Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.
Artykuł metodologiczny
Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrofluidyka zawiera fizjologicznie istotne substraty i przepływy, które naśladują układ naczyniowy i dlatego są cennym narzędziem do badania aspektów zakrzepicy i hemostazy. W środowiskach o wysokim ścinaniu symulujących przepływ tętniczy test mikroprzepływowy ułatwia badanie funkcji płytek krwi, ponieważ skrzepliny bogatopłytkowe tworzą się w zlokalizowanym obszarze zwężenia kanału przepływowego. Wykorzystanie urządzeń, które pozwalają na małą objętość próbki, może dodatkowo pomóc w ocenie funkcji płytek krwi pod przepływem z próbek pacjentów o ograniczonej objętości lub modeli zwierzęcych. Badanie próbek pobranych od pacjentów po urazach lub próbek pobranych po transfuzji produktów płytkowych może pomóc w ukierunkowaniu strategii terapeutycznych na populacje pacjentów, w których funkcja płytek krwi ma kluczowe znaczenie. W tym modelu można również badać efekty hamowania płytek krwi za pomocą środków farmakologicznych. Celem tego protokołu jest ustanowienie platformy mikroprzepływowej, która łączy przepływ fizjologiczny, powierzchnie biologiczne i odpowiednie mechanizmy hemostatyczne w celu oceny funkcji płytek krwi z implikacjami dla badań nad koagulopatią wywołaną urazem i medycyną transfuzjologiczną.
Wprowadzenie
Trauma jest główną globalną przyczyną śmierci i niepełnosprawności. Ciężki uraz jest często powikłany unikalnym, endogennym zaburzeniem hemostazy i zakrzepicy, określanym jako koagulopatia wywołana urazem (TIC)1. Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w TIC i zostały opisane jako posiadające zarówno funkcje adaptacyjne, jak i nieadaptacyjne2. Mechanizmy dysfunkcji płytek krwi po urazie pozostają niejasne i istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia odpowiedzi komórkowej, aby pokierować rozwojem ulepszonej resuscytacji i terapii. Dodatkowym irytującym problemem związanym z funkcją płytek krwi po urazie jest niepewność co do wiarygodności obecnych odczytów funkcji płytek krwi u pacjenta po urazie.
Liczne badania wykazały, że nawet lekko uszkodzeni pacjenci, bez znanego klinicznego fenotypu krwawienia, mają nieprawidłową funkcję płytek krwi przy użyciu konwencjonalnych testów funkcji płytek krwi, takich jak agregometria3,4. Jednak ograniczenia w agregometrii do oceny funkcji płytek krwi w warunkach urazu obejmują brak fizjologicznie istotnej powierzchni urazu, redukcjonistyczne podejście do stymulacji agonistycznej, rozcieńczenie próbki za pomocą agregometrii impedancji krwi pełnej, separację osocza za pomocą agregegometrii optycznej przepuszczalności światła oraz ocenę stagnacji próbki. Dodatkowo, nie jest jasne, czy ta wrażliwość funkcji płytek krwi reprezentuje prawdziwą dysfunkcję komórkową, czy artefakt pomiarowy, taki jak zwiększona podstawowa impedancja elektryczna, w warunkach urazu2. W związku z tym badanie odpowiednich funkcji płytek krwi w kontekście traumy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia TIC i istnieje znaczne pole do innowacji i ulepszeń w tej dziedzinie.
Platformy tradycyjnie używane do badania funkcji płytek krwi nie uwzględniają dynamiki i przepływu płynów, co może być kluczowe w zrozumieniu dysfunkcji płytek krwi związanych z traumą i koagulopatią wywołaną traumą5. Mechanizmy hemostazy, które są zależne od przepływu, obejmują wydłużenie czynnika von Willebranda (VWF) przy wysokim ścinaniu, powyżej krytycznej szybkości ścinania, oraz wychwytywanie płytek krwi przez glikoproteinę 1b6,7,8, które nie są wychwytywane za pomocą testów stagnacji funkcji płytek krwi. Ponadto płytki krwi preferencyjnie wiążą VWF lub fibrynogen w zależności od reżimu przepływu i wywołują zróżnicowane role w zakrzepicy tętniczej i żylnej9,10. Skrzepliny tętnicze składają się głównie z płytek krwi, podczas gdy skrzepliny żylne składają się głównie z czerwonych krwinek, częściowo opartych na reżimach przepływu11. Testy, które obejmują reżimy przepływu, mogą pomóc w wyjaśnieniu dysfunkcji związanych ze spektrum fenotypów TIC, od hipokoagulacji i fenotypów krwawienia po nadkrzepliwość i fenotypy zakrzepowe. Wreszcie, ograniczenia w pobieraniu próbek krwi w populacjach pacjentów po urazach mogą sprawić, że tradycyjne badanie funkcji płytek krwi będzie wyzwaniem. Chociaż testy, takie jak cytometria przepływowa, mogą i powinny być stosowane w takich okolicznościach, wyniki często przedstawiają fizyczną charakterystykę próbki, a nie hemostatyczną ocenę funkcjonalną.
Chociaż mechanizmy dysfunkcji płytek krwi mogą nie być w pełni zrozumiałe w przypadku urazów, modelowanie dysfunkcji płytek krwi in vitro, na przykład z antagonistami P2Y12, może również pomóc w prowadzeniu badań nad interwencjami terapeutycznymi. Resuscytacja hemostatyczna jest niezwykle ważna u pacjentów po urazach, u których produkty krwiopochodne są przetaczane w zrównoważony sposób w celu rozwiązania problemu wstrząsu, koagulopatii i uszkodzenia śródbłonka za pomocą krwi pełnej lub składników krwi (krwinek czerwonych, osocza i koncentratów płytek krwi) w stosunku 1:1:1 jednostki12,13,14. U pacjentów po urazach wczesne stosowanie produktów krwiopochodnych wiąże się z poprawą przeżycia15,16. Aby przedłużyć okres przydatności do spożycia, coraz częściej bada się produkty płytkowe przechowywane w chłodni. Badanie płytek krwi przechowywanych w niskiej temperaturze wykazuje zwiększoną aktywność hemostatyczną, a także bezpieczeństwo po przetoczeniu po urazie17,18.
Ewolucja resuscytacji płytek krwi przechowywanej w zimnej temperaturze podkreśla potrzebę dodatkowych badań, aby zrozumieć najbardziej skuteczny produkt płytkowy dostępny w leczeniu urazów. Jednak tradycyjne testy funkcji płytek krwi są często nadmiernie lub niedostatecznie nasilone w celu wykrycia dysfunkcji, występującej zarówno u pacjenta po urazie otrzymującego terapeutyczną transfuzję płytek krwi, jak i w samym przetoczonym produkcie, widocznym w zmianach spichrzających płytki krwi. Określenie pochodzenia dysfunkcji może być trudne, biorąc pod uwagę ograniczenia w obecnych testach funkcji płytek krwi, w tym statyczny charakter większości tych testów. Dlatego też, podczas badania resuscytacji hemostatycznej in vitro, platforma i metody wykrywania zarówno dla populacji biorców, jak i produktów płytek krwi mają kluczowe znaczenie w określaniu optymalnych interwencji terapeutycznych.
Testy mikroprzepływowe oferują profile przepływu i powierzchnie biofideliczne, aby stworzyć fizjologicznie istotny test, na którym można badać płytki krwi. Urządzenia mikroprzepływowe można dostosować do badania określonych patofizjologii lub typów urazów, takich jak nakłucie naczynia krwionośnego19 lub uszkodzenie śródbłonka20. Urządzenia te składają się zazwyczaj z polidimetylosiloksanu (PDMS) połączonego ze szklanym szkiełkiem mikroskopowym z modyfikacjami powierzchni, takimi jak kolagen, w celu naśladowania podśródbłonka i uszkodzenia tkanek. Wykorzystanie tego typu urządzeń opartych na przepływie może pomóc w prowadzeniu badań nad dysfunkcją płytek krwi związaną z urazami oraz pomóc w badaniu optymalnych metod medycyny transfuzjologicznej w celu złagodzenia dysfunkcji płytek krwi. Strategie te mogą pomóc w wyjaśnieniu istniejącego zamieszania co do znaczenia statycznych testów płytek krwi, takich jak aggregometria, u pacjenta z urazem mózgu.
Protokół
Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Uzyskano zgodę Biura Ochrony Badań nad Ludźmi (Human Research Protection Office) Uniwersytetu w Pittsburghu oraz świadomą zgodę zdrowych ochotników.
1. Przygotowanie urządzenia mikrofluidycznego
- Aby wykonać część urządzenia z PDMS, przygotuj formę matrycą z mosiądzu za pomocą mikrobicia sterowanego numerycznie (CNC).
UWAGA: W zależności od wymiarów kanałów, do stworzenia formy matrycy można zastosować techniki fotolitografii. Urządzenie użyte w tym protokole zawiera osiem równoległych kanałów wykonanych metodą mikrobicia o szerokości ok. 480 µm, wysokości 140 µm przy wlocie i wylocie urządzenia oraz wysokości 40 µm w miejscu zwężenia urządzenia, z długością rampy do/z obszaru zwężonego wynoszącą ok. 0,3 mm. Długość kanałów wynosi ok. 6 mm. - Po uzyskaniu formy matrycy, wlej bazę elastomeru silikonowego (z zestawu elastomerowego) do naczynia wagowego. Dodaj utwardzacz silikonowy (z zestawu elastomerowego), który ułatwia sieciowanie łańcuchów polimeru silikonowego, przekształcając ciekły PDMS w trwałą i elastyczną substancję stałą, w stosunku 10:1 (baza do utwardzacza) i dokładnie wymieszaj mieszaninę.
- Umieść formę w szalce Petriego i wlej nieutwardzony PDMS na formę. Umieść szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym na 30 min, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
- Zakończ utwardzanie PDMS w formie matrycy, umieszczając ją w piekarniku ustawionym na 70 °C przez 90 min.
- Po całkowitym utwardzeniu PDMS, wytnij odlew mikrofluidyczny za pomocą żyletki lub skalpela. Wywierć otwory na krawędziach kanałów (o średnicy 1,5 mm po obu stronach).
- Za pomocą taśmy laboratoryjnej oczyść powierzchnię szkiełka przedmiotowego oraz trawioną stronę odlewu mikrofluidycznego. W razie potrzeby użyj sprężonego powietrza, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia.
- Umieść szkiełko przedmiotowe i odlew mikrofluidyczny trawioną stroną do góry w oczyszczaczu plazmowym. Uruchom pompę próżniową, zamknij komorę i włącz oczyszczacz plazmowy na wysokie ustawienie. Pozostaw szkiełko i PDMS w oczyszczaczu plazmowym przez 30 s, a następnie wyłącz urządzenie i zniesć próżnię.
- Połącz oczyszczony plazmą odlew i szkiełko przedmiotowe, delikatnie dociskając do siebie strony, które były skierowane do góry w oczyszczaczu plazmowym. Następnie umieść urządzenie mikrofluidyczne w piekarniku/na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C przez 10 min.
UWAGA: Nie przykładaj zbyt dużego nacisku podczas łączenia odlewu ze szkiełkiem przedmiotowym, ponieważ może to doprowadzić do utraty morfologii kanałów. - Przepłucz każdą komorę 10-30 µL 70% etanolu w celu sterylizacji i pozostaw urządzenie mikrofluidyczne do wyschnięcia na płycie grzejnej o temperaturze 70 °C.
UWAGA: Urządzenia należy wykonać co najmniej 24 h wcześniej, choć mogą być przygotowane z wyprzedzeniem kilku tygodni lub miesięcy. Urządzenia należy przechowywać w szczelnym pojemniku lub przykrytej szalce Petriego w temperaturze pokojowej. - W dniu poprzedzającym eksperymenty z urządzeniem mikrofluidycznym, ponownie przepłucz każdą komorę 10-30 µL 70% etanolu w celu sterylizacji i pozostaw urządzenie mikrofluidyczne do wyschnięcia na płycie grzejnej o temperaturze 70 °C.
- Pokryj komorę odczynnikiem kolagenu włóknistego konia typu 1 (1 mg/mL), rozcieńczonym w 0,9% NaCl w stosunku objętościowym 1:5, wprowadzając go przez wyznaczony wylot do wyznaczonego wlotu. Upewnij się, że kierunkowość jest zachowana w obrębie eksperymentu. Przechowuj urządzenie w ciepłym, wilgotnym, zamkniętym pojemniku, aby zapobiec odparowaniu naniesionego kolagenu wewnątrz kanału.
- Po 1 h przepłucz urządzenie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć roztwór kolagenu. Płucz w kierunku przeciwnym do kierunku nanoszenia powłoki. Gdy urządzenie nie jest używane, przechowuj je ponownie w ciepłym, wilgotnym, zamkniętym pojemniku.
2. Przygotowanie próbki krwi
- Pobrać próbkę całą krwi z cytrynianem drogą nakłucia żyły. Inkubować krew z cytrynianem z roztworem blokującym receptory FC (1:600).
UWAGA: Próbki krwi są przechowywane w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem i w trakcie eksperymentu. - Inkubować krew z cytrynianem z przeciwciałem CD41 sprzężonym z fluorescencją (z użyciem wybranego fluoroforu) (1:600). Barwić przez 30 min na mieszadle typu nutating rocker.
- Jako kontrolę pozytywną hamowania płytek krwi dodać Ticagrelor, antagonistę receptora P2Y12, rozpuszczony w roztworze 30% w/v 2-hydroksypropyl-β-cyklodekstryny (HP-β-CD) w PBS.
UWAGA: Roztwory zapasowe Ticagreloru do stężenia 6,4 mM powinny zostać przygotowane, a dalsze rozcieńczenie zapasów Ticagreloru w roztworze HP-β-CD (30% HP-β-CD rozpuszczone w PBS) może zostać wykonane przed eksperymentem (zaleca się stężenia zapasowe 1000x). - Inkubować próbkę z cytrynianem z Ticagrelorem (stężenie końcowe do 6,4 µM) przez 30 min, aby zaobserwować hamowanie płytek krwi.
- W przypadku mieszania produktu krwiopochodnego z próbką z cytrynianem, zbarwić produkt krwiopochodny roztworem blokującym receptory FC (1:600) oraz przeciwciałem CD41 sprzężonym z fluorescencją (z użyciem fluoroforu odrębnego i innego niż ten zastosowany w próbce z cytrynianem) (1:600).
- Wymieszać objętościowy ekwiwalent jednostek produktu przetoczonego z próbką z cytrynianem. Na przykład, aby zasymulować przetoczenie 2 jednostek koncentratu płytek krwi osobie z krwotokiem (około 250 mL na produkt przy całkowitej objętości krwi 5000 mL), wymieszać 100 µL produktu krwiopochodnego z 1000 µL próbki krwi z cytrynianem.
- Bezpośrednio przed eksperymentem przefiltrować próbkę krwi przez filtr 40 µm do sterylnej probówki mikrocentryfużowej 1,5 mL.
3. Badanie funkcji płytek krwi w warunkach przepływu (Metoda 1)
- Włącz mikroskop oraz powiązane oprogramowanie.
- Ustaw pompę strzykawkową do odsysania na poziomie stolika mikroskopu. Skonfiguruj ustawienia pompy strzykawkowej.
- Oblicz objętościowy przepływ (Q) dla pożądanego średniego szybkości ścinania przy ścianie (γ) wynoszącego 3,500 s-1 w obszarze zwężenia kanału, korzystając z równań (1) i (2)21.
(1)
(2)
Gdzie A to pole przekroju poprzecznego kanału, P to obwód zwilżony, λ to współczynnik kształtu, b to krótki bok prostokąta (wysokość), a a to długi bok prostokąta (szerokość).
UWAGA: Wartość 3,500 s-1 została wybrana ze względu na krytyczne ścinanie VWF i mieści się w zakresie tętniczym7,22,23.
- Oblicz objętościowy przepływ (Q) dla pożądanego średniego szybkości ścinania przy ścianie (γ) wynoszącego 3,500 s-1 w obszarze zwężenia kanału, korzystając z równań (1) i (2)21.
- Umieść urządzenie mikrofluidyczne na stoliku mikroskopu. Przyklej krawędzie urządzenia mikrofluidycznego do stolika taśmą, aby uniknąć przemieszczania. Upewnij się, że wylot jest skierowany w stronę tylnej części mikroskopu.
- Podłącz jeden koniec rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16” (o długości około 30 cm) do złączki kątowej, a drugi koniec do strzykawki 10 mL z złączem ID 1/16”.
- Napełnij strzykawkę sterylnym PBS i podłącz ją do pompy strzykawkowej.
- Włóż złączkę kątową do wylotu urządzenia.
- Przygotuj linie wlotowe o długości około 10 cm z złączką kątową na jednym końcu i cięciem pod kątem na drugim końcu.
- Podłącz wlotową złączkę kątową do wlotu urządzenia.
- Umieść linię wlotową w probówce mikrocentryfugowej na odpady, korzystając z uchwytu pod kątem.
- Użyj obiektywu 10x dla kanałów o szerokości około 500 µm i ustaw ostrość na krawędziach kanału urządzenia mikrofluidycznego.
- Przepłucz linie roztworem PBS i oczyść kanał z wszelkich pozostałości PDMS/zanieczyszczeń, przesuwając pompę strzykawkową ręcznie. Należy sprawdzić obszary w pobliżu wlotu i wylotu kanału.
- Otwórz zapisane ustawienia przechwytywania obrazu lub utwórz procedurę przechwytywania obrazów w serii czasowej, rejestrowanych co 1–2 s w kanale jasnego pola oraz kanałach fluorescencyjnych odpowiadających zastosowanym w próbce krwi przeciwciałom CD41.
- Pobierz przefiltrowaną próbkę krwi cytratowanej i wymieszaj ją poprzez pipetowanie w górę i w dół bezpośrednio przed eksperymentem. Umieść próbkę w uchwycie mikrocentryfugowym pod kątem.
- Wprowadź linię wlotową do próbki.
- Rozpocznij rejestrację obrazów.
- Powoli odsysaj zawartość strzykawki, aby wypełnić objętość martwą w rurkach. Gdy krew dotrze do kanału, natychmiast naciśnij play na pompie strzykawkowej, aby wznowić przepływ z pożądaną szybkością ścinania.
- W razie potrzeby skoryguj ostrość.
- Przeprowadź eksperyment do momentu całkowitego zablokowania obszaru zwężenia urządzenia mikrofluidycznego przez płytki krwi lub do osiągnięcia punktu końcowego eksperymentu (np. 10 min).
- Upewnij się, że rurka wlotowa jest zanurzona w próbce krwi przez cały czas trwania eksperymentu.
- Po zakończeniu eksperymentu zatrzymaj przechwytywanie obrazów i wyłącz pompę strzykawkową. Zapisz zarejestrowane obrazy.
- Zdejmij wlotową złączkę kątową i opróżnij zawartość rurek do probówki stożkowej na odpady. Opróżnij również zawartość strzykawki i linii wylotowej do probówki stożkowej na odpady.
- Wymień złączki wlotowe i wylotowe oraz rurki w razie potrzeby przed analizą kolejnych próbek.
4. Badanie funkcji płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem próbek o małej objętości (poniżej 1 mL) (Metoda 2)
- Powtórz kroki od 1.1 do 1.4 zgodnie z powyższą instrukcją.
- Wykonaj otwór wylotowy o średnicy 1,5 mm oraz wlotowy o średnicy 3 mm na krawędziach kanałów.
- Powtórz kroki od 1.6 do 3.6 zgodnie z powyższą instrukcją.
- Dla kanałów o szerokości około 500 µm użyj obiektywu 10x i ustaw ostrość na krawędziach kanałów urządzenia mikrofluidycznego.
- Oczyść kanał z resztek PDMS/zanieczyszczeń, przesuwając ręcznie pompę strzykawkową i odsączając nadmiar płynu za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Usuń wszelkie zanieczyszczenia z górnej części urządzenia mikrofluidycznego za pomocą taśmy laboratoryjnej.
- Ręcznie przesuń pompę, aby napełnić zbiornik wlotowy o średnicy 3 mm roztworem PBS.
- Otwórz zapisane ustawienia przechwytywania obrazów lub utwórz procedurę przechwytywania obrazów dla serii czasowych rejestrowanych co 1–2 s w kanale pola jasnego oraz w kanałach fluorescencyjnych odpowiadających przeciwciałom CD41 używanym w próbce krwi.
- Uruchom odsysanie w pompie strzykawkowej (ręcznie lub z ustawioną prędkością) i gdy PBS zacznie wpływać do kanału, a poziom cieczy w zbiorniku zacznie opadać, zatrzymaj odsysanie w pompie.
- Usuń nadmiar PBS ze zbiornika za pomocą pipety.
- Uruchom przechwytywanie obrazów.
- Nanieś próbkę krwi do zbiornika za pomocą pipety (około 40 μL) i natychmiast uruchom strzykawkę odsysającą. Upewnij się, że przepływ się rozpoczął.
UWAGA: Jeśli silnik pompy strzykawkowej do odsysania nie został przygotowany w kroku 4.8, przepływ nie rozpocznie się natychmiast i należy powtórzyć eksperyment. - Uzupełniaj krew w zbiorniku przez cały czas trwania eksperymentu, dbając o to, aby do kanału nie dostały się pęcherzyki powietrza.
- Prowadź eksperyment do czasu całkowitego zamknięcia zwężonego obszaru urządzenia mikrofluidycznego przez płytki krwi lub do osiągnięcia punktu końcowego eksperymentu (np. 10 min).
- Po zakończeniu eksperymentu zatrzymaj przechwytywanie obrazów oraz pompę strzykawkową. Zapisz zarejestrowane obrazy.
- Usuń nadmiar krwi ze zbiornika za pomocą pipety. Opróżnij zawartość drenu odsysającego do stożkowej probówki na odpady.
- W razie potrzeby wymień złączki i dreny przed analizą kolejnych próbek.
5. Dekontaminacja
- Oczyść linie wlotowe i wylotowe z krwi, przepłukując je 10% roztworem wybielacza.
- Jeśli wszystkie kanały w urządzeniu mikrofluidycznym zostały wykorzystane, należy wyrzucić urządzenie do pojemnika na odpady biologiczne typu Sharps.
UWAGA: Wszystkie odpady biologiczne powinny być utylizowane w odpowiedni sposób jako odpady niebezpieczne biologicznie.
6. Analiza obrazu
- Wyeksportuj obrazy z eksperymentów kinetycznych za pomocą oprogramowania, klikając File | Export/Import | Export.
- Wybierz następujące parametry: typ pliku (filetype): Tagged Image File Format (TIFF); kompresja (compression): LZW; zaznacz Original Data oraz Shift Pixel; odznacz Apply display curve and channel color; zaznacz Define Subset (Region, Rectangle region i zaznacz obszar kanału z zachowaniem jednakowej szerokości i wysokości pomiaru pomiędzy warunkami). Eksportuj do wybranego folderu i zaznacz Create folder.
- Zanotuj w oprogramowaniu poniższe wartości eksperymentalne: klatkę początkową (start frame) w momencie, gdy krew wpływa do kanału; częstotliwość klatek (frame rate) (Info, Time Series).
- Zmierz znormalizowaną średnią intensywność fluorescencji dla każdej klatki w eksperymencie, wykorzystując kod Matlab dostarczony jako Supplemental File 1, zmieniając dla każdego eksperymentu następujące dane wejściowe: klatkę początkową/końcową (start frame/end frame) w zależności od długości eksperymentu (należy upewnić się, że długość eksperymentu jest stała pomiędzy warunkami); nazwę eksperymentu/nazwę folderu; parametry przycinania X, Y, H oraz W. Uruchom kod raz dla kanału fluorescencyjnego płytek biorcy i raz dla kanału fluorescencyjnego płytek produktu. Podaj znormalizowane wartości MFI (kolumna 2) oraz znormalizowane wartości AUC (znormalizowane względem klatki początkowej). Odejmij wartość długości eksperymentu od znormalizowanej wartości AUC.
Wyniki
Eksperymenty mikroprzepływowe przeprowadzone z zastosowaniem tej metody powinny wykazać tworzenie się zakrzepów bogatych w płytki krwi w obszarze zwężenia kanału przepływowego (Rysunek 1). Rysunek 1A przedstawia reprezentatywne wyniki, w których funkcjonalne płytki krwi utworzyły zakrzep w zwężonym obszarze kanału, blokując przepływ krwi przez kanał. Krzywe średniej intensywności fluorescencji (MFI) uzyskane z obrazów kinetycznych pobieranych przez cały czas trwania eksperymentu ilustrują fazę opóźnienia, fazę wzrostu oraz fazę plateau włączania płytek do rosnącego zakrzepu (Rysunek 2A,C). Zwiększanie stężeń antagonisty P2Y12, Ticagreloru, obniża MFI płytek oraz obliczoną pole pod krzywą (AUC) dla krzywych MFI (Rysunek 2B,D). Aby zaobserwować wyraźną dysfunkcję płytek, wymagany jest dłuższy czas inkubacji (30 min w porównaniu do 5 min), co jest zgodne z bardziej wyraźną zależnością dawka-odpowiedź uzyskaną w badaniu agregometrii impedancyjnej krwi pełnej po 30 min inkubacji z Ticagrelorem w porównaniu do inkubacji przez 5 min (Rysunek uzupełniający S1). W różnych warunkach zastosowania nośnika w modelu mikroprzepływowym zaobserwowano podobne efekty hamowania P2Y12 zależne od czasu (Rysunek uzupełniający S2).
Wizualizacja dwóch populacji płytek krwi w symulowanej metodzie reanimacji hemostatycznej obrazuje wbudowanie obu populacji płytek w zakrzep (Rycina 3A). Stopień wbudowania obu populacji płytek, określony na podstawie odpowiadających im sygnałów fluorescencyjnych, można określić kinetycznie w czasie trwania eksperymentu za pomocą pomiarów MFI (Rycina 3B). Stromsze nachylenia w fazie wzrostu, a także wyższe wartości końcowe pomiarów MFI świadczą o zwiększonej funkcjonalności płytek i potencjale hemostatycznym; można to zaobserwować w ilościowym oznaczeniu płytek biorcy w sytuacji, gdy w próbce krwi wywołano dysfunkcję płytek poprzez inhibicję P2Y12, a następnie przeprowadzono symulację reanimacji poprzez zmieszanie z新鮮ą autologiczną pełną krwią w stosunku objętościowym 1:10, zabarwioną odrębnym fluorophorem dla płytek. Po zmieszaniu z autologiczną pełną krwią, w zakrzep wbudowano więcej płytek z symulowanego produktu przetoczonego w porównaniu z produktem z aferezy przechowywanym w temperaturze pokojowej w 5. dniu, który wykazał minimalne wbudowanie produktu w tworzący się zakrzep. Mieszanie z produktem płytkowym z 5. dnia przechowywania w temperaturze pokojowej wykazało również niższy stopień wbudowania płytek biorcy w porównaniu z mieszaniem ze świeżą autologiczną pełną krwią (Rycina 3B).
Rysunek 1: Przedstawienie badania funkcji płytek krwi z wykorzystaniem mikrofluidyki. (A) Przedstawiono schemat mikrofluidycznej konfiguracji eksperymentalnej do badania funkcji płytek krwi z wykorzystaniem próbek krwi o małej objętości, obejmujący pompę strzykawkową do pobierania krwi, która przeciąga krew przez komorę przepływową ze zwężeniem, co umożliwia przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym. (B) Przedstawiono widok z boku komory przepływowej ze zwężeniem, zawierający powierzchnię powleczoną kolagenem, do której płytki będą przylegać, aktywować się i agregować, co prowadzi do wzrostu zakrzepu w obszarze zwężenia. (C) Przechwytywanie obrazów w czasie rzeczywistym cytrynianowej próbki krwi w przepływie w mikrofluidycznym kanale ze zwężeniem (3,500 s-1) oraz wzrost zakrzepu formującego się w ciągu 300 s. Paski skali = 200 µm (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Zmniejszone zmiany krotności MFI płytek krwi oraz pole pod krzywą po 30 min inkubacji z antagonistą P2Y12 tikagrelorem. (A) Inkubacja z antagonistą P2Y12 przez zaledwie 5 min wykazuje nieznacznie wydłużone fazy opóźnienia krzywych MFI oraz (B) niewielkie spadki AUC dla MFI. (C) Inkubacja przez 30 min z antagonistą P2Y12 skutkuje wydłużeniem faz opóźnienia i obniżeniem końcowych wartości MFI, a także (D) silniejszą dysfunkcją wykazaną poprzez AUC dla MFI. Pojedyncze punkty danych reprezentują powtórzenia biologiczne; przedstawiono średnią ± odchylenie standardowe. Skróty: MFI = średnia intensywność fluorescencji; AUC = pole pod krzywą; HP-β-CD = 2-hydroksypropyl-β-cyklodekstryna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Mieszanie produktów krwi z koagulopatycznym hamowaniem P2Y12 w próbce biorcy, symulujące dysfunkcję płytek krwi pacjenta, w komorze mikroprzepływowej. (A) Jednostka płytek z aferezy (osocze, 7. dzień przechowywania) (CD41 w kolorze cyjanowym) zmieszana w stosunku 1:10 z cytrynianową krwią inkubowaną wcześniej z 0,8 µM Ticagreloru przez 30 min (CD41 w kolorze czerwonym). (B) Reprezentatywne krzywe znormalizowanej średniej intensywności fluorescencji próbki krwi biorcy otrzymującej jednostkę płytek z aferezy (5. dzień przechowywania) lub autologiczną świeżą krew pełną (stosunek 1:10) wraz z kinetyką płytek biorcy w czasie. Cytrynianowa krew biorcy była inkubowana wcześniej z 0,8 µM Ticagreloru przez 30 min przed zmieszaniem z produktami krwi. (C) Reprezentatywny obraz z serii z-stack z urządzenia zmodyfikowanego i przyklejonego do szkiełka podstawowego do mikroskopii konfokalnej. Produkt płytek z aferezy zmieszano z próbką krwi z małopłytkowością w stosunku objętościowym 1:5 (produkt:krew) z dodatkiem przeciwciała przeciwko czynnikowi von Willebranda (1:600). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Plik uzupełniający 1: Kod Matlab do analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca S1: Zależność czasowa hamowania P2Y12 przez Ticagrelor w badaniu impedancyjnej agregometrii krwi pełnej. Inkubacja przez 30 min skutkuje bardziej wyraźną zależnością dawka-odpowiedź w porównaniu do 5 min. Roztwory nośnika i leku stosowano w stężeniu 0,1% v/v. Poszczególne punkty danych reprezentują powtórzenia biologiczne, a przedstawiono średnią ± odchylenie standardowe. Skróty: AUC = pole pod krzywą; HP-β-CD = 2-hydroksypropyl-β-cyklodekstryna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek dodatkowy S2: Zależne od czasu hamowanie P2Y12 przez Ticagrelor w mikroprzepływowym modelu funkcji płytek krwi. Przedstawiono reprezentatywne krzywe MFI oraz wartości pola pod krzywą (AUC) dla powtórzeń technicznych od pojedynczego zdrowego dawcy, z zastosowaniem etanolu jako nośnika (1% v/v) w celu zapewnienia rozpuszczalności leku. Skróty: MFI = średnia intensywność fluorescencji; AUC = pole pod krzywą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Powyższy protokół zawiera kilka krytycznych kroków w celu zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności eksperymentów. Po pierwsze, należy dokładnie rozważyć przeciwciała fluorescencyjne. Przeciwciała stosowane do wykrywania płytek krwi w próbce nie powinny blokować funkcji receptora płytek krwi glikoproteiny Ib (GPIb). Dopasowanie partii, gdy tylko jest to możliwe między eksperymentami, ma również kluczowe znaczenie dla zapewnienia odtwarzalności sygnału fluorescencyjnego. Kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole jest stosowanie sterylnych materiałów eksploatacyjnych i roztworów oraz przefiltrowanych próbek, gdy tylko jest to możliwe. Filtrowanie próbek krwi bezpośrednio przed eksperymentem zapobiegnie blokowaniu przepływu przez zanieczyszczenia lub grudki płytek krwi większe niż wymiary kanału, co jest kolejnym krytycznym parametrem, który należy zachować między eksperymentami. Ponadto próbki krwi powinny zostać przebadane w ciągu 4 godzin od pobrania, zgodnie z opisem w okólniku informacyjnym dotyczącym stosowania ludzkiej krwi i składników krwi przygotowanym przez AABB, Amerykański Czerwony Krzyż, Amerykańskie Centra Krwi i Program Krwi Sił Zbrojnych, z wyjątkiem badań zmian w przechowywaniu produktów krwiopochodnych.
W tym protokole można rozważyć modyfikacje, takie jak przyklejenie PDMS do szkiełka nakrywkowego do mikroskopii konfokalnej, co zilustrowano na rysunku 3C. Jeśli to konieczne, przed obrazowaniem, roztwór utrwalający może być przeprowadzony przez kanały i przemyty PBS w celu przechowywania przed obrazowaniem. Ponadto, chociaż powtarzalne wymiary kanału są kluczem do zapewnienia zachowanych szybkości ścinania między warunkami, wysokość obszaru zwężenia może być modyfikowana, ale będzie to miało bezpośredni wpływ na czas tworzenia się skrzepliny, nawet jeśli są zgodne z szybkościami ścinania. Ponieważ większe wymiary kanału będą wymagały więcej czasu, aby osiągnąć znaczne tworzenie skrzepliny, konieczna będzie większa objętość próbki. Podczas rozwiązywania problemów z tym protokołem należy wziąć pod uwagę strategię powlekania. Konkretny rodzaj kolagenu, czas, rozcieńczenie i warunki przechowywania to czynniki, które mogą wpływać na powłokę powierzchniową. Chociaż protokół ten został zwalidowany dla tego konkretnego odczynnika kolagenowego (tabela materiałów), można rozważyć alternatywy kolagenu, które mogą niezawodnie przylegać do powierzchni urządzenia i przyczepność zwalidowaną za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub innych środków, które były wcześniej z powodzeniem stosowane przez inne grupy24.
Potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest brak bezpośredniej odpowiedzi śródbłonka. Można jednak wprowadzić strategie powlekania i modyfikacje w celu uwzględnienia badania funkcji płytek krwi w odpowiedzi na uszkodzenie śródbłonka. Na przykład czynniki zapalne, które komórki śródbłonka wydzielają w odpowiedzi na uraz, mogą być modyfikowane w strategii powlekania tego protokołu lub dodawane egzogennie do badanej próbki krwi. Dodanie tych czynników bez złożoności celularyzacji pozwoliłoby na ukierunkowane podejście do badania wpływu śródbłonka na czynność płytek krwi. W podobny sposób, osocze pacjenta z chorobą lub zdrowym stanem kontrolnym może zostać wzbogacone do systemu w celu przetestowania wpływu rozpuszczalnych w osoczu mediatorów na funkcję płytek krwi.
Badanie funkcji płytek krwi pod przepływem zgodnie z tym protokołem może ułatwić badanie koagulopatii wywołanej traumą i metod medycyny transfuzjologicznej w urazach. Obecne badania funkcji płytek krwi są często nadmiernie lub niedostatecznie nasilone, aby zobaczyć dysfunkcyjną odpowiedź u pacjenta po urazie. Metoda ta pozwala na elastyczność i modyfikacje projektu w celu obserwacji funkcji płytek krwi w próbkach pacjentów po urazach, nawet przy ograniczeniach objętościowych, a także symulacji dysfunkcji płytek krwi w celu oceny interwencji terapeutycznych. Poza pacjentem po urazie, metoda ta może być rozważana u pacjentek z krwotokiem poporodowym, pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych lub pacjentek z rakiem w celu oceny funkcjonalności płytek krwi i potencjalnych interwencji terapeutycznych. Co ważne, metoda ta uwzględnia dynamikę przepływu, która ma kluczowe znaczenie dla mechanizmów tworzenia czopów płytkowych i funkcji hemostatycznej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują i dziękują wszystkim dawcom krwi, którzy wzięli udział, a także flebotomistom z Laboratorium Badawczego Medycyny Urazowej i Transfuzjologicznej oraz Centrum Badań Klinicznych i Translacyjnych UPMC Montefiore za pomoc w zbieraniu plonów. SMS jest obsługiwany przez K25HL161401. MDN jest obsługiwany przez 1R01HL166944-01A1.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipments | |||
| Axio Observer | Zeiss | 491917-0001-000 | |
| Bel-Art Space Saver Odsysacze próżniowe | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Fisherbrand Isotemp Cyfrowe mieszadło z płytą grzejną | Fisher Scientific FB30786161 | ||
| Mikser nutujący | Fischer Scientific | 88-861-043 | |
| Waga wagi OHAUS Scout | Uline | H-5852 | |
| Piekarnik | Fisher Scientific | 15-103-0520 | |
| Myjka plazmowa | Harrick | PDC-32G (115V) | |
| Pompa strzykawkowa (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE) | Aparat Harvard | 883015 | |
| Oprogramowanie Zen 3.4 | Zeiss | Blue edition | |
| < mocny>Materiał< / mocny> | |||
| 1/16 cala ID - Kolczaste łączniki łokciowe | Qosina | 11691 | |
| 10 ml strzykawka | Fischer Scientific | 14-955-459 | |
| 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna | Cayman Chemicals | 16169 | 30% rozpuszczona w buforowanej fosforanie sól |
| fizjologiczna 40-mikronowe filtry | Fischer Scientific | ||
| Przeciwciało CD41 | Novus Biologicals | NB100-2614 | Stosunek 1:600 w |
| odczynniku kolagenowym Chrono-Par | Chrono Log Corporation | 385 | Stosunek 1:5 w 0,9% soli fizjologicznej |
| Mikroskopia elektronowa Sciences Miltex Dziurkacz do biopsji z tłokiem, 3,0 mm | Probówki Fisher Scientific | NC0856599 | |
| Eppendorf Snap-Cap SafeLock, 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Essendant 121 uncji Clorox Wybielacz bakteriobójczy | Fischer Scientific 50371500 | ||
| etanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | 70% |
| Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Sprężony gaz | Supra | 1381978 | |
| Human TruStain | Biolegend | 422302 | Stosunek 1:600 we krwi pełnej |
| LevGo smartSpatula Jednorazowa szpatułka polipropylenowa | Fisher Scientific | 18-001-017 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Gibco | 10010-023 | |
| Bezpieczny skalpel | Fisher Scientific | 22-079-718 | |
| Milipore | soli | 567442 | 0,90% |
| Polistyren Sartorius Łodzie wagowe | Fisher Scientific | 13-735-744 | |
| Szkiełka nakrywkowe Superslip - Superslip nr 1.5 | Fisher Scientific | 12-541-055 | |
| SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych | Fisher Scientific | NC9285739 | Polidimetylosiloksan (PDMS) |
| Ticagrelor | Cayman Chemicals | 15425 | |
| Przezroczysta rurka PVC Tygon 1/16" ID, 1/8" OD, 50 stóp długości | McMaster-Carr | 6516T11 | |
| Ultra-obrabiany mosiądz 360 Pręt | McMaster-Carr | 8954K721 | Do produkcji form mistrzowskich |
| Vacutainers | BD | 363083 | |
| World Precision Instrument Wielokrotnego użytku dziurkacz do biopsji, 1,5 mm | Fisher Scientific | NC1215626 |
Bibliografia
- Moore, E. E., et al. Trauma-induced coagulopathy. Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).
- Vulliamy, P., et al. Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive. Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).
- Starr, N. E., et al. Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping. J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).
- Kutcher, M. E., et al. Characterization of platelet dysfunction after trauma. J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).
- Yakusheva, A. A., et al. Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions. Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).
- Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
- Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).
- Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow. Cell. 94 (5), 657-666 (1998).
- Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell. 84 (2), 289-297 (1996).
- Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. Adhesion mechanisms in platelet function. Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).
- Chernysh, I. N., et al. The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli. Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).
- Holcomb, J. B., et al. Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial. JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).
- Shea, S. M., et al. Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage. J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).
- Cardenas, J. C., et al. Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial. Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).
- Sperry, J. L., et al. Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock. N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).
- Meyer, D. E., et al. Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality. J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).
- Shea, S. M., et al. Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism. J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).
- Sperry, J. L., et al. Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial. Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).
- Schoeman, R. M., et al. A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation. Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).
- Sakurai, Y., et al. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis. Nat Commun. 9 (1), 509(2018).
- Miller, C. Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section. Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).
- Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. Occlusive thrombosis in arteries. APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Sorrells, M. G., Neeves, K. B. Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays. Micromachines. 11 (1), 62(2020).
Przedruki i uprawnienia
