Artykuł metodologiczny

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

DOI:

10.3791/67336

⸱

3 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Bellagen Biotechnology Co. Ltd, 2School of Life Sciences, Shandong Normal University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje hodowlę odpornych odmian ryżu skrobiowego za pomocą technologii edycji genomu w precyzyjny, wydajny i technicznie prosty sposób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne podejścia do hodowli roślin, które opierają się głównie na czasochłonnych i pracochłonnych metodach, takich jak tradycyjna hybrydyzacja i hodowla mutacyjna, stoją przed wyzwaniami w efektywnym wprowadzaniu docelowych cech i generowaniu zróżnicowanych populacji roślin. Z drugiej strony, pojawienie się technologii edycji genomu zapoczątkowało zmianę paradygmatu, umożliwiając precyzyjną i przyspieszoną manipulację genomami roślin w celu celowego wprowadzenia pożądanych cech. Jednym z najbardziej rozpowszechnionych narzędzi edycyjnych jest system CRISPR/Cas, który był używany przez naukowców do badania ważnych problemów związanych z biologią. Jednak precyzyjny i efektywny proces edycji genomu nie został dobrze zdefiniowany w hodowli roślin. W tym badaniu pokazaliśmy cały proces hodowli odmian ryżu wzbogaconych o wysoki poziom skrobi opornej (RS), cechy funkcjonalnej, która odgrywa kluczową rolę w zapobieganiu chorobom takim jak cukrzyca i otyłość. Przebieg pracy obejmował kilka kluczowych etapów, takich jak wybór funkcjonalnego genu SBEIIb, zaprojektowanie jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA), wybór odpowiedniego wektora edycji genomu, określenie metody dostarczania wektora, przeprowadzenie hodowli tkanek roślinnych, genotypowanie mutacji i analiza fenotypowa. Dodatkowo w przejrzysty sposób zostały przedstawione ramy czasowe niezbędne dla każdego etapu procesu. Protokół ten nie tylko usprawnia proces hodowli, ale także zwiększa dokładność i efektywność wprowadzania cech, przyspieszając w ten sposób rozwój funkcjonalnych odmian ryżu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjna hodowla polega na wprowadzaniu cech do upraw lub wytwarzaniu populacji roślin o wystarczającej różnorodności, co wymaga długoterminowej obserwacji terenowej1,2. Ze względu na ograniczenia tradycyjnej hodowli opracowano technologię edycji genów, która może precyzyjnie modyfikować genom roślin uprawnych w celu uzyskania pożądanych cech populacji roślin3. Najczęściej stosowanym systemem edycji genów u roślin jest CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), który opiera się na programowalnej endonukleazie sterowanej RNA w celu tworzenia ukierunkowanych pęknięć dwuniciowych (DSB) w klasie DNA4,5. Te DSB są następnie naprawiane przez naturalne mechanizmy naprawy DNA komórki6,7, często powodując wprowadzenie pożądanych zmian genetycznych. Chociaż technologia ta została wdrożona w różnych uprawach, w tym w pszenica8, kukurydza9, soybeans10 i ryż11, jest ona używana głównie do ujawniania problemów biologicznych. W porównaniu z jego szerokim zastosowaniem w wyjaśnianiu funkcji genów roślin, badania nad zastosowaniem technologii edycji genów w hodowli roślin pozostają stosunkowo rzadkie12.

Proces edycji genów w uprawach zazwyczaj przebiega według dobrze zdefiniowanego przepływu pracy, który obejmuje kilka kluczowych kroków13. Pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie konkretnego genu lub regionu genetycznego, który należy zmodyfikować, aby osiągnąć pożądaną cechę. Po drugie, projektowana jest strategia edycji genów, obejmująca wybór odpowiedniego systemu edycji genów (np. CRISPR-Cas9 lub CRISPR-Cas12) oraz projektowanie specyficznych przewodników RNA, które kierują endonukleazę do miejsca docelowego. Po trzecie, system edycji genów jest następnie włączany do wektora dostarczania, który jest używany do wprowadzania maszynerii edycyjnej do komórek roślinnych. Wektory te mogą być kompleksami DNA, RNA lub rybonukleoproteinami (RNP). Następnie wektory edycji genów są dostarczane do komórek roślinnych przy użyciu różnych metod, w tym transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, bombardowania cząstkami lub elektroporacji. Natychmiast przekształcone komórki roślinne są hodowane w odpowiednich warunkach w celu wytworzenia genetycznie edytowanego kalusa lub tkanek embrionalnych. Tkanki te są następnie regenerowane w całe rośliny za pomocą technik hodowli tkankowych. Zregenerowane rośliny poddawane są rygorystycznej charakterystyce molekularnej, która ma potwierdzić obecność pożądanych zmian genetycznych.

Poprzedni artykuł autorstwa Tsakirpaloglou et al.14 dostarcza szerokiego przeglądu procesu edycji genów, od projektowania wektorów do generowania edytowanych siewek, ale nie zagłębia się w szczegółową analizę specyficznych cech związanych z docelowym genem, ani późniejszą ocenę wydajności agronomicznej lub funkcjonalnej walidacji edytowanych upraw. Wyszliśmy poza zwykłe zademonstrowanie wykonalności edycji genu w ryżu. Nasza praca kompleksowo ocenia wpływ tej edycji na cechy biochemiczne, molekularne i agronomiczne edytowanych linii ryżu. Obejmuje to ocenę składu skrobi, kluczowego czynnika wpływającego na jakość ziarna i wartość odżywczą, który nie został szeroko zbadany w poprzednich badaniach nad edycją genów.

Skrobia ryżowa zazwyczaj składa się z ~20% amylozy i ~80% amylopektyny15. SBEIIb jest enzymem niezbędnym do syntezy amylopektyny i ulega ekspresji w endospermie16. Knockdown OsSBEIIb przez ekspresję RNA spinki do włosów (RNAi) i mikroRNA zwiększył zawartość skrobi opornej17,18. Skrobia oporna to skrobia substratowa, która nie może być trawiona i wchłaniana w jelicie cienkim, ale może być rozkładana na krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe i gazy przez niektóre bakterie trawienne w jelitach. Ponieważ nie można jej szybko rozłożyć, ma niższy indeks glikemiczny w porównaniu z innymi skrobiami i nie powoduje szybkiego wzrostu poziomu cukru we krwi w krótkim czasie po jedzeniu, co może w pewnym stopniu złagodzić cukrzycę w Diet19. Ponadto skrobia oporna pełni bardziej fizjologiczne funkcje, takie jak zmniejszanie odpowiedzi insulinowej, regulacja funkcji jelit, zapobieganie gromadzeniu się tłuszczu, ułatwianie kontroli masy ciała i promowanie wchłaniania jonów mineralnych. Dlatego jest szeroko stosowany jako nowy rodzaj błonnika pokarmowego20.

Aby sprostać tym wyzwaniom i skutecznie wykorzystać technologie edycji genów do hodowli funkcjonalnych odmian ryżu, udoskonaliliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły operacyjne w ryżu. Skupiliśmy się na skrupulatnej analizie projektu docelowych loci genów, starannym doborze najbardziej odpowiednich narzędzi do edycji genów i przeprowadzeniu rygorystycznej analizy fenotypowej w całym procesie hodowli. Jako świadectwo mocy i skuteczności tych technologii przedstawiamy studium przypadku prezentujące szybki rozwój funkcjonalnej odmiany ryżu wzbogaconej o skrobię o wysokiej odporności. Przykład ten podkreśla potencjał edycji genów w przyspieszaniu hodowli funkcjonalnego ryżu, rozwiązując obecny niedostatek badań w tej dziedzinie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało przeprowadzone w Bellagen Biotechnology Co. Ltd w Chinach zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach. Przed wzięciem udziału w badaniu, protokół badania został dokładnie wyjaśniony uczestnikom, którzy wyrazili świadomą zgodę.

1. Projektowanie sgRNA i wektora budowy (czas 5-7 dni)

UWAGA: Wektor binarny został użyty do wyrażenia systemu CRISPR/Cas-SF0121. Nie mogą mieć mniej niż 3 nukleotydy (nt) niezgodności z potencjalnym miejscem poza celem dla sgRNA. Adapter sgRNA musi uzupełniać lepki koniec, który jest generowany przez trawienie enzymatyczne Bsa I wektora edycyjnego. Wybór oprogramowania został oparty na zgłaszanej wysokiej wydajności i specyficzności oprogramowania w rice14, a także na jego łatwości obsługi i dostępności dla grupy badawczej.

  1. Przejdź do strony internetowej NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), aby pobrać gen OsSBEIIb (LOC4329532) w Japonica. Pobierz i uzyskaj dostęp do genomu referencyjnego w oprogramowaniu SnapGene.
  2. Przeanalizuj insercje/delecje (InDel) i polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) w sekwencji eksonu OsSBEIIb z odmiany X134, porównując ją z genomem referencyjnym. Wykorzystaj NCBI Primer Blast22 do zaprojektowania starterów flankujących regiony eksonów (Tabela uzupełniająca 1).
  3. Aby zwalidować sekwencję eksonów genu OsSBEIIb w X134 za pomocą sekwencjonowania Sangera, należy przygotować reakcję w następujący sposób: 10 μl buforu mieszaniny polimerazy z 1 μl startera do przodu, 1 μl startera odwrotnego, 1 μl gDNA z tkanek X134 i 7 μl wody destylowanej. Uruchom program PCR w następujący sposób: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) z 35 cyklami i 72 °C, 5 min.
  4. Zaprojektuj sgRNA na sekwencji eksonów OsSBEIIb X134, przestrzegając protokołu Tsakirpaloglou et al.14i upewniając się, że sekwencja PAM to TTN.
  5. Zmodyfikuj sekwencję sgRNA, dodając -ACAC- oligonukleotydy na końcu 5' startera do przodu i dodając -GGCC- oligokleotydaże na końcu 5' startera odwrotnego. Komercyjnie syntetyzować startery do przodu/do tyłu (dla sgRNA).
  6. Rozpuścić startery do przodu i do tyłu do stężenia 10 μmol/l, pobrać 1 μl każdego z nich i dodać do 8 μl buforu do wyżarzania (bufor Tris-EDTA + 50 mM NaCl) i wymieszać pipetując. Umieścić w maszynie do PCR i uruchomić program wyżarzania w następujący sposób na maszynie do PCR: powolny proces schładzania 95 °C do 16 °C przy 0,1 °C/s.
  7. Złóż sgRNA w wektor edycji genomu. Przygotować reakcję w następujący sposób: 20 μl buforu mieszającego z 0,5 μl ligazy DNA T4, 1 μl Bsa I, 2 μl 10x buforu restrykcyjnego, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 2 μl starterów wyżarzających, 2,5 μl wektora (jego objętość jest dostosowana do proporcji) i 10 μl wody destylowanej. We wszystkich przypadkach należy stosować stosunek wkładki do wektora 2:1, aby osiągnąć wydajność montażu. Uruchom program montażu PCR jako (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) z 30 cyklami i 55 °C, 30 min.
  8. Przekształć wynikowy wektor w komórki E. coli zgodnie z opisem23.
  9. Zaprojektuj startery flankujące miejsce insercji gRNA w plazmidzie. Używając tych starterów, wykonaj amplifikację PCR na poszczególnych koloniach, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem udanych insercji. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera produktów PCR, aby potwierdzić pomyślne klonowanie i wyizolować plazmid24.

2. Przemiana Agrobacterium (czas 4 dni)

  1. Rozmrozić EHA105 Kompetentna komórka Agrobacterium na lodzie. Dodaj 1-2 μl plazmidowego DNA (zawierającego ~100-200 ng DNA) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.
  2. Transformację szoku cieplnego przeprowadzić poprzez umieszczenie probówki na lodzie na 5 minut, ciekłym azocie na 5 minut, szoku cieplnego w temperaturze 37 °C na 5 minut, a następnie w łaźni lodowej na 5 minut.
  3. Dodaj 700 μl pożywki z ekstraktem drożdżowym (YEP), bez antybiotyku, do probówki i delikatnie wymieszaj. Odzyskać komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C, 200-250 obr./min, przez 2-3 godziny.
  4. Odwirować kulturę przy 2 800 x g przez 1 minutę. Wyrzucić większość supernatantu, pozostawiając około 100 μl, i ponownie zawiesić komórki. Rozprowadzić komórki na płytkach agarowych YEP zawierających 1% antybiotyków (Kanamycyna i Ryfampicyna) w celu selekcji plazmidu. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 24-48 godzin.
  5. Przesmaruj płytkę YEP (z opornością na antybiotyki) końcówką pipety zawierającą pojedynczą kolonię Agrobacterium zawierającą CRISPR/Cas i przenieś komórki do 5 ml płynnej pożywki YEP z odpowiednimi antybiotykami. Inkubować ciecz w temperaturze 28 °C przez 3 dni.
  6. Przekształcone szczepy Agrobacterium należy przechowywać w postaci zapasów glicerolu w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.

3. Transformacja ryżu przez Agrobacterium (czas 3 miesiące)

UWAGA: Opisano kilka metod transformacji roślin dla dostarczania i ekspresji obcej sekwencji DNA w komórce roślinnej25. Biorąc pod uwagę integrację pojedynczej kopii i niską częstotliwość DSB w genomie, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest metodą z wyboru do integracji fragmentu ekspresji DNA z chromosomami ryżu.

  1. Wykonaj transformację ryżu za pośrednictwem Agrobacterium zgodnie z protokołem in25. Aktywnie rosnące kalusy (żółtawobiałe, stosunkowo suche o średnicy 1-3 mm) są kluczowym punktem dla efektywnej transformacji. Wyrzuć nasiona z rozwojem siewki lub brązowym kalusem przed zakażeniem kalusa Agrobacterium.

4. Genotypowanie roślin transgenicznych i zbiór nasion (czas 8 miesięcy)

UWAGA: Dwa pokolenia ryżu będą uprawiane w celu uzyskania homozygotycznej mutacji i obcych linii wolnych od DNA.

  1. Pobieranie próbek tkanki siewki: Przeszczep rośliny transgeniczne do doniczek i hoduj je przez 1 miesiąc w szklarni. Aby określić typ mutacji, zbierz 2-3 mg świeżych liści z każdego krzewu pojedynczej sadzonki i połącz je w jedną próbkę.
  2. Ekstrakcja genomowego DNA: Postępuj zgodnie z ustalonym protokołem ekstrakcji DNA genomu roślinnego26.
  3. Projektowanie starterów mutacji (Tabela uzupełniająca 1): Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji regionu genu SBEIIb otaczającego miejsce docelowe sgRNA14. Wzmocniony fragment ma długość 493 pz.
  4. Genotypowanie mutacji: Sekwencjonuj fragmenty PCR bezpośrednio lub sklonuj je do wektora klonu T i sekwencjonuj przy użyciu metody Sangera w celu identyfikacji mutacji14.
  5. Zbiór nasion: Wybierz linie E0 wykazujące homozygotyczne mutacje przesunięcia ramki i posadź je w szklarni, aby uzyskać nasiona.
  6. Projektowanie starterów do identyfikacji T-DNA: Zaprojektuj trzy specyficzne startery dla kasety higromycyny, kasety UBI i kasety Cas konstruktu w celu identyfikacji obcych linii wolnych od DNA wśród mutacji (Tabela uzupełniająca 1).
  7. Potwierdzenie obcych linii wolnych od T-DNA: Zbierz liście z 2-tygodniowych siewek i wyekstrahuj DNA genomu rośliny, jak opisano w kroku 4.2. Przeprowadzić genomiczny PCR za pomocą następującego programu: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) z 35 cyklami i 72 °C, 5 min. Pozwala to na wykrycie kasety higromycyny, UBI i Cas w genomie rośliny.
  8. Przeanalizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i wybierz linie, które nie wykazują prążków, co oznacza, że są to linie E1 wolne od transgenów. Zbierz nasiona z tych wybranych linii.

5. Pomiar zawartości skrobi opornej (czas 4 dni)

  1. Zbierz nasiona zmutowanych roślin i X134 i pozwól im naturalnie wyschnąć w temperaturze pokojowej, utrzymując wilgotność około 13%-15%. Oznaczyć zawartość skrobi opornej za pomocą procedury α-amylozy/amyloozydazy trzustkowej (AMG) opisanej poniżej.
  2. Aktywuj obieraczkę i wprowadź 10 g ziaren ryżu do podajnika, aby skutecznie usunąć łupinę ryżu, w wyniku czego uzyskasz przetworzone nasiona ryżu.
  3. Przenieś obrane nasiona ryżu do młynka do ryżu i pracuj przez 60 sekund, aby wyeliminować warstwę aleuronu, uzyskując polerowany ryż.
  4. Umieść wypolerowany ryż w młynku do tkanek, dostosowując częstotliwość mielenia do 60 Hz. Uruchom młynek na 15 sekund, powtarzając cykl 2x, aby uzyskać proszek ryżowy.
  5. Umieść zmielony ryż w proszku na szalce Petriego i umieść go w nagrzanym piekarniku. Ustaw temperaturę na 37 °C i pozostaw do wyschnięcia na 12 godzin.
  6. Dokładnie zważyć 100 mg ± 5 mg próbek i przelać bezpośrednio do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Delikatnie postukaj w probówkę, aby upewnić się, że próbka osiada na dnie.
  7. Dodać 180 μl oczyszczonej wody do probówki i gotować próbki przez 20 minut w łaźni wodnej.
  8. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie wprowadzić 4 ml AMG (3 U/ml) zawierającego α-amylazę trzustkową (10 mg/ml) do każdej probówki.
  9. Bezpiecznie zakryć probówki, wymieszać je na oscylatorze wirowym i inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z ciągłym mieszaniem.
  10. Dodaj 4 ml etanolu i wymieszaj za pomocą wiru. Odwirować probówkę o masie 1 500 x g przez 10 minut.
  11. Zdekantować supernatant, dodać 2 ml 50% etanolu, a następnie 6 ml 50% IMS i wymieszać za pomocą wirówki i wirówki.
  12. Ostrożnie wylać supernatant i odwrócić probówkę, aby spuścić nadmiar płynu. Umieścić probówki w łaźni lodowej, dodać 2 ml 2 M KOH do każdej probówki i mieszać próbki przez 20 minut w celu ponownego zawieszenia kłaczków i rozpuszczenia skrobi opornej.
  13. Dodaj 8 ml 1,2 M buforu octanu sodu (pH 3,8) do każdej probówki i wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego.
  14. Natychmiast wprowadzić 0,1 ml AMG (3300 U/ml), dokładnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C z przerywanym mieszaniem za pomocą wiru. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut.
  15. Przenieść 0,1 ml supernatantu do szklanej probówki, dodać 3 ml odczynnika oksydazy glukozowej/peroksydazy (GOPOD) i inkubować w temperaturze 50 °C przez 20 minut. Przygotować ślepą próbę odczynnika, mieszając 0,1 ml 100 mM buforu octanu sodu i 3 ml odczynnika GOPOD. Przygotuj wzorce, mieszając 0,1 ml D-glukozy z 3 ml odczynnika GOPOD.
  16. Ostrożnie odpipetować 200 μl każdego roztworu próby ślepej, roztworu, który ma być badany, oraz roztworu wzorcowego na płytkę 96-dołkową.
  17. Zmierzyć absorbancję każdej próbki przy długości fali 510 nm w stosunku do roztworu próby ślepej i obliczyć zawartość skrobi opornej, korzystając z podanego wzoru.
    Skrobia oporna (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27
    Gdzie ΔA = absorbancja odczytana w stosunku do ślepej próby odczynnika; F = przeliczenie z absorbancji na mikrogramy (określa się absorbancję otrzymaną dla 100 μg D-glukozy w reakcji GOPOD); W = sucha masa analizowanej próbki.

6. Poposiłkowa odpowiedź na stężenie glukozy we krwi (czas 5 dni)

  1. Zastosuj następujące kryteria włączenia uczestników: zdrowi dorośli Chińczycy pochodzenia azjatyckiego w wieku od 18 do 60 lat, osoby niepalące, wskaźnik masy ciała (BMI) między 18,5 a 25 kg/m2 oraz prawidłowe ciśnienie krwi (< 140/90 mm. Hg). Stosuj następujące kryteria wykluczenia: choroby metaboliczne (takie jak cukrzyca, nadciśnienie itp.), zaburzenia żołądkowo-jelitowe, nieprawidłowości układu hormonalnego lub choroby psychiczne. W sumie 10 uczestników zostało przebadanych i zrekrutowanych.
  2. Procedura sesji testowej (obejmująca dwa kolejne dni)
    1. Dzień 0 (Dzień Przygotowania): Poproś uczestników, aby utrzymywali regularne wzorce snu i normalną dietę przez pierwsze 3 dni poprzedzające test. Wieczorem przed testem (po godzinie 20:00) poproś uczestników o powstrzymanie się od posiłków bogatych w błonnik i cukier. Energiczne ćwiczenia są odradzane rano pierwszego dnia.
    2. Dzień 1 (Dzień testu): Przygotuj biały ryż, mieląc nasiona ryżu, a następnie opłucz biały ryż 2x. Napełnij garnek 1,5 części wody na 1 część białego ryżu. Gotuj ryż, aż woda całkowicie się wchłonie. Wyłącz ogień, przykryj garnek i odstaw na 10 minut.
    3. Losowo przydziel 10 uczestników do dwóch równych grup: jednej grupy testowej karmionej białym ryżem opornym na skrobię i jednej grupy kontrolnej karmionej białym ryżem X134. Poproś uczestników, aby odpoczęli przez 10 minut przed rozpoczęciem testu.
    4. Sterylizuj opuszki palców 75% alkoholem medycznym. Delikatnie dociśnij lancet do opuszka palca i zwolnij sprężynę, aby nakłuć skórę. Delikatnie ściśnij palec, aby wytworzyć małą kropelkę krwi i przyłóż tę kroplę do absorbującego krew końca paska testowego w glukometrze. Glukometr automatycznie pobiera krew i rozpoczyna proces badania. Poczekaj na wyświetlenie odczytu stężenia glukozy we krwi.
    5. Spożycie ryżu i pobieranie próbek krwi: Przedstaw uczestnikom 50 g przygotowanego ryżu z 200 ml wody i poproś ich, aby zjedli to w wygodnym tempie w ciągu 5-10 minut. Po posiłku należy pobrać próbki krwi żylnej w następujących punktach czasowych: 15 min, 30 min, 60 min, 90 min i 120 min od rozpoczęcia posiłku. Wykonaj analizę stężenia glukozy we krwi jak w kroku 6.2.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu, całe procedury hodowli funkcjonalnego ryżu zostały zademonstrowane poprzez edycję genomu w celu uzyskania stabilnych, odpornych odmian ryżu skrobiowego. Zintegrowaliśmy sgRNA ukierunkowane na SBEIIb z CRISPR / Cas-SF01 (rysunek uzupełniający 1), infiltrowaliśmy ryż za pomocą transformacji Agrobacterium i uzyskaliśmy rośliny generacji E0 po etapach przesiewania i ukorzeniania. Rośliny z utratą funkcji genów poddano badaniom przesiewowym, a ich zawartość skrobi oporn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W procesie konstruowania wektorów knockdown opartych na CRISPR/Cas-SF01 kluczowa jest skrupulatna selekcja jednoprzewodnikowych RNA (sgRNA). Wymaga to przyjęcia sekwencji, które wykazują wysoką wydajność edycji przy minimalnych efektach niedocelowych. Dodatkowo, synteza starterów celujących obejmuje krótkie oligonukleotydy adapterowe pasujące do miejsc łączenia wektora, zapewniając bezproblemową integrację. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do poprzednich metodologii, które wymagały sekwencyjnego trawienia enzymatyczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez fundusze z Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 x Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co., LtdP213  Wykrywanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) genów
Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) SolutioPhyto TechnologyD309
AAMmedium Shandong Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFNew england biolabsR3535Bsa I trawienie enzymatyczne wektora edytującego
antybiotyki karbenicylinoweApplygenAPC8250-5Wybór  pożywka, pożywka regeneracyjna
BBI-Life SciencesCorporationA603060-0500Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna
DH5 i alfa; Chemicznie kompetentna komórkaWeidi Biotechnology Co., Ltd.DL1001E. coli < / em>kompetentne komórki
D-sorbitolBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA, sól disodowa, dihydratDiamentA100105-0500CTAB bufor
EHA105 Chemicznie kompetentna komórkaWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010Agrobacterium kompetentne komórki
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co., LtdREC01-100Plazmid izolowany
antybiotyki higromycynoweYeasen60224ESpodłoże do wspólnej uprawy, podłoże selekcyjne, podłoże regeneracyjne i podłoże korzeniowe
Antybiotyki KanamycynaYeasen60206ES10Selekcja agrobacterium
KOHMacklinP766798CTAB bufor
L-glutaminaPhyto TechnologyG229Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna
L-ProlinePhyto TechnologyP698Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna
Suche nasiona ryżu Mautre (Xiushui134)-odmiany Japonica do hodowla RS
ryż Młyn ryżowy mechineMARUMASUMHR1500ADo produkcji białego ryżu
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519Pożywka korzeniowa, pożywka regeneracyjna
FitotechnologiaI703Pożywka regeneracyjna
NaClMacklinS805275Dla  Pożywka YEP
NB Basal MediumPhyto TechnologyN492Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna
Pepton SolarbioLA8800dla  YEP media
FitożelShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot Grupa Midea Co.MB-5E86Do gotowania ryżu
LodówkaHaierBCD-170Przechowywanie podłoża
Zestaw do oznaczania skrobi opornejMegazymeK-RSTARPomiar i analiza skrobi opornej
Antybiotyki ryfampicynySigmaR3501-250MGSelekcja agrobacterium
Roztwór podchlorynu soduMacklinS817439Do sterylizacji nasion
SacharozaShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB21647Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna
Ligaza DNA T4Nowa anglia biolabsM0202Łączenie sgRNA z wektorem CEISPRY/Cas-SF01
Monitor glukozySprzęt medyczny i Supply Co., LtdXuetang 582Wykrywanie glukozy we krwi
Tris-HCLMacklinT766494bufor CTAB
Agar drożdżowySolarbioLA1370dla  YEP media
YEP media--Uprawa Agrobacterium

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review. Front Genet. 12, 643761(2021).
  3. Khalil, A. M. The genome editing revolution: review. J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).
  4. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
  5. Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117, 119-128 (2015).
  6. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).
  7. Koonin, E. V., Makarova, K. S. Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back. Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).
  8. Zhang, Y., et al. Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits. Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).
  9. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Comm. 7, 13274(2016).
  10. Li, Z., et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean. Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).
  11. Li, M., et al. Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front Plant Sci. 7, 377(2016).
  12. Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences. Plants. 10 (10), 2055(2021).
  13. Hua, K., et al. Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding. Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).
  14. Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops. Plants. 12 (20), 3564(2023).
  15. Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. Starch biosynthesis in cereal endosperm. Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).
  16. Crofts, N., et al. Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes. J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).
  17. Butardo, V. M., et al. Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing. J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).
  18. Baysal, C., et al. Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).
  19. Keenan, M. J., et al. Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance. Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).
  20. Shen, L., Li, J., Li, Y. Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond. Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).
  21. Duan, Z., et al. An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants. Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).
  22. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinform. 13, 134(2012).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  25. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).
  26. Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).
  27. Li, P., et al. Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice. Rice. 15 (1), 18(2022).
  28. Huang, X., et al. Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2. Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).
  29. Lv, P., et al. Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3. Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).
  30. Čermák, T., et al. A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants. Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR Casskrobia opornagen SBE2bpojedyncze przewodnie RNAhodowla tkanek ro linnychgenotypowanie mutacjianaliza fenotypowaanaliza poziomu glukozy we krwi

Powiązane artykuły