Artykuł metodologiczny

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/67237

⸱

11 kwietnia 2025

 ,  , 
1Department of Precision Medicine, Graduate School of Basic Medical Science (GSBMS), Institute for Antimicrobial Resistance Research and Therapeutics, Sungkyunkwan University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) zrewolucjonizowała biologię strukturalną, umożliwiając badanie struktur makromolekularnych w warunkach zbliżonych do rodzimych, zawieszonych w szklistym lodzie. Technika ta pozwala na wizualizację białek i innych biomolekuł w wysokiej rozdzielczości bez konieczności krystalizacji, oferując istotny wgląd w ich funkcję i mechanizm. Ostatnie postępy w analizie pojedynczych cząstek, w połączeniu z ulepszonym przetwarzaniem danych obliczeniowych, sprawiły, że cryo-EM stał się nieodzownym narzędziem we współczesnej biologii strukturalnej. Pomimo rosnącego zastosowania, cryo-EM stoi w obliczu ciągłych wyzwań, które mogą ograniczać jego skuteczność, w szczególności nierównomiernego rozkładu cząstek. Problem ten często prowadzi do słabej rozdzielczości i zmniejszonej dokładności w zrekonstruowanych strukturach białkowych. W tym artykule przedstawiono proste, praktyczne podejście do rozwiązania tego problemu, na przykładzie małego białka szoku cieplnego z Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Metoda optymalizuje przygotowanie próbki w celu zminimalizowania preferencyjnej adsorpcji, zapewniając bardziej jednorodny rozkład cząstek i wyższej jakości struktury krio-EM białek. Technika ta stanowi cenne wskazówki dla badaczy dążących do przezwyciężenia podobnych wyzwań w badaniach strukturalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki najnowszym postępom zarówno w sprzęcie instrumentalnym1,2 i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów3,4,5, kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) stała się popularnym i potężnym narzędziem w nowoczesnej biologii strukturalnej. Pomimo tych przełomowych odkryć, nadal istnieją wąskie gardła w uzyskiwaniu struktur makromolekularnych o wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-EM. Jednym z takich istotnych wyzwań jest nierównomierny rozkład cząstek, w tym zjawisko preferencji orientacji, które obserwuje się głównie na granicy faz powietrze-woda6,7,8,9.

Podczas witryfikacji próbki, niektóre cząsteczki wykazują tendencję do ustawiania się wzdłuż określonych osi na siatce. Prowadzi to do nierównomiernego rozkładu widoków cząstek w końcowym zbiorze danych. Niektóre orientacje mogą być nadreprezentowane, podczas gdy inne są niedostatecznie reprezentowane lub całkowicie nieobecne, co skutkuje niepełnym próbkowaniem całkowitej architektury białka. Regiony białka, które są preferencyjnie zorientowane w kierunku wiązki elektronów, będą bardziej widoczne na mapie gęstości, podczas gdy regiony zorientowane z dala od wiązki mogą być słabo rozdzielone lub całkowicie ich brakować10,11. W związku z tym nierównomierny rozkład cząstek wprowadza potencjalne odchylenia i artefakty do końcowej, zrekonstruowanej struktury trójwymiarowej (3D). Warto zauważyć, że kluczowe elementy strukturalne, takie jak helisy alfa i arkusze beta, mogą ulec przekrzywieniu, łańcuchy aminokwasów lub nukleotydów mogą wydawać się pofragmentowane, a gęstości określonych segmentów białek lub kwasów nukleinowych mogą wykazywać zniekształcenia12. Ostatecznie, te błędne interpretacje stanowią poważne wyzwanie dla dokładnego rozwikłania struktury i funkcji cząsteczek biologicznych.

Różne eksperymentalne podejścia są obecnie stosowane w celu przezwyciężenia takich wyzwań, w tym optymalizacja przygotowania próbek13,14,15, leczenie siatki16,17,18,19,20,21,22, oraz strategia zbierania danych23. W szczególności zaleca się, aby w miarę możliwości zająć się tym wyzwaniem na etapie przygotowania próbki7. Typowe optymalizacje w przygotowaniu próbek obejmują modyfikację składu buforu, wprowadzanie małocząsteczkowych lub makromolekularnych partnerów wiążących, generowanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań krzyżowych i różne detergenty. Dotyczy to również białek błonowych24,25, chociaż detergenty muszą być używane specjalnie do celów oczyszczania i stabilizacji. Wśród nich możliwość dostosowania, opłacalność i powszechna dostępność optymalizacji białkowych sprawiają, że jest to preferowana strategia w większości laboratoriów. Takie podejście pozwala na precyzyjne i natychmiastowe dostosowanie różnych parametrów w celu dopasowania do specyficznych wymagań każdej próbki białka. Dzięki iteracyjnemu doskonaleniu naukowcy mogą systematycznie testować różne warunki buforowe i dostosowywać różne parametry w celu zminimalizowania preferowanych orientacji i poprawy ogólnej jakości danych krio-EM. Proste zmienianie składników bufora białkowego i dostosowywanie ich stężeń wykazało skuteczność w wpływaniu na stabilność białek poprzez modulację ładunku powierzchniowego, co w konsekwencji wpływa na zachowanie białek w ciele szklistym lodu25. Dlatego optymalizacja składu buforu białkowego jest uważana za jedno z najwygodniejszych i najprostszych podejść do rozwiązywania typowych problemów w cryo-EM.

Tutaj sugerowany jest protokół do rozwiązania powszechnej przeszkody w cryo-em - pokonania nierównomiernego rozkładu cząstek. W tym protokole przedstawiono kluczowe procedury przygotowania białek i badań przesiewowych, uzupełnione przygotowaniem siatki, przy użyciu małego białka szoku cieplnego z Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)26 jako studium przypadku (Rysunek 1). Ten sHSP jest natywnie stabilny, ma masę cząsteczkową 16,5 kDa na monomer i składa się w 24-merową klatkę oktaedryczną26,27, co czyni go atrakcyjnym kandydatem do analizy strukturalnej za pomocą cryo-EM. Jednak obserwacja nierównomiernego rozkładu cząstek podczas zbierania danych kriogenicznych nie była przewidziana i okazało się to poważnym wyzwaniem podczas eksperymentów. Ponadto omówiono potencjalne podejścia przydatne dla naukowców zajmujących się podobnymi wyzwaniami, ułatwiając w ten sposób skuteczne wyjaśnienie struktur makromolekularnych za pomocą cryo-EM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Oczyszczanie białka

  1. Indukuj ekspresję rekombinowanego MjsHSP16.5 w E. coli BL21(DE3) i oczyść białko za pomocą kolumny chromatograficznej chelatującej nikiel, jak opisano wcześniej26. Po oczyszczeniu w kolumnie chromatografii wykluczania wielkości (SEC)26, zbadaj czystość białka, ładując 5 μl frakcji pikowych na 12,5% żel SDS-PAGE i wizualizując za pomocą standardowego barwienia na niebiesko Coomassie28 (Rysunek 2).
  2. Zagęścić frakcje puli zawierające MjsHSP16,5 w temperaturze 4 °C do około 65 mg/ml za pomocą filtrów odśrodkowych o masie cząsteczkowej 50 kDa, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Delikatnie pipetować roztwór białka co 5 minut podczas wirowania, aby zapobiec agregacji białek.
  3. Po zagęszczeniu odwirować próbkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów, podzielić supernatant na objętość 50 μl w cienkościennych probówkach do PCR o pojemności 0,2 ml, błyskawicznie zamrozić probówki w ciekłym azocie i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

2. Przygotowanie białka do obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

  1. Rozmrozić dwie zamrożone rurki białkowe na lodzie. Po rozmrożeniu delikatnie wymieszać roztwór, kilkakrotnie przesuwając probówkę, aby zapewnić jednorodność, a następnie odwirować roztwór białka o sile 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów.
  2. Wstrzyknąć supernatant do kolumny SEC i zebrać 0,5 ml frakcji elucyjnej.
  3. Zebrać frakcje elucyjne odpowiadające pikowi wykazującemu najwyższą absorbancję UV przy 280 nm i zmierzyć stężenie białka w tych frakcjach za pomocą testu Bradforda29.
    UWAGA: Aby zapewnić wystarczające stężenie białka w pojedynczej frakcji szczytowej do dalszych zastosowań, konieczne jest załadowanie dużej ilości próbki białka do kolumny SEC przy jednoczesnym zachowaniu zalecanej pojemności kolumny.

3. Wymiana bufora

  1. Przygotować żądany roztwór buforowy (9 mM MOPS-Tris (pH 7,2), 50 mM NaCl i 0,1 mM EDTA), podzielić na zlewki o pojemności 50 ml i utrzymywać zlewki buforowe w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Opierając się na wcześniejszej wiedzy na temat biochemii białka docelowego, przygotuj różne roztwory buforowe o różnym składzie (typy, pH i siła jonowa), takie jak 20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl i 0-5 mM DTT, aby zidentyfikować warunki, które promują optymalną rozpuszczalność, jednorodność i stabilność białek w dalszym przygotowaniu siatki.
  2. Przygotować membranę do dializy zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  3. Pociąć membranę dializacyjną na kawałki o wymiarach 30 mm x 30 mm za pomocą nożyczek. Zrównoważ te błony, inkubując je w wodzie destylowanej lub roztworach buforowych (Rysunek 3A).
  4. Dodać 55 μl roztworu białkowego (około 2,5 mg/ml) do komory z 50-μl guzikami do mikrodializy (Rysunek 3B).
  5. Trzymaj membranę dializacyjną pionowo za pomocą kleszczy i delikatnie dotknij jedną krawędzią membrany o bibułę, aby odsączyć nadmiar płynu (Rysunek 3C). Ostrożnie przykryj przycisk mikrodializy membraną, upewniając się, że do komory mikrodializy nie dostały się pęcherzyki powietrza (Rysunek 3D). Umieść O-ring na membranie dializy. Delikatnie wtocz O-ring w rowek na krawędzi przycisku.
  6. Alternatywna metoda: Umieść O-ring wzdłuż osi koszulki golfowej i ustaw koszulkę golfową do góry nogami na membranie (Rysunek 3E). Delikatnie przesuń O-ring w dół koszulki golfowej, aż zsunie się na krawędź przycisku (Rysunek 3F). Ostrożnie wprowadź O-ring w rowek na krawędzi przycisku (Rysunek 3G).
  7. Zanurz każdy przycisk dializy w oddzielnej zlewce zawierającej bufor docelowy stroną z membraną skierowaną do góry (Rysunek 3H).
  8. Podczas procesu dializy należy utrzymywać zlewki w temperaturze 4 °C. Po 2 godzinach należy zmienić bufor dializacyjny i kontynuować dializę przez noc.
  9. Użyj strzykawki z cienką igłą (np. strzykawki Hamilton lub strzykawki insulinowej), aby ostrożnie przebić membranę i odzyskać roztwór białka z komory mikrodializy (Rysunek 3I). Przechowuj próbkę białka w probówce do mikrowirówki na lodzie do czasu dalszego użycia. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda29.

4. Przygotowanie siatki

  1. Wybierz odpowiedni typ siatki.
    UWAGA: Powszechnie stosuje się amorficzną, dziurawą folię węglową na miedzianym podłożu. Grubość folii węglowej, rozmiar otworu i liczbę oczek należy dobrać na podstawie żądanej grubości lodu. Do przygotowania próbki MjsHSP16.5 użyto siatek pokrytych węglem Holey.
  2. Delikatnie chwyć kratki za krawędzie za pomocą pęsety, aby uniknąć uszkodzenia otworów siatki. Umieść kratki na uchwycie siatki stroną z włókna węglowego skierowaną do góry. Umieść uchwyt siatki w komorze systemu wyładowań jarzeniowych.
  3. Wykonaj wyładowanie jarzeniowe przez 60 s przy 15 mA, aby siatka stała się hydrofilowa. Podczas tego procesu zaleca się zastosowanie ładunku ujemnego.
    UWAGA: Zalecane parametry służą jako punkt wyjścia dla systemu wyładowań jarzeniowych zastosowanego w tym badaniu. Optymalizacja może być konieczna w zależności od typu przyrządu do wyładowań jarzeniowych i w celu osiągnięcia pożądanego poziomu hydrofilowości dla określonych materiałów siatek. W przypadku czyszczenia plazmowego należy rozważyć przetestowanie alternatywnych gazów lub mieszanin gazów, takich jak wodór lub mieszaniny argonu i tlenu.
  4. Opcjonalny krok: wprowadzić dodatkowe roztwory chemiczne, takie jak 99% amylaminy w otwartej szklanej butelce, do komory przylegającej do uchwytu siatki, aby specyficznie wytworzyć dodatni ładunek netto na siatce.
  5. Użyj rozładowanych kratek w ciągu 0,5-1 godziny, aby zapewnić optymalną wydajność.

5. Przygotowanie siatki do barwienia negatywnego

  1. Załadować 5 μl próbki (50-300 nM lub 20-120 ng/ml) na rozżarzoną siatkę. Pozostawić próbkę w spokoju na powierzchni siatki przez 1 minutę, aby ułatwić osadzanie się białek.
  2. Przygotuj trzy krople wody po 50 μl każda na arkuszu folii parafinowej. Delikatnie umyj próbkę na siatce, pocierając powierzchnię siatki o powierzchnię pierwszej kropli wody. Powtórz krok prania z pozostałymi dwiema kroplami wody.
    UWAGA: Czas prania może być zoptymalizowany zgodnie ze specyficznymi wymaganiami każdego eksperymentu.
  3. Załadować 5 μl przefiltrowanego 1% (w/v) roztworu octanu uranylu na siatkę i natychmiast odpipetować roztwór octanu uranylu.
  4. Załadować kolejne 5 μl 1% (w/v) roztworu octanu uranylu na siatkę. Pozostawić siatkę do inkubacji w roztworze octanu uranylu przez 90 s w celu barwienia.
    UWAGA: Czas barwienia można dostosować i zoptymalizować w zależności od konkretnych próbek.
  5. Delikatnie dotknij strony pęsety siatki bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego. Pozostaw kratkę do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Przechowuj wysuszoną siatkę w pojemniku z siatką w temperaturze pokojowej do czasu obserwacji.

6. Witryfikacja próbki

  1. Rozcieńczyć próbkę białka do pożądanego stężenia.
    UWAGA: Stężenie białka powinno być wystarczająco wysokie, aby zmaksymalizować liczbę cząstek w każdym otworze, ale wystarczająco niskie, aby zapewnić rozkład pojedynczych cząstek. Stężenia białek Cryo-EM zwykle wahają się od 0,5 do 2 mg/ml. Jednak niektóre białka, w zależności od ich masy cząsteczkowej i specyficznych warunków przygotowania próbki, mogą wymagać stężeń spoza tego zakresu.
  2. Odwirować próbkę o masie 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich osadów.
  3. Włącz przyrząd do zamrażania wgłębnego. Napełnij zbiornik nawilżacza wodą destylowaną. Zamontuj bibułę filtracyjną z pierścieniami na podkładkach do bibuły. Ustaw parametry witryfikacji (temperatura: 4 °C, wilgotność: 100%, czas osuszania: 6 s, siła klestania: 5 jednostek, czas oczekiwania: 10 s).
    UWAGA: Czas i siła osuszania są ważnymi parametrami dla optymalizacji urządzenia do witryfikacji, ponieważ usuwanie wody z siatki i narażenie cząstek na granicę faz powietrze-woda może wywołać dysocjację lub odchylenie orientacji.
  4. Zamontuj elementy pojemnika kriogenicznego, w tym mosiężny kubek, uchwyt na siatkę, jednostkę pająka i pierścień zapobiegający skażeniu, w tacce podstawowej. Schłodzić zespół pojemnika, napełniając tackę ciekłym azotem. Napełnij mosiężny kubek kriogenem (ciekłym etanem). Usuń jednostkę pająka, gdy kriogen osiągnie temperaturę topnienia.
  5. Zamontuj pęsetę i zespół siatki na instrumencie, załaduj próbkę (zwykle 4 μl) na węglową stronę siatki i rozpocznij proces zamrażania wgłębnego.
  6. Ostrożnie odczep pęsetę od instrumentu, umieść siatkę na siatce do przechowywania i zamknij pudełko pokrywką. Pojemnik siatkowy zawierający zeszklone próbki należy przechowywać w ciekłym azocie.

7. Wczytywanie siatek do TEM

  1. Zmontuj stację montażową autogrid i schłodź ją ciekłym azotem.
  2. Umieść pudełko kratowe zawierające zeszklone kratki i ostrożnie odkręć pokrywę, aby uzyskać dostęp do kratek. Umieść w pobliżu pustą skrzynkę do przechowywania automatycznej siatki, aby łatwo przenieść zmontowane siatki.
  3. Umieść pierścień automatycznej siatki w wyznaczonym miejscu na pierścień na stanowisku montażowym. Ostrożnie przesuń zeszkloną siatkę z pudełka z siatką i włóż ją do pierścienia automatycznej siatki. Upewnij się, że siatka i pierścień są wyrównane.
  4. Wyrównaj dysk, aby ustawić otwór w okręgu na górze pierścienia automatycznej siatki i zespołu siatki. Aby zamocować siatkę w pierścieniu automatycznej siatki, umieść narzędzie do wstawiania C-clip na górze siatki i delikatnie dociśnij, aby zatrzasnąć C-clip w środku.
  5. Obróć dysk z powrotem i przenieś zmontowane siatki do schowka automatycznej siatki.
  6. Zmontuj kasetową stację ładowania i schłodzić stację ładowania ciekłym azotem.
  7. Umieść schowek na autosiatkę w stacji załadowczej. Przenieś zespół siatki ze skrzynki do przechowywania automatycznej siatki do kasety i delikatnie postukaj w siatkę, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie.
  8. Użyj uchwytu, aby umieścić kasetę w kapsule automatycznego podajnika. Sprawdź pin w autoloaderze, aby potwierdzić jego swobodny ruch i upewnić się, że nie jest zamrożony.
  9. Zadokuj kapsułę automatycznego ładowania do TEM w celu obserwacji siatki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować optymalne warunki siatki dla MjsHSP16.5, przeprowadzono wstępne badanie krio-EM, skupiając się przede wszystkim na badaniu różnych warunków buforowania białka: (1) końcowy bufor oczyszczający, który zapewnia stabilność i jednorodność MjsHSP16.5 i jest ważny dla jego krystalizacji30; (2) dostosowane do warunków niezbędnych do wzrostu kryształów MjsHSP16.5 o wysokiej jakości dyfrakcyjnej30; oraz (3) stosowane wcześniej w badaniach mikroskopii elektronowej (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania strukturalne białek rozpoczynają się od oczyszczania białek, iteracyjnego procesu mającego na celu osiągnięcie równowagi między izolacją celów białkowych o wysokiej czystości i jednorodności przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnej funkcjonalności. Mimo że kompozycje buforowe do oczyszczania i konserwacji próbek białek są starannie wybierane podczas procesu oczyszczania, te często stanowią wyzwanie podczas późniejszego przygotowywania próbek krio-EM i obrazowania6. Problem ten...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Cooperative Center for Research Facilities (CCRF) (Sungkyunkwan University, Korea) za hojne udzielenie nam dostępu do ich obiektu kriogenicznego. Praca ta była wspierana przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) dla K.K.K. (nr 2021M3A9I4022936). Wykorzystanie urządzeń kriogenicznych przez konsorcjum NEXUS było wspierane przez grant National Research Foundation of Korea RS-2024-00440289.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14-mililitrowa probówka z okrągłym dnemSPL Nauki Przyrodnicze40114
250 µ L Strzykawka gazoszczelna Model 1725 LTNHamilton81100Igła cementowa, rozmiar 22s, 2 cale, styl punktowy 2
50 i mikro; L Przycisk do dializyHampton ResearchHR3-326
50 ml Szklana zlewkaDIAMONDHA.1010D.50
Ä KTA pure 25 LCytiva29018224FPLC
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15MilliporeUFC90502450-KDa NMWL
Bradford OdczynnikSupelcoB6916
Dumoxel Style N5Dumont0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEMThermoFisher ScientificGLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgCytiva28989335
Mikroprobówka wirówkowa 1,5 mlHD MicroH23015
Probówki PCR 0,2 ml, płaska nakrętkaAxygenPCR-02-C
PELCO easiGlow Jednostka wyładowczaTed Pella91000
PELCO TEM Blok uchwytu siatkowegoTed Pella16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, CuMikroskopia elektronowa NaukiQ2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Rurki membranowe do dializy Fisher Scientific086705B3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GLCytiva29091596
octan uranyluMerck8473
Vitrobot Mark IVThermoFisher ScientificVITROBOT
VitroEase Zestaw do przesiewania i detergentyThermoFisher ScientificA49856

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faruqi, A. R., Mcmullan, G. Electronic detectors for electron microscopy. Q Rev Biophys. 44 (3), 357-390 (2011).
  2. Hamaguchi, T., et al. A new cryo-EM system for single particle analysis. J Struct Biol. 207 (1), 40-48 (2019).
  3. Kimanius, D., Dong, L., Sharov, G., Nakane, T., Scheres, S. H. W. New tools for automated cryo-Em single-particle analysis in relion-4.0. Biochem J. 478 (24), 4169-4185 (2021).
  4. Punjani, A., Fleet, D. J. 3Dflex: Determining structure and motion of flexible proteins from cryo-Em. Nat Methods. 20 (6), 860-870 (2023).
  5. Chen, M., Schmid, M. F., Chiu, W. Improving resolution and resolvability of single-particle cryo-EM structures using gaussian mixture models. Nat Methods. 21 (1), 37-40 (2024).
  6. Arnold, S. A., et al. Miniaturizing em sample preparation: Opportunities, challenges, and "visual proteomics". Proteomics. 18 (5-6), e1700176(2018).
  7. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 6), 560-571 (2018).
  8. Han, B. G., Avila-Sakar, A., Remis, J., Glaeser, R. M. Challenges in making ideal cryo-Em samples. Curr Opin Struct Biol. 81, 102646(2023).
  9. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-em single-particle analysis. J Biol Chem. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  10. Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nat Commun. 8 (1), 629(2017).
  11. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  12. Liu, Y. T., Hu, J., Zhou, Z. H. Resolving the preferred orientation problem in cryo-EM reconstruction with self-supervised deep learning. Microsc Microanal. 29 (Supplement_1), 1918-1919 (2023).
  13. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1863 (3), 183533(2021).
  14. Li, B., Zhu, D., Shi, H., Zhang, X. Effect of charge on protein preferred orientation at the air-water interface in cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 213 (4), 107783(2021).
  15. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  16. Da Fonseca, P. C. A., Morris, E. P. Cryo-EM reveals the conformation of a substrate analogue in the human 20s proteasome core. Nature Commun. 6 (1), 7575(2015).
  17. Nguyen, T. H. D., et al. Cryo-EM structure of the yeast u4/u6.U5 tri-snrnp at 3.7 å resolution. Nature. 530 (7590), 298-302 (2016).
  18. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. J Struct Biol. 170 (1), 152-156 (2010).
  19. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-em grids. J Struct Biol. 204 (1), 80-84 (2018).
  20. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Sci Rep. 4 (1), 7084(2014).
  21. Patel, A. B., et al. Structure of human tfiid and mechanism of TBP loading onto promoter DNA. Science. 362 (6421), eaau8872(2018).
  22. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482 (7384), 186-191 (2012).
  23. Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-em. J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).
  25. Xu, Y., Dang, S. Recent technical advances in sample preparation for single-particle cryo-em. Front Mol Biosci. 9, 892459(2022).
  26. Lee, J., Ryu, B., Kim, T., Kim, K. K. Cryo-em structure of a 16.5-kda small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii. Int J Biol Macromol. 258 (Pt 1), 128763(2024).
  27. Kim, K. K., Kim, R., Kim, S. H. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394 (6693), 595-599 (1998).
  28. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J Vis Exp. (16), e758(2008).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Kim, K. K., et al. crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. J Struct Biol. 121 (1), 76-80 (1998).
  31. Kim, R., et al. On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (14), 8151-8155 (2003).
  32. Shi, J., Koteiche, H. A., Mchaourab, H. S., Stewart, P. L. Cryoelectron microscopy and EPR analysis of engineered symmetric and polydisperse hsp16.5 assemblies reveals determinants of polydispersity and substrate binding. J Biol Chem. 281 (52), 40420-40428 (2006).
  33. Kim, R., Kim, K. K., Yokota, H., Kim, S. H. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (16), 9129-9133 (1998).
  34. Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. J Pharm Sci. 106 (3), 713-733 (2017).
  35. Collins, B., Stevens, R. C., Page, R. Crystallization optimum solubility screening: Using crystallization results to identify the optimal buffer for protein crystal formation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 12), 1035-1038 (2005).
  36. D'arcy, A. Crystallizing proteins - A rational approach. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50 (Pt 4), 469-471 (1994).
  37. Jancarik, J., Pufan, R., Hong, C., Kim, S. H., Kim, R. Optimum solubility (os) screening: An efficient method to optimize buffer conditions for homogeneity and crystallization of proteins. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 9), 1670-1673 (2004).
  38. Zhang, C. Y., et al. A strategy for selecting the ph of protein solutions to enhance crystallization. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 7), 821-826 (2013).
  39. Basanta, B., Hirschi, M. M., Grotjahn, D. A., Lander, G. C. A case for glycerol as an acceptable additive for single-particle cryo-EM samples. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (Pt 1), 124-135 (2022).
  40. Michon, B., et al. Role of surfactants in electron cryo-microscopy film preparation. Biophys J. 122 (10), 1846-1857 (2023).
  41. Chen, S., Li, J., Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Interaction of human erythrocyte catalase with air-water interface in cryo-EM. Microscopy (Oxf). 71 (Supplement_1), i51-i59 (2022).
  42. Vinothkumar, K. R., Henderson, R. Single particle electron cryomicroscopy: Trends, issues and future perspective. Q Rev Biophys. 49, e13(2016).
  43. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  44. Bagby, S., Tong, K. I., Liu, D., Alattia, J. R., Ikura, M. The button test: A small scale method using microdialysis cells for assessing protein solubility at concentrations suitable for NMR. J Biomol NMR. 10 (3), 279-282 (1997).
  45. Gewering, T., Januliene, D., Ries, A. B., Moeller, A. Know your detergents: A case study on detergent background in negative stain electron microscopy. J Struct Biol. 203 (3), 242-246 (2018).
  46. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  47. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em. Nat Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  48. Earl, L. A., Falconieri, V., Milne, J. L., Subramaniam, S. Cryo-EM: Beyond the microscope. Curr Opin Struct Biol. 46, 71-78 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza pojedynczych cz steczekwizualizacja struktury bia ektransmisyjna mikroskopia elektronowaszybkie mro enie plunge freezingchromatografia wykluczania cz steczekmembrana dializacyjnarozk ad cz steczeksiatka poddana wy adowaniu arowemu

Powiązane artykuły