Jednoetapowa ekstrakcja i analiza zymograficzna żelatynaz bakteryjnych

Podsumowanie

Proteinazy są niezbędne dla patogenezy bakterii, umożliwiając inwazję i unikanie odporności. Jednoetapowa ekstrakcja białek cytoplazmatycznych i błonowych bakterii w ich aktywnej postaci jest wstrząsająca. Ten artykuł wideo przedstawia ekstrakcję całych białek komórkowych Leptospira do analizy zymografii w celu wykrycia i scharakteryzowania żelatynaz.

Streszczenie

Proteinazy bakterii chorobotwórczych przyczyniają się do inwazji i patogenezy poprzez aktywną degradację składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) gospodarza i barier komórkowych, modyfikację odpowiedzi immunologicznej gospodarza i degradację systemu obronnego gospodarza. To sprawia, że proteinazy są jedną z najbardziej zjadliwych cząsteczek, a ich identyfikacja i charakterystyka są niezbędne do zapobiegania i kontrolowania chorób. Wiele bakterii posiada również proteinazy związane z błoną zewnętrzną. Izolacja i charakterystyka białek błony zewnętrznej w ich aktywnych formach stanowi poważne wyzwanie ze względu na ich lokalizację w błonie zewnętrznej. W tym badaniu demonstrujemy jednoetapową metodę ekstrakcji zarówno cytoplazmatycznych, jak i związanych z błoną zewnętrzną żelatynaz z Leptospira i wykazujemy ich aktywność enzymatyczną za pomocą zymografii. W tej metodzie używamy deoksycholanu sodu do przerwania błony komórkowej i uwolnienia związanych białek oraz kwasu 6-aminokapronowego do rozpuszczania uwolnionego białka błonowego w jego natywnej postaci. Ponadto pokazujemy analizę zymograficzną żelaz leptospiralnych. Takie podejście zapewnia wszechstronne ramy do izolowania, oczyszczania i charakteryzowania metaloproteaz, kolagenaz i żelatynaz z różnych patogenów bakteryjnych.

Wprowadzenie

Większość patogenów bakteryjnych musi napotkać macierz zewnątrzkomórkową gospodarza (ECM) podczas inwazji i rozprzestrzeniania się do narządów docelowych podczas patogenezy. Kolagen stanowi główny składnik ECM tkanek zwierzęcych¹. Żelatynazy to grupa proteaz, które działają na kolagen i jego hydrolizowaną formę, żelatynę. Degradacja ECM jest wykonywana głównie przez grupę proteaz, która obejmuje kolagenazy i żelatynazy ^2,3. Patogeny bakteryjne wykorzystują kolagenazy i żelatynazy do przebudowy lub rozkładu ECM gospodarza dla ich wygody w inwazji i patogenezie ^4,5. Bakteryjne enzymy rozkładające ECM są potencjalnymi kandydatami do ukierunkowania na szczepionki i leki⁵.

Proteazy bakteryjne występują w formach wydzielniczych i błonowych 6,7,8,9. Wiele metod ekstrakcji enzymów komórkowych jest nieskutecznych w izolowaniu bakteryjnych żelatynaz i kolagenaz związanych z błoną, ponieważ procedury te mogą nie zachować skutecznie natywnej formy białek związanych z błoną. Podobnie istnieją metody specyficzne dla błony, które ekstrahują tylko proteazy i żelatynazy związane z błoną. Konwencjonalne metody ekstrakcji białek całkowitych, w tym białek błonowych, często obejmują detergenty i jony chaotropowe, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną. Procedura ekstrakcji, która utrzymuje aktywność enzymu i rozpuszczalność, jest niezbędna do separacji elektroforetycznej i umożliwia rozwój symografii w celu wykrycia aktywności proteazy.

Deoksycholan sodu, jonowy detergent, który może lizować komórki poprzez rozerwanie błony komórkowej, umożliwia uwolnienie zawartości komórki i białka błonowego. Kwas 6-aminokapronowy może rozpuszczać uwolnione białko błonowe w jego natywnej postaci. Solubilizacja kwasem 6-aminokapronowym ma tę zaletę, że nie wpływa na elektroforezę. Tutaj pokazujemy ekstrakcję komórkowych i błonowych proteinaz bakteryjnych za pomocą deoksycholanu sodu i kwasu 6-aminokapronowego, stabilizując je w ich natywnej rozpuszczalnej formie 10,11,12. Metoda ta skutecznie rozpuszcza białka z komórki i błony, które mogą być stosowane bezpośrednio bez zakłócania elektroforezy^13,14. Różne charakterystyki enzymatyczne można przeprowadzić poprzez zmianę inhibitorów proteazy i jonów metali stosowanych w buforze aktywacyjnym, w zależności od zastosowania.

Protokół

1. Ekstrakcja żelatynaz bakteryjnych

UWAGA: Patrz Tabela 1 w celu przygotowania odczynników i materiałów.

1. Hodować organizm na pożywce Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) zawierającej 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w temperaturze 30 °C. Pobrać 10 ml kultury Leptospira w środkowej fazie logarytmicznej wzrostu, zawierającej 3,5 × 10⁸ komórek/ml dla proteinaz ekstrakcyjnych^13,14. Użyj bezpośredniego zliczania mikroskopowego z komorą liczącą Petroffa-Haussera pod mikroskopem ciemnego pola, aby obserwować środkową fazę wzrostu.
2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 6 000 × g przez 10 minut i wyrzucić supernatant do pojemnika w celu odkażenia w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 60 minut.
3. Przenieść osad, zawieszając go w 1 ml buforu do przemywania do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 6 000 × g przez 5 minut. Powtórz to pranie.
4. Wyekstrahować białko z osadu, dodając 100 μl buforu ekstrakcyjnego dla osadu Leptospira z 10 ml kultury i wirować przez 5 minut. Kontynuować ekstrakcję, inkubując w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Zebrać wyekstrahowane białko przez odwirowanie w temperaturze 15 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i wyrzucić granulki do pojemnika w celu odkażenia w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 60 minut.
5. Ekstrakt białkowy należy stosować bezpośrednio do symulacji, dodając równą objętość 2x buforu próbki.
6. Użyj testu szacowania Bradforda, aby określić stężenie białka.
7. Jeżeli stężenie białka jest niskie, wytrącić je acetonem, mieszając białko z 4-krotnie większą objętością acetonu w celu wytrącenia i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C. Następnego dnia odwirować próbkę o masie 10 000 × g przez 10 minut, wysuszyć otrzymany osad na powietrzu i ponownie zawiesić go w PBS lub rozpuścić w żądanym buforze i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca. Używaj liofilizacji do długotrwałego przechowywania lub transportu.
   UWAGA: Ze względu na aktywne proteazy w ekstrakcie i brak inhibitorów proteazy, białka w próbce mogą ulec degradacji.

2. Zymografia żelatynaz

1. Przygotowanie żelu SDS PAGE współpolimeryzowanego żelatyną
   1. Żel rozdzielczy
      1. Przygotuj rozdzielczą mieszankę żelu, dodając składniki w wymaganych ilościach, aby odlać żel. Do 3,86 ml wody w zlewce o pojemności 50 ml dodaj 2,5 ml Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml z 10% żelatynowego roztworu podstawowego, 3,34 ml roztworu akryloamidu bis akryloamidu (ABA), 0,1 ml 10% SDS, 0,006 ml TEMED i 0,1 ml 10% nadsiarczanu amonu i dobrze wymieszaj bez pienienia i pęcherzyków. Wspomniany system (zwykłe płytki szklane; 18 x 8 cm) wymaga 10 ml rozdzielczej mieszanki żelowej.
         UWAGA: Jeśli żelatyna pochodzi z zamrożonej porcji, rozmrozić ją, aż się rozpuści, aby oczyścić roztwór bez grudek. Dodaj nadsiarczan amonu tuż przed odlewaniem, ponieważ polimeryzacja rozpocznie się natychmiast po dodaniu nadsiarczanu amonu.
      2. Wlej mieszaninę żelu rozdzielczego do komory odlewniczej do ~3-5 mm poniżej oznaczenia dna studzienek. Unikaj pęcherzyków powietrza.
      3. Powoli wlej trochę wody, aby uzyskać równą 1 mm warstwę na wierzchu żelu i usuń bąbelki. Pozostaw żel na 1 godzinę.
         UWAGA: Tworzenie się żelu można potwierdzić, szukając separacji faz między warstwą wody a żelem; Żelu nie można wylać, nawet jeśli kaseta na żel jest przechylona.
   2. Żel do układania w stosy
      1. Przygotuj żel do układania w stosy, mieszając następujące składniki. Do 1,84 ml wody w zlewce o pojemności 10 ml dodaj 2,5 ml Tris-Cl (pH 6,6), 0,35 ml ABA, 0,03 ml 10% SDS i 0,006 ml TEMED. System 8 x 10 cm o grubości 1 mm wymaga 3 ml rozdzielczej mieszanki żelowej.
      2. Z kasety na żel zdekantuj wodę utworzoną na górze żelu, przechylając zestaw żelu na bok i osuszając zebraną wodę z rogu za pomocą wąskiego paska bibuły filtracyjnej.
      3. Dodać 0,03 ml 10% APS do mieszaniny wymienionej w kroku 2.1.2.1 i wymieszać bez tworzenia pęcherzyków.
      4. Wlej żel do układania na żel rozdzielczy i natychmiast umieść grzebień na miejscu, nie tworząc pęcherzyków powietrza pod zębami grzebienia, pozostawiając grubość 3-5 mm żelu do układania między żelem rozdzielczym a dnem zębów grzebienia. Odczekać co najmniej 3 godziny na całkowitą polimeryzację i usieciowanie żelatyny.
      5. Wyjmij dolną przekładkę i zamocuj żel na aparacie do elektroforezy.
      6. Powoli umieść żel w zbiorniku zawierającym 1x bufor elektrody, upewniając się, że na dnie żelu nie ma uwięzionego powietrza.
2. Przygotowanie próbki
   1. Dodać równą objętość buforu próbki do ekstraktu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby SDS mógł związać się z białkiem. Jako kontrolę dodatnią należy użyć próbki zawierającej 2 μl surowicy ludzkiej z równą objętością buforu do próbki.
3. Ładowanie próbki
   1. Ostrożnie załaduj próbkę do studzienek za pomocą pipety z wąską końcówką lub strzykawki Hamiltona (0,5-1 ml). Stopniowo dodawać bufor elektrody, aby wypełnić pozostałe części studzienek, górną część żelu i górny zbiornik jednostki elektroforezy bez naruszania załadowanych próbek.
      UWAGA: Strzykawkę Hamilton należy dokładnie umyć między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
4. Elektroforeza biegowa
   1. Rozpocznij elektroforezę przy 6 mA na żel i biegnij, aż front barwnika wejdzie w żel rozdzielczy. Następnie zwiększ prąd do 12 mA na żel i kontynuuj, aż czoło barwnika osiągnie 1 cm nad dnem żelu.
      UWAGA: Czas pracy może ulec zmianie w zależności od zastosowanego stężenia ABA i wielkości białka docelowego.
5. Oznaczanie orientacji pasm normy
   1. Po zakończeniu elektroforezy ostrożnie zdemontuj szklane płytki za pomocą narzędzia do separacji płytek lub plastikowej szpatułki i zaznacz orientację ładowania próbki, przecinając prawy dolny róg żelu i zaznacz wstępnie zabarwione pasma znaczników, wybijając otwory w pobliżu lub skanując żel.
6. Renaturacja rozwiązanych enzymów
   1. Zanurzyć żel w roztworze do renaturyzacji zawierającym Triton X-100 w tacce na żel i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania.
      UWAGA: Triton X-100 renaturuje białka, ponieważ żel zymogramowy zawierający rozwiązane białka może ulec denaturacji i stracić aktywność w obecności SDS.
7. Inkubacja pod kątem aktywności proteazy
   1. Zastąpić roztwór do renaturyzacji buforem aktywacyjnym, który całkowicie zanurza żel i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin w inkubatorze.
      UWAGA: Zmodyfikuj bufor aktywacyjny, dodając inhibitory lub aktywatory badanych proteinaz w celu scharakteryzowania aktywności proteinazy w razie potrzeby.
8. Barwienie zymogramu
   1. Po inkubacji usunąć bufor aktywacyjny i krótko płukać żel wodą przez 1 minutę, aby usunąć resztki Triton X-100 i zapobiec pienieniu się podczas wstrząsania.
   2. Dodaj roztwór barwiący do tacki, upewniając się, że żel jest całkowicie zanurzony. Delikatnie wstrząśnij żelem z małą prędkością, aby zapobiec uszkodzeniom. Kontynuuj barwienie, aż żel zmieni kolor na całkowicie niebieski.
   3. Usunąć nadmiar plamy z powierzchni żelu, spłukując go wodą przez 1 min. Dodaj roztwór odbarwiający do tacki i delikatnie wstrząśnij. Zastąp roztwór odbarwiający świeżym roztworem kilka razy, aż do uzyskania pożądanego kontrastu pasma na niebieskim tle.
      UWAGA: Podczas wykonywania odbarwienia należy stale monitorować żel, aby upewnić się, że nie ulega całkowitemu odbarwieniu, co umożliwia obserwację i rejestrację prążków proteolitycznych.
   4. Zeskanuj żel w systemie dokumentacji żelu lub skanerze dokumentów i określ masę cząsteczkową prążków białkowych, porównując je ze wzorcami białkowymi.

Wyniki

Wynik pokazuje zymogram białka leptospirali i żelatynaz z ludzkiej surowicy. Wyniki, pokazane na rysunku 1, przedstawiają proteazy jako białe, przezroczyste pasma na niebieskim tle. Pasma reprezentują obszary, w których skopolimeryzowana żelatyna ulega degradacji, a zatem nie jest barwiona, podczas gdy inne obszary całego żelu są zabarwione na niebiesko ze względu na obecność żelatyny. Co więcej, pokazuje, że chociaż żelatyna jest również białkiem, nie ulega elucji w elektroforezie w wyniku ...

Dyskusja

Podczas przygotowania żelu akrylowego żelatyna kopolimeryzuje z matrycą polimeru akrylamidu. W konsekwencji skopolimeryzowana żelatyna pozostaje unieruchomiona w żelu i nie migruje podczas elektroforezy, mimo że jest białkiem. Po elektroforezie natywne białka ekstrahowane za pomocą deoksycholanu i buforu kwasu 6-aminokapronowego rozdzielają się w zależności od ich masy i ładunku. Po usunięciu SDS białka te ulegają renaturyzacji w obecności Triton X-100 i odzyskują swoją aktywność. W warunkach natywnych, w zależności od w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 6-aminokapronowy	Merck	Ciągnik siodłowy A2504
Kwas octowy	Sigma	695092
Aceton	Sigma	32201
Akrylamid	Sigma	A-3553
Nadsiarczan amonu	Sigma	A-3678
Bis Akrylamid	Sigma	Zobacz materiał M7279
Surowica bydlęca frakcja albuminy V (BSA)	Sigma	A-8022 powiedział:
Błękit bromofenolowy	Sigma	B-8026
CaCl2	Merck	Zobacz materiał C4901
Coomassie brylantowy niebieski	Sigma	1.12553
Deoksycholan	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D6750
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) średnie, Difco	Firma Difco	279410
Żelatyna	Merck	Zobacz materiał G9382
Glicerol	Merck	Zobacz materiał G5516
Glicyna G8790	Sigma	G-8898 powiedział:
Leptospira interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , przechowywany w biorepozytorium ICMR-RMRC Portblair	Przechowywane w repozytorium biologicznym ICMR-RMRC Port Blair		Optymalna temperatura wzrostu 30 & deg; C
Chlorek magnezu M8266	Sigma	Zobacz materiał M8266
Metanol	Sigma	17995-7
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	P4417
Narzędzie do rozdzielania płyt	Cudowny Klin
Wirnik	Termonaukowy	FIBERLite F15 8x50 cy
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma	L-4396
TEMED	Sigma	T-9281 powiedział:
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8787 TGL
Baza Trizma (TRIS)	Sigma	Zobacz materiał T6066