania są wykonywane na oddzielnym stanowisku do elektrofizjologii, bardzo ważne jest, aby płyty głowy były przymocowane do wypoziomowanej czaszki. Wprowadzenie dodatkowych kątów (np. pochylona głowa) zwiększa ryzyko błędu, które jest szczególnie wysokie w przypadku małych, głębokich struktur mózgu (ryc. 9).
Ponieważ sondy krzemowe są delikatne, ważne jest, aby usunąć oponę twardą z powierzchni mózgu i upewnić się, że żadne fragmenty kości nie blokują okna czaszki. Po usunięciu opony twardej może wystąpić lekkie krwawienie, dlatego ważne jest, aby oczyścić powierzchnię kraniotomii z zakrzepłej krwi, która może spowodować wygięcie sondy. Jeśli wprowadzenie sondy krzemowej do mózgu okazuje się trudne (np. sonda się wygina), ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma pozostałości opony twardej lub czy powierzchnia mózgu wyschła, ponieważ cienka błona może się utworzyć, gdy zostanie pozostawiona z niewielką ilością płynu lub nie ma go wcale. U ludzi27 obszary w pobliżu naczyń krwionośnych mają grubszą oponę twardą, a podobny problem występuje u myszy, u których usunięcie opony twardej bez pękania naczyń może być trudne. Chociaż staranne usunięcie opony twardej zwykle skutkuje płynnym wprowadzeniem sondy, większe kąty wsunięcia mogą stanowić dodatkowe trudności.
Wydajność nagrań może się znacznie różnić w zależności od zwierzęcia i zależy od wielu zmiennych. Jednym z istotnych czynników jest gęstość neuronów w docelowej strukturze; Obszary o niskiej gęstości neuronów (np. Kora mózgowa) mają zwykle niższą wydajność rejestrowanych pojedynczych neuronów. Ponadto uszkodzenie tkanki, takie jak pęknięcie naczynia pod powierzchnią mózgu, może prowadzić do śmierci lub uszkodzenia neuronów, co jeszcze bardziej zmniejsza wydajność21,29. Kluczowa jest również jakość nagrań, ponieważ wyższa jakość nagrań ułatwia rozróżnienie pojedynczych neuronów. Niecelna trajektoria sondy może również skutkować niższymi wydajnościami. Chociaż protokół ten został opracowany do nagrań w vlPAG, może być używany do nagrywania z pobliskich struktur w pniu mózgu.
Oświadczenia
W związku z niniejszą pracą autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.
Podziękowania
Rysunek 1, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 8 i Rysunek 9 zostały utworzone za pomocą BioRender.com. Chcielibyśmy podziękować Scottowi Kilianskiemu za pomoc przy kodzie MATLAB i udostępnienie swoich skryptów. Dziękujemy Annie Grace Carns za pomoc w rekonstrukcji trajektorii sondy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1024-kanałowy kontroler nagrywania RHD | Intan Technologies, Los Angeles, Kalifornia, USA | C3008 | Nagrywanie sondą krzemową; sprzęt i oprogramowanie do nagrywania |
| 24 mm x 50 mm Szkiełko nakrywkowe nr 1.5 VWR | VWR, Radnor, Pensylwania, USA | 48393-081 | Histologia |
| 4% PFA w PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | J61899. AK | Histologia; roztwór perfuzyjny |
| C& B metabond | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | proszek: 5533559, szybka baza: 5533492, katalizator: 55335007 | Headplate & Implantacja zestawu słuchawkowego |
| C57/6J myszy 4-6 tygodni, samce | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | |
| Capnomac Ultima | Datex, Helsinki, Finlandia | ULT-SVi-27-07 | Analizator gazów; wycofane z produkcji; alternatywny analizator gazów można zakupić w Bionet America |
| CM-DiI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | V22888 | Czerwony barwnik fluorescencyjny do powlekania sondy silikonowej |
| Nagłówek złącza | DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA | 1212-1788-ND | Zestaw słuchawkowy ECoG |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA | 0100-20 | Histologia |
| iBOND Universal | Patterson Dental, Richmond, Wirginia, USA | 044-1113 | Płyta czołowa i Implantacja zestawu słuchawkowego; dla Mocowanie drutów ze stali nierdzewnej do czaszki |
| Klej silikonowy o niskiej toksyczności | World Precision Instruments, Sarasota, Floryda, USA | KWIK-SIL | |
| Scale Technologies, Victor, Nowy Jork, USA | Manipulator wielosondowy: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, Pierścień MPM do ramion ręcznych MPM, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 | Zapis sondą krzemową; wprowadzenie sondy do mózgu | |
| Mikrosondy | UCLA, Los Angeles, Kalifornia, USA | 256 ANS, 64M | Wycofane; alternatywne sondy krzemowe można kupić w Neuropixels |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA | M8410-100ML | Zapis sondy silikonowej; zapobieganie wysychaniu tkanki podczas nagrywania |
| Sól fizjologiczna | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | Z1376 | Płyta czołowa i Implantacja zestawu słuchawkowego; zapobieganie wysuszeniu mózgu podczas operacji |
| Drut ze stali nierdzewnej pokryty PFA o średnicy 0,008 cala pokryty pasiastymi końcami | Systemy AM, Sequim, Waszyngton, USA | 791400 | Zestaw słuchawkowy ECoG i elektroda referencyjna do ECoG |
| Drut platynowy 24AWG | World Precision Instruments, Sarasota, Floryda, USA | Elektroda referencyjna PTP201 | do rejestracji sondy krzemowej |
| Szkiełka mikroskopowe Shandon Colorfrost Plus | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 99-910-01 | Histologia |
| Głowica ze stali nierdzewnej | Star Rapid, Chiny | wykonana na zamówienie | Płyta główna i Implantacja zestawu słuchawkowego; projekt dostępny na życzenie |
| Aparatura stereotaktyczna | KOPF, Tujunga, Kalifornia, USA | Model 940 Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt z cyfrowym wyświetlaczem | Konsola Płyta główna i Implantacja zestawu słuchawkowego |
Bibliografia
- Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
- Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
- Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
- Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
- Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
- Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
- Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
- Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
- Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
- The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
- Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
- Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
- Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
- Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
- Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).
Przedruki i uprawnienia
