Oznaczanie stabilności ludzkiego enzymu deaminazy adenozyny 1 w surowicy

Podsumowanie

W tym artykule szczegółowo opisujemy metody charakteryzujące zdolność enzymu do zachowania funkcji podczas inkubacji w temperaturze 37 °C w ludzkiej surowicy, co jest farmakologiczną właściwością określaną jako stabilność jego surowicy. Zdolność ta może być kluczowym czynnikiem w przewidywaniu profilu farmakokinetycznego enzymu i jego przydatności do zastosowania terapeutycznego.

Streszczenie

Pojęcie stabilności enzymu jest zazwyczaj używane w odniesieniu do termostabilności enzymu - jego zdolności do zachowywania struktury i aktywności wraz ze wzrostem temperatury. W przypadku enzymu terapeutycznego kluczowe mogą być również inne miary stabilności, w szczególności jego zdolność do zachowania funkcji w ludzkiej surowicy w temperaturze 37 °C, którą nazywamy stabilnością surowicy. W tym miejscu opisujemy test in vitro w celu oceny stabilności surowicy enzymu deaminazy adenozynowej I (HsADA1) typu dzikiego przy użyciu procedury mikropłytki opartej na absorbancji. W szczególności manuskrypt ten opisuje przygotowanie i odczynników, metodę organizowania komonetyzacji HsADA1 w surowicy, metodę analizy próbek testowych za pomocą czytnika mikropłytek oraz towarzyszącą analizę w celu określenia frakcji aktywności, którą enzym HsADA1 zachowuje w surowicy w funkcji czasu. Dalej omawiamy rozważania dotyczące dostosowania tego protokołu do innych enzymów, na przykładzie enzymu kynureninazy Homo sapiens, aby pomóc w adaptacji protokołu do innych enzymów, w przypadku których stabilność surowicy jest interesująca.

Wprowadzenie

Poniższa metoda pozwala użytkownikowi ilościowo ocenić zdolność enzymu do zachowania swojej aktywności po wystawieniu na warunki, które naśladują to, co napotka po wstrzyknięciu dożylnym. Metoda in vitro naśladuje takie warunki in vivo i polega na inkubacji enzymu w zbiorczej surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C oraz analizach zachowania aktywności enzymu w czasie. Zdolność enzymu do utrzymania aktywności w tych warunkach nazywamy jego stabilnością w surowicy, a metoda analizy aktywności enzymu wykorzystuje różnice w absorbancji między substratem enzymu a otrzymanym produktem. Koncepcja stabilności surowicy nie jest specyficzna tylko dla enzymu i została zastosowana również do kilku innych metod leczenia. Na przykład stabilność surowicy aptamerów RNA ukierunkowanych na białka kolców COVID została wcześniej oceniona poprzez monitorowanie ich degradacji po inkubacji za pomocą płodu cielęcego surowica¹. Peptydy przeciwbakteryjne zostały również ocenione pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu bakterii po inkubacji z pulą surowicy ludzkiej².

HsADA1 to enzym, który katalizuje przemianę adenozyny lub 2-deoksyadenozyny odpowiednio w inozynę lub 2-deoksyinozynę³. Adenozyna ma pik absorpcji 260 nm, podczas gdy inozyna wchłania się najsilniej przy 250 nm⁴. To przesunięcie pików absorpcji można wykryć na czytniku mikropłytek poprzez zmniejszenie intensywności absorpcji przy 260 nm, gdy HsADA1 jest dodawany do adenozyny. Enzym HsADA1 ma ważne implikacje w organizmie człowieka, a jego niedobór powoduje ciężki złożony niedobór odporności (ADA-SCID)⁵. Bydlęcy homolog HsADA1, BtADA1, może być wykorzystany jako enzymatyczny środek zastępczy w leczeniu ADA-SCID, a wcześniej wykazaliśmy, że HsADA1 typu dzikiego traci swoją aktywność, gdy jest inkubowany z połączoną surowicą ludzką, potencjalnie utrudniając jego stosowanie jako terapeutycznej klasy 6. Dlatego wybraliśmy enzym HsADA1 typu dzikiego, aby zademonstrować procedurę określania stabilności enzymu w surowicy. Szczegółowa metoda oczyszczania HsADA1 została opisana wcześniej⁶.

W poniższym protokole (opisanym w Rysunek 1), pokazujemy, jak współinkubować HsADA1 typu dzikiego w zbiorczej surowicy ludzkiej w temperaturze 37 °C. W tym czasie próbki testowe są pobierane w określonych punktach czasowych i zamrażane w celu przyszłej analizy. Po pobraniu wszystkich próbek przeprowadza się test mikropłytki, w którym każda próbka jest łączona z substratem, przy czym wynikający spadek absorbancji jest korelacją dla zachowanej aktywności enzymu. Przedstawiono reprezentatywne wyniki ilustrujące stabilność HsADA1 w surowicy, a ponieważ wskaźnik ten może być istotny dla określenia potencjalnej wartości terapeutycznej innych enzymów, omawiamy również rozważania dotyczące dostosowania tego protokołu do zmodyfikowanego enzymu kynureninazy Homo sapiens (HsKYNazy) i wszelkich enzymów bardziej ogólnie. HsKYNaza jest enzymem biorącym udział w metabolizmie tryptofanu i jest zdolna do rozkładu produktów ubocznych tryptofanu kinureniny i hydroksy-kinureniny (OH-Kyn) odpowiednio do kwasu antranilowego i kwasu hydroksy-antranilowego (OH-AA). Modulacja metabolizmu tryptofanu za pośrednictwem enzymów może mieć znaczenie terapeutyczne⁷.

Protokół

1. Inkubacja surowicy

1. Przygotować 10-krotny roztwór zapasowy HsADA1 w 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) o stężeniu końcowym 10 µM. Odmrozić 15 mL alikwot połączonego surowicy ludzkiej i podgrzać do 37 °C. Podgrzać 50 mL alikwot 1x PBS do 37 °C.
2. Przygotować mieszaniny do inkubacji enzymu z surowicą, dodając 100 µL 10-krotnego roztworu zapasowego HsADA1 do 900 µL połączonej surowicy ludzkiej w probówce do mikrowirówki o niskim wiązaniu (low-bind), określanej jako mieszanina enzym + surowica. W osobnej probówce low-bind dodać 100 µL 10-krotnego roztworu zapasowego HsADA1 do 900 µL 1x PBS w celu porównania z kontrolą bezsurowiczą, określaną jako mieszanina enzym + 1x PBS. Stężenie końcowe HsADA1 w każdej mieszaninie wyniesie 1 µM.
3. Przygotować dodatkową kontrolę w probówce low-bind, składającą się ze 100 µL 1x PBS zmieszanego z 900 µL połączonej surowicy ludzkiej. Będzie ona służyć jako kontrola bezenzymowa dla mieszaniny enzym + surowica. Dodatkowo przygotować kontrolę składającą się z 1 mL 1x PBS, która będzie służyć jako kontrola bezenzymowa dla mieszaniny enzym + 1x PBS.
4. Odmierzyć 100 µL każdej mieszaniny z kroku 1.2 do osobnych probówek low-bind i rozcieńczyć w stosunku 1:1 za pomocą 100 µL 30% (v/v) glicerolu w 1x PBS. Zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki te będą stanowić punkt czasowy Dzień 0, a stężenie HsADA1 w nich wyniesie 500 nM. Powtórzyć ten krok dla mieszanin kontrolnych bezenzymowych z punktu 1.3. Uszczelnić wszystkie mieszaniny enzymów i kontroli przezroczystą folią i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
5. Po 24 h pobrać 100 µL każdej inkubowanej próbki i rozcieńczyć 1:1 za pomocą 100 µL 30% (v/v) glicerolu w 1x PBS. Zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki te będą stanowić punkt czasowy Dzień 1. Wrócić wszystkie mieszaniny enzymów i kontroli do inkubatora w temperaturze 37 °C. Powtórzyć ten krok w 72 h i 120 h.
   UWAGA: Pobrane alikwoty próbek nie muszą być koniecznie mrożone błyskawicznie. Alternatywnie użytkownik może wykonać analizę na mikropłytce natychmiast po pobraniu każdej próbki, przy czym przy każdym badaniu próbki należy przygotować świeże krzywe wzorcowe i zapasy substratu adenozyny.

2. Analiza w płytkach mikrotitracyjnych

1. Przygotować czytnik mikropłytek, konfigurując protokół pomiaru kinetycznego (Rycina 2) do pomiaru absorbancji przy 260 nm z najkrótszym odstępem czasu pomiaru przez 30 min i rozgrzać czytnik do temperatury zadanej 37 °C.
2. Odmrozić wszystkie zebrane próbki na lodzie. Rozcieńczyć każdą rozmrożoną próbkę w stosunku 1:10, używając 1x PBS wstępnie ogrzanego do 37 °C jako rozcieńczalnika, w probówkach do mikrocentryfugi typu low-bind. Nowe stężenie HsADA1 w tych próbkach wyniesie 50 nM.
3. Przygotować również 10-krotne rozcieńczenie w 1x PBS z kontrolnej próbki surowicy bez enzymu. Dodatkowo przygotować roztwór zapasowy adenozyny 5 mM, dodając 66,8 mg adenozyny do 50 mL 1x PBS. Przygotować rozcieńczenie adenozyny 250 µM, dodając 400 µL roztworu zapasowego adenozyny do 7 600 µL 1x PBS i wstępnie ogrzać go do 37 °C w inkubatorze.
4. Do kompatybilnej z UV mikropłytki 96-dołkowej dodać 160 µL rozcieńczenia adenozyny 250 µM oraz 40 µL każdej rozcieńczonej próbki białka w trzech powtórzeniach, aby uzyskać całkowitą objętość 200 µL. Pozwoli to uzyskać końcowe stężenie adenozyny 200 µM i końcowe stężenie enzymu 10 nM.
5. Powtórzyć rozcieńczanie dla próbek kontrolnych, dodając 40 µL rozcieńczonej surowicy lub kontroli 1x PBS oraz 160 µL rozcieńczenia adenozyny 250 µM w trzech powtórzeniach. Pozwoli to również uzyskać końcowe stężenie adenozyny 200 µM, ale bez enzymu.
   UWAGA: W celu skrócenia całkowitego czasu napełniania może być korzystne najpierw dodać wszystkie rozcieńczone próbki enzymu i kontroli indywidualnie do mikropłytki, a następnie dodać substrat adenozyny za pomocą mikropipety 12-kanałowej. Dodatkowo w tym kroku należy używać płytek przezroczystych dla UV, aby zapobiec zakłócaniu mierzonego sygnału absorbancji przez samą płytkę.
6. Zmierzyć absorbancję każdego dołka przy 260 nm przez 30 min w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

3. Analiza danych z czytnika mikropłytek

1. Wyznacz nachylenie odcinka liniowego danych absorbancji w funkcji czasu dla pierwszych kilku minut pomiarów na płytce mikrotitracyjnej. Dla próbek rozcieńczonych w surowicy odpowiadało to pierwszym ~120 s. Dla próbek rozcieńczonych w 1x PBS odpowiadało to pierwszym ~270 s. Nachylenie to, opisujące spadek wartości absorbancji, będzie miało ujemną wartość liczbową i będzie wyrażone w jednostkach zmiany absorbancji na sekundę (ΔA260/s).
2. Od nachylenia uzyskanego dla danych enzym + surowica odejmij nachylenie kontroli negatywnej składającej się z puli surowicy ludzkiej. Wykonaj tę samą operację dla mieszanin enzym + 1x PBS, odejmując nachylenie kontroli 1x PBS.
3. Znormalizuj wszystkie skorygowane nachylenia względem początkowego nachylenia w czasie t=0 h, aby obliczyć frakcję pozostałej aktywności za pomocą równania 1.
       Równanie 1
4. Przedstaw na wykresie zależność frakcji pozostałej aktywności od czasu.

Wyniki

Rysunki przedstawiają wyniki testu przeprowadzonego z wykorzystaniem HsADA1 typu dzikiego. Rysunek 3A,B ilustruje krzywe spadku absorbancji przy 260 nm próbek pochodzących z mieszanin 1x PBS/surowica-enzym dla HsADA1 typu dzikiego po dodaniu adenozyny. Dane dotyczące tego spadku absorbancji w funkcji czasu są tym, czego użytkownik może oczekiwać po pomyślnym przeprowadzeniu testu na mikropłytce i są podobne do danych absorbancji, które pojawiłyby się po dodaniu odpowiedniej ...

Dyskusja

Protokół ten wykorzystuje zmianę absorbancji, gdy substrat jest przekształcany w produkt w celu zmierzenia aktywności enzymu. W związku z tym podłoże i produkt muszą mieć odrębne profile spektralne. Tak jest w przypadku adenozyny i inozyny, które mają różne profile widmowe i współczynniki ekstynkcji w zakresie 260-265 nm 6,8,12,13. Ten test jest inspirowany kilkoma wcześniejszymi pracami. Kalac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenozyna	Sigma Aldrich	A9251-25G	25 g
			mikropłytek BioTek Synergy HT
Probówki do mikrowirówek Eppendorf LoBind: Białko	Fisher Naukowy	13-698-795	2 ml
glicerolu	Fisher Scientific	G33-4	4 L
HsKYNase66-W102H-T333N	Własne
serum ludzkie, zbiorcze	MP Biomedicals	92931149	100 ml
hydroksy-kinureniny	Cayman Chemicals	27778
Inozyna	TCI	I0037	25 g
PBS, 1x  pH 7,4+/- 0,1	Corning	21-040-CM
5-fosforan pirydoksalu jednowodny, 99%	Thermo Scientifc	228170010	1 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 DOŁKÓW, COC, F-BOTTOM	Greiner Bio
Ludzka deaminaza adenozynowa typu dzikiego 1	we własnym zakresie

Czytnik 655801