Artykuł metodologiczny

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

DOI:

10.3791/67338

⸱

31 stycznia 2025

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje protokół zastosowania modelu in vitro do wyczerpania w celu przeprowadzenia całego genomu ekranu nokautującego CRISPR w zdrowych limfocytach T receptora chimerycznego antygenu dawcy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) jest innowacyjną formą celowanej immunoterapii, która zrewolucjonizowała leczenie raka. Jednak trwała reakcja pozostaje ograniczona. Ostatnie badania wykazały, że epigenetyczny krajobraz produktów z komórek CART przed infuzją może wpływać na odpowiedź na terapię, a jako rozwiązanie zaproponowano edycję genów. Konieczne jest jednak wykonanie dalszych prac w celu określenia optymalnej strategii edycji genów. Badania przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom stały się popularnymi narzędziami zarówno do badania mechanizmów oporności, jak i optymalizacji strategii edycji genów. Jednak ich zastosowanie w komórkach pierwotnych wiąże się z wieloma wyzwaniami. W tym miejscu opisujemy metodę przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR obejmującego cały genom w komórkach CART od zdrowych dawców. Jako model potwierdzający słuszność koncepcji zaprojektowaliśmy tę metodę w celu zbadania rozwoju wyczerpania w komórkach CART ukierunkowanych na antygen CD19. Uważamy jednak, że podejście to może być wykorzystane do zajęcia się różnymi mechanizmami oporności na terapię w różnych konstruktach CAR i modelach nowotworów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) wykazała imponujący sukces w leczeniu nowotworów złośliwych komórek B; jednak trwała odpowiedź jest ograniczona do 30-40%1,2,3,4,5. Chociaż naukowcy opracowali i przetestowali kilka podejść mających na celu rozwiązanie problemów z mechanizmami oporności na terapię komórkową CART, w tym optymalizację konstrukcji CAR, edycję genów i terapie skojarzone, rozwój oporności pozostaje w dużej mierze nieznany. Ostatnio pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wyjściowy profil ekspresji genów w produktach z komórek CART przed infuzją jest ważnym czynnikiem determinującym zarówno toksyczność, jak i skuteczność terapii CART6,7,8,9. W związku z tym edycja genów podczas produkcji komórek CART stała się popularnym podejściem do poprawy skuteczności terapii komórkowej CART.

Na przykład, nasze laboratorium wcześniej pokazało, że użycie technologii Cas9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) do wyeliminowania czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów genu (GM-CSF) poprawia aktywność komórek CART i zmniejsza oznaki toksyczności związanej z CART10,11,12. Dodatkowo, terapia komórkowa modyfikowana przez CRISPR została przetestowana w badaniach klinicznych i wykazała skuteczność i bezpieczeństwo13. Razem wskazuje to, że edycja genów za pomocą technologii CRISPR może nie tylko poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii komórek CART, ale także wygenerować translowalne produkty komórkowe CART.

Ekrany nokautujące CRISPR dla całego genomu stają się coraz bardziej popularnymi narzędziami w badaniach nad biologią nowotworów, pozwalającymi zrozumieć mechanizmy oporności na terapie. W tej technice dziesiątki tysięcy przewodnikowych RNA (gRNA) są dostarczane do pul komórek, aby zachęcić do wejścia jednego gRNA na komórkę14. Następnie komórki poddawane są warunkom wywołującym ciśnienie, w których komórki transdukowane gRNA ukierunkowane na niezbędne geny umierają, a komórki transdukowane gRNA ukierunkowane na geny hamujące przeżywają i namnażają się. Korzystając z sekwencjonowania nowej generacji, możemy określić, jak zmienia się reprezentacja gRNA w całym ekranie CRISPR14.

Jednak skala i czas selekcji wymagane do perturbacji genów w całym genomie mogą być trudne do osiągnięcia w komórkach pierwotnych, takich jak komórki CART. W związku z tym grupy wykorzystały ukierunkowane badania przesiewowe CRISPR, aby lepiej zrozumieć mechanizmy oporności terapeutycznej15,16. Ekrany docelowe są często łatwiejsze do wykonania w komórkach podstawowych, ponieważ mają mniejsze biblioteki, które wymagają mniejszej liczby komórek, aby uzyskać odpowiednią reprezentację biblioteki. Chociaż badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmów oporności na terapię komórkową CART, celowane badania przesiewowe wprowadzają błąd systematyczny ze względu na ręczną selekcję docelowych genów. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie metody przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w komórkach CART od zdrowych dawców. W związku z tym to wysokoprzepustowe podejście pozwala na wydajną, bezstronną identyfikację kluczowych szlaków i genów, które można edytować w celu poprawy odpowiedzi terapeutycznych17,18,19.

W szczególności, protokół opisany w tym artykule ma na celu zwiększenie wiedzy na temat wyczerpania komórek CART poprzez uzupełnienie ekranu nokautu CRISPR obejmującego cały genom modelem in vitro dla wyczerpania. Wyczerpanie to dysfunkcyjny los komórki CART, który jest związany z brakiem odpowiedzi na terapię komórkową CART20,21,22. Wiadomo, że ten los komórkowy jest regulowany epigenetycznie i charakteryzuje się spadkiem proliferacji komórek CART, spadkiem produkcji cytokin efektorowych i wzrostem ekspresji receptorów hamujących23. We wcześniejszej literaturze edycja genów była w stanie zapobiec rozwojowi wyczerpania poprzez regulację kluczowych genów w górę lub w dół24,25,26. Biorąc pod uwagę zarówno spadek zdolności proliferacyjnej w miarę wyczerpania komórek CART, jak i dowody na to, że edycja genów może zapobiec jego wystąpieniu, modelowaliśmy nasz ekran nokautujący CRISPR w całym genomie in vitro na tym losie komórkowym. Protokół ten może jednak zostać zmieniony w przyszłości w celu zbadania innych mechanizmów oporności na terapię komórkową CART.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Co ważne, poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi i otrzymał zgodę od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Kliniki Mayo (IRB 18-005745) oraz Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC HIP00000252.43). Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową, w tym produkcja lentiwirusa, powinny być wykonywane w kapturze do hodowli komórkowych z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej. W szczególności prace związane z lentiwirusami powinny być prowadzone z zachowaniem środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), w tym stosowania 10% wybielacza do dezynfekcji przedmiotów przed usunięciem.

1. Wzmocnienie biblioteki CRISPR

  1. Wzmocnij bibliotekę CRISPR zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko mówiąc, poddaj elektroporację, bibliotekę CRISPR na cztery podwielokrotności elektrokompetentnych komórek, wykonując następujące czynności:
    1. Dodaj 2 μl plazmidu z biblioteki CRISPR o mocy 50 ng/μl do 25 μl elektrokompetentnych ogniw w kuwecie 1,0 mm.
    2. Elektroporację próbek należy przeprowadzić przy użyciu następujących ustawień: 10 μF, 600 omów, 1 800 woltów i stałej czasowej od 3,5 ms do 4,5 ms.
    3. Odzyskać w 975 μl pożywki regeneracyjnej i przenieść do probówki z dodatkowym 1 ml pożywki odzyskiwania.
    4. Obracać wszystkie porcje z prędkością 250 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Uporządkuj transformacje:
    1. Połącz wszystkie porcje elektroporowanych ogniw i dobrze wymieszaj.
    2. Pokryj wszystkie elektroporowane ogniwa, rozprowadzając 400 μl mieszanki transformacyjnej na podgrzanych 10 cm płytkach bulionu Luria (LB) ze 100 μg/ml karbenicyliny. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 32 °C na 14 godzin.
  3. Zbierz kolonie:
    1. Odpipetować 1 ml pożywki LB + 100 μg/ml karbenicyliny na każdą płytkę. Zeskrob kolonie z każdej płytki i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj kolejny 1 ml pożywki LB + 100 μg/ml karbenicyliny do każdej płytki, aby umyć i zapewnić całkowite wyzdrowienie.
    3. Wykonaj maxi-prep, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu maxi-prep.
    4. Połącz wynikowe plazmidowe DNA.

2. Sekwencjonowanie nowej generacji w celu weryfikacji podstawowej reprezentacji gRNA w bibliotece CRISPR

UWAGA: Startery NGS dla tej biblioteki CRISPR zostały zaprojektowane w poprzedniej publikacji27. Użycie innego odwróconego startera dla każdej próbki spowoduje okodowanie kreskowe każdej próbki i umożliwi łączenie próbek podczas sekwencjonowania.

  1. Przygotować próbki do PCR z następującą mieszaniną reakcyjną (objętość całkowita = 50 μl): mieszanina wzorcowa PCR o wysokiej wierności, 2x: 25 μL; zbiorcze matrycowe DNA, 0,5 μg: 1 μL; Starter do przodu biblioteki NGS, 10 μM: 1,25 μL; Podkład odwrócony biblioteki NGS, 10 μM: 1,25 μL; Woda wolna od DNaz: 21,5 μL.
  2. Przeprowadzić PCR w następujących warunkach cyklicznych: cykl 1: denaturacja w temperaturze 98 °C przez 3 minuty; cykle 2–23: denaturacja w temperaturze 98 °C przez 10 s, wyżarzanie w temperaturze 63 °C przez 10 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 25 s; cykl 24: przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty.
  3. Oczyść reakcję PCR, łącząc reakcje PCR dla każdej próbki i oczyszczając produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przeprowadzić 3 μg produktu PCR dla każdej próbki na 2% (w/v) żelu agarozowym.
  5. Usuń produkt PCR (~260-270 pz) z żelu, ekstrahując DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Celuj w co najmniej 500 ng DNA.
  6. Wyekstrahowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Wykonaj sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) z próbkami i dąż do 100 odczytów na gRNA27.
  8. Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą potoku MAGeCK-VISPR i upewnij się, że więcej niż 99,5% gRNA w bibliotece jest reprezentowanych28.

3. Produkcja biblioteki CRISPR i lentiwirusów ekspresji CAR

  1. Przygotuj lentiwirusa zgodnie z wcześniejszym opisem10,29.
    1. Dzień 1: Zacznij od kolb T175 zawierających 80-90% zlewających się komórek 293T, które rosły w pożywce D10 składającej się z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v / v), 1% penicyliny, streptomycyny i glutaminy (PSG) (v / v) oraz zmodyfikowanej pożywki orła Dulbecco. Przed rozpoczęciem podgrzej odczynniki do transfekcji i DNA do temperatury pokojowej i określ ilościowo DNA.
    2. Dla każdej kolby 293T oznaczyć dwie stożkowe probówki A i B o pojemności 50 ml. Dodać 4,5 ml zredukowanej pożywki surowicy do probówki A i do probówki B.
    3. W sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszaj następujące DNA i pozostaw na 1 minutę: 18 μg pCMVR8.74 (gag, pol, tat i rev), 7 μg pMD2.G (VSV-G) i 15 μg lentiwirusowego wektora ekspresyjnego (biblioteka CRISPR A lub wektory CAR19-28ζ).
    4. Dodać 129 μl odczynnika do transfekcji do probówki A. Dobrze wymieszaj rurkę A, wirując palcem.
    5. Dodaj mieszaninę DNA do probówki B. Dobrze wymieszaj rurkę B, wirując palcem.
    6. Dodać 111 μl obojętnego odczynnika kolipidowego do probówki B. Dobrze wymieszaj rurkę B, wirując palcem.
    7. Dodać zawartość probówki A do probówki B i dobrze wymieszać, wirując palcem. Inkubować probówkę B przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Pod koniec 30-minutowego okresu inkubacji należy przygotować komórki 293T, odsysając istniejące podłoża. Dodaj 16 ml pożywki R10 składającej się z 10% FBS (v/v), 1% PSG (v/v) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Po 30-minutowym okresie inkubacji dodać zawartość probówki B (około 9 ml) kroplami do kolby z komórkami 293T. Odłożyć kolbę i delikatnie ją obrócić przed inkubacją w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    10. W dniu 2 (około 24 godziny po transfekcji) pobrać lentiwirusa w następujący sposób:
      UWAGA: Wstępnie schłodzić cały sprzęt i materiały i wykonać następujące czynności na lodzie, aby utrzymać zimny supernatant wirusa.
      1. Przenieść supernatant z transfekowanych kolb 293T do wstępnie schłodzonych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
      2. Dodać 30 ml wstępnie podgrzanej pożywki R10 do kolb 293T.
      3. Osadzać resztki komórkowe przez odwirowanie stożkowych probówek o pojemności 50 ml o stężeniu 900 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w zamkniętych wirnikach.
      4. Po odwirowaniu przefiltrować supernatant filtrem 0,45 μm. Wirować filtrat w ultrawirówce w temperaturze 112 700 × g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
      5. Po 2-godzinnym wirowaniu odessać supernatant do momentu, aż pozostanie około 5 ml. Ponownie zawiesić cząsteczki wirusa, delikatnie pipetując w górę iw dół 10 razy. Zawiesinę wirusa należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
    11. W dniu 3 należy zebrać i przechowywać lentiwirusa w następujący sposób:
      1. Przenieść supernatant z transfekowanych kolb 293T do wstępnie schłodzonych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
      2. Dodaj 30 ml 10% wybielacza do kolb 293T.
      3. Osadzać resztki komórkowe w supernatancie przez odwirowanie stożkowych probówek o pojemności 50 ml o stężeniu 900 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w zamkniętych wirnikach.
      4. Po odwirowaniu przefiltrować supernatant filtrem 0,45 μm. Wirować filtrat w ultrawirówce w temperaturze 112 700 × g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
      5. Po 2-godzinnym wirowaniu odessać supernatant do momentu, gdy pozostanie około 2 ml, a następnie zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Przechowywać supernatant wirusa w podwielokrotnościach o objętości 300-500 μl i utrzymywać w temperaturze -80 °C.

4. Obliczanie miana wirusa dla lentiwirusa wykazującego ekspresję CAR

UWAGA: lentiwirus CAR został zainfekowany zgodnie z wcześniejszym opisem10,12.

  1. W dniu 1 aktywuj i płytkuj limfocyty T .
    1. Wyizoluj od 1 × 106 limfocytów T od zdrowych PBMC dawcy za pomocą zestawu do selekcji negatywnej.
    2. Policz limfocyty T.
    3. Umyj wystarczającą ilość kulek CD3 + / CD28 +, aby stymulować limfocyty T w stosunku 3: 1 kulki do komórek. Na przykład, aby stymulować 1 × 106 limfocytów T, umyj 3 × 106 kulek. Aby to zrobić, umyj koraliki, wykonując następujące czynności 3x:
      1. Użyj separacji magnetycznej, aby usunąć kulki z zawiesiny.
      2. Usunąć supernatant.
      3. Dodać 1000 μl pożywki z komórek T (TCM) składającej się z 10% surowicy ludzkiej (v/v), 1% PSG (v/v) i pożywki z komórek krwiotwórczych.
        UWAGA: TCM należy wysterylizować przed użyciem poprzez filtrowanie za pomocą sterylnego filtra próżniowego 0,45 μm, a następnie sterylnego filtra próżniowego 0,22 μm.
      4. Dodaj kulki do zawiesiny limfocytów T w stosunku 3:1 kulki do komórek.
      5. Ponownie zawiesić limfocyty T na 1 × 106 komórek/ml w TCM.
      6. Dodaj 100 μl aktywowanych limfocytów T do 10 dołków 96-dołkowej płytki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. W dniu 2 dodać rozcieńczoną lentiwirusa CAR, tworząc płytkę rozcieńczającą w następujący sposób:
    1. Dodaj 100 μl TCM do siedmiu dołków 96-dołkowej płytki.
    2. Do pierwszego dołka dodać 50 μl wirusa, który Cię interesuje; dobrze wymieszaj.
    3. Wirusa należy dalej seryjnie rozcieńczać, dodając 50 μl z dołka 1 do dołka 2; dobrze wymieszać.
    4. Dodać 50 μl z dołka 2 do dołka 3 i kontynuować ten wzór aż do dołka 7.
    5. Po wymieszaniu studzienki 7 usunąć 50 μl. Upewnij się, że wszystkie studzienki mają łączną objętość 100 μl.
    6. Dodaj 50 μl z każdego dołka płytki rozcieńczającej do pierwszych siedmiu dołków płytki limfocytów T z dnia 1. Dobrze wymieszaj.
    7. Do trzech ostatnich dołków płytki limfocytów T dodać 50 μl TCM; dobrze wymieszać. Przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. W dniu 3 nakarm komórki, dodając 100 μl TCM do wszystkich dołków płytki limfocytów T; dobrze wymieszaj.
  4. W dniu 4 wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć odsetek komórek wykazujących ekspresję CAR za pomocą przeciwciała łańcucha anty-kappa, zastępczego markera ekspresji CAR, wykonując następujące czynności:
    1. Obracać płytkę limfocytu T o masie 1 000 × g przez 3 minuty i zdekantować.
    2. Przemyć płytkę 3x buforem przeciwciał łańcucha anty-kappa (składającym się z 4% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (w/v)) dodając 200 μl buforu przeciwciał łańcucha anty-kappa, obracając płytkę w ilości 1 000 × g przez 3 minuty i dekantując.
    3. Dodaj przeciwciało anty-kappa anty-kappa z biotyną do każdej studzienki. Inkubować przez 45 minut na bujaczku w temperaturze 4 °C.
    4. Przemyć płytkę 3x buforem przeciwciał łańcucha anty-kappa, jak w kroku 4.4.2.
    5. Wybarwić komórki do cytometrii przepływowej przeciwciałem streptawidyny sprzężonym z fluorochromem i żywym/martwym przeciwciałem. Próbki inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Przemyć próbki raz w buforze przepływowym (składającym się z 2% FBS (v/v) i 1% azydku sodu (v/v) w PBS), dodając 200 μl buforu przepływowego, obracając płytkę o masie 1 000 × g przez 3 minuty i dekantując.
    7. Zawiesić w 100 μl buforu przepływowego i uruchomić na cytometrze.
    8. Wykonaj bramkowanie ujemne za pomocą trzech nietransdukowanych studzienek.

5. Obliczanie miana wirusa dla lentiwirusa z biblioteki CRISPR

UWAGA: Ten protokół opisuje minimalną liczbę limfocytów T do miareczkowania lentiwirusa z biblioteki CRISPR, ale może być skalowany w górę, aby pomieścić więcej limfocytów T, a tym samym większe ilości wirusa.

  1. W dniu 0 aktywuj limfocyty T, dodając 18 × 106 kulek CD3 + / CD28 + (stosunek kulek do komórek 3: 1) do 6 × 106 limfocytów T i doprowadzając końcową objętość do 6 ml za pomocą TCM. Podwielokrotność 0,5 ml zawiesiny limfocytów T do 12 dołków na płytce 48-dołkowej. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Dwadzieścia cztery godziny później, w dniu 1, dodaj wirusa CAR w wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3 do każdego dołka. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Czterdzieści osiem godzin później, w dniu 2, dodaj serię woluminów wirusa z biblioteki CRISPR do aktywowanych komórek CART, dodając jeden z następujących tomów wirusa CRISPR do każdej studzienki (0 μL, 0 μL, 6,25 μL, 6,25 μL, 12,5 μL, 12,5 μL, 25 μL, 25 μL, 50 μl, 50 μl, 100 μl lub 100 μl). Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. W dniu 3 dodaj 1 μg puromycyny na ml pożywki do połowy studzienek, w tym do jednego dołka, w którym przyjęto każdą z następujących objętości wirusa CRISPR (0 μL, 6,25 μL, 12,5 μL, 25 μL, 50 μL i 100 μL). Pozostałe studzienki nie będą leczone puromycyną.
  5. Od 4 do 8 dni należy codziennie liczyć limfocyty T i dostosować końcową gęstość komórek do 1 × 106 komórek/ml z 1 μg/ml puromycyny w TCM dla studzienek poddanych działaniu puromycyny i z TCM dla studzienek nieleczonych.
  6. W dniu 8 policz liczbę żywych komórek w studzience i oblicz jednostki transdukcji/ml supernatantu wirusa, używając następującego równania:
    figure-protocol-1
    Gdzie A: Liczba żywych komórek w dobrze transdukowanej wirusie; B: Liczba żywych komórek w studzience kontrolnej bez selekcji antybiotyków; V: Objętość wirusa wykorzystana do infekcji w każdym studzience; D: Fałd rozcieńczenia.
  7. Korzystając z dołka TU / ml obliczonego ze studzienki wykazującej około 20% skuteczności transdukcji, oblicz objętość wirusa potrzebną do transdukcji 1 × 106 komórek przy MOI 0,3, używając następującego wzoru:
    figure-protocol-2

6. Faza produkcji komórek CART na ekranie CRISPR (dni 0 - 8)

UWAGA: Poniższy protokół opisuje zakończenie badania przesiewowego CRISPR w jednym biologicznym powtórzeniu. Jednak ten protokół został wcześniej zweryfikowany z trzema powtórzeniami biologicznymi i zalecamy użycie co najmniej trzech powtórzeń biologicznych dla innych osób, które wypełniają ten protokół30.

  1. Dzień 0: Wyizoluj i stymuluj limfocyty T ze zdrowej krwi dawcy, jak opisano wcześniej10.
    1. Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) z pozbawionej identyfikacji zdrowej krwi dawcy.
      1. Dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki do separacji gradientu gęstości.
      2. Dodaj rozcieńczoną krew w stosunku 1:2 do górnej części probówki do separacji gradientu gęstości. Wirować przy 1 200 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Krew należy rozcieńczyć buforem izolacyjnym (2% FBS (v/v) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami [PBS]).
      3. Ubogą górną warstwę do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i podwoić objętość za pomocą bufora izolacyjnego. Odwirować próbkę o masie 300 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
      4. Ponownie zawiesić osad komórkowy z buforem izolacyjnym i policzyć PBMC.
    2. Wyizoluj limfocyty T z PBMC za pomocą zestawu do selekcji negatywnej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
      UWAGA: Załóżmy 10-20% odzysk limfocytów T z PBMC.
    3. Stymuluj limfocyty T za pomocą kulek CD3+/CD28+.
      1. Policz limfocyty T.
      2. Podać wystarczającą ilość kulek CD3 + / CD28 +, aby stymulować limfocyty T w stosunku 3: 1 kulki do komórek. Na przykład, aby stymulować 110 × 106 limfocytów T, podwielokrotność 330 × 106 kulek. Umyj kulki 3x, najpierw oddzielając je od zawiesiny za pomocą separacji magnetycznej, a następnie dodając 1,000 μL TCM.
      3. Dodaj kulki do zawiesiny limfocytów T. Ponownie zawiesić limfocyty T na 1 × 106 komórek/ml w TCM.
      4. Podziel limfocyty T na 6-dołkowe płytki, aby uzyskać najlepszą wydajność transdukcji. Dodaj 5 × 106 limfocytów T do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  2. Dzień 1: W warunkach BSL-2 + rozmrozić wystarczającą ilość lentiwirusa CAR, aby transdukować limfocyty T przy wielokrotności infekcji 3,0. Delikatnie rozbij rozety limfocytów T przed dodaniem odpowiedniej ilości puli lentiwirusa, aby transdukować 5 × 106 limfocytów T przy MOI 3,0. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Zbierz lentiwirusa z wielu produkcji w jednej probówce przed transdukcją limfocytów T. Gwarantuje to, że wszystkie limfocyty T otrzymują takie samo leczenie. Dodatkowo lentiwirus powinien być rozmrożony tylko raz.
  3. Dzień 2: W warunkach BSL-2 + rozmrozić wystarczającą ilość lentiwirusa CRISPR, aby transdukować limfocyty T przy MOI 0,3. Delikatnie rozbij rozety limfocytów T i ponownie zawieś limfocyty T przed dodaniem odpowiedniej ilości puli lentiwirusa w celu transdukcji 5 × 106 limfocytów T przy MOI 0,3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Zbierz lentiwirusa z wielu produkcji w jednej probówce przed transdukcją limfocytów T. Gwarantuje to, że wszystkie limfocyty T otrzymują takie samo leczenie.
  4. Dni 3 - 5: Ponownie zawieś komórki CART, aby rozbić rozety i policzyć komórki. Doprowadź końcowe stężenie komórek do 1 × 106 komórek/ml w TCM za pomocą 1 μg/ml puromycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Dzień 6: Ponownie zawieś komórki CART, aby rozbić rozety, usuń koraliki CD3 + / CD28 + poprzez separację magnetyczną i policz komórki CART. Dodać TCM z 1 μg/ml puromycyny, aby doprowadzić końcowe stężenie komórek do 1 × 106 komórek/ml i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Określić ekspresję CAR za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w kroku 4.4.

7. Faza selekcji gRNA w badaniu przesiewowym CRISPR (dni 8 - 22)

  1. Dzień 8: Zachowaj próbki do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i rozpocznij kokulturę.
    1. Przemyć komórki CART 3x w TCM, odwirowując próbki o stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odsysając supernatant i ponownie zawieszając próbki w 20 ml TCM.
    2. Policz komórki KOSZYKA.
    3. Zachowaj próbki pod kątem NGS, wykonując następujące czynności:
      1. Podwielokrotność komórek CART w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby utrzymać reprezentację gRNA wynoszącą 500 komórek na gRNA (np. podwielokrotność około 33 × 106 komórek CART, jeśli używasz biblioteki CRISPR z 65 383 gRNA). Odwirować próbkę o masie 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Przemyć probówkę stożkową o pojemności 50 ml 1 ml PBS i przenieść popłuczynę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
      3. Odwirować próbki o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -20 °C.
      4. Rozpocznij kohodowlę, dodając komórki CART do komórek CD19 + JeKo-1 w stosunku 1: 1. Na przykład dodaj 80 × 106 komórek KOSZYKA do 80 × 106 komórek JeKo-1. Doprowadzić całkowitą objętość kokultury do 160 ml za pomocą TCM. Próbki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
        UWAGA: Zalecamy rozpoczęcie od co najmniej 80 × 106 komórek CART, aby zachować reprezentację biblioteki i mieć wystarczającą liczbę komórek do zachowania próbek w dniu 15 i dniu 22.
  2. Dzień 10: Aby ponownie stymulować komórki CART, zebrać kokultury do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować próbki w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić każdą próbkę w 80 ml TCM i dodać 80 × 106 komórek JeKo-1 w 80 ml TCM. Próbki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Dzień 12 i 14: Ponownie stymuluj komórki CART, jak w kroku 7.2.
  4. Dzień 15: Zachowaj próbki pod kątem NGS i ponownie stymuluj komórki CART.
    1. Wyizoluj komórki CART z kohodowli, najpierw licząc komórki, a następnie łącząc zestaw pozytywnej selekcji dla limfocytów T CD4 + z zestawem pozytywnej selekcji dla limfocytów T CD8 + w celu wyizolowania limfocytów T z kokultur CART-JeKo-1. Policz limfocyty T.
    2. Zakonserwować próbki na obecność NGS, dzieląc 33 × 106 komórek CART w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i odwirowując próbkę przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić próbkę w 1 ml PBS i przenieść ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Przemyć probówkę stożkową o pojemności 50 ml 1 ml PBS i przenieść popłuczynę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Odwirować próbki o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C; usunąć supernatant; i przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -20 °C.
    3. Skonfiguruj kohodowle, aby kontynuować model in vitro w celu wyczerpania, dodając 80 × 106 komórek CART do 80 × 106 komórek JeKo-1. Następnie doprowadź całkowitą objętość kokultury do 160 ml za pomocą TCM. Próbki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Dzień 17, 19 i 21: Ponownie stymuluj komórki CART, jak w kroku 7.2.
  6. Dzień 22: Zachowaj próbki pod kątem NGS.
    1. Wyizoluj komórki CART z kohodowli, najpierw licząc komórki. Następnie połącz zestaw do pozytywnej selekcji limfocytów T CD4 + z zestawem do pozytywnej selekcji dla limfocytów T CD8 +, aby wyizolować limfocyty T z kokultur CART-JeKo-1. Policz limfocyty T.
    2. Aby zachować próbki do NGS, powtórzyć krok 7.4.2.

8. Przygotowanie genomowego DNA do sekwencjonowania nowej generacji

UWAGA: Aby utrzymać odpowiedni zasięg, genomowe DNA (gDNA) powinno być wyizolowane z co najmniej 33 × 106 komórek CART. Dodatkowo do sekwencjonowania należy przygotować całość gDNA z 33 × 106 komórek CART.

  1. Wyizoluj gDNA z zamrożonych granulek komórkowych za pomocą zestawu do izolacji gDNA.
  2. Oczyść gDNA poprzez wytrącanie etanolu.
    1. Schłodzić 100% EtOH do -20 °C.
    2. Podwielokrotność wymywała DNA równomiernie do kilku probówek do mikrowirówek (200-250 μl). Do każdej podwielokrotności dodać dwie objętości 100% EtOH (500 μL dla 250 μL podwielokrotności lub 400 μL dla 200 μL); 0,1 objętości 3 M octanu sodu (25 μl dla 250 μl podwielokrotności lub 20 μl dla 200 μl); i 1 μl glikogenu 20 mg/ml. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
    3. Drugiego dnia należy wirować próbki o masie 13 000 × g przez 20 minut, aby osadzać wytrącone DNA. Usunąć supernatant. Przemyć granulki 1 ml 70% EtOH, wirując z prędkością 7 500 × g przez 10 minut.
    4. Całkowicie usuń resztki EtOH. Pozostaw granulki do wyschnięcia na 30-45 minut.
    5. Zawiesić granulki w 50 μl sterylnej wody.
  3. Przygotuj gDNA dla NGS.
    UWAGA: Startery NGS dla tej biblioteki CRISPR, które wzmacniają gRNA za pomocą sekwencji adaptera Illumina, zostały zaprojektowane w poprzedniej publikacji27. Użycie innego odwróconego startera dla każdej próbki spowoduje okodowanie kreskowe każdej próbki i umożliwi łączenie próbek podczas sekwencjonowania.
    1. Przygotować próbki do PCR z następującą mieszaniną reakcyjną (objętość całkowita = 50 μl): mieszanina wzorcowa PCR o wysokiej wierności, 2x: 25 μL; zbiorcze matrycowe DNA, 0,5 μg: 1 μL; Starter do przodu biblioteki NGS, 10 μM: 1,25 μL; Podkład odwrócony biblioteki NGS, 10 μM: 1,25 μL; Woda wolna od DNaz: 21,5 μL.
    2. Przeprowadzić PCR w następujących warunkach cyklicznych: cykl 1: denaturacja w temperaturze 98 °C przez 3 minuty; cykle 2–23: denaturacja 98 °C przez 10 s, wyżarzanie w temperaturze 63 °C przez 10 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 25 s; cykl 24: przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty.
    3. Połączyć reakcje PCR dla każdej próbki i oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Przeprowadzić 3 μg produktu PCR dla każdej próbki na 2% (w/v) żelu agarozowym.
    5. Usuń produkt PCR (~260-270 pz) z żelu, ekstrahując DNA z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Wykonaj sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) z próbkami. Dąż do ponad 500 odczytów na gRNA w bibliotece.

9. Analiza wyników sekwencjonowania

  1. Do analizy NGS należy użyć platformy MAGeCK-VISPR28. Użyj standardowych ustawień algorytmu szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa (MAGeCK-MLE). Aby przygotować pliki wyjściowe do analizy:
    1. Uruchom polecenie FASTQC, aby ocenić jakość pliku sekwencji31.
    2. Scal pliki sekwencjonowania sparowanych końców dla każdej próbki za pomocą bbmerge32.
    3. Analizuj próbki na platformie MAGeCK-VISPR za pomocą algorytmu MAGeCK-MLE. W przypadku analizy MAGeCK-MLE znormalizuj wszystkie liczby gRNA do listy 1,000 niedocelowych gRNA.
    4. Oceń jakość pliku sekwencjonowania, oceniając zawartość GC, jakość podstawową, odczyty sekwencjonowania i zamapowane odczyty.
    5. Oceń powodzenie fazy selektywnego ciśnienia w badaniu przesiewowym CRISPR, oceniając zmiany w indeksie Giniego, grupowaniu analizy głównych składowych (PCA) i szlakach związanych z listą negatywnie wybranych genów32.
    6. Przesłuchuj najważniejsze trafienia, przeprowadzając wyszukiwanie w literaturze i przeprowadzając analizę ścieżek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać geny i szlaki, które mogą być edytowane w celu poprawy aktywności komórek CART w bezstronny sposób, zaprojektowaliśmy ekran nokautujący CRISPR in vitro dla całego genomu (Rysunek 1). To przesiewanie ma dwie fazy: fazę produkcji ogniw CART i fazę selektywnego ciśnienia. W fazie produkcji komórek CART co najmniej 110 × 106 limfocytów T jest najpierw izolowanych ze zdrowych PBMC dawcy i aktywowanych kulkami CD3+/CD28+. Następnego dnia, w dniu 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Edycja genów stała się potężnym narzędziem zarówno w zrozumieniu mechanizmów oporności na terapie, jak i w projektowaniu nowatorskich terapii komórkowych CART w celu poprawy długowieczności i aktywności komórek CART 16,17,26. Podczas gdy niektóre strategie edycji genów wykazały poprawę aktywności komórek CART zarówno w modelach przedklinicznych, jak i badaniach klinicznych, nadal pozostaje wiele do zrobienia w celu optymalizacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), Humanigen (poprzez Mayo Clinic), Mettaforge (poprzez Mayo Clinic) i MustangBio (poprzez Mayo Clinic) oraz Chymal therapeutics (przez Mayo Clinic). CS, CMR i SSK są wynalazcami patentów, na które licencja jest udzielona firmie Immix Biopharma. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK odłączyło się od konsultanta dla Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma i Humanigen. CMS i SSK są wynalazcami własności intelektualnej, która powstała w wyniku tego protokołu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), National Institutes of Health K12CA090628 (SSK) i R37CA266344-01 (SSK), grant Departamentu Obrony CA201127 (SSK), Fundację Predolin (SSK) oraz Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics (SSK). CMS jest wspierany przez Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Schemat ekranu CRISPR (rysunek 1) został stworzony za pomocą BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki 293TATCCCRL-3216Komórki używane do produkcji lentiwirusa
Przeciwciało Biotyna BiałkoLGenScriptM00097przeciwciało łańcuchowe anty-kappa do wykrywania CAR
Surowica bydlęca AlbuminaMillipore SigmaA7906
Karbenicylina sól disodowaMillipore SigmaC1389-1GAntybiotyk karbenicylinowy
CD4 Izolacja KoralikiMiltenyi Biotec130-045-101 
Kulki izolacyjne CD8Miltenyi Biotec130-045-201
CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
Woda bez DNazInvitrogenAM9937
Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)Corning10-017-CV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoGibco14190-144
Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySepSTEMCELL Technologies17951RFZestaw do izolacji ujemnej
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1Elektrokompetentne ogniwa z pożywką regeneracyjną
EtanolMillipore SigmaE7023
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library AAddGene1000000048Biblioteka CRISPR plazmid
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105Elektroporator
glikogenMillipore Sigma10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ komórki docelowe 
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000075Zestaw odczynników do transfekcji z odczynnikiem do transfekcji (odczynnik Lipofectamine 3000) i neutralnym odczynnikiem kolipidowym (p3000)
ŻYWY/MARTWY AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851Gradient gęstości średni
Zestawy Machery-Nagel NucleoBond Xtra MaxiZestaw do przygotowania Maxi ThermoFisher Scientific12748412
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SMastermix do PCR o wysokiej wierności
Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicyGibco31985-070Zredukowana pożywka w surowicy
pCMVR8.74AddGene22036Plazmid do pakowania lentiwirusowego
Pennicylina-streptomycyna-glutamina (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G otoczka z ekspresją plazmidu
Pooled Human AB Surowica Innowacyjne badaniaISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Zestaw do ekstrakcji Gek
Zestaw Qucik-DNA Midiprep Plus ZymoResearchD4075Zestaw służący do izolacji gDNA
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Automatyczny separator komórek
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450Rurka do separacji gradientu gęstości
Octan soduInvitrogenAM9740
Azydek soduFisher Scientific71448-16
Przeciwciało streptawidyny (PE)BioLegend405203Przeciwciało drugorzędowe używany do wykrywania CAR
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Ultrawirówka (Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
Systemy filtrów próżniowych, 0,22 i mikro; mThermoFisher Scientific567-0020
Systemy filtrów próżniowych, 0,45 &mikro; mThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicyLonza04-418QPożywka z komórek krwiotwórczych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).
  6. Bai, Z., et al. Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all. Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).
  7. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 24, 563-571 (2018).
  8. Gennert, D. G., et al. Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion. Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).
  9. Deng, Q., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).
  10. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  11. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  12. Cox, M. J., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  13. Ottaviano, G., et al. Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia. Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).
  14. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).
  15. Mccutcheon, S. R., et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens. Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).
  16. Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype. Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).
  19. Belk, J. A., et al. Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  20. Jiang, P., et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).
  21. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  22. Beider, K., et al. Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies. Cells. 11 (7), 1140(2022).
  23. Wherry, E. J. T. cell exhaustion. Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).
  24. Prinzing, B., et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity. Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).
  25. Lynn, R. C., et al. C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature. 576, 293-300 (2019).
  26. Tang, N., et al. TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).
  27. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  28. Li, W., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biol. 16, 281(2015).
  29. Sakemura, R., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).
  30. Stewart, C. M., et al. IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells. Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).
  31. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  32. Bbmerge. , https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh (2019).
  33. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  34. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  35. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  36. Zhou, P., et al. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).
  37. Sutra Del Galy, A., et al. In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response. Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).
  38. Ramos, A., et al. Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening. Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki CAR Tprzesiew genomowyimmunoterapia nowotwor wedycja gen wwyczerpanie kom rek Tsekwencjonowanie nast pnej generacjiizolacja genomowego DNAantygen CD19po ywka do hodowli kom rek T

Powiązane artykuły