Artykuł metodologiczny

Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67244

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

W tym artykule

Podsumowanie

Glej jelitowy staje się coraz bardziej rozpoznawalny ze względu na swoją rolę w homeostazie jelit i procesach chorobowych, w tym powikłaniach pooperacyjnych. Pacjenci koni powracający do zdrowia po laparotomii zwiadowczej w nagłych wypadkach cierpią na wysokie ryzyko wystąpienia stanów zapalnych pooperacyjnych, co podkreśla znaczenie ustalenia powtarzalnej hodowli pierwotnych komórek glejowych jelit koni do badania.

Streszczenie

Zapalne stany pooperacyjne kolki koni (ostry brzuch) nie tylko przyczyniają się do zwiększenia kosztów klienta, dyskomfortu pacjenta i czasu hospitalizacji, ale w wielu przypadkach okazują się zagrażać życiu. Unikalna populacja komórek jelitowych, glej jelitowy, jest coraz częściej uznawana za swoją rolę w wyczuwaniu środowiska żołądkowo-jelitowego i komunikowaniu się z otaczającymi typami komórek. Interakcje między glejem jelitowym a nabłonkiem jelitowym mogą okazać się kluczowe w ustaleniu, w jaki sposób glej jelitowy koni może zmieniać barierę śluzówkową w celu modulowania stanu zapalnego w zdrowiu i kolce.

Aby zbadać tę interakcję, przedstawiamy metodę tworzenia pierwotnych kultur gleju jelitowego koni z jelita czczego koni i wystawiania tych kultur na stany zapalne, o których wiadomo, że są obecne w kolce. Pierwotne posiewy gleju jelitowego uzyskano od dorosłych koni poddanych eutanazji z przyczyn niezwiązanych z kolką. Kosmki jelitowe i blaszkę właściwą poddano mikropreparowaniu w celu odsłonięcia błony podśluzowej. Wyizolowaną błonę podśluzową poddano trawieniu enzymatycznemu kolagenazą, proteazą i albuminą surowicy bydlęcej przez 2-3 godziny. Następnie, mechaniczna mineralizacja obejmująca wirowanie, pipetowanie i sitka komórkowe (40-100 μm), dała osad używany do posiewu na studzienkach pokrytych poli-L-lizyną o stężeniu 0,05 mg/ml poli-lizyny o stężeniu ~400 000 komórek/300 μl pożywki.

Po konfluencji i pierwszym pasażu, komórki glejowe jelita były następnie wystawione na działanie rekombinowanego IL-1β (0, 10, 25 ng) przez 24 godziny. Aby modelować interakcje nabłonkowo-glejowe w czasie kolki, pożywkę kondycjonowaną przez kontrolny lub leczony glej jelitowy dodano bezpośrednio do zlewających się monowarstw jelita czczego koni podczas pomiaru transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) przy użyciu dwuelektrodowej komory EndOhm. Dane te pokazują tylko jedno z wielu potencjalnych zastosowań gleju jelitowego koni.

Wprowadzenie

Kolka u koni jest najczęstszą dolegliwością medyczną wymagającą konsultacji w nagłych wypadkach1. Biorąc pod uwagę, że nawet 17% tych koni wymaga korekcji chirurgicznej, wysiłki na rzecz poprawy wyników pooperacyjnych powinny być w czołówce badań medycznych koni 2. Obecnie pacjenci z kolką pooperacyjną doświadczają wysokiego ryzyka wystąpienia kilku zagrażających życiu zaburzeń, w tym sepsy/wstrząsu endotoksemicznego (12,3% pacjentów) i pooperacyjnej niedrożności jelit (13,7% pacjentów)3. Pomimo postępów w leczeniu powikłań pooperacyjnych, nadal istnieje zapotrzebowanie na zaawansowane metody leczenia w celu zapobiegania lub leczenia tych schorzeń.

Ostatnie badania wykazały miejscowy i ogólnoustrojowy stan zapalny pacjentów z kolką4. Na przykład wykazano, że białka prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworów (TNF) alfa, interleukina 1β (IL-1β), interleukina 6 (IL-6) i białko chemoatraktantu monocytów-1, wykazują znacznie zwiększoną ekspresję w błonie śluzowej jelita kolki w porównaniu z normalną tkanką jelitową4. Z ogólnoustrojowego punktu widzenia wykazano, że zwiększony poziom TNF alfa w tkance jelitowej jest skorelowany ze zwiększonym ryzykiem pooperacyjnego refluksu nosowo-żołądkowego większego niż 2 l, co jest ogólnym pomiarem dysmotoryki pooperacyjnej4. Wiadomo również, że podawanie interleukiny IL-1β i TNF alfa jest w stanie wywołać kliniczne objawy wstrząsu septycznego5.

Potencjalnym wyjaśnieniem stanu zapalnego tkanki jelitowej kolki i jej związku z powikłaniami pooperacyjnymi jest bariera nabłonkowa jelit. W zdrowiu kompleksy połączeń ścisłych łączące pojedynczą warstwę nabłonka walcowatego, który wyściela przewód pokarmowy, stanowią funkcjonalną barierę ograniczającą zawartość światła i jej składniki bakteryjne przed przedostaniem się do przestrzeni podśluzówkowej i krwiobiegu. Jednak wzdęcia i uszkodzenia spowodowane niedrożnością jelit związaną z kolką i manipulacją jelit podczas operacji mogą zakłócić tę funkcję bariery jelitowej.

Jeśli chodzi o funkcjonalne składniki ściany jelita jako całości, wykazano, że podśluzówkowa sieć glejowa jelitowa w obrębie jelitowego układu nerwowego jest kluczowa w patofizjologicznym rozwoju powikłań pooperacyjnych związanych ze szlakami zapalnymi i może stanowić konkretny cel terapeutyczny6,7,8,9. Glej jelitowy jest nie tylko obecny w całym przewodzie pokarmowym, ale działa jako czujniki środowiska jelitowego, wpływa na sygnalizację za pomocą wielu typów komórek ściany jelita i bezpośrednio reguluje barierę jelitową6. W związku z tym uzasadnione jest założenie, że te silne czujniki jelita zostałyby aktywowane przez uraz i stan zapalny i mogłyby wywołać ostrą reakcję, taką jak zmiany w przepuszczalności bariery.

To badanie jest pierwszym, które opisuje hodowlę gleju jelitowego koni, a dokładniej rolę zapalnego gleju jelitowego koni na funkcję bariery jelitowej. W tym artykule przedstawiono metody hodowli pierwotnej podśluzówkowego gleju jelitowego koni i ich odpowiedzi na ekspozycję na zapalną IL-1β, ocenę wpływu produktów glejowych jelitowych po ekspozycji na IL-1β na przepuszczalność monowarstw enterocytów koni oraz możliwą blokadę poprzez zastosowanie surowicy koni.

Protokół

Pierwotne kultury glejowe jelitowe koni uzyskano od trzech koni, które zostały humanitarnie poddane eutanazji przez przedawkowanie barbituranu z powodów niezwiązanych z tym badaniem. Konie wybrane do badań kulturowych były końmi dorosłymi, bez aktualnej historii chorób przewodu pokarmowego.

1. Podśluzówkowa hodowla pierwotna przędowa jelitowa koni

  1. Wyhoduj monowarstwy nabłonka koni z krypt jelita czczego uzyskanych od trzech oddzielnych dorosłych koni konnych.
    1. Płytki 24-dołkowe pokryć roztworem powlekającym przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze pokojowej, umyć je 2x sterylną wodą i przechowywać w temperaturze pokojowej, aż komórki będą gotowe do posiewu.
    2. Po humanitarnej eutanazji, w ciągu 60 minut, usuń fragment jelita czczego i umieść go w zimnym roztworze Ringera na lodzie.
    3. Usuń 10-centymetrową część z jelita czczego i otwórz ją na granicy antykrezkowej, aby utrzymać obszary nielimfatyczne w środku tkanki. Przytnij porcję do odcinka o wymiarach około 7 cm x 7 cm. Przed sekcją dobrze wypłucz tkankę w świeżym roztworze Ringera.
    4. Przypnij tkankę do płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym w zimnym roztworze Ringera lub PBS śluzówką do góry, rozciągając tkankę tak bardzo, jak to możliwe (Rysunek 1A).
    5. Usuń kosmki jelitowe za pomocą zakrzywionych kleszczyków (Rysunek 1B), a następnie warstwę blaszki właściwej z obszaru nielimfoidalnego o wymiarach około 5 cm x 5 cm (Rysunek 1C).
      UWAGA: Warstwy te łatwo oddzielają się od błony podśluzowej (Rysunek 1B).
    6. Usuń błonę podśluzową w jednym arkuszu, uwalniając ją nożyczkami do mikrodysekcji w jednym rogu i obserwuj naturalną separację, jednocześnie odrywając błonę podśluzową od wewnętrznej okrągłej warstwy mięśni jelita czczego (Rysunek 1D).
    7. Zmielić zebraną warstwę podśluzówkową na 2-5 mm kawałki i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml "Organo-FBS" (Tabela 1), 0,825 mg kolagenazy, 5 mg proteazy i 20 mg albuminy surowicy bydlęcej. Inkubować tkankę przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C w celu trawienia enzymatycznego.
    8. Po inkubacji dodać 10 ml roztworu "Organo + FBS" o temperaturze pokojowej, aby zatrzymać działanie enzymu. Pipetować mieszaninę tkanek w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu dysocjacji komórek od tkanki, a następnie odwirować w temperaturze 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 10 ml PBS o temperaturze pokojowej, pipetując ponownie około 15 razy w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu oddzielenia komórek od tkanki.
    10. Odwirować stożkową probówkę o masie 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml roztworu "Organo + FBS" o temperaturze pokojowej, pipetując w górę i w dół około 15 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu oddzielenia komórek od tkanki.
    11. Przefiltruj komórki szeregowo przez sitko o wielkości porów 100 μm, 70 μm, a następnie 40 μm.
    12. Odwirować przefiltrowane komórki i pożywki o masie 3 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml "Organo + FBS".
    13. Wybarwić błękitem trypanowym, aby zidentyfikować żywe komórki i policzyć je za pomocą hemocytometru.
    14. Wysiewaj około 400 000 komórek w 300 μl "Organo + FBS" w każdym dołku 24-dołkowej płytki i dodaj czynniki wzrostu do każdej studzienki: N2 5 μl / dołek, G5 5 μl / dołek i B27 10 μl / dołek. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić przyleganie komórek. Dwadzieścia cztery godziny później zmień pożywkę na "pożywkę glejową" (Tabela 1) z powyższymi czynnikami wzrostu i zmieniaj co 48 godzin (Rysunek 2).

2. Cytologia immunofluorescencyjna

  1. Wyhoduj komórki glejowe jelitowe z hodowli pierwotnej (P0) (krok 2.1.14) do 70-80% zbiegu i przeprowadź je raz (P1).
  2. Utrwalić komórki kultury pierwotnej (P0) w studzienkach za pomocą 4% paraformaldehydu przez 5 minut przed zastosowaniem 0,1% azydku PBS.
  3. Przygotować roztwór nasycający składający się z azydku PBS, 4% surowicy osła i 0,5% Triton-X. Dodać 300 μl roztworu nasyconego do studzienek, aby przepuszczalność komórek przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało dla markera glejowego, kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i pierwszorzędowe przeciwciało dla markera fibroblastów, aktyny alfa mięśni gładkich, w rozcieńczeniach 1:1,000 w roztworze nasycającym do inkubacji przez noc w temperaturze 4 oC.
  5. Przemyć 3x PBS przed dodaniem drugorzędowego przeciwciała przeciwko królikowi IgG Alexa Fluor 594 i koziej anty-mysiej IgG Alexa Flour 488 w rozcieńczeniu 1:500 w roztworze nasycającym przez 2-3 godziny.
  6. Wybarwić jądra 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS przez 5 minut.
  7. Po trzech przemyciach PBS przechowuj komórki w 0,1% azydku PBS.

3. Podśluzówkowa ekspozycja na pierwotną hodowlę IL-1β koniowatych

  1. Gdy komórki z pierwszego pasażu (P1) osiągną 70-80% konfluencji, należy przeprowadzić eksperyment ekspozycji na IL-1β. Wystawić studzienki na działanie 0 ng, 10 ng i 25 ng IL-1β przez 24 godziny. Po upływie 24 godzin należy przechowywać pożywki z każdej studzienki w temperaturze -80 °C.

4. Hodowla organoidów koni do produkcji monowarstw enterocytów

UWAGA: Zgodnie z protokołem Stewart et al. opublikowanym w 2018 roku, bankowane krypty jelitowe koni i pąki, które zostały poddane kriobankowaniu, zostały rozszerzone do badań enteroidów 2D10.

  1. Użyj około 700-1,000 pąków/fragmentów krypty (40 000-50 000 komórek po dysocjacji na pojedyncze komórki) na wkładkę transwell. Pokryj wkładki transwell 42 μl 0,05% Matrigel przed dodaniem enterocytów. Pozostawić Matrigel do utrwalenia na wkładce poprzez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37 oC. Odessać dodatkowe podłoże i pozostawić transwelle do wyschnięcia przez 30 minut bez przykrycia. Dodać 200 μl pożywki DMEM-F12 do każdej wkładki transwell i przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
  2. Umyj paszteciki Matrigel zawierające organoidy PBS, a następnie wystawij je na działanie 500 μl Cell Recovery na lodzie. Odpipetuj je wielokrotnie, aby zapewnić pełne pobranie komórek do probówki o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować probówkę o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w docelowej objętości pożywki z komórek macierzystych nabłonka jelitowego (IESC). Oblicz objętość docelową, mnożąc żądaną liczbę monowarstw przez 200 μl podłoża. (Tabela 1).
  4. Wstępnie pokryć strzykawkę o pojemności 1 ml w pożywce IESC i odessać zawiesinę komórek przez igłę 16 G. Zastąp igłę 16 G igłą 28 G i wyrzuć przez nią zawiesinę komórek, aby ułatwić rozdzielenie organoidów.
  5. Umieść 200 μl powstałej zawiesiny komórek po stronie wierzchołkowej powlekanych transwelli i 500 μl IESC, jak również wcześniej opisane czynniki wzrostu po podstawowej stronie wkładki transwell10. Zmieniaj pożywkę i czynniki wzrostu co 24-48 godzin, aż do osiągnięcia konfluencji. Zdefiniuj konfluencję jako gęstość komórek odpowiadającą TEER wynoszącemu 1 000 omówxcm2,11. Aby zapoznać się z pomiarem, patrz krok 5.1.

5. Przepuszczalność monowarstwy enterocytów koni po ekspozycji na cytokiny zapalne i produkty glejowe jelitowe koni

  1. Użyj dwuelektrodowej komory pomiarowej TEER, aby określić ilościowo TEER na monowarstwach i ustalić odczyt bazowy na każdej przepuszczalnej membranie transwell. Upewnij się, że media IESC i transwell mają 15 minut na osiągnięcie temperatury pokojowej przed wykonaniem pomiarów. Napełnij kubek hodowlany 1.5 ml pożywki IESC i upewnij się, że we wkładzie transwell znajduje się dokładnie 200 μl pożywki, tak aby przewody płynu pasowały do siebie w momencie pomiaru.
  2. Wystawić podstawno-boczny aspekt wkładek transwell na działanie cytokin zapalnych 25 ng IL-1β, 10 ng i 25 ng interleukiny 6 (IL-6) na studzienkę lub produktów glejowych kultur wystawionych na działanie 10 ng lub 25 ng IL-1β. Wystawić podstawno-boczny aspekt kontrolnych wkładek transwell na działanie pożywki glejowej i pożywki glejowej z kultur nienarażonych na IL-1β.
  3. Mierz TEER przez 45 minut w odstępach 10-15 minut, umieszczając każdy transwell w kubku hodowlanym.

6. Statystyki

  1. Oblicz zmianę fałdu TEER każdej transwella dla punktów czasowych: 0, 10, 20, 30 i 45 min.
  2. Korzystając z wybranego oprogramowania (patrz tabela materiałów), porównaj korelacje między zmniejszonym TEER a bazolateralną ekspozycją na IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng i 100 ng) oraz pożywkę glejową (wystawioną na 0 ng IL-1β, 10 ng IL-1β i 25 ng IL-1β) w celu kontrolowania pożywek za pomocą niesparowanego jednostronnego testu t.

Wyniki

Mikrosekcja jelita czczego konia do warstwy podśluzówkowej (Rycina 1) z następującym trawieniem enzymatycznym i mechanicznym pozwoliła na uzyskanie żywych kultur komórek glei jelitowej konia. Komórki wykazywały pleomorfizm z przewagą komórek wrzecionowatych, co jest zgodne z obrazem glei jelitowej u innych gatunków (Rycina 2A). Kultury były pozytywne pod kątem selektywnego markera glejowego, białka kwaśnego włókienstwa glejowego (GFAP), przy niskim stopniu zanieczyszczenia fibroblastami (alpha SMA, Rycina 2B). W niektórych przypadkach mikrosekcja warstw podśluzówkowych nie była wystarczająco precyzyjna, a kultury były zanieczyszczone wysokim odsetkiem fibroblastów, co zaobserwowano w immunofluorescencji markera fibroblastów – aktyny mięśni gładkich (Rycina 3).

Następnie, jako przykład użyteczności hodowli glejowych komórek jelitowych koni, oceniono wpływ gleju jelitowego eksponowanego na IL-1β na funkcję bariery nabłonkowej jelit. Basolateralna ekspozycja na pożywkę z hodowli gleju podśluzówkowego koni eksponowanego na 10 ng i 25 ng IL-1β przez 24 h znacząco zwiększyła przepuszczalność (odpowiednio p = 0,05 i 0,04, średnia dla pożywki kontrolnej = 0,9, średnia dla grupy glejowej 10 ng IL-1β = 0,8, przedział ufności 95% = -0,2 do 0,02, średnia dla grupy glejowej 25 ng IL-1β = 0,8, przedział ufności 95% = -0,1995 do 0,01060, n = 3-4) (Rysunek 4A). Jednakże ekspozycja monowarstw nabłonkowych koni na basolateralne 10-25 ng IL-6 koni – cytokiny zapalnej, o której wykazano, że jest produkowana przez glej jelitowy eksponowany na IL-1β i indukuje zwiększoną przepuszczalność enterocytów w modelach gryzoni12 – nie zwiększyła znacząco przepuszczalności monowarstwy enterocytów koni (Rysunek 4B)

Proces sekcji tkanki; analiza obrazu mikroskopowego; zestaw obejmuje szalkę Petriego, pęsetę, tkankę.
Rycina 1: Izolacja glejowi enteric z jelita czczo konia za pomocą mikrodysekcji oraz trawienia enzymatycznego i mechanicznego. (A) Jelito czczo zostało rozcięte wzdłuż brzegu antymezentealnego i przypięte stroną błony śluzowej do góry. (B) Kosmki jelitowe zostały zobrazowane pod mikroskopem i usunięte poprzez delikatne skrobanie, aż do momentu uwidocznienia włóknistej blaszki właściwej. (C) Następnie usunięto warstwę błony właściwej, aż do momentu, gdy włókna mięśni gładkich stały się widoczne przez półprzezroczystą błonę podśluzową. (D) Błonę podśluzową uniesiono i oddzielono od warstwy mięśniowej, przecinając w razie potrzeby włókniste fragmenty. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu sekcyjnego 10x (B,C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikroskopowa komórek; kontrast fazowy, immunofluorescence; jądra DAPI, GFAP, aktyna mięśni gładkich.
Rycina 2: Obrazowanie hodowli glei jelitowej z podśluzówki konia. (A) Morfologia gwiaździsta (strzałki), wrzecionowata (otwarta grot strzałki) i zrazowa (zamknięta grot strzałki) konnej glei jelitowej została oceniona za pomocą mikroskopii kontrastowej. (B) Czystość hodowli oceniono poprzez barwienie na GFAP oraz na marker fibroblastów, aktynę mięśni gładkich. Paski skali = 100 mm (A), 400 mm (B). Skróty: GFAP = kwaśne białko włókienstwie glejowego; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej hodowli komórkowych z zaznaczonym wyrażaniem białek i markerami molekularnymi.
Rycina 3: Obrazowanie nieudanych hodowli glejowych splotu podśluzówkowego konia. Czystość hodowli oceniono poprzez barwienie na GFAP (czerwony) oraz na marker fibroblastów, aktynę mięśni gładkich (zielony), co wykazało duży procent zanieczyszczenia fibroblastami. Żółta grot grota wskazuje GFAP, a biała grot grota aktynę mięśni gładkich. Pasek skali = 400 mm. Skrót: GFAP = kwaśne białko włókienstwa glejowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres przedstawiający zmianę krotności w czasie; wpływ IL-1β/IL6 na pożywkę; analiza odpowiedzi biologicznej.
Rysunek 4: TEER monowarstwy nabłonka konia po ekspozycji na cytokiny zapalne i zapalne produkty gleju. (A) Basolateralna ekspozycja na pożywkę z hodowli gleju entericznego podśluzówkowego konia, wystawionego na 10 ng i 25 ng IL-1β przez 24 h, znacząco zwiększyła przepuszczalność (*p = 0,05 i 0,04 odpowiednio, n = 3-4). (B) Ostra ekspozycja basolateralna monowarstwy enterocytów konia na 25 ng IL-1β oraz 10-25 ng konnego IL-6 nie zwiększyła znacząco przepuszczalności monowarstwy nabłonka konia (n = 2-4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Odczynniki do izolacji i hodowli. Poniższe odczynniki zostały wykorzystane do sporządzenia pożywek do izolacji glii jelitowej koni, hodowli glii jelitowej oraz hodowli komórek macierzystych nabłonka jelitowego koni. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Celem pracy było opracowanie powtarzalnej metody hodowli pierwotnej podśluzówkowego gleju jelitowego koni i wykazanie jej zastosowania do modelowania interakcji nabłonkowo-glejowych w czasie kolki. Izolacja i hodowla gleju jelitowego, która jest nowością u koni, okazała się korzystna w zrozumieniu szlaków chorób jelitowych w modelach świń i gryzoni oraz u ludzi 6,7,13,14. Badanie tej populacji komórek jest potencjalnie ważne ze względu na ich rolę jako podnabłonkowych czujników środowiska jelitowego, a także ich zdolność do interakcji i komunikowania się z otaczającymi komórkami w ścianie jelita. Dzięki ich wyostrzonej zdolności wyczuwania nietrudno wyobrazić sobie potencjalnie krytyczną rolę gleju w kolce koni, gdzie tkanka jelitowa jest obciążona wzdęciami, niedokrwieniem i potencjalnie chirurgiczną manipulacją6.

Wcześniejsze prace Lisowskiego i wsp. wykazały podwyższony stan zapalny tkanki jelitowej koni w czasie operacji kolki. Znaczenie łagodzenia tego środowiska zapalnego podkreślają hodowle gleju jelitowego gryzoni, które okazały się zdolne do syntezy produktów ze zdolnością do zakłócania funkcji bariery jelitowej 7,12. Wyciek treści świetlnej jelita do ściany jelita doprowadziłby nie tylko do reakcji zapalnej, ale także do potencjalnej infiltracji do krążenia, co mogłoby następnie wywołać wstrząs endotoksemiczny/posocznicę. Pacjenci z kolką końską po operacji są niestety nękani licznymi powikłaniami pooperacyjnymi o podłożu zapalnym, w tym sepsą i pooperacyjną niedrożnością jelit, które nie tylko zmniejszają przeżycie i komfort pacjenta, ale także zwiększają koszty klienta i stres emocjonalny3. Ustalenie modelu interakcji nabłonkowo-glejowych w czasie kolki może wyjaśnić potencjalną ścieżkę przepuszczalności bariery jelitowej koni w kolce i możliwe zapobieganie.

Hodowla podśluzówkowego gleju jelitowego koni wiąże się z adaptacjami i ograniczeniami wynikającymi z cech gatunku. Co najważniejsze, czas potrzebny do skutecznego trawienia enzymatycznego wymagał miareczkowania. Autorzy stwierdzili, że inkubacja z enzymami przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C była niezbędna do pomyślnej izolacji gleju jelitowego koni. Ponadto umożliwienie hodowlom jelitowym koni osiągnięcia ponad 80% zbieżności przed pasażowaniem wydaje się być szkodliwe dla żywotności hodowli. Głównym ograniczeniem tej metody w tym dniu jest wielkość próby. Badanie to obejmowało tylko tkanki/komórki, które zostały pozyskane od koni poddawanych operacji kolki lub eutanazji z powodów niezwiązanych z badaniem. Kontynuacja hodowli gleju jelitowego koni od dodatkowych uczestników, a także opracowanie protokołu zamrażania i przechowywania gleju jelitowego koni znacznie zwiększy moc tego badania.

Badanie to przedstawia nową użyteczność podśluzówkowej hodowli gleju jelitowego koni i pierwotnej hodowli enterocytów koni jako potencjalnych metodologii pomagających zrozumieć kolkę koni i choroby przewodu pokarmowego. Ponadto, podczas gdy monowarstwy nabłonka koni wyhodowane z izolowanych krypt jelitowych i organoidów były dobrze znane w przeszłości, badanie to nie tylko nadal prezentowało ich przydatność jako modelu, ale także zachęcało do dodatkowych badań oceniających interakcję z enterocytami jelitowymi koni i innymi typami komórek znajdującymi się w ścianie jelita.

Zaobserwowane interakcje między tymi typami komórek mają potencjalne zastosowanie zarówno w przypadku kolki, jak i innych zapalnych zaburzeń żołądkowo-jelitowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD) i zapalenie jelita grubego. Ponadto ciągłe doskonalenie metod hodowli gleju jelitowego i enterocytów pozwoli w przyszłości na rozpoczęcie badań nad współkulturą. Ponadto, podczas gdy obecne badanie koncentruje się na podśluzówkowej populacji glejów jelitowych ze względu na jej bliskość do monowarstwy nabłonka i skupienie się na funkcji bariery jelitowej, można wykonać dodatkowe prace w celu hodowli i oceny funkcji gleju jelitowego koni ze splotu mięśniowo-jelitowego ściany jelita, co może pomóc w określeniu wpływu zapalnego gleju jelitowego koni na ruchliwość15.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Morris Animal za finansowanie tego projektu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M bufor HEPESGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Alfa przeciwciało aktynowe mięśni gładkichAbcam7817
Amfoterycyna BSigmaAA95294,4 g / ml podwielokrotności podstawowe, stężenie końcowe 1,1 i mikro; g / mL
Anty-Anti-Micotic 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Albumina surowicy bydlęcejSigmaAA3311
BSA 50 mg/ml roztwór podstawowySigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Składnik obrączkarza koni ' s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".
KolagenazaSigma9891
DMEM-F12 mediaThermo Fisher11320033
Donkey anty-królik IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm dwuelektrodowa komora pomiarowa TEERPrecision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Instrukcja dla TEER MeasurementWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
Roztwór gentamycynySigmaG1272Stężenie końcowe 20 &mikro; g/mL
Przeciwciało GFAPAbcam4674
Koza anty-mysie IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Składnik Ringera dla koni" s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".
Roztwór L-glutaminyCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Składnik Ringera dla koni s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Składnik Ringera dla koni s Bulion 2: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra miarowego i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 1, aby wykonać kompletne " Dzwonek' Rozwiązanie".
NaClThermo FisherS271-10Składnik Ringera dla koni" s Bulion 1: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra z podziałką i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 2, aby ukończyć " Dzwonek' Rozwiązanie".
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Składnik Ringera dla koni" s Bulion 2: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra miarowego i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 1, aby wykonać kompletne " Dzwonek' Rozwiązanie".
NaHCO3Thermo FisherS637-212Składnik Ringera dla koni" s Bulion 2: połączyć z innymi składnikami, następnie dodać 100 ml tego bulionu do cylindra miarowego i rozcieńczyć do 1 litra wodą dejonizowaną. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5% CO2,
Połącz z Equine Ringer' s Zapas 1, aby wykonać kompletne " Dzwonek' Rozwiązanie".
Roztwór pióra/paciorkowcaGemini400-109
Poli-L-lizynaSigmaP26360,5 mg / ml w 1x bufor boranowy
Oprogramowanie PrismGraphPad
ProteazaSigmaP4630
Roztwór wodorowęglanu soduSigmaS87617,5% roztwór podstawowy
World

Bibliografia

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glia jelitowe konifunkcja bariery jelitowejizolacja kom rek pod luz wkowychtrawienie enzymatycznetransepitelna oporno elektrycznainterakcja nab onkowo glejowainterleukina 1 betajednowarstwowy nab onek jelitowy

Powiązane artykuły