Artykuł opisuje protokół zastosowania modelu in vitro do wyczerpania w celu przeprowadzenia całego genomu ekranu nokautującego CRISPR w zdrowych limfocytach T receptora chimerycznego antygenu dawcy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) jest innowacyjną formą celowanej immunoterapii, która zrewolucjonizowała leczenie raka. Jednak trwała reakcja pozostaje ograniczona. Ostatnie badania wykazały, że epigenetyczny krajobraz produktów z komórek CART przed infuzją może wpływać na odpowiedź na terapię, a jako rozwiązanie zaproponowano edycję genów. Konieczne jest jednak wykonanie dalszych prac w celu określenia optymalnej strategii edycji genów. Badania przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom stały się popularnymi narzędziami zarówno do badania mechanizmów oporności, jak i optymalizacji strategii edycji genów. Jednak ich zastosowanie w komórkach pierwotnych wiąże się z wieloma wyzwaniami. W tym miejscu opisujemy metodę przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR obejmującego cały genom w komórkach CART od zdrowych dawców. Jako model potwierdzający słuszność koncepcji zaprojektowaliśmy tę metodę w celu zbadania rozwoju wyczerpania w komórkach CART ukierunkowanych na antygen CD19. Uważamy jednak, że podejście to może być wykorzystane do zajęcia się różnymi mechanizmami oporności na terapię w różnych konstruktach CAR i modelach nowotworów.
Wprowadzenie
Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) wykazała imponujący sukces w leczeniu nowotworów złośliwych komórek B; jednak trwała odpowiedź jest ograniczona do 30-40%1,2,3,4,5. Chociaż naukowcy opracowali i przetestowali kilka podejść mających na celu rozwiązanie problemów z mechanizmami oporności na terapię komórkową CART, w tym optymalizację konstrukcji CAR, edycję genów i terapie skojarzone, rozwój oporności pozostaje w dużej mierze nieznany. Ostatnio pojawiło się coraz więc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Należy zaznaczyć, że opisany poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi i otrzymał zatwierdzenie Komisji Przeglądu Instytucjonalnego Mayo Clinic (IRB 18-005745) oraz Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC HIP00000252.43). Wszystkie prace z kulturami komórkowymi, w tym produkcja lentiwirusów, powinny być przeprowadzane w dygestorium do kultur komórkowych przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. W szczególności prace z lentiwirusami powinny być prowadzone zgodnie z zasadami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), w tym z zastosowaniem 10% podchlorynu sodu do dezynfekcji przedmiotów przed ich utylizacją.
<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby w sposób bezstronny zbadać geny i szlaki sygnałowe, których edycja może poprawić aktywność komórek CART, zaprojektowaliśmy in vitro genomowy screening CRISPR knockout (Rysunek 1). Przesiewanie to składa się z dwóch faz: fazy produkcji komórek CART oraz fazy presji selekcyjnej. W fazie produkcji komórek CART co najmniej 110 × 106 Limfocyty T są najpierw izolowane z PBMC zdrowego dawcy, a następnie aktywowane za pomocą CD3+/CD28+ kulek. Następnego .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Edycja genów stała się potężnym narzędziem zarówno w zrozumieniu mechanizmów oporności na terapie, jak i w projektowaniu nowatorskich terapii komórkowych CART w celu poprawy długowieczności i aktywności komórek CART 16,17,26. Podczas gdy niektóre strategie edycji genów wykazały poprawę aktywności komórek CART zarówno w modelach przedklinicznych, jak i badaniach klinicznych, nadal pozostaje wiele do zrobienia w celu optymalizacji.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), Humanigen (poprzez Mayo Clinic), Mettaforge (poprzez Mayo Clinic) i MustangBio (poprzez Mayo Clinic) oraz Chymal therapeutics (przez Mayo Clinic). CS, CMR i SSK są wynalazcami patentów, na które licencja jest udzielona firmie Immix Biopharma. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK odłączyło się od konsultanta dla Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma i Humanigen. CMS i SSK są wynalazcami własności intelektualnej, która powstała w wyniku tego protokołu.
Podziękowania
To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), National Institutes of Health K12CA090628 (SSK) i R37CA266344-01 (SSK), grant Departamentu Obrony CA201127 (SSK), Fundację Predolin (SSK) oraz Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics (SSK). CMS jest wspierany przez Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Schemat ekranu CRISPR (rysunek 1) został stworzony za pomocą BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki 293T | ATCC | CRL-3216 | Komórki używane do produkcji lentiwirusa |
| Przeciwciało Biotyna BiałkoL | GenScript | M00097 | przeciwciało łańcuchowe anty-kappa do wykrywania CAR |
| Surowica bydlęca Albumina | Millipore Sigma | A7906 | |
| Karbenicylina sól disodowa | Millipore Sigma | C1389-1G | Antybiotyk karbenicylinowy |
| CD4 Izolacja Koraliki | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Kulki izolacyjne CD8 | Miltenyi Biotec | 130-045-201 | |
| CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| Cytoflex | Beckman Coulter | NC2279958 | |
| Woda bez DNaz | Invitrogen | AM9937 | |
| Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco | Gibco | 14190-144 | |
| Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySep | STEMCELL Technologies | 17951RF | Zestaw do izolacji ujemnej |
| Endura Electrocompetent Cells | Biosearch Technologies | 60242-1 | Elektrokompetentne ogniwa z pożywką regeneracyjną |
| Etanol | Millipore Sigma | E7023 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A | AddGene | 1000000048 | Biblioteka CRISPR plazmid |
| Gene Pulser II | Bio-Rad | 165-2105 | Elektroporator |
| glikogen | Millipore Sigma | 10901393001 | |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | CD19+ komórki docelowe |
| Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000075 | Zestaw odczynników do transfekcji z odczynnikiem do transfekcji (odczynnik Lipofectamine 3000) i neutralnym odczynnikiem kolipidowym (p3000) |
| ŻYWY/MARTWY Aqua | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 7851 | Gradient gęstości średni |
| Zestawy Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi | Zestaw do przygotowania Maxi ThermoFisher Scientific | 12748412 | |
| NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMix | New England BioLabs | M0541S | Mastermix do PCR o wysokiej wierności |
| Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicy | Gibco | 31985-070 | Zredukowana pożywka w surowicy |
| pCMVR8.74 | AddGene | 22036 | Plazmid do pakowania lentiwirusowego |
| Pennicylina-streptomycyna-glutamina (100X) | Life Technologies | 10378-016 | |
| pMD2.G | AddGene | 12259 | VSV-G otoczka z ekspresją plazmidu |
| Pooled Human AB Surowica | Innowacyjne badania | ISERABHI | |
| Puromycin | Millipore Sigma | P8833 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Zestaw do ekstrakcji Gek |
| Zestaw Qucik-DNA Midiprep Plus Zymo | Research | D4075 | Zestaw służący do izolacji gDNA |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Automatyczny separator komórek |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) | Gibco | 21870092 | |
| SepMate-50 | STEMCELL Technologies | 85450 | Rurka do separacji gradientu gęstości |
| Octan sodu | Invitrogen | AM9740 | |
| Azydek sodu | Fisher Scientific | 71448-16 | |
| Przeciwciało streptawidyny (PE) | BioLegend | 405203 | Przeciwciało drugorzędowe używany do wykrywania CAR |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Ultrawirówka (Optima XPN-80) | BeckmanCoulter | A99839 | |
| Systemy filtrów próżniowych, 0,22 i mikro; m | ThermoFisher Scientific | 567-0020 | |
| Systemy filtrów próżniowych, 0,45 &mikro; m | ThermoFisher Scientific | 165-0045 | |
| X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicy | Lonza | 04-418Q | Pożywka z komórek krwiotwórczych |
Bibliografia
- Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtag....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
