Niniejsze badanie podkreśla zalety stosowania metody opracowanej przez Jeffreya i Humphreya do ekstrakcji i ilościowego oznaczania rozpuszczalnych w tłuszczach pigmentów z mikroalg. Metoda ta służy jako cenne narzędzie do oceny wpływu czynników wzrostu na produkcję chlorofilu i zawartość komórkową w tych organizmach.
Artykuł metodologiczny
Ocena wpływu czynników wzrostu na produkcję chlorofilów a i b z mikroalg
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroalgi zawierają dwie główne grupy pigmentów: chlorofile i karotenoidy. Chlorofil to zielony pigment, który pochłania energię świetlną i przekształca ją w energię chemiczną, aby ułatwić syntezę związków organicznych. Pigment ten służy jako cenne podstawowe źródło biotechnologicznych produktów wejściowych w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i kosmetycznym ze względu na swoje wysokie właściwości przeciwutleniające i zdolności barwiące. Celem tych badań była ocena wpływu czynników wzrostu (stężenieCO2, barwa światła i natężenie światła) poprzez projekt eksperymentalny Taguchi L4 na wzrost komórek i zawartość komórkową chlorofilu a i b w Chlorella sorokiniana, a następnie walidacja metody z wykorzystaniem Haematococcus pluvialis mikroalgi jako dodatkowy model badawczy. Wzrost komórek określono ilościowo za pomocą techniki spektrofotometrycznej gęstości optycznej przy długości fali 550 nm. Do ilościowego oznaczania chlorofili ekstrakt komórkowy otrzymano przy użyciu 90% czystego roztworu acetonu, a następnie stężenia chlorofili a i b oznaczono ilościowo za pomocą technik spektrofotometrycznych przy długościach fal 647 nm i 664 nm, zgodnie z metodą opisaną przez Jeffreya i Humphreya. Wyniki eksperymentów wykazały, że warunki kontrolne o niskim dodatku CO2 , fioletowym świetle i niskim natężeniu światła zwiększają zarówno wzrost komórek, jak i stężenie chlorofili a i b w komórkach. Wdrożenie tej metody kwantyfikacji chlorofilu pozwala na szybkie, proste i precyzyjne określenie zawartości chlorofilu, ponieważ stosowane długości fal znajdują się na pikach absorbancji obu typów chlorofilów, dzięki czemu technika ta jest łatwa do odtworzenia dla wszystkich badanych mikroglonów.
Wprowadzenie
W ostatnich latach, narastające problemy środowiskowe spowodowane działalnością antropogeniczną i jej negatywnym wpływem na zdrowie i równowagę ekosystemów napędzały poszukiwania bardziej wydajnych i przyjaznych dla środowiska systemów produkcji. Przyspieszyło to procesy w przemyśle i sprzyjało wdrażaniu zabiegów bioremediacji oraz rozwojowi biozwiązków w celu złagodzenia tych szkodliwych skutków1.
Ten kontekst doprowadził do znacznego wzrostu badań nad mikroalgami, napędzanego potrzebą znalezienia innowacyjnych rozwiązań dla obecnych wyzwań środowiskowych i ekonomicznych. Mikroalgi rozwijają się w środowisku wodnym, wykorzystując światło słoneczne i dwutlenek węgla jako źródła energii i węgla. Ta cecha sprawia, że są one zrównoważoną i obiecującą alternatywą do wytwarzania różnych wartościowych produktów. Badania w tej dziedzinie koncentrowały się na zrozumieniu fizjologii i metabolizmu tych komórek, a także na opracowaniu wydajnych technologii ich hodowli i przetwarzania2.
Istnieje wyraźna potrzeba opracowania dostępnych i niezawodnych narzędzi do badania mikroalg, aby przyspieszyć procesy badawcze i pogłębić zrozumienie ich fizjologii, metabolizmu i potencjalnych zastosowań. Narzędzia te powinny umożliwić szybką analizę wpływu czynników środowiskowych i produkcyjnych na kluczowe parametry, takie jak stężenie chlorofilu, który jest podstawowym wskaźnikiem zdrowia i rozwoju tych organizmów. Spadek zawartości chlorofilu może wskazywać na stres środowiskowy, niedobory żywieniowe lub choroby.
Te zielone pigmenty odgrywają kluczową rolę w fotosyntezie, przechwytując energię słoneczną w celu przekształcenia dwutlenku węgla i wody w glukozę i tlen i stanowią od 0,5% do 5% biomasy mikroalg3. Poza swoją istotną rolą w podtrzymywaniu procesów życiowych, chlorofile znalazły zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu. Ekstrakty chlorofilowe są wykorzystywane w przetwórstwie żywności i napojów jako naturalne barwniki, nadając produktom żywe zielone odcienie, a jednocześnie zapewniając właściwości przeciwutleniające. Co więcej, suplementy na bazie chlorofilu zyskują popularność w sektorze zdrowia i dobrego samopoczucia ze względu na ich rzekome działanie detoksykujące i przeciwzapalne. Wykorzystując wieloaspektowe właściwości chlorofilu, przemysł może opracowywać innowacyjne produkty, które przyczyniają się zarówno do atrakcyjności wizualnej, jak i dobrego samopoczucia konsumentów1.
Pod tym względem, jedną z mikroalg o dużym znaczeniu biotechnologicznym jest C. sorokiniana. Mikroorganizm ten wyróżnia się szybkim tempem wzrostu, dzięki czemu jest bardzo wydajny w produkcji biomasy. Ponadto C. sorokiniana wykazuje zróżnicowaną zawartość wysoce odżywczych związków, w tym białek, lipidów i witamin, co czyni go cennym do różnych zastosowań w produkcji żywności, pasz i biopaliw2. Co więcej, stwierdzono, że ten gatunek mikroalg wytwarza enzymy zewnątrzkomórkowe o różnych funkcjach, otwierając możliwości zastosowań biotechnologicznych, takich jak oczyszczanie ścieków, bioremediacja i farmaceutyki4. Oprócz szybkiego wzrostu i wszechstronnych zastosowań, C. sorokiniana wykazuje również znaczny potencjał w produkcji chlorofilu. Jako mikroorganizm fotosyntetyzujący, C. sorokiniana posiada maszynerię niezbędną do syntezy chlorofilu, który stanowi od 0,5% do 5% biomasy mikroalg3. Ta zdolność sprawia, że C. sorokiniana jest atrakcyjnym kandydatem do produkcji chlorofilu na skalę komercyjną i zapowiada się na zrównoważone rozwiązanie pilnych wyzwań środowiskowych i żywieniowych5.
Z drugiej strony, innym gatunkiem mikroalg o dużym zainteresowaniu jest H. pluvialis. Ta mikroalga słynie z produkcji astaksantyny, silnego pigmentu przeciwutleniającego o licznych zastosowaniach przemysłowych. Astaksantyna służy jako mechanizm ochronny dla fotosystemu H. pluvialis, chroniąc go przed stresem oksydacyjnym wywołanym czynnikami środowiskowymi. Pigment ten jest bardzo poszukiwany w przemyśle kosmetycznym, nutraceutykach i akwakulturze, ze względu na swoje właściwości przeciwutleniające i potencjalne korzyści zdrowotne. Dzięki swojej obfitej zdolności do produkcji astaksantyny, H. pluvialis stanowi obiecującą drogę do rozwoju innowacyjnych produktów zaspokajających różne potrzeby przemysłowe i konsumenckie6.
Ostatnie badania również podkreśliły potencjał H. pluvialis1 do produkcji chlorofilu, co jeszcze bardziej zwiększa jego przemysłowe znaczenie. Na przykład w jednym z badań zbadano zawartość chlorofilu w H. pluvialis w różnych warunkach wzrostu i stwierdzono, że przy optymalnych parametrach uprawy H. pluvialis wykazywał niezwykłe tempo produkcji chlorofilu, przewyższające inne gatunki mikroalg7. Odkrycie to podkreśla potencjał H. pluvialis jako zrównoważonego źródła chlorofilu, oferując nowe możliwości jego wykorzystania w różnych sektorach przemysłu.
Protokół
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i przygotowanie inokulum
- Przygotować 1 l pożywki 3N-BBM+ V(CCAP) (makroelementy: NaNO3 [0,75 g L-1], CaCl2 [0,019 g L-1],MgSO4 [0,019 g L-1], K2HPO4 [0,057 g L-1], NaCl [0,025 g L-1], KH2PO4 [0,175 g L-1]; mikroelementy: Na2 EDTA [0,0186 g L-1], FeCl3 [0,0024 g L-1], MnCl2 [0,001 g L-1], ZnCl2 [1,25 x 10-4 g L-1], CoCl2 [5 x 10-5 g L-1], Na2MoO4 [9,98 x 10-5 g L-1])8 i sterylizuj przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi.
- Zaszczepić kolbę 1 litrem pożywki wzrostowej o przybliżonym stężeniu 3 x 106 komórek mL-1 dla mikroalgi C. sorokiniana; lub dodać 5% do 10% (v/v) inokulum do pożywki wzrostowej.
UWAGA: Aby utrzymać sterylne warunki, zaleca się używanie kaptura z przepływem laminarnym, rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maski na twarz. - Inkubować zaszczepioną kolbę pod czerwonymi źródłami światła o przybliżonej intensywności 3 600 do 4 200 luksów, w temperaturze między 22-26 °C, przy fotoperiodzie 12 godzin światła i 12 godzin ciemności dla C. sorokiniana oraz fotoperiodze 16 godzin światła i 8 godzin ciemności dla H. pluvialis, i ręcznie mieszać co 24 godziny, około 7 dni dla obu szczepów.
UWAGA: Utrzymywać w warunkach wzrostu przez co najmniej 7-10 dni (do uzyskania intensywnego zielonego koloru) w przypadku C. sorokiniana i 10-12 dni w przypadku H. pluvialis. Aby uzyskać koncentrat mikroalg, który posłuży jako inokulum w kinetyce, konieczne jest usunięcie pożywki sklarowanej nad osadem z wytworzonych glonów. - W sterylnym środowisku napełnić sterylne stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml około 10 ml zaszczepionej pożywki i odwirować przy 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 25-30 °C.
- W sterylnych warunkach usunąć supernatant za pomocą mikropipety lub przez wlanie i zagęszczenie biomasy w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Powtarzaj ten proces w razie potrzeby, aż do uzyskania wymaganej objętości inokulum dla kinetyki.
- Zmierzyć gęstość optyczną (OD550 nm) inokulum, aby określić stężenie komórek mikroalg i przechowywać je w temperaturze 3-4 °C do momentu przygotowania do użycia.
UWAGA: Bezpośrednie zliczanie komórek było początkowo przeprowadzane w celu skorelowania stężenia komórek z absorbancją. Po policzeniu inokulum można przechowywać w lodówce nie dłużej niż 4 dni.
2. Badanie kinetyki wzrostu
- Przygotować wymaganą objętość 3N-BBM+ V(CCAP) odpowiednią dla każdego eksperymentu (8 l do badań poziomu w fotobioreaktorze na obecność C. sorokiniana i 0,5 l do badań na poziomie kolby na obecność H. pluvialis) zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi, zapewniając właściwą sterylizację.
- Zarówno w przypadku fotobioreaktora, jak i kolb, skonfiguruj źródło światła do żądanego spektrum kolorów (niebieski przy 460 nm, fioletowy, mieszanka 460 nm i 630 nm dla C. sorokiniana i czerwony przy 630 nm dla H. pluvialis); zakryj oba systemy, aby uniknąć zewnętrznych zakłóceń światła.
UWAGA: Ze względu na różnice w długości fali emitowanej przez każdą diodę elektroluminescencyjną, spektroradiometrię przeprowadzono przy użyciu spektroradiometru na źródłach światła, aby określić długość fali i moc emisji każdej diody9. Fioletowe światło uzyskano poprzez połączenie czerwonych i niebieskich diod LED, w wyniku czego uzyskano długości fal 460 nm przy mocy emisji 1,65 W nm-1 dla niebieskich diod LED i 630 nm przy mocy emisji 0,6 W nm-1 dla czerwonych diod LED. Pomiary te wykorzystano do testów przeprowadzonych wyłącznie w świetle niebieskim i czerwonym. - Zaprogramuj timer tak, aby przełączał się między 12-godzinnymi cyklami światła i 12-godzinnymi cyklami ciemności dla C. sorokiniana oraz 16-godzinnymi cyklami światła i 8-godzinnymi cyklami ciemności dla H. pluvialis.
- Podłączyć system napowietrzania CO2 do naczynia do hodowli fotobioreaktora, aby zapewnić dopływ dwutlenku węgla w odstępach 12 godzin dla C. sorokiniana.
- Zaszczepić naczynie hodowlane wystarczającą objętością pre-inokulum, aby uzyskać początkową gęstość komórek 3 x 105 komórek mL-1 lub jego odpowiednik w gęstości optycznej (OD550 nm) = 0,180,
UWAGA: Podczas inokulacji należy zapewnić technikę aseptyczną, aby zapobiec zakażeniu. - Próbki z hodowli należy pobierać w regularnych odstępach czasu 12 godzin w przypadku C. sorokiniana i 8 godzin w przypadku H. pluvialis w celu monitorowania wzrostu komórek i parametrów fizjologicznych. Pobieraj próbki przy użyciu sterylnych technik, aby zachować integralność kultury.
3. Kwantyfikacja chlorofilów
UWAGA: Dane do kwantyfikacji komórkowej znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1.
- Umieścić 40 ml próbki w plastikowych stożkowych probówkach wirówkowych.
- Odwirować przy 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 15 °C i odrzucić supernatant przez dekantację lub przy użyciu pipety Pasteura.
- Przenieś osad komórkowy do szklanej rurki pokrytej folią aluminiową i zakrętką, aby zapobiec utlenianiu.
- Zawiesić osad komórkowy za pomocą 3 ml 90% czystego roztworu acetonu za pomocą wiru.
- Sonikować zawieszoną próbkę w łaźni lodowej przez dwa cykle po 5 minut każdy i pozostawić ją w temperaturze 4 °C przez 16 h10.
- Po 16 godzinach ponownie poddać sonikacji w tych samych warunkach, o których mowa w poprzednim kroku (krok 3.5) i ponownie odwirować w poprzednio opisanych warunkach (krok 3.2).
- Oddziel ekstrakt pigmentowy za pomocą pipety Pasteura i przenieś go do innej czystej probówki chronionej przed światłem.
- Umieść ekstrakt pigmentowy w komórce kwarcowej, aby odczytać go w spektrofotometrze o długości fali 630 nm, 647 nm i 664 nm.
UWAGA: Wcześniej skalibruj spektrofotometr za pomocą 90% acetonu. - Aby obliczyć stężenie chlorofilu, użyj następujących równań11:
Chlorofil A = 11,93 A664 - 1,93 A647
Chlorofil b = 20,36 A647 - 5,50 A664
UWAGA: Wyniki są wyrażone w μg mL-1 ekstraktu, które mnoży się przez objętość ekstraktu i dzieli przez liczbę ml próbki w celu uzyskania stężeń chlorofilu w μg mL-1 hodowli. - Aby uzyskać wartości w μg chl komórka-1, użyj następującego wzoru:
μg chl komórka-1 = μg chl w 1 ml hodowli / [komórki mL-1] stężenie komórek w hodowli.
Wyniki
Aby zaobserwować skuteczność techniki wykrywania zmian w komórkowej koncentracji chlorofilu oraz ocenić wpływ czynników wzrostu na C. sorokiniana, opracowano plan eksperymentalny Taguchiego L4, oceniając dodatek objętości CO2, barwę światła oraz natężenie światła. Każdy czynnik oceniano na poziomie niskim i wysokim, jak pokazano w Tabeli 1, w warunkach określonych przez plan eksperymentalny w Tabeli 2.
Po zakończeniu procesu eksperymentalnego wyniki wykazały, że kombinacja niskiego dodatku CO2, fioletowego światła i wysokiego natężenia światła (C1, P, I2) odpowiadająca traktowaniu 2, zwiększyła wzrost drobnoustrojów do 7,83 x 105 cells mL-1. Z drugiej strony, zawartość chlorofilu była wyższa w traktowaniu 4 w warunkach C2, P, I2, osiągając stężenie 5,92 x 10-7 µg cel-1 w 132 h (Rycina 1), co wskazuje fioletowe światło i wysokie natężenie światła jako optymalne poziomy czynników w obu doświadczeniach.
Jednocześnie podobne zachowanie zaobserwowano we wszystkich czterech ocenianych liniach. Jednakże w testach przeprowadzonych pod światłem fioletowym odnotowano wyraźną przewagę. Wzór ten sugeruje, że światło fioletowe może pozytywnie wpływać na wyniki, potencjalnie sprzyjając optymalnym warunkom wzrostu lub aktywności komórkowej. Wyniki te podkreślają znaczenie starannego doboru warunków oświetlenia w eksperymentach biologicznych.
Na podstawie analizy statystycznej sporządzono wykres głównych efektów. Na Rysunku 2 można zaobserwować, w jaki sposób każdy poziom badanych czynników wpływa na produkcję chlorofilu w C. sorokiniana. Najlepsze warunki dla produkcji chlorofilu stanowiły wysoki dodatek CO2, światło fioletowe oraz wysokie natężenie światła (C2, P, I2), przy czym kolor i stężenie dwutlenku węgla wykazują bardzo zbliżone wartości istotności, podczas gdy natężenie światła wykazuje niższy istotny wpływ na oceniane zmienne odpowiedzi.
Dodatkowo sporządzono wykres kontrastowy (Rysunek 3), przedstawiający zmiany stężenia chlorofilu komórkowego w zależności od efektu dodania objętości CO2 oraz barwy światła, na którą oddziaływano.
Zaobserwowano, że światło fioletowe (mieszanina światła niebieskiego i czerwonego) oraz wysokie natężenie światła znacząco stymulują wzrost mikroorganizmów i produkcję chlorofilu. Jednocześnie wysoka podaż CO2 wpływa na oba parametry odpowiednio pozytywnie i negatywnie, ponieważ zwiększa komórkowe stężenie chlorofilu do poziomu maksymalnego w czasie eksperymentu, lecz hamuje wzrost drobnoustrojów. Zauważalny jest jednak fakt, że pod wpływem światła fioletowego, CO2 dodawanie objętościowe 20-sekundowych impulsów CO2 co 12 h przy szybkości przepływu 8,5 ft³ h⁻¹-1 pozwala na uzyskanie korzystnej odpowiedzi dla obu parametrów.
Aby zwalidować metodę i wyniki uzyskane dla C. sorokiniana, przeprowadzono potwierdzający test w kolbie na H. pluvialis pod wpływem czerwonego światła, ze względu na naturalną zdolność tego organizmu do degradacji chlorofilu w celu syntezy astaksantyny w warunkach stresu, które wywołano po 168 h poprzez zwiększenie zasolenia medium. Wygenerowano wykres stężeń (Rycina 4), na którym maksymalne stężenie chlorofilu uzyskano w czasie 0 h i wynosiło ono 1,41 x 10-7 µg cel-1. W tym przypadku, ze względu na naturalne zachowanie mikroalg, zaobserwowano spadek stężenia chlorofilu, co sugeruje potencjalne zmiany fizjologiczne w badanym modelu biologicznym. Zostało to dodatkowo przedstawione na Rycynie 5, która ukazuje mikrografię C. sorokiniana (Rycina 5A) oraz dwie mikrografie H. pluvialis: jedną w fazie zielonej (Rycina 5B) i jedną w fazie zmian i produkcji astaksantyny (Rycina 5C). Co ciekawe, pomimo tego spadku, nie wystąpiły żadne zakłócenia spowodowane obecnością związków karotenoidowych, które są w nich zawartymi pigmentami rozpuszczalnymi w tłuszczach; stanowi to silny dowód na selektywność i powtarzalność techniki w mikroalgach o różnych możliwościach i zachowaniach.
Wykres przedstawia spadek całkowitego stężenia chlorofilu w trakcie trwania eksperymentu. Warto zauważyć wzrost zawartości chlorofilu a w porównaniu do chlorofilu b w 50 h, kiedy to stężenie chlorofilu b ulega znacznemu obniżeniu. Najbardziej istotny spadek stężenia chlorofilu występuje pod koniec fazy wzrostu wykładniczego. Spadek ten przypisuje się produkcji karotenoidów w H. pluvialis.
Podobnie przeprowadzono analizę składu chlorofili a i b dla wariantu z najwyższą produkcją C. sorokiniana (C1, P, I2) przedstawionego na Rysunku 6. W przeciwieństwie do H. pluvialis, produkcja chlorofilów wykazywała stały wzrost przez cały okres eksperymentu, który analizowano wyłącznie w fazie wykładniczej. Zaobserwowano, że podobnie jak w przypadku H. pluvialis, na początku eksperymentu chlorofil a występuje początkowo w niższych proporcjach niż chlorofil b; jednak proporcje te ulegają wyraźnej zmianie w 50 h, po czym chlorofil a wykazuje wyższą szybkość produkcji niż chlorofil b.
Technika analityczna zastosowana w niniejszym badaniu okazała się skuteczna w wykrywaniu zmian w obrębie jednego modelu biologicznego oraz pomiędzy różnymi modelami biologicznymi. Wyniki te podkreślają czułość i precyzję zastosowanej metody analitycznej, umożliwiając szczegółowe zrozumienie dynamiki chlorofilu wewnątrz i pomiędzy systemami biologicznymi. Takie spostrzeżenia są nieocenione dla wyjaśnienia złożonych mechanizmów sterujących syntezą i metabolizmem pigmentów, co toruje drogę do dalszych postępów w badaniach biotechnologicznych i środowiskowych.
Rysunek 1: Komórkowa zawartość chlorofilu w ramach zastosowanych traktowań eksperymentalnych. Komórkowa zawartość chlorofilu zmierzona w Chlorella sorokiniana w różnych traktowaniach eksperymentalnych. Dane przedstawiono jako odchylenie standardowe dla n = 3. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Wykres głównych efektów dla komórkowej zawartości chlorofilu. Wykres głównych efektów ilustrujący wpływ różnych zabiegów na komórkową zawartość chlorofilu u Chlorella sorokiniana. Dane przedstawiono jako odchylenie standardowe dla n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Wykres konturowy stężenia chlorofilu w komórkach. Wykres konturowy przedstawiający zależność między stężeniem chlorofilu w komórkach, stężeniem CO2 a kolorem światła. Kolor światła jest reprezentowany na osi 1 jako niebieski i na osi 2 jako fioletowy, przy czym poziomy pośrednie wskazują na dodatek światła czerwonego. Dane przedstawiono jako odchylenie standardowe dla n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Stężenie chlorofilu podczas kinetyki wzrostu H. pluvialis. Stężenie chlorofilu mierzone w trakcie kinetyki wzrostu Haematococcus pluvialis. Dane przedstawiono jako odchylenie standardowe dla n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Mikrografie C. sorokiniana i H. pluvialis. Obrazy mikrograficzne Chlorella sorokiniana (A) oraz Haematococcus pluvialis, przedstawiające jeden okaz w fazie zielonej (B) i drugi w wczesnej fazie czerwonej (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Stężenie chlorofilu podczas kinetyki wzrostu C. sorokiniana. Stężenie chlorofilu mierzone podczas kinetyki wzrostu Chlorella sorokiniana. Dane przedstawiono jako odchylenie standardowe dla n = 3. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Czynnik | Niski poziom | Wysoki poziom |
| CO2 dodanie (L) | C1 | C2 |
| Kolor światła | Niebieski (B) | Fioletowy (P) |
| Natężenie światła (Lux) | I1 | I2 |
Tabela 1: Czynniki kinetyczne i ich poziomy. Przegląd czynników kinetycznych i ich poszczególnych poziomów: C1 = 0.078 L; C2 = 0.15 L; B = światło niebieskie; P = światło fioletowe; I1 = 550 lux; I2 = 1200 lux.
| Leczenie | CO2 dodawanie | Kolor światła | Natężenie światła (luks) |
| (L) | |||
| 1 | C1 | B | I1 |
| 2 | C1 | P | I2 |
| 3 | C2 | B | I1 |
| 4 | C2 | P | I2 |
Tabela 2: Projekt eksperymentalny i zabiegi. Podsumowanie projektu eksperymentalnego oraz zastosowanych zabiegów: C1 = 0,078 L; C2 = 0,15 L; B = światło niebieskie; P = światło fioletowe; I1 = 550 lux; I2 = 1200 lux.
Plik uzupełniający 1: Dane kwantyfikacji komórkowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Badania porównawcze H. pluvialis i C. sorokiniana wykazały istotne różnice w dynamice produkcji chlorofilu. Podczas gdy H. pluvialis wykazywał spadek stężenia chlorofilu przez cały czas trwania eksperymentu, C. sorokiniana wykazywała stały wzrost. Dodatkowo, początkowo występował mniejszy udział chlorofilu a u obu gatunków, ale stosunek ten odwrócił się w określonych warunkach wzrostu, co może wskazywać na indukcję produkcji wspomnianych chlorofili poprzez selektywność lub ekspozycję na określone długości fal. Odkrycia te sugerują unikalną reakcję każdego gatunku na warunki eksperymentalne, podkreślając czułość techniki analitycznej stosowanej do wykrywania zmian w modelach biologicznych i między nimi. Zdolność do dostrzegania subtelnych zmian w proporcjach chlorofilu a i b dostarcza nowych informacji na temat regulacji syntezy pigmentu w mikroalgach, co może mieć znaczące implikacje w dziedzinach takich jak biotechnologia i badania środowiskowe.
Wykrywanie okresów zwiększonej produkcji chlorofilu ma kluczowe znaczenie ze względu na jego rolę jako głównego pigmentu w procesie fotosyntezy. Chlorofil a jest niezbędny do wychwytywania energii świetlnej i przekształcania jej w energię chemiczną, która jest następnie wykorzystywana do napędzania wzrostu i metabolizmu komórek. W związku z tym wzrost produkcji chlorofilu A wskazuje na zwiększenie zdolności fotosyntezy organizmów, co sugeruje optymalne warunki dla wzrostu drobnoustrojów12; potwierdza to obserwację C . sorokiniana , że testy, które wygenerowały wyższe stężenie chlorofilu, były tymi, w których uzyskano większy wzrost komórek, dostarczając cennych informacji na temat tego, kiedy warunki środowiskowe są najbardziej korzystne dla rozwoju i proliferacji mikroorganizmów fotosyntetycznych.
W szczególności zrozumienie proporcji chlorofilu w H. pluvialis jest szczególnie intrygujące, ponieważ mogą one dostarczyć ważnych sygnałów dotyczących stanu stresu związanego z mikroalgami. Gdy warunki stają się niekorzystne, na przykład pod wpływem silnego światła lub braku składników odżywczych, mikroalgi mogą zmniejszać produkcję chlorofilu i zamiast tego syntetyzować pigmenty karotenoidowe, takie jak astaksantyna11. To przejście od zielonych faz wzrostu, charakteryzujących się wysokimi stężeniami chlorofilu, do faz wywołanych stresem bogatych w astaksantynę, jest korzystne dla maksymalizacji wydajności astaksantyny. Podkreśla to znaczenie monitorowania poziomu chlorofilu jako wskaźnika zastępczego dla reakcji na stres i dynamiki produkcji pigmentu w uprawie H. pluvialis .
Ponadto, chociaż ograniczenia tej techniki są niewielkie ze względu na jej wysoką selektywność, niezbędne są środki ostrożności, takie jak trzymanie ekstraktów z dala od światła, aby zapobiec utlenianiu i ostrożne obchodzenie się z odwirowanymi próbkami w celu wyeliminowania zmętnienia pozostałości biomasy. Ponadto wadą metody jest wymóg stosunkowo dużych objętości próbek, zwłaszcza w przypadku rozcieńczonych pożywek lub długotrwałych badań kinetycznych na poziomie kolby, co może stanowić wyzwanie logistyczne. Rozważania te podkreślają znaczenie starannego projektowania eksperymentów i obchodzenia się z próbkami w celu maksymalizacji skuteczności technik analizy chlorofilu w badaniach nad mikroalgami.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują za częściowe dofinansowanie od TecNM w ramach Wezwania do Badań Naukowych, Rozwoju Technologicznego i Innowacji (16898.23-P) dla Institutos Tecnologicos Federales. Doceniają również wsparcie ze strony Instituto de Ciencia, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo (FCCHTI23_ME-4.1.-0001).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| C3H6O | Meyer | 67-64-1 | Aceton 90% |
| 15 mL probówka | Biologix | 10-9502 | Probówka |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | Sonicator |
| 5 ml probówka z nakrętką | Kimax | 45066-13100 | Probówka |
| 50 ml Probówka | Biologix | 10-9151 | Probówka |
| Folia | aluminiowa Reynolds | 611 standard, 12" x 1000 stóp | Pokrywa probówki |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | Wirówka chlorku wapnia |
| Dynamica | 14 R | Wirówka chłodzona | |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | Dichlorek kobaltu |
| FeCl3 | Merck | 157740 | Chlorek żelaza(III) |
| K2HPO4 | Meyer | 2051-250 | Fosforan dipotasu |
| KH2PO4 | Meyer | 2055-250 | Fosforan monopotasowy |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | Mikropipeta siarczanu magnezu |
| LabNet | Model Beta-Pette | Mikropipeta | |
| MnCl2 | Merck | 429449 | Chlorek manganu(II) |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, Edetato Sól disodowa dwuwodzian |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 | Molibdenian sodu |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | Chlorek sodu |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | z azotanu sodu |
| Steren | -LED2 | Light źródło | |
| Spektrofotometr | PerkinElmer | Model Lambda35 | Spektrofotometr |
| Spektroradiometr | Gigahertz-Optik | model BTS256 | |
| Vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | Vortex |
| ZnCl2 | Merck | 208086 | Chlorek |
Bibliografia
- Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306 (2013).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).
- Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth. Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).
- Pancha, I., et al. Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077. Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).
- Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions. Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).
- Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions. Nova. 11 (19), 94-104 (2013).
- Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735 (2019).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. University of Texas. 6318, 95(1963).
- Cerezo, R. LED characterization through the use and programming of a spectrometer. Universidad Politécnica de. 22323, (2013).
- Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403 (2017).
- Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii. Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).
- Vera-López, F., Martínez, A. Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques. BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).
Przedruki i uprawnienia
