Artykuł metodologiczny

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67247

⸱

6 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 2Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 3Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Streszczenie

Ludzka tkanka płucna składa się z połączonej sieci komórek nabłonka, mezenchymy, śródbłonka i komórek odpornościowych od górnych dróg oddechowych nosogardzieli do najmniejszego worka pęcherzykowego. Interakcje między tymi komórkami mają kluczowe znaczenie w rozwoju i chorobie płuc, działając jako bariera przed szkodliwymi substancjami chemicznymi i patogenami. Obecne modele kohodowli in vitro wykorzystują unieśmiertelnione linie komórkowe o różnym pochodzeniu biologicznym, które mogą nie odzwierciedlać dokładnie środowiska komórkowego lub interakcji płuc. Zróżnicowaliśmy ludzkie iPSC na organoidy płuc 3D (zawierające zarówno nabłonek, jak i mezenchymę), komórki śródbłonka i makrofagi. Hodowano je wspólnie w formacie granicy faz powietrze-ciecz (ALI) w celu utworzenia nabłonkowo-mezenchymalnej bariery wierzchołkowej wyposażonej w makrofagi i barierę śródbłonka podstawno-bocznego (iAirway). Linie iAirways pochodzące z iPSC wykazały zmniejszenie integralności bariery w odpowiedzi na zakażenie wirusami układu oddechowego i toksynami papierosowymi. Ten wieloliniowy system kohodowli płuc stanowi platformę do badania interakcji komórkowych, szlaków sygnałowych i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju płuc, homeostazy i progresji choroby. iAirways ściśle naśladuje ludzką fizjologię i interakcje komórkowe, może być generowane z iPSC pochodzących od pacjenta i może być dostosowywane do różnych typów komórek dróg oddechowych. Ogólnie rzecz biorąc, modele iAirway pochodzące z iPSC stanowią wszechstronne i potężne narzędzie do badania integralności bariery w celu lepszego zrozumienia genetycznych czynników powodujących choroby, odpowiedź patogenów, regulację immunologiczną oraz odkrywanie leków lub zmianę ich przeznaczenia in vitro, co może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy i leczenia chorób dróg oddechowych.

Wprowadzenie

Bariera krew-powietrze w dużych drogach oddechowych obejmuje tchawicę, oskrzela i oskrzeliki. Odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia układu oddechowego i składa się z nabłonka dróg oddechowych, błony podstawnej, naczyń krwionośnych i komórek śródbłonka oraz komórek odpornościowych. Pierwotne komórki nabłonkowe w drogach oddechowych obejmują komórki podstawne, komórki maczugowe, komórki rzęskowe i komórki kubkowe. Komórki podstawne, działające jako komórki macierzyste nabłonka dróg oddechowych, są multipotencjalnymi komórkami progenitorowymi o wysokich zdolnościach proliferacyjnych i samoodnawialnych, dając początek dojrzałym komórkom nabłonka dróg oddechowych1. Komórki klubowe to nieorzęsione komórki wydzielnicze, które przyczyniają się do utrzymania wyściółki dróg oddechowych poprzez wydzielanie ochronnych białek i środków powierzchniowo czynnych2. Komórki kubkowe, znajdujące się w świetle i gruczołach podśluzówkowych, wydzielają mucyny, które zatrzymują zanieczyszczenia i chronią drogi oddechowe3. Komórki rzęskowe są integralną częścią mechanizmu schodów śluzowo-rzęskowych, zapobiegając gromadzeniu się szkodliwych mikroorganizmów4. Błona podstawna składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej, która zapewnia wsparcie strukturalne5. Tchawica i reszta dróg oddechowych są otoczone bogatą siecią naczyń krwionośnych, które są wyłożone komórkami śródbłonka, które odgrywają istotną rolę we wspieraniu funkcji tchawicy poprzez dostarczanie składników odżywczych i tlenu, usuwanie odpadów, regulację stanu zapalnego i przyczynianie się do naprawy tkanek i angiogenezy6. Wreszcie, makrofagi dróg oddechowych są tkankowo specyficznymi komórkami odpornościowymi, niezbędnymi do ochrony układu oddechowego przed infekcjami, usuwania wdychanych cząstek i utrzymywania zrównoważonej odpowiedzi immunologicznej7.

Skoordynowane działania komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonka i komórek makrofagów są kluczowe dla skutecznej odpowiedzi immunologicznej na patogeny w drogach oddechowych8. Komórki nabłonkowe stanowią pierwszą linię obrony przed infekcjami wirusowymi, działając jako bariera fizyczna, ze ścisłymi połączeniami ograniczającymi przepływ szkodliwych substancji. Skoordynowane działanie komórek rzęskowych i kubkowych pomaga wychwytywać i usuwać wdychane cząsteczki, patogeny i zanieczyszczenia4. Dodatkowo komórki nabłonka dróg oddechowych wytwarzają cytokiny i chemokiny do rekrutacji komórek odpornościowych9. Komórki śródbłonka utrzymują integralność naczyń krwionośnych, zapobiegając rozprzestrzenianiu się cząsteczek wirusa w krwiobiegu, zwiększają poziom cząsteczek adhezyjnych (VCAM-1) w celu ułatwienia adhezji komórek odpornościowych i wytwarzają cytokiny prozapalne w celu rekrutacji komórek odpornościowych z krwiobiegu do miejsca infekcji10. Makrofagi dróg oddechowych pochłaniają i trawią cząsteczki wirusa, zakażone komórki i szczątki, prezentują antygeny wirusowe limfocytom T i wytwarzają cytokiny do aktywacji i rekrutacji innych komórek odpornościowych, wraz z interferonami typu I w celu zahamowania replikacji wirusa11. Skoordynowane działanie komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i makrofagów tworzy solidny i dynamiczny system obronny, który chroni drogi oddechowe przed infekcjami wirusowymi i utrzymuje zdrowie układu oddechowego.

Zrozumienie dynamicznych interakcji między różnymi typami komórek w ludzkim płucu jest kluczowe dla zrozumienia reakcji płuc na infekcje wirusowe, choroby zapalne i dostarczanie leków. Kohodowle in vitro pozwalają na badanie sygnalizacji komórka-komórka między nabłonkiem, komórkami śródbłonka i wrodzonymi komórkami odpornościowymi12. Opracowaliśmy pierwszy autentyczny wielokomórkowy model płuc pochodzący z specyficznych dla pacjenta hiPSCs13. Obejmuje to zarówno populacje komórek nabłonkowych, jak i mezenchymalnych, utworzonych w orientacji 3D. Następnie komórki progenitorowe płuc można różnicować w "organoid dróg oddechowych"14, hodować na sterylnych wkładkach do hodowli komórkowych i wystawiać na działanie interfejsu powietrze-ciecz (ALI), odtwarzając warunki panujące w ludzkich drogach oddechowych15,16,17. Komórki śródbłonka pochodzące z iPSC są hodowane po stronie podstawno-bocznej błony, naśladując ich orientację w ludzkich drogach oddechowych, znajdujących się poniżej warstwy nabłonkowej/mezenchymalnej w błonie podstawnej. Na koniec makrofagi pochodzące z iPSC są dodawane do wierzchołkowej strony błony, oddziałując z komórkami nabłonkowymi i oczekując na sygnały aktywacji (Figura 1A). Model ten dokładnie odtwarza biologię i funkcję dróg oddechowych. Zakładamy, że pochodzące z hiPSC, specyficzne dla pacjenta, autentyczne wielokomórkowe hodowle iAirway najlepiej nadają się do wyjaśnienia wewnętrznej, ostrej odpowiedzi bariery dróg oddechowych i patogenów, w tym infekcji wirusowych. Na przykład model ten może być wykorzystany do (1) badania wnikania i replikacji wirusa, (2) badania początkowej odpowiedzi immunologicznej przez nabłonkowe i tkankowo specyficzne komórki odpornościowe, (3) badania integralności i funkcji bariery, (4) testowania skuteczności środków terapeutycznych oraz (5) badania komórkowych i molekularnych mechanizmów patogenezy w modelu specyficznym dla pacjenta.

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół przygotowania wielokomórkowych kokultur płuc do badania odpowiedzi komórkowych na infekcje wirusowe.

Protokół

Ten protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of UCSD's Human Research Protections Program (181180). Protokół ten wykorzystuje małe cząsteczki i czynniki wzrostu do kierowania różnicowaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki dróg oddechowych, komórki śródbłonka i makrofagi. Komórki te są następnie hodowane wspólnie na wkładkach do hodowli komórkowych i polaryzowane w granicy faz powietrze-ciecz. Szczegółowe informacje na temat używanych odczynników, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów. Składy pożywki i znajdują się w pliku uzupełniającym 1.

1. Wytwarzanie organoidów dróg oddechowych pochodzących z iPSC (Dzień 1 - 30)

UWAGA: Ten protokół przedstawia kroki wymagane do wygenerowania organoidów dróg oddechowych pochodzących z iPSC (Rysunek 1B), zgodnie z metodologią opisaną w Leibel et al.13. Proces ten obejmuje indukcję ostatecznej endodermy (dni 1-3), wytwarzanie endodermy przedniego jelita grubego (dni 4-6) i różnicowanie w komórki progenitorowe płuc (dni 7-16). Szczegółową metodologię można znaleźć w poprzedniej publikacji13. Poniższe kroki szczegółowo opisują wytwarzanie organoidów dróg oddechowych z komórek progenitorowych płuc.

  1. Ekstrakcja i dysocjacja sferoid progenitorowych płuc z polimeru ECM (Dzień 17)
    1. Rozmrozić polimer macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (8-9 mg/ml) na lodzie.
    2. Odessać zużyte pożywki, za pomocą aspiratora próżniowego, z organoidów płuc osadzonych w ECM.
      UWAGA: Do kolejnych etapów aspiracji użyj aspiratora próżniowego, chyba że zaznaczono inaczej.
    3. Dodać 1 ml 2 U/ml dypazy uzupełnionej 10 μM inhibitora ROCK1 (ROCKi) do komórek i użyć pipety P1000 do ręcznego ponownego zawieszenia komórek progenitorowych płuc w ECM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, ponownie zawieszając mieszaninę co 15 minut w celu zwiększenia skuteczności dysocjacji dypazy poprzez obróbkę mechaniczną.
    4. 15 minut przed użyciem umieść 45 ml PBS o temperaturze pokojowej w zamrażarce o temperaturze -20 °C do schłodzenia. Upewnij się, że PBS jest zimniejszy niż 4 °C, aby uzyskać optymalną depolimeryzację ECM w kolejnych etapach.
    5. Po 30 minutach inkubacji dypazy przenieść organoid i roztwór dypazy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    6. Dodać schłodzony PBS (2 ml na 1 ml proteazy) w celu umycia i zebrania pozostałości organoidów i materiału ECM z płytki. Zawiesić organoidy za pomocą pipety P1000 i odwirować przy 400 x g przez 5 min.
      UWAGA: Wszystkie etapy wirowania są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że w niniejszym protokole określono inaczej.
    7. Po odwirowaniu powinna być widoczna mętna osada ECM z organoidami. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety, unikając osadu ECM.
    8. Wykonać drugie płukanie PBS schłodzonym PBS, zawiesić ponownie za pomocą pipety P1000 i odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Odessać supernatant za pomocą pipety, pozostawiając ~100 μl pozostałego roztworu.
    9. Dodaj 2 ml proteazy podobnej do trypsyny do organoidów w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zawiesić ponownie za pomocą pipety P1000. Inkubować przez 10-12 minut w temperaturze 37 °C, odwracając lub przesuwając probówkę w celu ponownego zawieszenia mieszaniny w połowie inkubacji.
      UWAGA: Wykonaj 10-12 minut dysocjacji proteazy podobnej do trypsyny, aby przekazać organoidy jako agregaty.
    10. Po 12 minutach zatrzymaj reakcję proteazy podobnej do trypsyny, dodając 2 ml 2% FBS do pożywki podstawowej (Stop Media, patrz plik uzupełniający 1). Zawiesić roztwór za pomocą pipety P1000 i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
    11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić organoidy w pożywce Stop uzupełnionej 10 μM ROCKi. Pobrać próbkę o objętości 10 μl do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Utrzymuj organoidy na lodzie podczas liczenia.
    12. Oblicz objętość potrzebną do uzyskania 100 000 komórek na studzienkę. Podwielokrotne komórki agreguje się w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirują przez 5 minut przy 400 x g. Usunąć nadmiar supernatantu, pozostawiając 10 μl pozostałej pożywki.
    13. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl zimnego polimeru ECM (unikaj pęcherzyków i pracuj szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji). Dodać 200 μl mieszaniny ECM i komórek na dno każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Pozostawić ECM do częściowej polimeryzacji w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 5 minut.
    14. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na 30-60 minut, aby zakończyć polimeryzację ECM. Następnie dodać 1,5 ml pożywki indukcyjnej organoidów dróg oddechowych (plik uzupełniający 1).
    15. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez 14 dni aż do 30 dnia. Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty w ciągu 24 godzin, zwiększ objętość do 2 ml.

2. Generowanie komórek śródbłonka pochodzących z iPSC (Dzień 1 - 14)

UWAGA: Poniższa procedura szczegółowo opisuje generowanie komórek śródbłonka z iPSC (Rysunek 1C), zaadaptowane z Patsch et al.18. Metoda ta obejmuje przygotowanie płytek, różnicowanie iPSC, indukcję komórek śródbłonka, sortowanie i ekspansję. W tabeli 1 wymieniono przeciwciała użyte w tym badaniu.

  1. Posiewanie iPSC w celu różnicowania śródbłonka (Dzień 0)
    1. Rozpocznij różnicowanie komórek śródbłonka, gdy hiPSC osiągną zbieg 70%-80%. Dodać 10 μM ROCKi Y-27632 do każdego dołka na godzinę przed dysocjacją.
    2. Odessać pożywkę, przemyć studzienki 1 ml PBS, a następnie zdysocjować iPSC, dodając 1 ml roztworu do odrywania komórek na dołek 12-dołkowej płytki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Zneutralizować roztwór do odrywania komórek, dodając 2 ml pożywki zatrzymującej do studzienek. Odpipetować w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g.
    4. Odessać supernatant, ponownie zawiesić iPSC w pożywkach hodowlanych iPSC uzupełnionych 10 μM ROCKi i przeprowadzić zliczanie komórek. Płytka 100 000 hiPSC na basenik 12-dołkowej płytki pokrytej ECM w 1 ml pożywki hodowlanej iPSC z 10 μM ROCKi. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Gęstość wysiewu dla różnicowania iPSC-śródbłonka może wymagać optymalizacji dla każdej linii komórkowej. Oceń skuteczność różnicowania za pomocą cytometrii przepływowej dla CD31 w dniu 6.
  2. Indukcja mezodermy bocznej (dzień 1-3)
    1. Odessać pożywki hodowlane iPSC z posianych iPSC i dodać 3 ml pożywki zasadowej N2B27 uzupełnionej 6 μM CHIR i 25 ng/ml BMP4 na basenik (plik uzupełniający 1). Podgrzej podłoże przed dodaniem go do komórek. Nie zmieniaj nośnika przez 3 dni.
  3. Indukcja komórek śródbłonka (dzień 4-5)
    1. W dniu 4 odessać pożywkę N2B27 i dodać 2 ml pożywki do różnicowania śródbłonka (EDM) uzupełnionej 200 ng / ml VEGF165 i 2 μM forskoliny na dołek. Zmień nośnik w dniu 5.
  4. Sortowanie i ponowne powlekanie komórek śródbłonka (dzień 6)
    1. W dniu 5 lub 6 należy przygotować kolbę T75 pokrytą fibronektyną do wzbogacenia sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) poprzez rozpuszczenie 1 mg fibronektyny w sterylnej wodzie w celu uzyskania 100 μg/ml roztworu fibronektyny. Pokryć kolbę T75 6 ml roztworu fibronektyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Odessać roztwór fibronektyny i przemyć sterylną wodą. Pozostawić kolbę T75 do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Dodatkowe wyprodukowane kolby można przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj pożywkę do konserwacji śródbłonka (EMM)18.
    3. W dniu 6 wzbogać komórki śródbłonka pochodzące z iPSC za pomocą FACS przy użyciu przeciwciała CD3118.
    4. Dodać 10 μM ROCKi Y-27632 do każdego dołka na godzinę przed dysocjacją w temperaturze 37°C. Odessać pożywkę i przemyć PBS. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu do oddzielania komórek do dołka na 12-dołkowej płytce i inkubować przez 8-10 minut w temperaturze 37°C.
    5. Delikatnie odpipetować, aby zapewnić odłączenie pojedynczej komórki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj równą objętość pożywki stopowej. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki śródbłonka w 1 ml pożywki zatrzymującej uzupełnionej 10 μM ROCKi. Przepuść komórki przez filtr 70 μm, najpierw dodając 1 ml pożywki zatrzymującej, aby zwilżyć filtr, a następnie pipetuj komórki przez filtr. Pobrać próbkę o objętości 10 μl do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Utrzymuj komórki na lodzie podczas liczenia.
    7. Wykonaj zliczanie komórek. Przygotować podwielokrotność 200 000 komórek jako niebarwioną kontrolę ujemną. Przenieś pozostałe komórki do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i dodaj 10 μl CD31-APC na każdy 1 milion komórek w 100 μl buforu FACS. Inkubować przez 30 minut na rotatorze w temperaturze 4 °C.
    8. Po zakończeniu inkubacji odwirować probówkę Eppendorfa z komórkami przez 5 minut przy 300 x g, przemyć komórki, dodając 1 ml PBS. Powtórz etap mycia i wirowania dwukrotnie. Ręcznie usunąć supernatant między praniami.
    9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu FACS i 5 ug/ml roztworu DAPI w celu barwienia żywotności, 5 minut przed sortowaniem. Sortuj według wytycznych instytucjonalnych.
    10. Zebrać komórki posortowane przez FACS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 2 ml EMM. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml z komórkami przez 5 minut przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki śródbłonka w 10 ml EMM uzupełnionym 10 μM ROCKi Y-27632 i penicyliną Streptomycyną (1%).
    11. Przenieść ponownie zawieszone komórki śródbłonka pochodzące z iPSC wzbogacone w FACS do kolby pokrytej fibronektyną. Równomiernie rozprowadzić komórki i umieścić na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Należy użyć co najmniej 500 000 komórek i maksymalnie 2 000 000 komórek na kolbę T75.
  5. Ekspansja i kriokonserwacja posortowanych komórek śródbłonka (Dzień 7+)
    1. Wymieniaj nośniki EMM co 2-3 dni po wzbogaceniu FACS. Gdy kolba T75 zacznie się zlewać (około 7 dni po FACS, w zależności od gęstości wysiewu), komórki śródbłonka pochodzące z iPSC można wykorzystać do kohodowli lub kriokonserwacji do przyszłych zastosowań.
    2. Przygotuj 2x roztwór do zamrażania śródbłonka przed dysocjacją komórek (80% Endo-CM2, 20% DMSO, 20 μM ROCKi).
    3. Oznaczyć probówki kriowialne we wstrzykiwaczu odpornym na etanol odpowiednimi informacjami. Identyfikator linii, numer przejścia, pożywki hodowlane, "rozmrozić w 6 studzienkach", data zamrożenia.
    4. Gdy posortowane komórki śródbłonka pochodzące z iPSC zlewają się, zainicjuj dysocjację.
    5. Umyć kolbę T75 5 ml PBS -/-.
    6. Dysocjuj komórki śródbłonka pochodzące z iPSC za pomocą 5 ml proteazy podobnej do trypsyny na T75. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C PRZEZ 10 minut, okresowo sprawdzając T75 w celu sprawdzenia, czy komórki się podniosły.
    7. Zneutralizować reakcję, dodając 5 ml pożywki Stop Media. Przenieść 10 ml komórek w roztworze do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    8. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki śródbłonka w pożywce E-CBM i pobrać 10 μl próbki do policzenia za pomocą hemacytometru.
    9. Po zliczeniu komórek podwielokrotność 1 miliona komórek na 0,5 ml pożywki EGM2.
      UWAGA: Następny krok jest zależny od czasu. Przygotuj kriowiale i naczynia do zamrażania do natychmiastowego użycia.
    10. Podwielokrotność równej objętości 2x roztworu zamrażającego do komórek śródbłonka. Końcowe stężenie to 90% Endo-CM2, 10% DMO i 10 μM ROCKi (1 ml/1 milion komórek).
    11. Natychmiast przenieść zakorkowane fiolki do komory zamrażania i umieścić w temperaturze -80 °C na noc, a następnie w ciekłym azocie (-180 °C) następnego dnia w celu długotrwałego przechowywania.

3. Generacja makrofagów pochodzących z iPSC (Dzień 1 - 26)

UWAGA: Ta procedura przedstawia kroki generowania makrofagów z iPSC (Rysunek 1D), zaadaptowane z van Wilgenburg et al.19 i Pouyanfard et al.20. Obejmuje jednokomórkową adaptację iPSC, różnicowanie ciała zarodka, tworzenie progenitorów makrofagów i dojrzewanie makrofagów.

  1. Jednokomórkowa adaptacja iPSC
    1. Gdy iPSC osiągną konfluencję ~70%-90% bez widocznych oznak różnicowania, rozpocznij pasaż pojedynczej komórki z proteazą podobną do trypsyny.
    2. Odessać zużytą pożywkę i spłukać PBS. Usuń PBS i dodaj proteazę podobną do trypsyny (1 ml / dołek płytki 6-dołkowej, 500 μl / dołek płytki 12-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut, aż kolonie iPSC oddzielą się od płytki.
    3. Zneutralizować proteazę podobną do trypsyny równą objętością pożywki Stop (1 ml / dołek płytki 6-dołkowej, 500 μl / dołek płytki 12-dołkowej). Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
    4. Odessać supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej iPSC za pomocą 10 μM ROCKi. Przejście na nowe płyty z powłoką ECM. Powtórz dla 2-3 pasaży przed krioprezerwacją lub użyciem dostosowanych do pojedynczych komórek iPSC.
      UWAGA: Dostosuj współczynnik przejścia od 1:2 do 1:10 w zależności od stanu i adaptacji komórek. Ponadto iPSC, które przeszły co najmniej trzy pasaże jednokomórkowe i mają niską pasażność, dają optymalne różnicowanie makrofagów.
  2. Tworzenie się ciała zarodka (Dzień 0-6)
    1. Gdy jednokomórkowe adaptacje iPSC osiągną ~75% konfluencji, pasuj iPSC z proteazą podobną do trypsyny, zgodnie z krokami 3.1-3.4.
    2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce Stop Media i przepuścić przez sitko o wielkości 70 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia grudek. Zawiesić komórki i pobrać 10 μl próbki do zliczenia komórek za pomocą hemacytometru.
    3. W celu wytworzenia ciała zarodkowego (EB) 8 000-50 000 komórek jest sianych na dołek 96-dołkowej płytki o bardzo niskim przyczepieniu (ULA). Oblicz całkowitą liczbę komórek potrzebnych do wysiewu 60 dołków 96-dołkowej płytki ULA.
      UWAGA: Gęstość wysiewu iPSC może wymagać optymalizacji dla każdej linii komórkowej.
    4. Odwirować iPSC w stożkowym nakładzie o pojemności 15 ml przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant.
    5. W przypadku 480 000 iPSC (8 000 komórek / studzienkę w 60 dołkach) należy zawiesić w 6 ml (100 ul/studzienka w 60 dołkach) pożywce indukcyjnej EB.
    6. Dodać 150 μl PBS do 36 zewnętrznych dołków 96-dołkowej płytki ULA z okrągłym dnem.
    7. Zawieś ponownie i przenieś iPSC z nośnika EB do koryta nośnika. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl/studzienkę zawiesiny komórek do środkowych 60 dołków 96-dołkowej płytki ULA. Okresowo zawieszaj iPSC w pożywkach EB, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek.
    8. Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (jeśli jest dostępna). Przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C.
    9. Po 48-72 h wymienić 50 μl pożywki (podmiana o połowę). Sprawdź, czy nie tworzy się torbiel po 6 dniach.
      UWAGA: Niektóre linie iPSC tworzą EB wcześniej lub łatwiej niż inne. Monitoruj tworzenie się EB i upewnij się, że EB są przenoszone w odpowiednim punkcie czasowym (powinny rozwijać się torbiele).
  3. Otoczka żelatynowa i transfer EB w celu tworzenia progenitorów makrofagów (Dzień 6-19)
    1. Przygotuj dwie 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną o stężeniu 0,1%. Dodaj 1 ml 0,1% żelatyny do dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Zassać roztwór żelatyny i pozostawić płytki do wyschnięcia w okapie na 30-60 minut.
    2. Przenieść EB z płytki 96-dołkowej na płytki 6-dołkowe pokryte żelatyną za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml. Rozprowadzić około 8-10 EB na dołek 6-dołkowej płytki pokrytej żelatyną.
    3. Ostrożnie usuń resztki zużytego nośnika EB z transferu. Dodać 2 ml pożywki do hodowli makrofagów 1 (Mac-CM1) do dołka. Inkubować EB w spokoju w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5-7 dni.
      UWAGA: Idealnie, jedną 96-dołkową płytkę z ciałami zarodków można podzielić na dwie 6-dołkowe płytki. Jeśli EB są słabo rozwinięte, liczbę EB przenoszonych na płytkę 6-dołkową można dostosować, aby zoptymalizować etap różnicowania iPSC do ciała zarodka.
  4. Pokolenie progenitorów makrofagów
    1. Wymieniaj 2/3 podłoża dwa razy w tygodniu, zwiększając objętość do 3 ml, jeśli zmieni się kolor nośnika.
    2. Sprawdź kultury między 8 a 19 dniem, aby określić, czy są gotowe do pobrania prekursorów makrofagów. Jeśli EB oderwą się, przenieść EB na świeżo pokrytą płytkę z Mac-CM1 i inkubować w spokoju przez 7 dni.
      UWAGA: Utrzymanie kompleksu tworzącego progenitory makrofagów ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju i ciągłego generowania progenitorów makrofagów. Zoptymalizowane kompleksy tworzące progenitory makrofagów będą stale generować mieloidalne komórki progenitorowe przez 2-6+ miesięcy.
  5. Zbieranie przodków szpiku (dzień 19-26+)
    1. Gdy w zawiesinie znajdują się komórki progenitorowe makrofagów, należy pobrać pożywkę z komórkami i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant.
    2. Zawiesić progenitory makrofagów w Mac-CM2 i przenieść do niepoddanego działaniu substancji sterylnego naczynia/kolby hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3-4 dni.
      UWAGA: W zależności od liczby pobranych komórek, przenieść na 10-centymetrową szalkę Petriego (3-4 dołki na płytce 6-dołkowej), kolbę T25 (1-2 dołki na płytce 6-dołkowej) lub kolbę T75 (pełna płytka 6-dołkowa) z odpowiednią objętością pożywki. Użyj 5-6 ml pożywki dla kolby T25, 10-12 ml pożywki na szalce Petriego i 12-15 ml pożywki dla kolby T75. W przypadku kolejnych zbiorów, przodkowie szpiku i komórki makrofagów mogą być łączone z poprzednich zbiorów, jeśli pochodzą z tej samej linii/kompleksów tworzących szpik. Wystarczy upewnić się, że kolba jest wystarczająca do utrzymania i nakarmienia liczby komórek w kolbie (kolbach). Makrofagi nie namnażają się; Są one generowane z komórek progenitorowych makrofagów. Makrofagi można gromadzić i utrzymywać przez 2-6 tygodni bez utraty markerów ekspresji.
  6. Zbieranie makrofagów
    UWAGA: Po 14 dniach różnicowania makrofagów w pożywkach Mac-CM2 kultury makrofagów są gotowe do kohodowli lub analizy cytometrii przepływowej.
    1. Zebrać zużytą pożywkę i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać kolbę/płytkę PBS w celu usunięcia resztek podłoża i komórek.
    2. Dodać pożywkę bazową do kolby (3 ml dla T25 i 5 ml dla T75) i użyć sterylnego skrobaka do komórek, aby oderwać komórki od dna kolby/płytki. Przenieś komórki do stożkowej rurki i w razie potrzeby powtórz skrobanie.
    3. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim podłożu lub buforze do dalszego użycia.

4. Wspólna hodowla komórek dróg oddechowych, komórek śródbłonka i makrofagów

UWAGA: Ta procedura opisuje etapy kohodowli komórek dróg oddechowych, komórek śródbłonka i makrofagów (Rysunek 1A) przy użyciu wkładek do hodowli komórkowych, zaadaptowanych z Costa et al.12.

  1. Powlekanie ECM wkładek do hodowli komórkowych do kohodowli (dzień 0 kohodowli)
    1. Płytki do hodowli komórkowych z poliestru (PET) o porach 3,0 μm pokryć roztworem ECM o stężeniu 4 mg/mL. Krótko pokryć wierzchołkową stronę wkładek do hodowli komórkowych w płytce roztworem ECM w ilości 4 mg/ml. Odpipetować pozostały roztwór ECM. Umieścić płytkę w inkubatorze na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Otrzymać dużą szalkę Petriego (100 mm x 20 mm lub 150 mm x 20 mm). Za pomocą czystej pęsety sterylnie przenieś wkładki do hodowli komórkowych z 12-dołkowej płytki na dużą szalkę Petriego. Odwróć wkładki tak, aby strona podstawno-boczna była wyprostowana.
    3. Pokryj stronę podstawno-boczną roztworem ECM o stężeniu 4 mg/mL. Odpipetować pozostały roztwór ECM. Umieścić szalkę Petriego z wkładkami do hodowli komórkowych pokrytymi ECM w inkubatorze o temperaturze 37 °C do wyschnięcia przez noc.
  2. Dysocjacja i posiew komórek śródbłonka pochodzących z iPSC (dzień 1 kohodowli)
    1. Przemyć kolbę T75 PBS i odsysać roztworem. Dodać 5 ml proteazy trypsynopodobnej do kolby T75 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut. Oceń wzrokowo, czy komórki śródbłonka uniosły się z kolby.
      UWAGA: Wydłużyć czas dysocjacji proteazy podobnej do tysyny, jeśli komórki śródbłonka pochodzące z iPSC nie uniosły się z kolby.
    2. Postukaj w kolbę, aby zapewnić oderwanie komórek śródbłonka i przenieść komórki do stożkowego o pojemności 15 ml. Dodaj 5 ml pożywki Stop Media, aby zatrzymać dysocjację. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do hodowli śródbłonka z 10 μM ROCKi. Uzyskać 10 μl roztworu zawieszonego do zliczania komórek i umieścić komórki na lodzie podczas liczenia.
    4. Użyj 150 000 komórek śródbłonka iPSC na 12 mm wkładkę do hodowli komórkowej w 100 μl pożywki do hodowli śródbłonka. Dostosuj odpowiednią objętość nośnika, aby osiągnąć żądaną liczbę komórek na wkładkę.
    5. Otrzymać z inkubatora szalkę Petriego z wkładkami do hodowli komórkowych 3,0 μm pokrytymi ECM (patrz kroki 4.1-4.3).
    6. Ponownie zawiesić komórki śródbłonka iPSC i pipetować 100 μl ze 150 000 komórek na odwróconą wkładkę do hodowli komórek (stroną podstawno-boczną skierowaną do góry). Powtórzyć pipetowanie dla każdej z przygotowanych wkładek do hodowli komórkowych
    7. Ostrożnie przenieś komórki do inkubatora i pozostaw je w spokoju na 3 godziny.
    8. Na 12-dołkowej płytce dodać 1 ml pożywki do hodowli śródbłonka do każdej studzienki (dla odpowiedniej liczby przygotowanych wkładek do hodowli komórkowych).
    9. Wyjmij szalkę Petriego z komórkami śródbłonka z inkubatora. Za pomocą czystej pęsety ostrożnie przenieś wkładki do hodowli komórkowych na płytkę z pożywką do hodowli śródbłonka (odwracając wkładkę tak, aby spód był teraz skierowany w dół do podłoża).
    10. Sprawdź wzrokowo pod mikroskopem, czy komórki śródbłonka przylegały. Umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Dysocjacja i posiew organoidów dróg oddechowych pochodzących z iPSC (dzień 2 kohodowli)
    UWAGA: Patrz kroki 1.1.1-1.1.15 w celu wyizolowania organoidów dróg oddechowych z polimeru ECM. Zmodyfikuj czas dysocjacji proteazy trypsynopodobnej (krok 1.1.10) do 15-20 minut, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    1. Po 15-20 minutach zatrzymaj reakcję proteazy podobnej do trypsyny, dodając 3 ml Stop Media. Zawiesić roztwór za pomocą pipety P1000 i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić organoidy dróg oddechowych w 1 ml pożywki rozprężającej drogi oddechowe z 10 μM ROCKi. Pobrać próbkę o objętości 10 μl do zliczania komórek za pomocą hemacytometru i podczas liczenia umieścić komórki na lodzie.
    3. Zasiać 300 000 komórek dróg oddechowych iPSC w 500 μl pożywki rozszerzającej drogi oddechowe na 12 mm wkładkę do hodowli komórkowej. Dostosuj odpowiednią objętość nośnika, aby osiągnąć żądaną liczbę komórek na przygotowaną wkładkę.
    4. Wyjąć płytkę z wkładkami do hodowli komórkowych z komórkami śródbłonka (wysianymi po stronie podstawno-bocznej) z inkubatora o temperaturze 37 °C.
    5. Ponownie zawiesić komórki iPSC dróg oddechowych i pipetować 500 μl z 300 000 komórek do komory wierzchołkowej każdej wkładki do hodowli komórkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 48 godzin z komórkami wierzchołkowymi w stanie ciecz-płyn.
  4. Współkultura z podnoszeniem powietrza (Dzień 4 kokultury)
    1. Usuń pożywkę z wierzchołkowej strony wkładki do hodowli komórkowej. Zmień pożywki podstawno-boczne na pożywki różnicujące drogi oddechowe 1:1 i pożywki do hodowli śródbłonka. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
  5. Dysocjacja i posiew makrofagów pochodzących z iPSC (dzień 5 kohodowli)
    1. Oddzielić makrofagi pochodzące z iPSC od kolby za pomocą skrobaka do komórek (patrz kroki 3.22-3.24). Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odsysać supernatant.
    2. Ponownie zawiesić makrofagi iPSC w 1 ml Mac-CM2. Pobrać próbkę o objętości 10 μl do zliczania komórek i podczas liczenia umieścić komórki na lodzie. Liczba makrofagów będzie odzwierciedlać liczbę zasianych komórek dróg oddechowych (stosunek makrofagów do komórek dróg oddechowych 1:1).
    3. Po zliczeniu komórek, podwielokrotność 300 000 makrofagów w pożywce 35 μl na dołek przygotowanej hodowli komórkowej wprowadza się do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    4. Po odwirowaniu odpipetować supernatant. Ponownie zawieś makrofagi w odpowiednim Mac-CM2 z obliczeń.
    5. Usunąć z inkubatora wkładki z kokulturami komórek śródbłonka i dróg oddechowych. Umieść 300 000 makrofagów w 35 μl Mac-CM2 na wierzchołkowej stronie wkładki do hodowli komórkowej. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 48 godzin
      UWAGA: Aby potwierdzić przyleganie komórek odpornych na iPSC do wkładki do hodowli komórkowej, komórki można oznaczyć sondą fluorescencyjną. Potwierdź przestrzeganie za pomocą mikroskopii dla sygnału fluorescencyjnego 48 godzin po posiewie makrofagów.
  6. Potrójna kokultura (7 dzień kokultury)
    1. Upewnij się, że kokultura jest gotowa do dalszych zastosowań, takich jak badania infekcji, pomiary transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) i testy integralności bariery.

Wyniki

Istnieje wiele etapów, na których można ocenić, czy różnicowanie organoidów dróg oddechowych, komórek śródbłonka, komórek odpornościowych oraz kokultur pochodnych z iPSC zostało pomyślnie zakończone. Różnicowanie można przeprowadzać na różnych liniach iPSC, a niniejszy protokół został przetestowany na co najmniej pięciu różnych liniach. Protokół wymaga dostosowania do każdej nowej linii iPSC, w szczególności poprzez modyfikację i optymalizację gęstości wysiewu.

Wydajność uzyskiwania organoidów dróg oddechowych pochodzących z iPSC można ocenić poprzez w polu jasnym i będą charakteryzować się czterema cechami: wyraźnymi granicami/krawędziami, przezroczystą/cystyczną morfologią, zdolnością do proliferacji/rozrostu oraz brakiem komórek nekrotycznych. Organoidy dróg oddechowych, które wydają się rozmyte, nie zwiększają rozmiarów w ciągu 2 tygodni hodowli i wykazują martwicę, nie powinny być wykorzystywane do eksperymentów z kokulturą. Organoidy z grubą warstwą luminalną na obwodzie kontraprzezroczyste/cysticzne organoidy mogą być nadal wykorzystywane w kolejnych eksperymentach. Jednakże przezroczyste/cysticzne organoidy dróg oddechowych składają się głównie z komórek podstawkowych, podczas gdy organoidy z grubą podwójną błoną składają się głównie z komórek Club. Ponieważ komórki podstawkowe łatwo proliferują i namnażają się, są one bardziej odpowiednie do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz oraz do polaryzacji. Innymi metodami oceny skuteczności uzyskania organoidów płuc pochodzących z iPSC są analiza cytometryczna na etapie progenitorów płuc (16. dzień różnicowania) pod kątem markeru powierzchniowego CPM (Tabela 1), pomyślna wydajność różnicowania >50% komórek CPM+.

W przypadku dysocjacji organoidów dróg oddechowych i hodowli na granicy faz powietrze-ciecz należy upewnić się, że cały polimer ECM został usunięty, w przeciwnym razie uniemożliwi to rozprzestrzenianie się komórek na błonie. Do 3. dnia hodowli, przed wystawieniem na powietrze, komórki powinny tworzyć warstwę konfluencyjną. Potwierdzenie typów komórek w iAirways można przeprowadzić poprzez barwienie na odpowiednie markery specyficzne dla danego typu komórek: komórek podstawnych (p63+), komórek klubniczkowych (SCGB1A1+), komórek kubkowych (MUC5AC+) oraz komórek rzęskowych (AcTub+). Charakterystyka i typowe markery specyficzne dla typów komórek płuc są weryfikowane w bazie LungMAP21. Mezenchymę można wykryć za pomocą przeciwciał przeciwko wimentynie lub aktynie mięśni gładkich. Aby uzyskać więcej komórek rzęskowych, hodowle mogą wymagać dłuższego czasu ekspozycji na powietrze lub dodania DAPT.

Poprawność uzyskania komórek śródbłonka pochodnych z iPSC można ocenić za pomocą mikroskopii w polu jasnym, co objawia się morfologią przypominającą bruk (6. dzień różnicowania komórek śródbłonka pochodnych z iPSC). Prawidłowa hodowla komórek śródbłonka pochodnych z iPSC powinna zawierać >50% komórek CD31+, a liczba wygenerowanych komórek powinna być na tyle duża, aby po sortowaniu uzyskiwała więcej niż 500 000 komórek. Komórki można pasażować lub kriozachować, a marker CD31 powinien być testowany za pomocą cytometrii przepływowej przy każdym pasażu lub nowej hodowli. Komórek nie należy pasażować powyżej P4. W celach referencyjnych należy zapoznać się z komórkami śródbłonka pochodnymi z iPSC przed i po sortowaniu CD31 (Rysunek 1C). Komórki śródbłonka będą płaskie, z dużym ciałem komórki o wydłużonej i wrzecionowatej morfologii.

W celu różnicowania w makrofagi ciała zarodkowe powinny pozostać na dnie dołka ULA, a w każdym dołku powinno znajdować się tylko jedno EB. Między 5. a 7. dniem powinny pojawić się zmiany torbielowate. Jeśli po wirowaniu nie utworzą się ciała zarodkowe, należy wysiać iPSC na płytkę ULA z 96 dołkami bez wirowania. Konieczne może być zwiększenie liczby iPSC. Skuteczna wydajność otrzymywania komórek odpornościowych pochodzących z iPSC jest całkowicie zależna od zdolności ciał zarodkowych (EB) do rozwoju w torbiele (7. dzień różnicowania). Odpornościowe EB pochodzące z iPSC, które nie rozwiną torbieli, nie utworzą zrostu po wysianiu na żelatynę i nie wyprodukują progenitorów mieloidalnych. Po przeniesieniu na płytkę pokrytą żelatyną EB powinny pozostać przytwierdzone do dna płytki. Przenoszenie płytki należy wykonywać ostrożnie, aby ich nie odczepić. Płytki powinny być wymieniane ręcznie dwa razy w tygodniu, a zawieszone komórki należy pasażować do Mac-CM2 lub krioziachować. Dodatkowo, po zbiorze zawieszonych progenitorów mieloidalnych, powinny one przylegać do niepowlekanej plastikowej kolby i tworzyć w świetle przeświecanym jasne komórki z wakuolami, co wskazuje na makrofagi. Marker monocytów CD14+ powinien wynosić >90% w zawieszonych komórkach. Marker makrofagów CD68 powinien wzrastać w czasie, przy czym ok. 50% makrofagów wykazuje ekspresję CD68+ po 2 tygodniach (Rycina 1D). Efektywność adhezji powinna być określona dla każdej linii komórkowej. Osiągamy średnią efektywność adhezji na poziomie 20%. W celu polaryzacji makrofagi M0 są polaryzowane do makrofagów M1 (iPSC-M1) lub M2 (iPSC-M2) przez 48 h w medium różnicującym II uzupełnionym o różne stymulatory: 100 ng/mL LPS i 20 ng/mL IFN-g dla polaryzacji M1 lub 50 ng/mL IL-4 i 20 ng/mL IL-13 dla polaryzacji M2. Markerem polaryzacji M1 jest CD80+, a polaryzacji M2 jest CD206+.

Prawidłowe utworzenie potrójnej kokultury można ocenić za pomocą immunofluorescencji na markery połączeń ścisłych nabłonkowych EPCAM, ECAD lub ZO-1, bądź marker połączeń ścisłych śródbłonka CD31 (Rysunek 2C, Tabela 1). Funkcjonalność potrójnej kokultury można również ocenić poprzez pomiar transepiteliatnego/transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER). Prawidłowo uformowane kokultury organoidów dróg oddechowych i śródbłonka będą wykazywać wyższy opór elektryczny, co wskazuje na optymalną komunikację i połączenia między komórkami. Czynniki szkodliwe z otoczenia, takie jak e-papierosy czy infekcja wirusowa, zaburzą integralność bariery nabłonkowej i śródbłonkowej, co doprowadzi do zmniejszenia oporu elektrycznego kokultury (Rysunek 3A,B) oraz dezorganizacji połączeń ścisłych (Rysunek 3C).

Schemat różnicowania iPSC z konfiguracją tri-kultury; mikroskopia, dane z cytometrii przepływowej dla E-CAD i CD31.
Rysunek 1: Różnicowanie i charakterystyka kultur nabłonka dróg oddechowych, śródbłonka i komórek odpornościowych pochodzących z iPSC. (A) Schemat ukierunkowanego różnicowania iPSC w celu stworzenia modelu iAirway. (B) Organoidy nabłonka dróg oddechowych pochodzące z iPSC charakteryzowane za pomocą mikroskopii w polu jasnym (lewo) oraz analizy cytometrii przepływowej (prawo) pod kątem EPCAM i ECAD. (C) Śródbłonek dróg oddechowych pochodzący z iPSC charakteryzowany za pomocą mikroskopii w polu jasnym (lewo), immunofluorescencji i analizy cytometrii przepływowej (prawo) pod kątem CD31. Po prawej stronie przedstawiono odpowiedni obraz w polu jasnym po sortowaniu CD31. (D) Makrofagi pochodzące z iPSC charakteryzowane za pomocą mikroskopii w polu jasnym (lewo) oraz analizy cytometrii przepływowej (prawo) pod kątem panhematopoetycznego markera CD45, markera monocytów CD14 i markera makrofagów CD68. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu z potrójną hodowlą komórek, przedstawiający układ kokultury komórek nabłonkowych, śródbłonkowych i odpornościowych.
Rysunek 2: Kokultura komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i makrofagów pochodzących z iPSC. (A) Schemat montażu iAirway. (B) Obrazy w jasnym polu odpowiednio dla monokultury nabłonkowej i śródbłonkowej, bikultury nabłonkowej i śródbłonkowej oraz kokultury nabłonkowej, śródbłonkowej i makrofagów. Makrofagi znakowane czerwonym cytotrackerem. Paski skali: 100 µm. (C) Barwienie immunofluorescencyjne markera białek połączeń ścisłych ZO-1 po stronie apikalnej wkładki do hodowli komórkowej oraz CD31 po stronie bazolateralnej. Paski skali: 100 µm. (D) Przekrój poprzeczny wkładki do hodowli komórkowej z dysocjowanymi organoidami dróg oddechowych po stronie apikalnej, 1 tydzień po przejściu na interfejs powietrzny (air-lift). Lewy panel z barwieniem H&E, gdzie czarna strzałka wskazuje komórki rzęskowe. Środkowy panel z obrazowaniem immunofluorescencyjnym pokazuje marker nabłonkowy E-cadherin (ECAD). Prawy panel z obrazowaniem immunofluorescencyjnym pokazuje markery mezenchymalne, takie jak vimentin (VIM) i aktyna mięśni gładkich (SMA). Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres TEER dla kokultury nabłonkowo-śródbłonkowej, obrazy mikroskopowe z analizą ZO-1, DAPI i ECAD.
Rycina 3: Zmiany w funkcji bariery dróg oddechowych iAirways poddanych działaniu e-papierosów i wirusów. (A) Schemat narzędzia do pomiaru transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER). (B) Wykres słupkowy TEER po 7 dniach dodania do medium e-papierosa mentolowego. Średnia +/- 95% przedział ufności. N = 5 powtórzeń biologicznych i 3 powtórzeń technicznych; wartość p <0,001. (C) Barwienie immunofluorescencyjne białka ZO-1 zcisków szczelnych przed i po infekcji SARS-CoV-2. Zwróć uwagę na zaburzoną strukturę ZO-1 po infekcji. Paski skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

PrzeciwciałoZastosowanieRozcieńczanie
CD 31 PECAM-1(APC)cytometria przepływowa (FC)10 μl w 100 µl buforu
EPCAM/CD 326 (APC)FC 1:500
E-CAD/CD 324 (APC)FC5 μl w 100 µl buforu
CPMFC 1:200
CD 45 (PE)FC5 μl w 100 $\mu$l buforu
CD 14 (FITC)FC5 μl w 100 µl buforu
CD 68 (PE)FC5 μl w 100 µl buforu
ZO-1Immunofluorescencja (IF) 1:300
WimentynaIF 1:200
SMAIF 1:100

Tabela 1: Przeciwciała użyte w FACS i immunofluorescencji.

Plik uzupełniający 1: Składy mediów i buforów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opracowanie i wdrożenie modelu bariery krew-powietrze w dużych drogach oddechowych do badania infekcji wirusowych i innych toksyn wymaga skrupulatnej dbałości o szczegóły, aby zapewnić pomyślne różnicowanie i funkcjonowanie różnych typów zaangażowanych komórek. Dyskusja ta będzie dotyczyła kluczowych czynników skutecznego różnicowania, potencjalnych wyzwań, alternatywnych zastosowań i implikacji dla badania chorób ludzkich.

Aby zapewnić pomyślne różnicowanie, ważne jest zwrócenie uwagi na rodzaj wkładki do hodowli komórkowej i wielkość porów. Należy wykorzystać duże pory, aby zapewnić komunikację komórka-komórka poprzez warstwy ECM. Zapewnienie optymalnej gęstości wysiewu dla linii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) ma kluczowe znaczenie. Odpowiednia gęstość ułatwia równomierne różnicowanie i zapobiega tworzeniu się niepożądanych grudek komórkowych, prowadząc do bardziej jednorodnej i funkcjonalnej warstwy nabłonka. Aby utrzymać zdrową i funkcjonalną warstwę nabłonka, ważne jest umycie powierzchni wierzchołkowej przed dodaniem jakichkolwiek związków, toksyn lub wirusów. Pomaga to usunąć nagromadzony śluz, martwe komórki i inne zanieczyszczenia, promując w ten sposób stabilne i żywotne środowisko hodowli oraz umożliwiając dostęp do komórek nabłonka.

W przypadku komponentu śródbłonka konieczne jest upewnienie się, że komórki są odpowiednio posortowane i jednorodne. Można to osiągnąć za pomocą technik takich jak FACS, który zapewnia, że używane są tylko pożądane komórki śródbłonka, zachowując w ten sposób spójność i funkcję.

W przypadku składnika makrofagów, pomimo łatwego przylegania do plastiku, makrofagi nie przylegają dobrze do komórek nabłonka wierzchołkowego. Zwiększenie liczby makrofagów może być korzystne dla zapewnienia dużej populacji makrofagów w iAirways. Przylegające makrofagi są lepiej przygotowane do interakcji z patogenami i innymi komórkami odpornościowymi, co zwiększa znaczenie modelu. Jeśli preferowane jest badanie śródbłonkowej sygnalizacji immunologicznej, makrofagi można wysiać w podstawno-bocznej stronie wkładów hodowli komórkowych w pożywce, aby naśladować krążącą populację monocytów22.

Model iAirway ma kilka innych istotnych zastosowań, w tym badanie rozwoju płuc dróg oddechowych. Model może być wykorzystany do badania skomplikowanych procesów związanych z rozwojem płuc, który obejmuje sygnalizację wielokomórkową między różnymi populacjami komórek, dostarczając wglądu w normalne i patologiczne stany. Aby zbadać rozwój i chorobę pęcherzyków płucnych, organoidy dróg oddechowych można zastąpić organoidami dystalnych płuc (DLO)23,24 Pozwala to naukowcom badać dystalne płuco, w tym rozwój i funkcję pęcherzyków płucnych. Jest to szczególnie przydatne do generowania i badania makrofagów pęcherzykowych, które odgrywają kluczową rolę w odporności płuc.

Opracowanie wiarygodnego i powtarzalnego modelu bariery krew-powietrze w dużych drogach oddechowych wiąże się z kilkoma wyzwaniami. Komórki progenitorowe płuc muszą wyrażać więcej niż 50% NKX2-1, aby pomyślnie się różnicować. Jeśli plon nie zostanie osiągnięty, kultury ALI mogą zawierać więcej mezenchymy lub być zanieczyszczone komórkami nabłonkowymi innymi niż płuca. Utrzymanie sterylności podczas posiewu komórek śródbłonka jest poważnym wyzwaniem, ponieważ są one hodowane po podstawno-bocznej stronie wkładki do hodowli komórkowej. Zapobiega to zamykaniu się pokrywy płytki w sterylnym środowisku, dlatego podczas wysiewu komórek śródbłonka należy użyć innych płytek. Zanieczyszczenia mogą zakłócić hodowlę i zagrozić integralności modelu. Większość kultur ALI jest inkubowana przez co najmniej 3 tygodnie w celu wytworzenia większości komórek dróg oddechowych, w tym komórek rzęskowych. Większość protokołów wysiewa komórki podstawne, a zatem musi dać czas mechanizmom sygnalizacyjnym na zróżnicowanie innych komórek dróg oddechowych. Obecny protokół dysocjuje organoidy dróg oddechowych, które zawierają już wiele komórek dróg oddechowych, choć w mniejszych ilościach w porównaniu z dojrzałym ALI pochodzącym z HBEC. Niewiele komórek rzęskowych jest widocznych wraz z typami komórek nabłonkowych i mezenchymalnych (ryc. 2D). Aby wytworzyć więcej komórek rzęskowych, DAPT można dodać do kultur organoidów dróg oddechowych i/lub pożywki ALI25. Platforma ta przetestowała również tylko krótkoterminową żywotność komórek wierzchołkowych i podstawno-bocznych po podnoszeniu powietrznym, gdy media podstawno-boczne są zmieniane na media nabłonkowe i śródbłonkowe w stosunku 1:1. Należy przeprowadzić więcej badań, aby przetestować żywotność w ciągu kilku tygodni, co może zwiększyć złożoność komórek w ALI.

Model bariery krew-powietrze ma głębokie implikacje dla badania chorób człowieka i opracowywania interwencji terapeutycznych. Model może być używany do badań przesiewowych i optymalizacji środków terapeutycznych, w tym leków przeciwwirusowych, zapewniając fizjologicznie istotne środowisko, które naśladuje ludzkie drogi oddechowe, zwłaszcza w przypadku ekspozycji komórek dróg oddechowych na działanie powietrza. Techniki nokautu genów mogą być stosowane do badania specyficznych mechanizmów dysfunkcji bariery i interakcji gospodarz-patogen. Model oferuje platformę do badania różnych aspektów chorób układu oddechowego u ludzi, od infekcji wirusowych po choroby przewlekłe, takie jak astma i POChP. Wiedza ta może prowadzić do opracowania skuteczniejszych i bardziej ukierunkowanych terapii.

Podsumowując, model bariery krew-powietrze dużych dróg oddechowych (iAirway) stanowi potężne narzędzie do badania dysfunkcji bariery spowodowanej infekcjami wirusowymi i innymi chorobami układu oddechowego. Zapewnienie skutecznego różnicowania typów komórek, sprostanie wyzwaniom rozwojowym i zbadanie alternatywnych zastosowań zwiększy użyteczność i dokładność tego modelu. Jego zastosowanie w badaniach nad celowaniem terapeutycznym i nokautem genów podkreśla jego potencjał w pogłębianiu wiedzy i leczeniu chorób układu oddechowego u ludzi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez CIRM (DISC2COVID19-12022).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweCorning3512
wkładki 12-dołkowe, 0,4 i mikro; m, półprzezroczysty VWR10769-208
2-merkaptoetanol Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnowacyjna technologia komórkowaAT104
Activin A R& D Systems338-AC
Kwas all-trans retinowy (RA) Sigma-AldrichR2625
kwas askorbinowySigmaA4544
B27 bez kwasu retinowego ThermoFisher12587010
BMP4 R& D Systems314-BP/CF
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V, roztwór 7,5% Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R& D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
Deksametazon Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR& D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR& D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS Gibco10082139
FGF10R& D Systems345-FG/CF
FGF7R& D Systems251-KG/CF
FibronectinFisher356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax Technologie życiowe35050061
szynce" s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove' s Zmodyfikowany Dulbecco" s Średni (IMDM) + Glutamax Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
Monotioglicerol Zestaw SigmaM6145
mTeSR plus (10 sztuk w opakowaniu)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen/paciorkowiecLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax Technologie życiowe12633012
SB431542 R& D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
Sygnalizacjakomórkowa Vimentin5741S
Y-27632 (inhibitor skał) R& D Systems1254/1
ZO-1Invitrogen339100

Bibliografia

  1. Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine. Respir Res. 23 (1), 122(2022).
  2. Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).
  3. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  4. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).
  5. Khalilgharibi, N., Mao, Y. To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease. Open Biol. 11 (2), 200360(2021).
  6. Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation. Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).
  7. Parker, D., Prince, A. Innate immunity in the respiratory epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).
  8. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  9. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).
  10. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).
  11. Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection. Front Immunol. 13, 1012048(2022).
  12. Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier. Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).
  13. Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease. J Vis Exp. (170), e62456(2021).
  14. Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).
  15. Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides. Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).
  16. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).
  17. Hao, S., et al. Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium. mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).
  18. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).
  19. Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), e71098(2013).
  20. Pouyanfard, S., et al. Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis. Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).
  21. Ardini-Poleske, M. E., et al. Lungmap: The molecular atlas of lung development program. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).
  22. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).
  23. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).
  24. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  25. Firth, A. L., et al. Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model dróg oddechowych z iPSCsystem kokulturykomórki mezenchymalne nabłonkakomórki śródbłonkakokultura makrofagówgranica powietrze-cieczorganoidy płuctest funkcji barierowejmodelowanie chorób układu oddechowego
Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.