Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Summary

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Abstract

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) zrewolucjonizowała biologię strukturalną, umożliwiając badanie struktur makromolekularnych w warunkach zbliżonych do rodzimych, zawieszonych w szklistym lodzie. Technika ta pozwala na wizualizację białek i innych biomolekuł w wysokiej rozdzielczości bez konieczności krystalizacji, oferując istotny wgląd w ich funkcję i mechanizm. Ostatnie postępy w analizie pojedynczych cząstek, w połączeniu z ulepszonym przetwarzaniem danych obliczeniowych, sprawiły, że cryo-EM stał się nieodzownym narzędziem we współczesnej biologii strukturalnej. Pomimo rosnącego zastosowania, cryo-EM stoi w obliczu ciągłych wyzwań, które mogą ograniczać jego skuteczność, w szczególności nierównomiernego rozkładu cząstek. Problem ten często prowadzi do słabej rozdzielczości i zmniejszonej dokładności w zrekonstruowanych strukturach białkowych. W tym artykule przedstawiono proste, praktyczne podejście do rozwiązania tego problemu, na przykładzie małego białka szoku cieplnego z Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Metoda optymalizuje przygotowanie próbki w celu zminimalizowania preferencyjnej adsorpcji, zapewniając bardziej jednorodny rozkład cząstek i wyższej jakości struktury krio-EM białek. Technika ta stanowi cenne wskazówki dla badaczy dążących do przezwyciężenia podobnych wyzwań w badaniach strukturalnych.

Introduction

Dzięki najnowszym postępom zarówno w sprzęcie instrumentalnym^1,2 i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów^3,4,5, kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) stała się popularnym i potężnym narzędziem w nowoczesnej biologii strukturalnej. Pomimo tych przełomowych odkryć, nadal istnieją wąskie gardła w uzyskiwaniu struktur makromolekularnych o wysokiej rozdzielczości za pomocą cryo-EM. Jednym z takich istotnych wyzwań jest nierównomierny rozkład cząstek, w tym zjawisko preferencji orientacji, które obserwuje się głów....

Protocol

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Oczyszczanie białka

1. Indukuj ekspresję rekombinowanego MjsHSP16.5 w E. coli BL21(DE3) i oczyść białko za pomocą kolumny chromatograficznej chelatującej nikiel, jak opisano wcześniej²⁶. Po oczyszczeniu w kolumnie chromatografii wykluczania wielkości (SEC)²⁶, zbadaj czystość białka, ładując 5 μl frakcji pikowych na 12,5% żel SDS-PAGE i wizualizując za pomocą standardowego barwienia na niebiesko Coomassie²⁸ (

Results

Aby zidentyfikować optymalne warunki siatki dla MjsHSP16.5, przeprowadzono wstępne badanie krio-EM, skupiając się przede wszystkim na badaniu różnych warunków buforowania białka: (1) końcowy bufor oczyszczający, który zapewnia stabilność i jednorodność MjsHSP16.5 i jest ważny dla jego krystalizacji³⁰; (2) dostosowane do warunków niezbędnych do wzrostu kryształów MjsHSP16.5 o wysokiej jakości dyfrakcyjnej³⁰; oraz (3) stosowane wcześniej w badaniach mikroskopii elektronowej (.......

Discussion

Wszystkie badania strukturalne białek rozpoczynają się od oczyszczania białek, iteracyjnego procesu mającego na celu osiągnięcie równowagi między izolacją celów białkowych o wysokiej czystości i jednorodności przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnej funkcjonalności. Mimo że kompozycje buforowe do oczyszczania i konserwacji próbek białek są starannie wybierane podczas procesu oczyszczania, te często stanowią wyzwanie podczas późniejszego przygotowywania próbek krio-EM i obrazowania⁶. Problem ten.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mililitrowa probówka z okrągłym dnem	SPL Nauki Przyrodnicze	40114
250 µ L Strzykawka gazoszczelna Model 1725 LTN	Hamilton	81100	Igła cementowa, rozmiar 22s, 2 cale, styl punktowy 2
50 i mikro; L Przycisk do dializy	Hampton Research	HR3-326
50 ml Szklana zlewka	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä KTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Odczynnik	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Mikroprobówka wirówkowa 1,5 ml	HD Micro	H23015
Probówki PCR 0,2 ml, płaska nakrętka	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Jednostka wyładowcza	Ted Pella	91000
PELCO TEM Blok uchwytu siatkowego	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Mikroskopia elektronowa Nauki	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Rurki membranowe do dializy	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
octan uranylu	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Zestaw do przesiewania i detergenty	ThermoFisher Scientific	A49856