Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Summary

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Abstract

Mikrofluidyka zawiera fizjologicznie istotne substraty i przepływy, które naśladują układ naczyniowy i dlatego są cennym narzędziem do badania aspektów zakrzepicy i hemostazy. W środowiskach o wysokim ścinaniu symulujących przepływ tętniczy test mikroprzepływowy ułatwia badanie funkcji płytek krwi, ponieważ skrzepliny bogatopłytkowe tworzą się w zlokalizowanym obszarze zwężenia kanału przepływowego. Wykorzystanie urządzeń, które pozwalają na małą objętość próbki, może dodatkowo pomóc w ocenie funkcji płytek krwi pod przepływem z próbek pacjentów o ograniczonej objętości lub modeli zwierzęcych. Badanie próbek pobranych od pacjentów po urazach lub próbek pobranych po transfuzji produktów płytkowych może pomóc w ukierunkowaniu strategii terapeutycznych na populacje pacjentów, w których funkcja płytek krwi ma kluczowe znaczenie. W tym modelu można również badać efekty hamowania płytek krwi za pomocą środków farmakologicznych. Celem tego protokołu jest ustanowienie platformy mikroprzepływowej, która łączy przepływ fizjologiczny, powierzchnie biologiczne i odpowiednie mechanizmy hemostatyczne w celu oceny funkcji płytek krwi z implikacjami dla badań nad koagulopatią wywołaną urazem i medycyną transfuzjologiczną.

Introduction

Trauma jest główną globalną przyczyną śmierci i niepełnosprawności. Ciężki uraz jest często powikłany unikalnym, endogennym zaburzeniem hemostazy i zakrzepicy, określanym jako koagulopatia wywołana urazem (TIC)¹. Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w TIC i zostały opisane jako posiadające zarówno funkcje adaptacyjne, jak i nieadaptacyjne². Mechanizmy dysfunkcji płytek krwi po urazie pozostają niejasne i istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia odpowiedzi komórkowej, aby pokierować rozwojem ulepszonej resuscytacji i terapii. Dodatkowym irytującym problemem związanym z funkcją płytek krwi po urazie jest niepewność co do wiarygodności obecnych odczytów funkcji płytek krwi u pacjenta po urazie.

Liczne badania wykazały, że nawet lekko uszkodzeni pacjenci, bez znanego klinicznego fenotypu krwawienia, mają nieprawidłową funkcję płytek krwi przy użyciu konwencjonalnych testów funkcji płytek krwi, takich jak agregometria3^,4. Jednak ograniczenia w agregometrii do oceny funkcji płytek krwi w warunkach urazu obejmują brak fizjologicznie istotnej powierzchni urazu, redukcjonistyczne podejście do stymulacji agonistycznej, rozcieńczenie próbki za pomocą agregometrii impedancji krwi pełnej, separację osocza za pomocą agregegometrii optycznej przepuszczalności światła oraz ocenę stagnacji próbki. Dodatkowo, nie jest jasne, czy ta wrażliwość funkcji płytek krwi reprezentuje prawdziwą dysfunkcję komórkową, czy artefakt pomiarowy, taki jak zwiększona podstawowa impedancja elektryczna, w warunkach urazu². W związku z tym badanie odpowiednich funkcji płytek krwi w kontekście traumy ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia TIC i istnieje znaczne pole do innowacji i ulepszeń w tej dziedzinie.

Platformy tradycyjnie używane do badania funkcji płytek krwi nie uwzględniają dynamiki i przepływu płynów, co może być kluczowe w zrozumieniu dysfunkcji płytek krwi związanych z traumą i koagulopatią wywołaną traumą⁵. Mechanizmy hemostazy, które są zależne od przepływu, obejmują wydłużenie czynnika von Willebranda (VWF) przy wysokim ścinaniu, powyżej krytycznej szybkości ścinania, oraz wychwytywanie płytek krwi przez glikoproteinę 1b^6,7,8, które nie są wychwytywane za pomocą testów stagnacji funkcji płytek krwi. Ponadto płytki krwi preferencyjnie wiążą VWF lub fibrynogen w zależności od reżimu przepływu i wywołują zróżnicowane role w zakrzepicy tętniczej i żylnej^9,10. Skrzepliny tętnicze składają się głównie z płytek krwi, podczas gdy skrzepliny żylne składają się głównie z czerwonych krwinek, częściowo opartych na reżimach przepływu¹¹. Testy, które obejmują reżimy przepływu, mogą pomóc w wyjaśnieniu dysfunkcji związanych ze spektrum fenotypów TIC, od hipokoagulacji i fenotypów krwawienia po nadkrzepliwość i fenotypy zakrzepowe. Wreszcie, ograniczenia w pobieraniu próbek krwi w populacjach pacjentów po urazach mogą sprawić, że tradycyjne badanie funkcji płytek krwi będzie wyzwaniem. Chociaż testy, takie jak cytometria przepływowa, mogą i powinny być stosowane w takich okolicznościach, wyniki często przedstawiają fizyczną charakterystykę próbki, a nie hemostatyczną ocenę funkcjonalną.

Chociaż mechanizmy dysfunkcji płytek krwi mogą nie być w pełni zrozumiałe w przypadku urazów, modelowanie dysfunkcji płytek krwi in vitro, na przykład z antagonistami P2Y12, może również pomóc w prowadzeniu badań nad interwencjami terapeutycznymi. Resuscytacja hemostatyczna jest niezwykle ważna u pacjentów po urazach, u których produkty krwiopochodne są przetaczane w zrównoważony sposób w celu rozwiązania problemu wstrząsu, koagulopatii i uszkodzenia śródbłonka za pomocą krwi pełnej lub składników krwi (krwinek czerwonych, osocza i koncentratów płytek krwi) w stosunku 1:1:1 jednostki^12,13,14. U pacjentów po urazach wczesne stosowanie produktów krwiopochodnych wiąże się z poprawą przeżycia^15,16. Aby przedłużyć okres przydatności do spożycia, coraz częściej bada się produkty płytkowe przechowywane w chłodni. Badanie płytek krwi przechowywanych w niskiej temperaturze wykazuje zwiększoną aktywność hemostatyczną, a także bezpieczeństwo po przetoczeniu po urazie^17,18.

Ewolucja resuscytacji płytek krwi przechowywanej w zimnej temperaturze podkreśla potrzebę dodatkowych badań, aby zrozumieć najbardziej skuteczny produkt płytkowy dostępny w leczeniu urazów. Jednak tradycyjne testy funkcji płytek krwi są często nadmiernie lub niedostatecznie nasilone w celu wykrycia dysfunkcji, występującej zarówno u pacjenta po urazie otrzymującego terapeutyczną transfuzję płytek krwi, jak i w samym przetoczonym produkcie, widocznym w zmianach spichrzających płytki krwi. Określenie pochodzenia dysfunkcji może być trudne, biorąc pod uwagę ograniczenia w obecnych testach funkcji płytek krwi, w tym statyczny charakter większości tych testów. Dlatego też, podczas badania resuscytacji hemostatycznej in vitro, platforma i metody wykrywania zarówno dla populacji biorców, jak i produktów płytek krwi mają kluczowe znaczenie w określaniu optymalnych interwencji terapeutycznych.

Testy mikroprzepływowe oferują profile przepływu i powierzchnie biofideliczne, aby stworzyć fizjologicznie istotny test, na którym można badać płytki krwi. Urządzenia mikroprzepływowe można dostosować do badania określonych patofizjologii lub typów urazów, takich jak nakłucie naczynia krwionośnego¹⁹ lub uszkodzenie śródbłonka²⁰. Urządzenia te składają się zazwyczaj z polidimetylosiloksanu (PDMS) połączonego ze szklanym szkiełkiem mikroskopowym z modyfikacjami powierzchni, takimi jak kolagen, w celu naśladowania podśródbłonka i uszkodzenia tkanek. Wykorzystanie tego typu urządzeń opartych na przepływie może pomóc w prowadzeniu badań nad dysfunkcją płytek krwi związaną z urazami oraz pomóc w badaniu optymalnych metod medycyny transfuzjologicznej w celu złagodzenia dysfunkcji płytek krwi. Strategie te mogą pomóc w wyjaśnieniu istniejącego zamieszania co do znaczenia statycznych testów płytek krwi, takich jak aggregometria, u pacjenta z urazem mózgu.

Protocol

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji. Uzyskano zgodę Biura Ochrony Badań Naukowych Uniwersytetu w Pittsburghu i uzyskano świadomą zgodę od zdrowych ochotników.

1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego

1. Aby wytworzyć część urządzenia PDMS, należy przygotować formę wzorcową przy użyciu mosiądzu za pomocą mikroobróbki sterowanej numerycznie (CNC).
   UWAGA: W zależności od wymiarów kanału, do stworzenia formy wzorcowej można zastosować techniki fotolitografii. Urządzenie używane w tym protokole obejmuje osiem równoległych kanałów poddanych mikroobróbce maszynowej o szerokości około 480 μm, wysokości 140 μm na wlocie i wylocie urządzenia oraz 40 μm wysokości na zwężeniu urządzenia, z długością rampy do/z obszaru zwężenia wynoszącą około 0,3 mm. Długości kanałów wynoszą około 6 mm.
2. Po uzyskaniu formy wzorcowej wlej bazę z elastomeru silikonowego (uzyskaną z zestawu elastomerów) do naczynia wagowego. Dodaj utwardzacz silikonowy (uzyskany z zestawu elastomerów), który ułatwia sieciowanie łańcuchów polimeru silikonowego w celu przekształcenia ciekłego PDMS w trwałe i elastyczne ciało stałe, w stosunku 10:1 (środek bazowy) i dobrze wymieszaj mieszaninę.
3. Umieść formę na szalce Petriego i wlej nieutwardzony PDMS na formę. Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym na 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków.
4. Zakończ utwardzanie PDMS w formie głównej, umieszczając ją w piekarniku ustawionym na 70 °C na 90 minut.
5. Po całkowitym utwardzeniu PDMS wytnij odlew mikroprzepływowy za pomocą żyletki lub skalpela. Przebij otwory na krawędziach kanałów (o średnicy 1,5 mm po obu stronach).
6. Za pomocą taśmy laboratoryjnej oczyść powierzchnię szkiełka podstawowego i wytrawioną stronę odlewu mikroprzepływowego. W razie potrzeby użyj sprężonego powietrza, aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia.
7. Umieść szkiełko podstawowe i odlew mikroprzepływowy wytrawioną stroną do góry w urządzeniu do czyszczenia plazmowego. Uruchom pompę próżniową, uszczelnij komorę i włącz myjkę plazmową na wysokie ustawienie. Pozostaw szkiełko i PDMS w myjce plazmowej na 30 sekund, a następnie wyłącz myjkę plazmową i usuń odkurzacz.
8. Zwiąż ze sobą odlew oczyszczony plazmowo i szkiełko podstawowe, delikatnie dociskając do siebie boki, które były skierowane do góry w czyszczarce plazmowej. Następnie umieść urządzenie mikroprzepływowe w piekarniku/płycie grzejnej w temperaturze 70 °C na 10 minut.
   UWAGA: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku podczas łączenia odlewu i szkiełka szkiełkowego, ponieważ może to prowadzić do utraty morfologii kanału.
9. Przepłucz każdą komorę 10-30 μl 70% etanolu w celu sterylizacji i pozostaw urządzenie mikroprzepływowe do wyschnięcia na płycie grzejnej o temperaturze 70 °C.
   UWAGA: Urządzenia powinny być wykonane co najmniej 24 godziny wcześniej, ale mogą być wykonane z tygodniowym lub miesięcznym wyprzedzeniem. Urządzenia należy przechowywać w hermetycznym pojemniku lub przykrytej szalce Petriego w temperaturze pokojowej.
10. Dzień przed eksperymentami z urządzeniem mikroprzepływowym należy ponownie przepłukać każdą komorę 10-30 μl 70% etanolu w celu sterylizacji i pozostawić urządzenie mikroprzepływowe do wyschnięcia na płycie grzejnej o temperaturze 70 °C.
11. Pokryj komorę odczynnikiem kolagenu fibrylarnego koni typu 1 (1 mg / ml), rozcieńczonym w 0,9% NaCl w stosunku objętościowym 1:5 przez wyznaczony wylot do wyznaczonego wlotu. Upewnij się, że kierunkowość w eksperymencie jest zachowana. Przechowuj urządzenie w ciepłym, wilgotnym, zamkniętym pojemniku, aby zapobiec parowaniu powlekanego kolagenu w kanale.
12. Po 1 godzinie spłukać solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby wypłukać roztwór kolagenu. Spłukać w kierunku przeciwnym do powłoki. Gdy nie jest używane, przechowuj urządzenie w ciepłym, wilgotnym, zamkniętym pojemniku.

2. Przygotowanie próbki krwi

1. Pobrać cytrynowaną próbkę krwi pełnej przez nakłucie żyły. Inkubować cytrynowaną krew pełną z roztworem blokującym receptor FC (1:600).
   UWAGA: Próbki krwi są przechowywane w temperaturze pokojowej przed i w trakcie eksperymentów.
2. Inkubować cytrynowaną krew pełną z przeciwciałem CD41 sprzężonym z fluorescencją (przy użyciu wybranego fluoroforu) (1:600). Bejcować przez 30 minut na bujaku nutującym.
3. Jako pozytywną kontrolę hamowania płytek krwi dodać Ticagrelor, antagonistę receptora P2Y12 odtworzonego w roztworze 30% w/v 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryny (HP-β-CD) w PBS.
   UWAGA: Przed eksperymentem należy przygotować zapasy tikagreloru do 6,4 mM, a przed eksperymentem można przeprowadzić dalsze rozcieńczanie zapasów tikagreloru w roztworze HP-β-CD (30% HP-β-CD rozpuszczone w PBS) (zaleca się 1000-krotne stężenie podstawowe).
4. Inkubować cytrynowaną próbkę z tikagrelorem (końcowe stężenie do 6,4 μM) przez 30 minut, aby zaobserwować zahamowanie płytek krwi.
5. W przypadku mieszania produktu krwiopochodnego z cytrynowaną próbką, należy wybarwić produkt krwiopochodny roztworem blokującym receptor FC (1:600) i fluorescencyjnie sprzężonym (przy użyciu oddzielnego i odrębnego fluoroforu z cytrynowaną próbką) przeciwciałem CD41 (1:600).
   1. Zmieszać objętościowy odpowiednik jednostek przetopionego produktu z próbką cytrynową. Na przykład, aby zasymulować 2 jednostki produktów płytkowych przetoczonych osobie z krwotokiem (około 250 ml na produkt na całkowitą objętość krwi 5000 ml), wymieszaj 100 μl produktu krwiopochodnego z 1000 μl próbki krwi cytrynowej.
6. Bezpośrednio przed eksperymentem przefiltruj próbkę krwi przez filtr 40 μm do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.

3. Badanie funkcji płytek krwi pod przepływem (Metoda 1)

1. Włącz mikroskop i powiązane oprogramowanie.
2. Ustawić poziom pompy strzykawkowej do pobierania ze stolikiem mikroskopu. Dostosuj ustawienia pompy strzykawkowej.
   1. Oblicz objętościowe natężenie przepływu (Q) dla pożądanej średniej szybkości ścinania ścianki (γ) wynoszącej 3,500 ^s-1 w obszarze zwężenia kanału, korzystając z równań (1) i (2)²¹.
      (1)
      (2)
      Gdzie A jest polem przekroju poprzecznego kanału, P jest obwodem zwilżonym, λ jest współczynnikiem kształtu, b jest krótszym bokiem prostokąta (wysokość), a a jest dłuższym bokiem prostokąta (szerokość).
      UWAGA: Wartość 3,500 ^s-1 jest wybierana ze względu na krytyczne ścinanie VWF i mieści się w reżimie tętniczym^7,22,23.
3. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu. Przyklej krawędzie urządzenia mikroprzepływowego do stolika, aby uniknąć ruchu. Upewnij się, że wylot jest skierowany w stronę tylnej części mikroskopu.
4. Podłącz jeden koniec rurki ID 1/16" (o długości około 30 cm) do złącza kolankowego, a drugi koniec do strzykawki 10 ml ze złączem ID 1/16".
5. Napełnić strzykawkę sterylnym PBS i podłączyć ją do pompy strzykawkowej.
6. Umieść złącze kolankowe w wylocie urządzenia.
7. Przygotuj przewody dopływowe o długości około 10 cm z łącznikiem kolankowym na jednym końcu i nacięciem kątowym na drugim końcu.
8. Podłącz złącze kolankowe wlotowe do wlotu urządzenia.
9. Umieść przewód dolotowy w probówce do mikrowirówki na odpadach na uchwycie kątowym.
10. Użyj obiektywu 10x dla kanałów o szerokości około 500 μm i skup się na krawędziach kanału urządzenia mikroprzepływowego.
11. Zalać przewody PBS i oczyścić kanał z wszelkich PDMS/zanieczyszczeń, ręcznie przesuwając pompę strzykawkową. Pamiętaj, aby sprawdzić w pobliżu wlotu i wylotu kanału.
12. Otwórz zapisane ustawienia przechwytywania obrazu lub utwórz procedurę przechwytywania obrazu dla obrazów szeregów czasowych rejestrowanych co 1–2 s z kanałem jasnego pola i kanałami fluorescencyjnymi odpowiadającymi fluorescencyjnym przeciwciałom CD41 użytym w próbce krwi.
13. Pobrać przefiltrowaną próbkę krwi z cytrynianu i wymieszać, pipetując w górę i w dół tuż przed eksperymentem. Umieścić próbkę na ustawionym pod kątem uchwycie mikrowirówki.
14. Umieścić przewód wlotowy w próbce.
15. Rozpocznij nagrywanie przechwytywanego obrazu.
16. Powoli wyjmować strzykawkę, aby wypełnić martwą objętość w rurce. Gdy krew dotrze do kanału, natychmiast naciśnij przycisk odtwarzania na pompie strzykawkowej, aby wznowić przepływ z żądaną szybkością ścinania.
17. W razie potrzeby dostosuj ostrość.
18. Eksperyment należy przeprowadzać do momentu, gdy płytki krwi całkowicie zamkną obszar zwężenia urządzenia mikroprzepływowego lub do osiągnięcia eksperymentalnego punktu końcowego (tj. 10 minut).
19. Upewnij się, że rurka wlotowa jest zanurzona w próbce krwi na czas trwania eksperymentu.
20. Po zakończeniu eksperymentu przerwij przechwytywanie obrazu i zatrzymaj pompę strzykawkową. Zapisz przechwycony obraz.
21. Wyjmij kolanko wlotowe i opróżnij zawartość rurki do stożka odpływowego. Opróżnij zawartość strzykawki i przewodów wylotowych do stożkowego pojemnika.
22. W razie potrzeby wymień złącza wlotowe i wylotowe oraz rurki dla kolejnych próbek.

4. Badanie funkcji płytek krwi pod przepływem z próbkami o małej objętości (poniżej 1 ml) (Metoda 2)

1. Powtórz kroki od 1.1 do 1.4 jak powyżej.
2. Przebij wylot o średnicy 1.5 mm i wlot o średnicy 3 mm na krawędziach kanałów.
3. Powtórz kroki od 1.6 do 3.6 jak powyżej.
4. Użyj obiektywu 10x dla kanałów o szerokości około 500 μm i skup się na krawędziach kanału urządzenia mikroprzepływowego.
5. Oczyść kanał z wszelkich PDMS/zanieczyszczeń, ręcznie przesuwając pompę strzykawkową i odprowadzając płyn dostępowy za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Usuń wszelkie zanieczyszczenia za pomocą taśmy laboratoryjnej na górze urządzenia mikroprzepływowego.
6. Ręcznie przesuń pompę, aby napełnić zbiornik wlotowy 3 mm PBS.
7. Otwórz zapisane ustawienia przechwytywania obrazu lub utwórz procedurę przechwytywania obrazu dla obrazów szeregów czasowych rejestrowanych co 1–2 s z kanałem jasnego pola i kanałami fluorescencyjnymi odpowiadającymi fluorescencyjnym przeciwciałom CD41 użytym w próbce krwi.
8. Rozpocznij pobieranie na pompie strzykawkowej (ręcznie lub z ustawioną prędkością), a gdy PBS zacznie wchodzić do kanału, a linia napełniania w zbiorniku zacznie spadać, wstrzymaj pobieranie na pompie.
9. Usunąć nadmiar PBS ze zbiornika za pomocą pipety.
10. Rozpocznij przechwytywanie obrazu.
11. Pobrać pipetę próbki krwi do zbiornika (około 40 μl) i natychmiast uruchomić strzykawkę do pobierania wody. Upewnij się, że przepływ zaczyna się.
    UWAGA: Jeśli silnik pompy strzykawkowej do pobierania nie został zalany w kroku 4.8, przepływ nie rozpocznie się natychmiast i eksperyment należy powtórzyć.
12. Uzupełnij zbiornik krwi na czas eksperymentu, upewniając się, że żadne kieszenie powietrzne nie dostają się do kanału.
13. Eksperyment należy przeprowadzać do momentu, gdy płytki krwi całkowicie zamkną obszar zwężenia urządzenia mikroprzepływowego lub do osiągnięcia eksperymentalnego punktu końcowego (tj. 10 minut).
14. Po zakończeniu eksperymentu przerwij przechwytywanie obrazu i zatrzymaj pompę strzykawkową. Zapisz przechwycony obraz.
15. Usunąć nadmiar krwi ze zbiornika za pomocą pipetowania. Opróżnij zawartość rurki wysyłkowej do stożkowej rurki odpływowej.
16. W razie potrzeby wymień złącza i rurki dla kolejnych próbek.

5. Dekontaminacja

1. Oczyść przewody wlotowe i wylotowe z krwi, spłukując je 10% roztworem wybielacza.
2. Jeśli wszystkie kanały w urządzeniu mikroprzepływowym zostały użyte, wyrzuć urządzenie do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie Sharps.
   UWAGA: Wszystkie odpady biologiczne należy odpowiednio utylizować wraz z odpadami stanowiącymi zagrożenie biologiczne.

6. Analiza obrazu

1. Eksportuj obrazy z eksperymentów kinetycznych za pomocą oprogramowania, klikając Plik | Eksport/Import | Eksport.
2. Wybierz następujące parametry: typ pliku: Tagged Image File Format (TIFF); kompresja: LZW; zaznacz opcję Oryginalne dane i Przesuń piksel; odznacz opcję Zastosuj krzywą wyświetlania i kolor kanału; zaznacz opcję Zdefiniuj podzbiór (Region, Region prostokąta i wybierz obszar kanału z pomiarem zachowania szerokości i wysokości między warunkami). Eksportuj do żądanego folderu i zaznacz opcję Utwórz folder.
3. Zwróć uwagę na poniższe wartości eksperymentalne w oprogramowaniu: ramka startowa, gdy krew dostanie się do kanału; liczba klatek na sekundę (informacje, szeregi czasowe).
4. Zmierz znormalizowaną średnią intensywność fluorescencji każdej klatki w eksperymencie, wykorzystując kod Matlab dostarczony jako plik uzupełniający 1, zmieniając następujące dane wejściowe dla każdego eksperymentu: klatka początkowa/końcowa na podstawie długości eksperymentu (upewnij się, że długość eksperymentu jest zachowana między warunkami); nazwa eksperymentu/nazwa folderu; przycinanie parametrów X, Y, H i W. Uruchom kod raz dla kanału fluorescencyjnego płytek krwi biorcy i raz dla kanału fluorescencyjnego płytek krwi produktu. Raportuj znormalizowane wartości MFI (kolumna 2) i znormalizowane wartości AUC (znormalizowane do klatki początkowej). Odejmij wartość długości eksperymentu od znormalizowanej wartości AUC.

Results

Eksperymenty mikroprzepływowe następujące po użyciu tej metody powinny wykazać tworzenie się skrzeplin bogatych w płytki krwi w obszarze zwężenia kanału przepływu (Rysunek 1). Rysunek 1A ilustruje reprezentatywne wyniki, gdzie funkcjonalne płytki krwi utworzyły skrzeplinę w obszarze zwężonym kanału, aby zablokować przepływ krwi przez kanał. Krzywe średniej intensywności fluorescencji (MFI) obrazów kinetycznych wykonanych w czasie trwania eksperymentu ilustrują fazę opóźnienia, wzrostu i plateau włączenia płytek krwi do rosnącej skrzepliny (Rysunek 2A,C). Rosnące stężenie antagonisty P2Y12, Tikagreloru, zmniejsza MFI płytek krwi, a także obliczoną powierzchnię pod krzywą (AUC) krzywych MFI (Rysunek 2B,D). Potrzebne są dłuższe czasy inkubacji (30 minut w porównaniu do 5 minut), aby zaobserwować wyraźną dysfunkcję płytek krwi, zgodnie z bardziej wyraźną zależnością dawka-odpowiedź z wykorzystaniem agregometrii impedancji krwi pełnej po 30-minutowej inkubacji tikagreloru w porównaniu z 5-minutową inkubacją (rysunek uzupełniający S1). W różnych warunkach jazdy zaobserwowano podobne zależne od czasu efekty hamowania P2Y12 w modelu mikroprzepływowym (rysunek uzupełniający S2).

Wizualizacja dwóch populacji płytek krwi w symulowanej metodzie resuscytacji hemostatycznej ilustruje włączenie obu populacji płytek krwi do skrzepliny (Rysunek 3A). Włączenie obu populacji płytek krwi do odpowiadającego im sygnału fluorescencyjnego można określić ilościowo kinetycznie w czasie trwania eksperymentu za pomocą pomiarów MFI (Rysunek 3B). Bardziej strome zbocza w fazie wzrostu, a także zwiększone pomiary MFI w punkcie końcowym wykazują zwiększoną funkcjonalność płytek krwi i potencjał hemostatyczny, co można zaobserwować w kwantyfikacji płytek krwi, gdy próbka krwi została wywołana dysfunkcją płytek krwi poprzez hamowanie P2Y12, a następnie resuscytacja symulowana przez zmieszanie świeżej autologicznej krwi pełnej w stosunku objętościowym 1:10 wybarwionej wyraźnym fluoroforem płytkowym. W przypadku autologicznego mieszania krwi pełnej więcej płytek krwi zostało włączonych z symulowanego przetoczonego produktu w porównaniu z produktem z płytkami krwi aferezy w temperaturze pokojowej przechowywania w 5. dniu, który wykazał minimalne włączenie produktu do tworzącej się skrzepliny. Mieszanie produktów płytkowych w temperaturze pokojowej w dniu 5 wykazało również mniejsze wprowadzanie płytek krwi biorcy w porównaniu z mieszaniem ze świeżą autologiczną krwią pełną (Ryc. 3B).

Rysunek 1: Przedstawienie badania funkcji płytek krwi za pomocą mikrofluidyki. (A) Pokazano schematyczną mikroprzepływową konfigurację eksperymentalną do badania funkcji płytek krwi przy użyciu próbek krwi o małej objętości, w tym pompę strzykawkową do pobierania krwi przez komorę zwężonego przepływu, co pozwala na przechwytywanie obrazu w czasie rzeczywistym. (B) Pokazano widok z boku komory przepływu zwężkowego, w tym powierzchnię pokrytą kolagenem, na której płytki krwi będą przylegać, aktywować i agregować, powodując wzrost skrzepliny w obszarze zwężenia. (C) Przechwytywanie w czasie rzeczywistym próbki krwi cytrynowanej pod przepływem w zwężonym kanale mikroprzepływowym (3500 ^s-1) i rosnącej skrzepliny utworzonej przez 300 s. Podziałka = 200 μm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zmniejszone zmiany fałdowania płytek krwi i obszar pod krzywą po 30 minutach inkubacji z antagonistą P2Y12 Ticagrelorem. (A) Inkubacja z antagonistą P2Y12 tylko przez 5 minut wykazuje nieznacznie wydłużone fazy opóźnienia krzywych MFI i (B) niewielkie spadki AUC MFI. (C) Inkubacja przez 30 minut z antagonistą P2Y12 powoduje wydłużenie faz opóźnienia i zmniejszenie wartości MFI punktu końcowego, a także (D) bardziej niezawodną dysfunkcję wykazaną za pomocą AUC MIF. Poszczególne punkty danych reprezentują kontrpróby biologiczne i pokazane jest średnie ± odchylenie standardowe. Skróty: MFI = średnia intensywność fluorescencji; AUC = pole pod krzywą; HP-β-CD = 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Mieszanie produktu krwionośnego z koagulopatycznym hamowaniem P2Y12 w próbce biorcy, symulując dysfunkcję płytek krwi pacjenta, w komorze mikroprzepływowej. (A) Jednostka płytek krwi aferezy (osocze, 7. dzień przechowywania) (CD41 w kolorze błękitnym) zmieszana w stosunku 1:10 z krwią cytrynianą wstępnie inkubowaną z tikagrelorem 0,8 μM przez 30 minut (CD41 na czerwono). (B) Reprezentatywne znormalizowane średnie krzywe intensywności fluorescencji próbki krwi biorcy otrzymującej jednostkę płytek krwi aferezy (5. dzień przechowywania) lub autologiczną świeżą krew pełną (stosunek 1:10) wraz z kinetyką płytek krwi biorcy w czasie. Krew cytrynowaną biorcy inkubowano wstępnie z tikagrelorem 0,8 μM przez 30 minut przed zmieszaniem z produktami krwiopochodnymi. (C) Reprezentatywny obraz stosu z modyfikowanego urządzenia połączonego ze szkiełkiem nakrywkowym do mikroskopii konfokalnej. Produkt płytek krwi aferezy zmieszano z próbką krwi trombocytopenicznej w stosunku objętościowym 1:5 (produkt:krew) wraz z przeciwciałem przeciwko czynnikowi von Willebranda (1:600). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kod Matlaba do analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1: Zależność od czasu agresji P2Y12 przez inhibicję P2Y12 z Tikagrelorem. Inkubacja przez 30 minut powoduje wyraźniejszą zależność między dawką a reakcją w porównaniu z 5 minutami. Roztwory nośników i leków stosowano w stężeniu 0,1% v/v. Poszczególne punkty danych reprezentują kontrpróby biologiczne i pokazane jest średnie ± odchylenie standardowe. Skróty: AUC = obszar pod krzywą; HP-β-CD = 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2:Zależne od czasu hamowanie P2Y12 za pomocą tikagreloru w mikroprzepływowym modelu funkcji płytek krwi. Reprezentatywne krzywe MFI i wartości pola pod krzywą dla kontrprób technicznych od indywidualnego zdrowego dawcy przedstawiono przy użyciu nośnika etanolu (1% v/v) wykorzystywanego do oznaczania rozpuszczalności leku. Skróty: MFI = średnia intensywność fluorescencji; AUC = obszar pod krzywą. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Powyższy protokół zawiera kilka krytycznych kroków w celu zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności eksperymentów. Po pierwsze, należy dokładnie rozważyć przeciwciała fluorescencyjne. Przeciwciała stosowane do wykrywania płytek krwi w próbce nie powinny blokować funkcji receptora płytek krwi glikoproteiny Ib (GPIb). Dopasowanie partii, gdy tylko jest to możliwe między eksperymentami, ma również kluczowe znaczenie dla zapewnienia odtwarzalności sygnału fluorescencyjnego. Kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole jest stosowanie sterylnych materiałów eksploatacyjnych i roztworów oraz przefiltrowanych próbek, gdy tylko jest to możliwe. Filtrowanie próbek krwi bezpośrednio przed eksperymentem zapobiegnie blokowaniu przepływu przez zanieczyszczenia lub grudki płytek krwi większe niż wymiary kanału, co jest kolejnym krytycznym parametrem, który należy zachować między eksperymentami. Ponadto próbki krwi powinny zostać przebadane w ciągu 4 godzin od pobrania, zgodnie z opisem w okólniku informacyjnym dotyczącym stosowania ludzkiej krwi i składników krwi przygotowanym przez AABB, Amerykański Czerwony Krzyż, Amerykańskie Centra Krwi i Program Krwi Sił Zbrojnych, z wyjątkiem badań zmian w przechowywaniu produktów krwiopochodnych.

W tym protokole można rozważyć modyfikacje, takie jak przyklejenie PDMS do szkiełka nakrywkowego do mikroskopii konfokalnej, co zilustrowano na rysunku 3C. Jeśli to konieczne, przed obrazowaniem, roztwór utrwalający może być przeprowadzony przez kanały i przemyty PBS w celu przechowywania przed obrazowaniem. Ponadto, chociaż powtarzalne wymiary kanału są kluczem do zapewnienia zachowanych szybkości ścinania między warunkami, wysokość obszaru zwężenia może być modyfikowana, ale będzie to miało bezpośredni wpływ na czas tworzenia się skrzepliny, nawet jeśli są zgodne z szybkościami ścinania. Ponieważ większe wymiary kanału będą wymagały więcej czasu, aby osiągnąć znaczne tworzenie skrzepliny, konieczna będzie większa objętość próbki. Podczas rozwiązywania problemów z tym protokołem należy wziąć pod uwagę strategię powlekania. Konkretny rodzaj kolagenu, czas, rozcieńczenie i warunki przechowywania to czynniki, które mogą wpływać na powłokę powierzchniową. Chociaż protokół ten został zwalidowany dla tego konkretnego odczynnika kolagenowego (tabela materiałów), można rozważyć alternatywy kolagenu, które mogą niezawodnie przylegać do powierzchni urządzenia i przyczepność zwalidowaną za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub innych środków, które były wcześniej z powodzeniem stosowane przez inne grupy²⁴.

Potencjalnym ograniczeniem tego protokołu jest brak bezpośredniej odpowiedzi śródbłonka. Można jednak wprowadzić strategie powlekania i modyfikacje w celu uwzględnienia badania funkcji płytek krwi w odpowiedzi na uszkodzenie śródbłonka. Na przykład czynniki zapalne, które komórki śródbłonka wydzielają w odpowiedzi na uraz, mogą być modyfikowane w strategii powlekania tego protokołu lub dodawane egzogennie do badanej próbki krwi. Dodanie tych czynników bez złożoności celularyzacji pozwoliłoby na ukierunkowane podejście do badania wpływu śródbłonka na czynność płytek krwi. W podobny sposób, osocze pacjenta z chorobą lub zdrowym stanem kontrolnym może zostać wzbogacone do systemu w celu przetestowania wpływu rozpuszczalnych w osoczu mediatorów na funkcję płytek krwi.

Badanie funkcji płytek krwi pod przepływem zgodnie z tym protokołem może ułatwić badanie koagulopatii wywołanej traumą i metod medycyny transfuzjologicznej w urazach. Obecne badania funkcji płytek krwi są często nadmiernie lub niedostatecznie nasilone, aby zobaczyć dysfunkcyjną odpowiedź u pacjenta po urazie. Metoda ta pozwala na elastyczność i modyfikacje projektu w celu obserwacji funkcji płytek krwi w próbkach pacjentów po urazach, nawet przy ograniczeniach objętościowych, a także symulacji dysfunkcji płytek krwi w celu oceny interwencji terapeutycznych. Poza pacjentem po urazie, metoda ta może być rozważana u pacjentek z krwotokiem poporodowym, pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych lub pacjentek z rakiem w celu oceny funkcjonalności płytek krwi i potencjalnych interwencji terapeutycznych. Co ważne, metoda ta uwzględnia dynamikę przepływu, która ma kluczowe znaczenie dla mechanizmów tworzenia czopów płytkowych i funkcji hemostatycznej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Odsysacze próżniowe	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Cyfrowe mieszadło z płytą grzejną	Fisher Scientific FB30786161
Mikser nutujący	Fischer Scientific	88-861-043
Waga wagi OHAUS Scout	Uline	H-5852
Piekarnik	Fisher Scientific	15-103-0520
Myjka plazmowa	Harrick	PDC-32G (115V)
Pompa strzykawkowa (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Aparat Harvard	883015
Oprogramowanie Zen 3.4	Zeiss	Blue edition
< mocny>Materiał< / mocny>
1/16 cala ID - Kolczaste łączniki łokciowe	Qosina	11691
10 ml strzykawka	Fischer Scientific	14-955-459
2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryna	Cayman Chemicals	16169	30% rozpuszczona w buforowanej fosforanie sól
fizjologiczna 40-mikronowe filtry	Fischer Scientific
Przeciwciało CD41	Novus Biologicals	NB100-2614	Stosunek 1:600 w
odczynniku kolagenowym Chrono-Par	Chrono Log Corporation	385	Stosunek 1:5 w 0,9% soli fizjologicznej
Mikroskopia elektronowa Sciences Miltex Dziurkacz do biopsji z tłokiem, 3,0 mm	Probówki Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap SafeLock, 1,5 ml	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121 uncji Clorox Wybielacz bakteriobójczy	Fischer Scientific 50371500
etanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Sprężony gaz	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	Stosunek 1:600 we krwi pełnej
LevGo smartSpatula Jednorazowa szpatułka polipropylenowa	Fisher Scientific	18-001-017
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-550-A3
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Gibco	10010-023
Bezpieczny skalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Milipore	soli	567442	0,90%
Polistyren Sartorius Łodzie wagowe	Fisher Scientific	13-735-744
Szkiełka nakrywkowe Superslip - Superslip nr 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Fisher Scientific	NC9285739	Polidimetylosiloksan (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Przezroczysta rurka PVC Tygon 1/16" ID, 1/8" OD, 50 stóp długości	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-obrabiany mosiądz 360 Pręt	McMaster-Carr	8954K721	Do produkcji form mistrzowskich
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Wielokrotnego użytku dziurkacz do biopsji, 1,5 mm	Fisher Scientific	NC1215626