Method Article

Ostre jednojednostkowe nagrania wieloelektrodowe z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania in vivo, wysokiej gęstości nagrań pojedynczych neuronów z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Podejście to jest stosowane do pomiaru potencjału czynnościowego neuronów w brzuszno-bocznej szarości okołowodociągowej - regionie pnia mózgu nieaktywnym podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) - przed i podczas znieczulenia ogólnego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapisy oparte na wieloelektrodach krzemowych są coraz bardziej popularne do badania aktywności neuronalnej w rozdzielczości czasowej potencjałów czynnościowych w wielu obszarach mózgu. Jednak rejestrowanie aktywności neuronalnej z głębokich struktur ogonowych, takich jak pień mózgu, za pomocą sond wielokanałowych pozostaje wyzwaniem. Istotnym problemem jest znalezienie trajektorii wprowadzania sondy, która pozwala uniknąć dużych naczyń krwionośnych, takich jak zatoka żylna strzałkowa górna i zatoka żylna poprzeczna. Uszkodzenie tych dużych żył może spowodować rozległe krwawienie, uszkodzenie leżącej poniżej tkanki mózgowej i potencjalnie śmierć. Podejście to opisuje celowanie w struktury pnia mózgu poprzez sprzężenie współrzędnych przednich z podejściem kątowym, co pozwala sondzie rejestrującej penetrować mózg poniżej struktur naczyniowych wysokiego ryzyka. W porównaniu z podejściem ściśle pionowym, podejście kątowe maksymalizuje liczbę obszarów mózgu, które mogą być celowane. Korzystając z tej strategii, brzuszno-boczny szary okołowodociągowy (vlPAG), region pnia mózgu związany ze snem REM, może być odtwarzalnie i niezawodnie dostępny w celu uzyskania jednojednostkowych, wieloelektrodowych zapisów u myszy z głową przed i podczas znieczulenia sewofluranem. Możliwość rejestrowania aktywności neuronalnej w vlPAG i otaczających jądrach z wysoką rozdzielczością czasową jest krokiem naprzód w zrozumieniu związku między snem REM a znieczuleniem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagrania oparte na wieloelektrodach krzemowych stają się coraz bardziej popularne do pomiaru aktywności neuronalnej w wielu obszarach mózgu z rozdzielczością pojedynczego potencjału czynnościowego1,2,3,4. W ciągu ostatniej dekady technologia nagrywania o dużej gęstości znacznie się rozwinęła. Obecne elektrody rejestrujące na bazie krzemu mogą pomieścić dużą liczbę kanałów, światłowody i urządzenia rejestrujące elektrokortykografię (ECoG)5,6. Co więcej, chroniczne wszczepianie tych elektrod pozwala na długoterminowe zapisy7,8.

Pomimo najnowszych osiągnięć technologicznych, celowanie w głębokie struktury ogonowe, takie jak pień mózgu, za pomocą wielokanałowych sond, pozostaje wyzwaniem. Podczas celowania w struktury pnia mózgu, takie jak brzuszno-boczna szarość okołoakwedukcyjna (vlPAG), jedną z istotnych przeszkód jest zidentyfikowanie trajektorii sondy, która omija główne naczynia krwionośne, np. zatokę żylną strzałkową górną i zatokę żylną poprzeczną. Uszkodzenie tych dużych żył może spowodować rozległe krwawienie, uszkodzenie leżącej poniżej tkanki mózgowej, a nawet śmierć9,10. Proponujemy celowanie w struktury pnia mózgu od współrzędnych przednich pod kątem, co pozwoli sondzie rejestrującej przeniknąć do mózgu poniżej takich struktur naczyniowych wysokiego ryzyka (patrz Rysunek 1). To podejście kątowe, w porównaniu z podejściem pionowym, maksymalizuje liczbę obszarów mózgu dostępnych do nagrywania. Dodatkowo, w warunkach eksperymentalnych, w których pożądane są zapisy ECoG, kątowe podejście przednie zapewnia większą powierzchnię czaszki dostępną do implantacji gogli ECoG, ponieważ okno kraniotomii do wprowadzenia sondy jest umieszczone bardziej do przodu10,11.

Identyfikacja konkretnych grup komórek i obwodów odpowiedzialnych za wywołane znieczuleniem zmiany snu REM pozostaje głównym celem badań nad anestezjologią. W związku z tym celem było powtarzalne i niezawodne uzyskanie dostępu do vlPAG - regionu pnia mózgu związanego ze snem REM - w celu uzyskania pojedynczych, wieloelektrodowych zapisów u myszy z unieruchomieniem głowy przed i podczas znie12,13. W poprzednich badaniach wykorzystano pomiary elektrofizjologicznego potencjału pola lokalnego (LFP) vlPAG u obudzonych myszy w celu zidentyfikowania zmian stanu neuronalnego związanych ze znieczuleniem14,15. Jednak pomiary LFP są przede wszystkim wrażliwe na aktywność synaptyczną, a nie potencjały czynnościowe, w obrębie rejestrowanego obszaru16. W związku z tym wiedza na temat tego, w jaki sposób środki znieczulające bezpośrednio wpływają na wzorce aktywności neuronalnej wytwarzane przez neurony vlPAG, jest ograniczona. W tym miejscu opisano metodę uzyskiwania nagrań pojedynczych neuronów o dużej gęstości z pnia mózgu myszy z unieruchomioną głową. Metodę tę można również dostosować do rejestrowania aktywności pojedynczych neuronów z różnych innych głębokich i tylnych struktur pnia mózgu.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wirginii (Charlottesville, Wirginia). Wykorzystano pięć samców myszy C57BL/6J w wieku 3-7 miesięcy, o wadze 25-30 g. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego tutaj sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Założenie płyty głównej i zestawu słuchawkowego

  1. Wykonaj zestaw słuchawkowy ECoG, przylutowując drut ze stali nierdzewnej pokrytej perfluoroalkoksy (PFA) do 3-pinowego złącza header (Rysunek 2A).
  2. Zidentyfikuj współrzędne wstawienia na podstawie stereotaktycznego atlasu17. Wykorzystanie twierdzenia Pitagorasa do obliczenia kąta i głębokości wsunięcia sondy - szczególnie gdy w literaturze jest niewiele informacji - jest rozsądnym punktem wyjścia (Rysunek 1)18.
    UWAGA: Ostatecznie współrzędne zostaną dostosowane metodą prób i błędów. Do wycelowania w vlPAG u dorosłych myszy użyto następujących współrzędnych: przednio-tylna (AP) -3,6 mm, przyśrodkowo-boczna (ML) +0,5 mm, grzbietowo-brzuszna (DV) -4 mm. Sonda została włożona pod kątem 20° (AP).
  3. Wywołaj znieczulenie ogólne, umieszczając mysz w komorze indukcyjnej (1,5%-3% izofluranu w tlenie). Po znieczuleniu umieść mysz w ramce stereotaktycznej, umieszczając nos zwierzęcia w stożku nosowym i stabilizując głowę za pomocą prętów na głowę.
  4. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki. Stosować system kontroli temperatury, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
  5. Nałóż krem do depilacji lub ogol sierść na skórę głowy, a następnie zdezynfekuj jodonem i 70% alkoholem. Stosuj technikę aseptyczną "tylko końcówki", aby utrzymać sterylne pole operacyjne.
  6. Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
  7. Podawać środek przeciwbólowy: karprofen 2,5 mg/kg, podawany podskórnie z tyłu w plecy.
  8. Wykonaj nacięcie skóry głowy o średnicy 5 mm, aby usunąć okrągły fragment skóry nad kośćmi ciemieniowymi i potylicznymi. Delikatnie usuń opony mózgowe, zeskrobując je ostrzem skalpela.
  9. Użyj ostrza skalpela, aby przeciąć przyczepy mięśniowe i odsłonić kości ciemieniowe i potyliczne19. W razie potrzeby zastosuj nadtlenek wodoru, aby zatamować krwawienie i osuszyć powierzchnię czaszki. Bardzo ważne jest, aby nałożyć cement dentystyczny i żywicę na suchą czaszkę, aby uzyskać silne wiązanie.
  10. Najpierw zidentyfikuj punkty orientacyjne bregma i lambda na skull20. Następnie wyreguluj pozycję stożka nosa, aby wyrównać przednią i tylną pozycję czaszki, upewniając się, że różnica wysokości między dwoma punktami orientacyjnymi nie przekracza 100 μm.
  11. Aby wyrównać przyśrodkowo-boczne położenie czaszki, wybierz dwa przeciwległe punkty między bregmą a lambdą, każdy 1 mm od szwu strzałkowego i sprawdź ich poziom. Jeśli różnica wysokości między nimi wynosi więcej niż 100 μm, dostosuj przyśrodkowo-boczne położenie czaszki, manipulując prętami na głowę.
  12. Zmierz odległość między bregmą a lambdą i porównaj ją z odległością podaną w atlasie stereotaktycznym Franklina-Paxinosa (zwykle 4,2 mm)17. Użyj różnicy między zmierzonymi i zgłoszonymi odległościami, aby proporcjonalnie przeskalować współrzędne AP. Zaznacz współrzędne kraniotomii na czaszce wysterylizowanym ołówkiem.
    UWAGA: Jeśli zmierzona odległość bregma-lambda różni się od 4,2 mm, współrzędne należy przeskalować proporcjonalnie. Wszystkie współrzędne AP podane w atlasie stereotaktycznym odpowiadają znormalizowanej odległości bregma-lambda. Ponieważ rozmiar czaszki myszy jest zmienny, ważne jest, aby odpowiednio dostosować współrzędne.
  13. Za pomocą stereotaktycznego mikromanipulatora umieść płytkę główną bezpośrednio na szwie lambda i przymocuj ją do czaszki, nakładając cement dentystyczny na płytę głowy i wokół niej (Rysunek 3A,B). Odczekaj co najmniej 10 minut, aż cement wyschnie.
  14. Wywierć otwory na zadziory (o średnicy 0,5 mm) na dwie elektrody korowe (korę czołową i ciemieniową) oraz na jedną, która będzie służyć jako elektroda referencyjna (móżdżek). Umieść odizolowane końce (0,5 mm) powlekanych elektrod z drutu srebrnego w otworach na zadziory i zabezpiecz żywicą aktywowaną światłem ultrafioletowym.
  15. Całkowicie pokryj powlekane druty ze stali nierdzewnej cementem dentystycznym, aby żaden drut nie był odsłonięty. Przykryj spód i boki zestawu słuchawkowego cementem dentystycznym, aby był mocno osadzony. Upewnij się, że szwy bregma i lambda pozostają widoczne po zamocowaniu zestawu słuchawkowego na miejscu (Rysunek 2B).
  16. Pozwól myszy dojść do siebie przez co najmniej 7 dni, codziennie badaj zwierzę i miejsce operacji pod kątem wszelkich nieprawidłowości. W razie potrzeby należy podać leki przeciwbólowe (karprofen 2,5 mg/kg mc., podskórnie).

2. Umieszczanie i nagrywanie sondy krzemowej

  1. Przyzwyczaj mysz do urządzenia rejestrującego i utrwalaj głowę (co najmniej 1,5 godziny w dwóch oddzielnych dniach) (Rysunek 2D).
  2. W dniu nagrania umieść mysz w komorze anestezjologicznej (izofluran 1,5%-3% w tlenie).
  3. Ustaw mysz w ramce stereotaktycznej, wyreguluj stożek nosa i paski na głowę zgodnie z opisem w 1.3. Utrzymuj znieczulenie (izofluran 1,5%-3% tlenu) przez cały czas operacji stereotaktycznej. Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
  4. Nałóż maść okulistyczną na oczy i utrzymuj odpowiednią temperaturę ciała.
  5. Zidentyfikuj bregmę i lambdę, upewniając się, że różnica wysokości między tymi dwoma anatomicznymi punktami orientacyjnymi nie przekracza 100 μm.
  6. Znajdź i zaznacz obliczone współrzędne na czaszce sterylnym ołówkiem, a następnie utwórz kontur okna kraniotomii 2 mm x 2 mm wokół współrzędnych.
  7. Wykonaj test szczypania palców u stóp, aby sprawdzić głębokość znieczulenia.
  8. Użyj wiertła szybkoobrotowego, aby stworzyć okienko kraniotomii 2 mm x 2 mm. Zastosuj 0,5-1 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu. Usunąć oponę twardą za pomocą igły strzykawkowej i drobnych kleszczyków.
    UWAGA: Uważaj na główne naczynia krwionośne (zatoka strzałkowa górna, zatoka poprzeczna), aby uniknąć nadmiernego krwawienia (Ryc. 3).
  9. Użyj wiertła szybkoobrotowego, aby utworzyć oddzielny otwór na elektrodę odniesienia sondy krzemowej, zwykle ~1-2 mm od okna czaszki.
  10. Nałóż 0,2 ml kleju silikonowego o niskiej toksyczności na czaszkę, aby całkowicie uszczelnić kraniotomię, za pomocą dołączonego aplikatora.
  11. Pozwól myszy dojść do siebie przez około 1 godzinę.
  12. Przymocuj głowę myszy do urządzenia rejestrującego elektrofizjologię za pomocą płyty czołowej i (Rysunek 2D).
  13. Pokryj trzpień sondy krzemowej barwnikiem fluorescencyjnym DiI (1:4 DiI:Etanol), aby trajektorię sondy można było zrekonstruować po eksperymencie.
  14. Zamontuj sondę na manipulatorze i ustaw żądany kąt. Do namierzania vlPAG zastosowano kąt PP 15-20°.
  15. Opuść sondę rejestrującą na powierzchnię mózgu w środku okna czaszki. Najpierw ręcznie włóż sondę na głębokość ~300 μm. Po włożeniu na tę głębokość powoli automatycznie opuść sondę (np. 200 μm/min) na docelową głębokość, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki21 (Rysunek 2C).
    UWAGA: Początkowo zalecane jest ręczne włożenie sondy. Ręczne wkładanie sondy zapewnia możliwość zatrzymania i cofnięcia sondy w przypadku jej wygięcia przy pierwszym włożeniu. Gdy sonda całkowicie wniknie w tkankę, generalnie można bezpiecznie kontynuować opuszczanie sondy w trybie automatycznym.
  16. Nałóż olej mineralny na powierzchnię mózgu w oknie kraniotomii, aby zapobiec wysuszeniu.
  17. Pozwól sondzie nagrywającej osiąść na 10 minut po włożeniu.
  18. Rejestruj dane z sondy krzemowej i ECoG z częstotliwością 30 kHz za pomocą kontrolera nagrywania Intan.
  19. 1-2 godziny po nagraniu użyj techniki perfuzji przezsercowej, aby utrwalić mózg w 4% paraformaldehyde22.
    UWAGA: Ze względu na cement usunięcie rostralnej części czaszki może być trudne. Dlatego lepiej jest wyciąć mózg poprzez usunięcie grzbietowych części czaszki.
  20. Odetnij głowę myszy, przetnij skórę wzdłuż linii środkowej po stronie grzbietowej, od szyi do dolnej szczęki. Usuń mięśnie i tkanki przyczepione do czaszki, odetnij dolną szczękę, aby ułatwić dostęp do mózgu.
  21. Jeśli perfuzja zostanie wykonana prawidłowo, mózg powinien się nieco skurczyć, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca, aby włożyć cienkie nożyczki w grzbietową część otworu wielkiego. Wykonaj jedno cięcie przyśrodkowe, jedno boczne i jedno przeciwległe, o wielkości około 1 mm, w kości potylicznej.
  22. Ostrożnie usuń grzbietową część czaszki za pomocą kleszczy okulistycznych. Zacznij od kości potylicznej, usuń wszystkie fragmenty czaszki, aż cała grzbietowa część mózgu zostanie odsłonięta.
  23. Wsuń mikroszpatułkę pod mózg, zaczynając od opuszki węchowej, aby zgarnąć mózg.
  24. Po perfuzji i usunięciu mózg może być przechowywany w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24-48 godzin.

3. Histologia do rekonstrukcji trajektorii sondy

  1. Podziel mózg na sekcje koronalne o długości 70 μm za pomocą wibratomu.
  2. Zamontuj sekcje na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego DAPI, które barwi jądra komórkowe. Nakryj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci.
  3. Zobrazuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym. Dostosuj kontrast/jasność tak, aby ścieżki sondy były wyraźnie widoczne. Upewnij się, że wynikowe rozmiary plików obrazów tiff są mniejsze niż 10 MB, aby kody MATLAB działały płynnie. Zrekonstruuj ścieżki sondy za pomocą kodu MATLAB23.

4. Analiza danych elektrofizjologicznych

  1. Analizuj zarejestrowane sygnały neuronowe z sondy krzemowej za pomocą oprogramowania do wykrywania i automatycznego sortowania w trybie off-line (Kilosort)24.
  2. Ręcznie klasyfikuj wykryte klastry za pomocą Phy jako wiele lub pojedyncze jednostki25. Klasyfikuj klastry jako pojedyncze jednostki, gdy mają fizjologiczny kształt fali szczytowej, pokazują okres refrakcji w korelogramie krzyżowym i normalny rozkład amplitudy.
  3. Zaimportuj dane pojedynczej jednostki do MATLAB i analizuj23.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pięciu mężczyzn C57BL/6J zostało wszczepionych z zestawem słuchawkowym ECoG i nakryciem głowy (Rysunek 4A). Po wyzdrowieniu myszy były przyzwyczajone do fiksacji głowy i urządzenia rejestrującego elektrofizjologię podczas dwóch 1,5-godzinnych sesji w oddzielnych dniach (Ryc. 4B). Następnie utworzono okno kraniotomii o wymiarach 2 mm x 2 mm (Rysunek 4C) i wstawiono sondę krzemową, gdy mysz była obudzona i skupiona na głowie (Rysunek 4D). Zastosowano dwa rodzaje krzemowych sond UCLA: (1) 64 M: jednotrzonkowa, 64-elektrodowa sonda; oraz (2) 256 ANS: czterozębowa sonda z 256 elektrodami. Sewofluran i tlen podawano za pomocą stożka nosowego przymocowanego do urządzenia do elektrofizjologii. Poziom tlenu i sewofluranu monitorowano co 5 minut za pomocą wbudowanego analizatora gazów. Po perfuzji przezsercowej pobrano mózg (Rysunek 4E) i oceniono pod kątem trajektorii sondy (Figura 4F). Zarejestrowane potencjały czynnościowe zostały następnie przetworzone na pojedyncze dane jednostkowe (Rysunek 4G).

Wykonano pięć nagrań, w których umiejscowienie sondy zostało zweryfikowane za pomocą dostępnych algorytmów rekonstrukcji sondy opracowanych w MATLAB23. Korzystając z tych algorytmów, każda elektroda sondy krzemowej została zlokalizowana w określonej strukturze mózgu, dzięki czemu uzyskano trójwymiarową perspektywę umieszczenia sondy w mózgu (Rysunek 5). Te algorytmy rekonstrukcji zostały sprzężone z markerami immunohistochemicznymi w celu dalszej walidacji trajektorii sondy (Rysunek 6). Dane zostały następnie dopasowane do wyselekcjonowanych pojedynczych jednostek (Rysunek 7).

Łącznie przechwycono 64 pojedyncze neurony, z czego 13 znajdowało się w vlPAG. Pozostałe 51 neuronów znajdowało się w pobliskich jądrach: śródmózgowiu, jądrze siatkowatym śródmózgowia, jądrze przybloczkowym, jądrze klinowym, jądrze nakrywkowym bocznym, jądrze przyramiennym i szypułkach móżdżku górnego. Aktywność wypalania neuronów u każdej myszy jest przedstawiona jako mapy cieplne (Rysunek 7). Mysz 3 została wykluczona z analizy ze względu na słabą jakość nagrania pojedynczej jednostki. Większość zarejestrowanych neuronów zmniejszyła swoje odpalanie podczas znieczulenia sewofluranem.

Średnie wystrzeliwanie neuronów vlPAG zostało porównane dla każdej myszy po 5 minutach (tj. 10-15 minutach od nagrania) i 5 minutach podczas sewofluranu (tj. 40-45 minut po nagraniu). Odpalanie vlPAG było znacznie zmniejszone (Rysunek 8A), a ponadto, wzrost ten był spójny we wszystkich neuronach vlPAG (Rysunek 8B).

figure-results-1
Rysunek 1: Obliczanie współrzędnych stereotaktycznych dla wstawienia sondy. Lewy panel: Użycie geometrii do obliczenia podejścia pod kątem do włożenia sondy. Zidentyfikowano następujące składowe trójkąta prostokątnego: (a) głębokość DV struktury docelowej od powierzchni mózgu (uzyskaną za pomocą atlasu stereotaktycznego), (b) odległość między współrzędną AP zakładającą ściśle pionowe opadanie a współrzędną AP struktury docelowej. Prawy panel: Za pomocą (a) i (b) można użyć twierdzenia Pitagorasa do obliczenia kąta AP (β) i długości (c) wsunięcia sondy. Do namierzenia vlPAG użyto następujących współrzędnych: (AP) -3,6 mm, (ML) +0,5 mm, (DV) -4 mm. Zastosowano kąt AP (β) wynoszący 20°. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wszczepienie płyty głównej i nagranie pojedynczej jednostki. (A) Umieszczenie przewodu zestawu słuchawkowego ECoG podczas implantacji. (B) Widok z góry czaszki myszy po wszczepieniu gogli ECoG i płytki glownej. (C) Krzemowe trzonki sondy włożone do mózgu. (D) Mysz przymocowana do głowy podczas nagrywania sondą krzemową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Umiejscowienie okna czaszki względem głównych naczyń krwionośnych. Schematyczne przedstawienie układu naczyniowego na powierzchni mózgu myszy z zaznaczoną zatoką strzałkową górną i zatoką poprzeczną. Biały kwadrat wskazuje położenie okna czaszki, a czerwona kropka reprezentuje punkt wprowadzenia sondy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Projekt eksperymentalny.Pięciu samcom myszy C57BL/6J wszczepiono zestaw słuchawkowy ECoG i płytę czołową (A). Po wyzdrowieniu przyzwyczaiły się do fiksacji głowy i urządzenia do nagrywania (B). Następnie wykonano kraniotomię (C) i założono sondę silikonową, gdy mysz była wybudzona i znajdowała się w pozycji unieruchomionej głowy. Lotne środki znieczulające i tlen podawano za pomocą stożka nosowego (D). Po zarejestrowaniu mózg został pobrany (E) i przeanalizowany przy użyciu technik immunohistochemicznych w celu zrekonstruowania trajektorii sondy (F). Zarejestrowane potencjały czynnościowe zostały następnie przekształcone w dane pojedynczej jednostki (G). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Model 3D mózgu ze zrekonstruowanymi śladami sondy. Każda prosta kolorowa linia reprezentuje trajektorię sondy. Każda kropka oznacza położenie barwnika DiI widocznego na koronalnych wycinkach mózgu. Trajektoria sondy jest rekonstruowana dla każdego trzpienia sondy krzemowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Rekonstrukcja post hoc umieszczenia sondy w vlPAG. Reprezentatywny wycinek mózgu koronalnego dla każdej zarejestrowanej myszy (1-5) zabarwiony DAPI (niebieski) pokazujący ślady sondy ((DiI, czerwony, oznaczony zielonymi strzałkami) z konturem obszarów mózgu. Podziałka: 500 μm. Mysz 1-3 została nagrana za pomocą sond krzemowych z pojedynczym trzpieniem (tj. 64 kanały), podczas gdy myszy 4 i 5 zostały nagrane z czterotrzonkowymi sondami krzemowymi (tj. 256 kanałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Aktywność wypalania w bined przed i w trakcie znieczulenia sewofluranem. Mapy cieplne reprezentują liczbę wyzwolonych potencjałów czynnościowych przez 64 pojedyncze neurony w odstępach jednominutowych. Pojedynczym neuronom przypisano strukturę pochodzenia na podstawie rekonstrukcji trajektorii sondy. Biała przerywana linia oznacza początek podawania sewofluranu, n = 4 myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Zniesiono uruchamianie neuronów vlPAG podczas znieczulenia sewofluranem. (A) Średnia liczba potencjałów czynnościowych wystrzelonych przed i w trakcie znieczulenia dla każdej myszy. (B) Liczba potencjałów czynnościowych wystrzeliwanych przez każdy neuron vlPAG (B). Test t-studenta w parach, **P = 0,0036, P = 0,0053 odpowiednio. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Przykład jak nierówne rozmieszczenie głowicy może wpływać na trajektorię sondy. (A) Nierówne rozmieszczenie główki na głowie myszy. (B,C) Rekonstrukcja mózgu myszy 3D z renderowaną trajektorią sondy, w której występuje niezamierzony kąt przyśrodkowo-boczny spowodowany nierównym umieszczeniem płyt głowy na głowie myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jądra pnia mózgu pośredniczą w podstawowych funkcjach, takich jak oddychanie, świadomość i sen 26,27,28. Lokalizacja pnia mózgu (głęboka i tylna) stanowi wyzwanie w badaniu jego aktywności neuronalnej in vivo przy użyciu standardowych technik. Tutaj przedstawiono kątowe podejście przednie, aby umożliwić powtarzalny zapis pojedynczej jednostki u myszy z głową.

Staranne włożenie wieloelektrodowej sondy krzemowej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia spójnego celowania w struktury pnia mózgu związane ze snem REM, przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia głównych naczyń krwionośnych. Wymagany jest znaczny stopień finezji, koncentracji i cierpliwości, aby ustalić najlepsze współrzędne i trajektorię wejścia13.

Ze względu na kątową trajektorię sondy i odległość wymaganą do namierzenia głębokich struktur, nawet drobne niespójności we współrzędnych i położeniu płyty czołowej prawdopodobnie spowodują pominięcie docelowej struktury. Konieczne jest, aby Bregma i Lambda znajdowały się na tym samym poziomie podczas implantacji płyty czołowej i aby odległość między nimi była dokładnie zmierzona. Warto zauważyć, że ponieważ operacje są wykonywane na ramie stereotaktycznej, a nagrania są wykonywane na oddzielnym stanowisku do elektrofizjologii, bardzo ważne jest, aby płyty głowy były przymocowane do wypoziomowanej czaszki. Wprowadzenie dodatkowych kątów (np. pochylona głowa) zwiększa ryzyko błędu, które jest szczególnie wysokie w przypadku małych, głębokich struktur mózgu (ryc. 9).

Ponieważ sondy krzemowe są delikatne, ważne jest, aby usunąć oponę twardą z powierzchni mózgu i upewnić się, że żadne fragmenty kości nie blokują okna czaszki. Po usunięciu opony twardej może wystąpić lekkie krwawienie, dlatego ważne jest, aby oczyścić powierzchnię kraniotomii z zakrzepłej krwi, która może spowodować wygięcie sondy. Jeśli wprowadzenie sondy krzemowej do mózgu okazuje się trudne (np. sonda się wygina), ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma pozostałości opony twardej lub czy powierzchnia mózgu wyschła, ponieważ cienka błona może się utworzyć, gdy zostanie pozostawiona z niewielką ilością płynu lub nie ma go wcale. U ludzi27 obszary w pobliżu naczyń krwionośnych mają grubszą oponę twardą, a podobny problem występuje u myszy, u których usunięcie opony twardej bez pękania naczyń może być trudne. Chociaż staranne usunięcie opony twardej zwykle skutkuje płynnym wprowadzeniem sondy, większe kąty wsunięcia mogą stanowić dodatkowe trudności.

Wydajność nagrań może się znacznie różnić w zależności od zwierzęcia i zależy od wielu zmiennych. Jednym z istotnych czynników jest gęstość neuronów w docelowej strukturze; Obszary o niskiej gęstości neuronów (np. Kora mózgowa) mają zwykle niższą wydajność rejestrowanych pojedynczych neuronów. Ponadto uszkodzenie tkanki, takie jak pęknięcie naczynia pod powierzchnią mózgu, może prowadzić do śmierci lub uszkodzenia neuronów, co jeszcze bardziej zmniejsza wydajność21,29. Kluczowa jest również jakość nagrań, ponieważ wyższa jakość nagrań ułatwia rozróżnienie pojedynczych neuronów. Niecelna trajektoria sondy może również skutkować niższymi wydajnościami. Chociaż protokół ten został opracowany do nagrań w vlPAG, może być używany do nagrywania z pobliskich struktur w pniu mózgu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W związku z niniejszą pracą autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 8 i Rysunek 9 zostały utworzone za pomocą BioRender.com. Chcielibyśmy podziękować Scottowi Kilianskiemu za pomoc przy kodzie MATLAB i udostępnienie swoich skryptów. Dziękujemy Annie Grace Carns za pomoc w rekonstrukcji trajektorii sondy.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1024-kanałowy kontroler nagrywania RHDIntan Technologies, Los Angeles, Kalifornia, USAC3008Nagrywanie sondą krzemową; sprzęt i oprogramowanie do nagrywania
24 mm x 50 mm Szkiełko nakrywkowe nr 1.5 VWRVWR, Radnor, Pensylwania, USA48393-081Histologia
4% PFA w PBSThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAJ61899. AKHistologia; roztwór perfuzyjny
C& B metabondPatterson Dental, Richmond, Virginia, USAproszek: 5533559, szybka baza: 5533492, katalizator: 55335007Headplate & Implantacja zestawu słuchawkowego
C57/6J myszy 4-6 tygodni, samceThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA000664
Capnomac UltimaDatex, Helsinki, Finlandia ULT-SVi-27-07Analizator gazów; wycofane z produkcji; alternatywny analizator gazów można zakupić w Bionet America 
CM-DiIThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAV22888Czerwony barwnik fluorescencyjny do powlekania sondy silikonowej
Nagłówek złączaDigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA1212-1788-NDZestaw słuchawkowy ECoG
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA0100-20Histologia
iBOND UniversalPatterson Dental, Richmond, Wirginia, USA044-1113Płyta czołowa i Implantacja zestawu słuchawkowego; dla  Mocowanie drutów ze stali nierdzewnej do czaszki
Klej silikonowy o niskiej toksycznościWorld Precision Instruments, Sarasota, Floryda, USAKWIK-SIL
Scale Technologies, Victor, Nowy Jork, USAManipulator wielosondowy: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, Pierścień MPM do ramion ręcznych MPM, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000Zapis sondą krzemową; wprowadzenie sondy do mózgu
MikrosondyUCLA, Los Angeles, Kalifornia, USA256 ANS, 64MWycofane; alternatywne sondy krzemowe można kupić w Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USAM8410-100MLZapis sondy silikonowej; zapobieganie wysychaniu tkanki podczas nagrywania
Sól fizjologicznaThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany ZjednoczoneZ1376Płyta czołowa i Implantacja zestawu słuchawkowego; zapobieganie wysuszeniu mózgu podczas operacji
Drut ze stali nierdzewnej pokryty PFA o średnicy 0,008 cala pokryty pasiastymi końcamiSystemy AM, Sequim, Waszyngton, USA791400Zestaw słuchawkowy ECoG i elektroda referencyjna do ECoG 
Drut platynowy 24AWG World Precision Instruments, Sarasota, Floryda, USAElektroda referencyjna PTP201do rejestracji sondy krzemowej 
Szkiełka mikroskopowe Shandon Colorfrost PlusThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA99-910-01Histologia
Głowica ze stali nierdzewnejStar Rapid, Chinywykonana na zamówieniePłyta główna i Implantacja zestawu słuchawkowego; projekt dostępny na życzenie
Aparatura stereotaktycznaKOPF, Tujunga, Kalifornia, USAModel 940 Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt z cyfrowym wyświetlaczemKonsola Płyta główna i Implantacja zestawu słuchawkowego
System mikromanipulatora New część

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
  2. Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).
  3. Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning. Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).
  4. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  5. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opinion Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  6. Nunez-Elizalde, A. O., et al. Neural correlates of blood flow measured by ultrasound. Neuron. 110 (10), 1631-1640.e4 (2022).
  7. Yang, L., Lee, K., Villagracia, J., Masmanidis, S. C. Open source silicon microprobes for high throughput neural recording. J Neural Eng. 17 (1), 016036(2020).
  8. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  9. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protoc. 1 (3), 100194(2020).
  10. Dias, M., et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 8 (4), (2021).
  11. Gao, Z. R., et al. Tac1-expressing neurons in the periaqueductal gray facilitate the itch-scratching cycle via descending regulation. Neuron. 101 (1), 45-59.e9 (2019).
  12. Atluri, N., et al. Anatomical substrates of rapid eye movement sleep rebound in a rodent model of post-sevoflurane sleep disruption. Anesthesiology. 140 (4), 729-741 (2023).
  13. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature. 538 (7623), 51-59 (2016).
  14. Frontera, J., et al. Bidirectional control of fear memories by cerebellar neurons projecting to the ventrolateral periaqueductal grey. Nat Commun. 11 (1234567890), (2020).
  15. Weber, F., et al. Regulation of REM and Non-REM sleep by periaqueductal GABAergic neurons. Nat Commun. 9 (1), 354(2018).
  16. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  17. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Elsevier, AP. Amsterdam. (2008).
  18. Pythagorean theorem. , Available from: https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Pythagorean_theorem&oldid=1222259845 (2024).
  19. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/chapters/skeleton.shtml (2024).
  20. Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
  21. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Sci Rep. 9, 111(2019).
  22. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).
  23. Peters, A. petersaj/AP_histology. , https://github.com/petersaj/AP_histology (2024).
  24. Pachitariu, M., Sridhar, S., Stringer, C. Solving the spike sorting problem with Kilosort. , (2023).
  25. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Sci Rep. 9 (1), 3521(2019).
  26. Leiras, R., Cregg, J. M., Kiehn, O. Brainstem circuits for locomotion. Ann Rev Neurosci. 45 (2022), 63-85 (2022).
  27. Benarroch, E. E. Brainstem integration of arousal, sleep, cardiovascular, and respiratory control. Neurology. 91 (21), 958-966 (2018).
  28. Guyenet, P. G., Bayliss, D. A. Neural control of breathing and CO2 homeostasis. Neuron. 87 (5), 946-961 (2015).
  29. Potter, K. A., Buck, A. C., Self, W. K., Capadona, J. R. Stab injury and device implantation within the brain results in inversely multiphasic neuroinflammatory and neurodegenerative responses. J Neural Eng. 9 (4), 046020(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Electrode RecordingsBrainstem RecordingsHead Fixed MiceSilicon ProbesSingle Unit RecordingStereotaxic SurgeryCraniotomy ProcedureNeuronal ActivitySevoflurane AnesthesiaVentrolateral Periaqueductal Gray

Related Articles