Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67338

⸱

31 stycznia 2025

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł opisuje protokół zastosowania modelu in vitro do wyczerpania w celu przeprowadzenia całego genomu ekranu nokautującego CRISPR w zdrowych limfocytach T receptora chimerycznego antygenu dawcy.

Streszczenie

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CART) jest innowacyjną formą celowanej immunoterapii, która zrewolucjonizowała leczenie raka. Jednak trwała reakcja pozostaje ograniczona. Ostatnie badania wykazały, że epigenetyczny krajobraz produktów z komórek CART przed infuzją może wpływać na odpowiedź na terapię, a jako rozwiązanie zaproponowano edycję genów. Konieczne jest jednak wykonanie dalszych prac w celu określenia optymalnej strategii edycji genów. Badania przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom stały się popularnymi narzędziami zarówno do badania mechanizmów oporności, jak i optymalizacji strategii edycji genów. Jednak ich zastosowanie w komórkach pierwotnych wiąże się z wieloma wyzwaniami. W tym miejscu opisujemy metodę przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR obejmującego cały genom w komórkach CART od zdrowych dawców. Jako model potwierdzający słuszność koncepcji zaprojektowaliśmy tę metodę w celu zbadania rozwoju wyczerpania w komórkach CART ukierunkowanych na antygen CD19. Uważamy jednak, że podejście to może być wykorzystane do zajęcia się różnymi mechanizmami oporności na terapię w różnych konstruktach CAR i modelach nowotworów.

Wprowadzenie

Terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CART) wykazała imponujący sukces w leczeniu nowotworów złośliwych komórek B; jednak trwała odpowiedź jest ograniczona do 30-40%1,2,3,4,5. Chociaż naukowcy opracowali i przetestowali kilka podejść mających na celu rozwiązanie problemów z mechanizmami oporności na terapię komórkową CART, w tym optymalizację konstrukcji CAR, edycję genów i terapie skojarzone, rozwój oporności pozostaje w dużej mierze nieznany. Ostatnio pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wyjściowy profil ekspresji genów w produktach z komórek CART przed infuzją jest ważnym czynnikiem determinującym zarówno toksyczność, jak i skuteczność terapii CART6,7,8,9. W związku z tym edycja genów podczas produkcji komórek CART stała się popularnym podejściem do poprawy skuteczności terapii komórkowej CART.

Na przykład, nasze laboratorium wcześniej pokazało, że użycie technologii Cas9 z regularnie rozmieszczonymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) do wyeliminowania czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów genu (GM-CSF) poprawia aktywność komórek CART i zmniejsza oznaki toksyczności związanej z CART10,11,12. Dodatkowo, terapia komórkowa modyfikowana przez CRISPR została przetestowana w badaniach klinicznych i wykazała skuteczność i bezpieczeństwo13. Razem wskazuje to, że edycja genów za pomocą technologii CRISPR może nie tylko poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii komórek CART, ale także wygenerować translowalne produkty komórkowe CART.

Ekrany nokautujące CRISPR dla całego genomu stają się coraz bardziej popularnymi narzędziami w badaniach nad biologią nowotworów, pozwalającymi zrozumieć mechanizmy oporności na terapie. W tej technice dziesiątki tysięcy przewodnikowych RNA (gRNA) są dostarczane do pul komórek, aby zachęcić do wejścia jednego gRNA na komórkę14. Następnie komórki poddawane są warunkom wywołującym ciśnienie, w których komórki transdukowane gRNA ukierunkowane na niezbędne geny umierają, a komórki transdukowane gRNA ukierunkowane na geny hamujące przeżywają i namnażają się. Korzystając z sekwencjonowania nowej generacji, możemy określić, jak zmienia się reprezentacja gRNA w całym ekranie CRISPR14.

Jednak skala i czas selekcji wymagane do perturbacji genów w całym genomie mogą być trudne do osiągnięcia w komórkach pierwotnych, takich jak komórki CART. W związku z tym grupy wykorzystały ukierunkowane badania przesiewowe CRISPR, aby lepiej zrozumieć mechanizmy oporności terapeutycznej15,16. Ekrany docelowe są często łatwiejsze do wykonania w komórkach podstawowych, ponieważ mają mniejsze biblioteki, które wymagają mniejszej liczby komórek, aby uzyskać odpowiednią reprezentację biblioteki. Chociaż badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat mechanizmów oporności na terapię komórkową CART, celowane badania przesiewowe wprowadzają błąd systematyczny ze względu na ręczną selekcję docelowych genów. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie metody przeprowadzenia badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w komórkach CART od zdrowych dawców. W związku z tym to wysokoprzepustowe podejście pozwala na wydajną, bezstronną identyfikację kluczowych szlaków i genów, które można edytować w celu poprawy odpowiedzi terapeutycznych17,18,19.

W szczególności, protokół opisany w tym artykule ma na celu zwiększenie wiedzy na temat wyczerpania komórek CART poprzez uzupełnienie ekranu nokautu CRISPR obejmującego cały genom modelem in vitro dla wyczerpania. Wyczerpanie to dysfunkcyjny los komórki CART, który jest związany z brakiem odpowiedzi na terapię komórkową CART20,21,22. Wiadomo, że ten los komórkowy jest regulowany epigenetycznie i charakteryzuje się spadkiem proliferacji komórek CART, spadkiem produkcji cytokin efektorowych i wzrostem ekspresji receptorów hamujących23. We wcześniejszej literaturze edycja genów była w stanie zapobiec rozwojowi wyczerpania poprzez regulację kluczowych genów w górę lub w dół24,25,26. Biorąc pod uwagę zarówno spadek zdolności proliferacyjnej w miarę wyczerpania komórek CART, jak i dowody na to, że edycja genów może zapobiec jego wystąpieniu, modelowaliśmy nasz ekran nokautujący CRISPR w całym genomie in vitro na tym losie komórkowym. Protokół ten może jednak zostać zmieniony w przyszłości w celu zbadania innych mechanizmów oporności na terapię komórkową CART.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Należy zaznaczyć, że opisany poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi i otrzymał zatwierdzenie Komisji Przeglądu Instytucjonalnego Mayo Clinic (IRB 18-005745) oraz Instytucjonalnego Komitetu Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC HIP00000252.43). Wszystkie prace z kulturami komórkowymi, w tym produkcja lentiwirusów, powinny być przeprowadzane w dygestorium do kultur komórkowych przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. W szczególności prace z lentiwirusami powinny być prowadzone zgodnie z zasadami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), w tym z zastosowaniem 10% podchlorynu sodu do dezynfekcji przedmiotów przed ich utylizacją.

1. Amplifikacja biblioteki CRISPR

  1. Namnożone bibliotekę CRISPR zgodnie z zaleceniami producenta. W skrócie, przeprowadź elektroporację biblioteki CRISPR do czterech alikwotów komórek elektrokompetentnych, wykonując następujące czynności:
    1. Dodaj 2 µL plazmidu biblioteki CRISPR o stężeniu 50 ng/µL do 25 µL komórek elektrokompetentnych w kuwecie 1,0 mm.
    2. Przeprowadź elektroporację próbek, stosując następujące ustawienia: 10 µF, 600 Ohms, 1 800 voltów oraz stałą czasową od 3,5 ms do 4,5 ms.
    3. Wykonywanie rekuperacji w 975 µL pożywki do rekuperacji, a następnie przeniesienie do probówki z dodatkowym 1 mL pożywki do rekuperacji.
    4. Inkubuj wszystkie alikwoty w rotatorze przy 250 RPM przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  2. Wysiej transformanty na płytki:
    1. Połącz wszystkie alikwoty elektroporowanych komórek i dokładnie wymieszaj.
    2. Wysiej wszystkie elektroporowane komórki, rozprowadzając 400 µL mieszaniny transformacyjnej na uprzednio ogrzane płytki z pożywką Luria broth (LB) o średnicy 10 cm z dodatkiem 100 µg/mL karbenicyliny. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 32 °C na 14 h.
  3. Zbierz kolonie:
    1. Nanieś pipetą 1 mL pożywki LB + 100 µg/mL karbenicyliny na każdą płytkę. Zeskrob kolonie z każdej płytki i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 mL.
    2. Dodaj kolejny 1 mL pożywki LB + 100 µg/mL karbenicyliny do każdej płytki, aby wypłukać i zapewnić całkowite odzyskanie komórek.
    3. Przeprowadź preparatykę maxi-prep zgodnie z instrukcją zestawu do maxi-prep.
    4. Połącz otrzymane DNA plazmidowe.

2. Sekwencjonowanie następnej generacji w celu weryfikacji reprezentacji bazowej gRNA w bibliotece CRISPR

UWAGA: Primery NGS dla tej biblioteki CRISPR zostały zaprojektowane w poprzedniej publikacji27. Zastosowanie innego primera odwrotnego dla każdej próbki pozwoli na ich znakowanie kodami kreskowymi, co umożliwi łączenie próbek podczas sekwencjonowania.

  1. Przygotować próbki do PCR z zastosowaniem następującej mieszaniny reakcyjnej (objętość całkowita = 50 µL): high-fidelity PCR master mix, 2x: 25 µL; połączone matrycowe DNA, 0,5 µg: 1 µL; forward primer biblioteki NGS, 10 µM: 1,25 µL; reverse primer biblioteki NGS, 10 µM: 1,25 µL; woda wolna od DNaz: 21,5 µL.
  2. Przeprowadzić PCR zgodnie z następującymi warunkami cyklów: cykl 1: denaturacja w 98 °C przez 3 min; cykle 2-23: denaturacja w 98 °C przez 10 s, annealing w 63 °C przez 10 s, elongacja w 72 °C przez 25 s; cykl 24: elongacja w 72 °C przez 2 min.
  3. Oczyścić produkt reakcji PCR poprzez połączenie reakcji PCR dla każdej próbki i oczyszczenie produktu PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcją producenta.
  4. NaNieść 3 µg produktu PCR dla każdej próbki na żel agarozy 2% (w/v).
  5. Wyciąć produkt PCR (~260-270 bp) z żelu, ekstrahując DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcją producenta. Należy uzyskać co najmniej 500 ng DNA.
  6. Próbki po ekstrakcji przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Przeprowadzić sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) próbek, dążąc do uzyskania 100 odczytów na gRNA27.
  8. Przeanalizować wyniki sekwencjonowania za pomocą potoku MAGeCK-VISPR i upewnić się, że reprezentowanych jest ponad 99,5% gRNA w bibliotece28.

3. Produkcja biblioteki CRISPR oraz lentiwirusów ekspresyjnych CAR

  1. Przygotować lentiwirusy zgodnie z wcześniejszym opisem10,29.
    1. Dzień 1: Rozpocząć od kolb T175 z komórkami 293T o konfluencji 80-90%, hodowanymi w pożywce D10 składającej się z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v), 1% penicyliny-streptomycyny-glutaminy (PSG) (v/v) oraz modyfikowanej pożywki Eagle'a z dodatkiem Dulbecco. Przed rozpoczęciem ogrzać odczynniki do transfekcji i DNA do temperatury pokojowej oraz przeprowadzić kwantyfikację DNA.
    2. Dla każdej kolby z komórkami 293T oznakować dwie probówki stożkowe 50 mL jako A i B. Do probówki A oraz do probówki B dodać po 4,5 mL pożywki o obniżonej zawartości surowicy.
    3. W sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zmieszać następujące ilości DNA i odstawić na 1 min: 18 µg pCMVR8.74 (gag, pol, tat i rev), 7 µg pMD2.G (VSV-G) oraz 15 µg lentiwirusowego wektora ekspresyjnego (wektory biblioteki CRISPR A lub CAR19-28ζ).
    4. Do probówki A dodać 129 µL odczynnika do transfekcji. Dobrze wymieszać zawartość probówki A poprzez delikatne potrząsanie palcami (finger vortexing).
    5. Do probówki B dodać mieszaninę DNA. Dobrze wymieszać zawartość probówki B poprzez delikatne potrząsanie palcami.
    6. Do probówki B dodać 111 µL neutralnego odczynnika kolipidowego. Dobrze wymieszać zawartość probówki B poprzez delikatne potrząsanie palcami.
    7. Przenieść zawartość probówki A do probówki B i dobrze wymieszać poprzez delikatne potrząsanie palcami. Inkubować probówkę B przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    8. Pod koniec 30-minutowego okresu inkubacji przygotować komórki 293T, odsysając istniejącą pożywkę. Dodać 16 mL pożywki R10 składającej się z 10% FBS (v/v), 1% PSG (v/v) oraz pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Po 30-minutowej inkubacji zawartość probówki B (około 9 mL) dodać kroplami do kolby z komórkami 293T. Położyć kolbę poziomo i delikatnie nią zakręcić przed inkubacją w temperaturze 37 ˚C i 5% CO2.
    10. W Dniu 2 (około 24 h po transfekcji) zebrać lentiwirusy w następujący sposób:
      UWAGA: Schłodzić cały sprzęt i materiały; poniższe czynności wykonywać na lodzie, aby utrzymać niską temperaturę nadpływu wirusowego.
      1. Przenieść nadpływ z kolb z transfektowanymi komórkami 293T do schłodzonych wcześniej probówek stożkowych 50 mL.
      2. Do kolb z komórkami 293T dodać 30 mL uprzednio ogrzanej pożywki R10.
      3. Osadzić szczątki komórkowe poprzez wirowanie probówek stożkowych 50 mL z prędkością 900 × g przez 10 min w temperaturze 4 ˚C w zamkniętych rotorach.
      4. Po wirowaniu przefiltrować nadpływ przez filtr 0,45 µm. Wirować filtrat w ultrycentryfudze z prędkością 112 700 × g w temperaturze 4 ˚C przez 2 h.
      5. Po 2-godzinnym wirowaniu odessać nadpływ, aż pozostanie około 5 mL. Resuspendować cząstki wirusowe, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Przechowywać zawiesinę wirusową w temperaturze 4 ˚C przez noc.
    11. W Dniu 3 zebrać i przechowywać lentiwirusy w następujący sposób:
      1. Przenieść nadpływ z kolb z transfektowanymi komórkami 293T do schłodzonych wcześniej probówek stożkowych 50 mL.
      2. Do kolb z komórkami 293T dodać 30 mL 10% roztworu wybielacza.
      3. Osadzić szczątki komórkowe w nadpływie poprzez wirowanie probówek stożkowych 50 mL z prędkością 900 × g przez 10 min w temperaturze 4 ˚C w zamkniętych rotorach.
      4. Po wirowaniu przefiltrować nadpływ przez filtr 0,45 µm. Wirować filtrat w ultrycentryfudze z prędkością 112 700 × g w temperaturze 4 ˚C przez 2 h.
      5. Po 2-godzinnym wirowaniu odessać nadpływ, aż pozostanie około 2 mL, a następnie resuspendować, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy. Przechowywać nadpływ wirusowy w aliquotach 300-500 µL w temperaturze -80 ˚C.

4. Obliczanie miana wirusowego dla lentiwirusa wykazującego ekspresję CAR

UWAGA: Miano lentiwirusa CAR określono zgodnie z wcześniejszym opisem10,12.

  1. Włączony Dzień 1aktywować i wysiać limfocyty T.
    1. Wyizolować 1 × 106 izolacja limfocytów T z PBMC zdrowego dawcy przy użyciu zestawu do selekcji negatywnej.
    2. Policz limfocyty T.
    3. Przemyj odpowiednią ilość CD3+/CD28+ kuleczki w celu stymulacji limfocytów T w stosunku kuleczek do komórek 3:1. Na przykład, aby stymulować 1 × 106 limfocyty T, przemyć 3 × 106 kuleczki. W tym celu należy przemyć kuleczki, wykonując następujące czynności trzykrotnie:
      1. Należy zastosować separację magnetyczną, aby usunąć kuleczki z zawiesiny.
      2. Usunąć nadsącz.
      3. Dodaj 1000 µL pożywki dla limfocytów T (TCM), składającej się z 10% surowicy ludzkiej (v/v), 1% PSG (v/v) oraz pożywki dla komórek krwiotwórczych.
        UWAGA: Przed użyciem TCM należy wysterylizować poprzez filtrowanie za pomocą 0.45 µm sterylnym filtrem próżniowym, a następnie za pomocą 0.22 µm sterylny filtr próżniowy
      4. Dodać kuleczki do zawiesiny limfocytów T w stosunku kuleczek do komórek 3:1.
      5. Resuspender limfocyty T do stężenia 1 × 106 komórek/ml w TCM.
      6. Dodaj 100 µL aktywowanych limfocytów T do 10 studzienek płytki 96-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 ˚C, w atmosferze 5% CO2.
  2. Włączony Dzień 2dodaj rozcieńczenie lentiwirusa CAR, przygotowując płytkę z rozcieńczeniami w następujący sposób:
    1. Dodaj 100 µL TCM do siedmiu studzienek płytki 96-dołkowej.
    2. Do pierwszej studzienki dodać 50 µL badanego wirusa; wymieszać dokładnie.
    3. Dalsze rozcieńczanie seryjne wirusa poprzez dodanie 50 µL z dołka 1 do dołka 2; dokładnie wymieszać.
    4. Dodaj 50 µL z dołka 2 do dołka 3 i kontynuuj ten schemat aż do dołka 7.
    5. Po dokładnym wymieszaniu [7], usunąć 50 µLUpewnij się, że we wszystkich dołkach znajduje się całkowita objętość wynosząca 100 µL.
    6. Dodaj 50µL z każdego dołka płytki z rozcieńczeniami do pierwszych siedmiu dołków płytki z limfocytami T z Dnia 1. Dobrze wymieszać.
    7. Do trzech ostatnich dołków płytki z limfocytami T dodać 50 µL pożywki TCM; wymieszać dokładnie. Przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, przy 5% CO22.
  3. Włączone Dzień 3dokarmić komórki, dodając 100 µL TCM do wszystkich studzienek płytki z limfocytami T; wymieszać dokładnie.
  4. Włączone Dzień 4przeprowadź analizę cytometryczną w celu oznaczenia procenta komórek wykazujących ekspresję CAR przy użyciu przeciwciała przeciwko łańcuchowi kappa, będącego markerem zastępczym dla ekspresji CAR, wykonując następujące czynności:
    1. Odwiruj płytkę z limfocytami T z prędkością 1000 × g przez 3 min, a następnie zdekantować.
    2. Przemyć płytkę trzykrotnie buforem do przeciwciał przeciwko łańcuchowi kappa (składającym się z 4% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (m/v)), dodając 200 µL buforu przeciwciał przeciwko łańcuchowi kappa, wirując płytkę z prędkością 1 000 × g przez 3 min, a następnie zdekantować.
    3. Do każdej studzienki należy dodać biotynowane przeciwciało przeciwko łańcuchowi kappa. Inkubować przez 45 min na wytrząsaciele w temperaturze 4 ˚C.
    4. Przemyć płytkę 3 razy buforem do przeciwciał przeciwko łańcuchowi kappa, zgodnie z instrukcją w punkcie 4.4.2.
    5. Przebarw komórki do cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciała streptawidyna sprzężonego z fluorochromem oraz przeciwciała live/dead. Inkubuj próbki przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    6. Przeplucz próbki raz w buforze przepływowym (składającym się z 2% FBS (v/v) i 1% azotku sodu (v/v) w PBS), dodając 200 µL buforu przepływowego, odwirując płytkę z prędkością 1000 × g przez 3 min, a następnie zdekantować.
    7. Resuspendować w 100 µL buforu przepływowego i przeprowadzić analizę na cytometrze.
    8. Wykonaj bramkowanie negatywne przy użyciu trzech studzienek nieprzetransdukowanych.

5. Obliczanie miana wirusowego dla lentiwirusa biblioteki CRISPR

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje minimalną liczbę limfocytów T niezbędną do mianowania lentiwirusa biblioteki CRISPR, jednak można go przeskalować, aby objął większą liczbę limfocytów T, a tym samym większe objętości wirusa.

  1. Włączone Dzień 0aktywować limfocyty T, dodając 18 × 106 CD3+/CD28+ perełki (stosunek perełek do komórek 3:1) do 6 × 106 limfocyty T i doprowadzenie końcowej objętości do 6 mL za pomocą TCM. Odnieść po 0,5 mL zawiesiny limfocytów T do 12 studzienek płytki 48-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 ˚C, w atmosferze 5% CO22.
  2. Dwadzieścia cztery godziny później, w dniu Dzień 1dodaj wirusa CAR z wielokrotnością zakażenia (MOI) równą 3 do każdej studzienki. Wymieszaj dokładnie, kilkukrotnie pipetując w górę i w dół. Przechowuj w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, 5% CO22.
  3. Czterdzieści osiem godzin później, w dniu Dzień 2do aktywowanych komórek CART dodać serię objętości wirusa z biblioteki CRISPR, dodając do każdej studzienki jedną z następujących objętości wirusa CRISPR (0 µL, 0 µL, 6.25 µL, 6.25 µL, 12.5 µL, 12.5 µL, 25 µL, 25 µL, 50 µL, 50 µL, 100 µLlub 100 µL). Wymieszać dokładnie, kilkakrotnie pipetując ciecz w górę i w dół. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, 5% CO2.
  4. Włączone Dzień 3dodaj 1 µg puromycyny na ml pożywki do połowy studzienek, w tym do jednej studzienki, która otrzymała każdą z następujących objętości wirusa CRISPR (0 µL, 6.25 µL, 12.5 µL, 25 µL, 50 µLi 100 µL). Pozostałe dołki nie zostaną poddane działaniu puromycyny.
  5. Z Dni 4–8codziennie zliczaj limfocyty T i dostosuj końcową gęstość komórek do 1 × 106 komórek/ml z 1 µg/mL puromycynę w TCM dla studzienek poddawanych leczeniu puromycyną oraz samo TCM dla studzienek nieleczonych.
  6. Włączone Dzień 8, policz liczbę żywych komórek w każdej studzience i oblicz jednostki transdukcji/ml nadsączu wirusowego, korzystając z następującego równania:
    Wzór na równowagę statyczną, TU/mL = A/BV×D, kluczowe pojęcie dla równań fizycznych.
    Gdzie A: liczba żywych komórek w studzience poddanej transdukcji wirusowej; B: liczba żywych komórek w studzience kontrolnej bez selekcji antybiotykowej; V: objętość wirusa użyta do infekcji w każdej studzience; D: stopień rozcieńczenia.
  7. Wykorzystując wartość TU/ml obliczoną dla studni wykazującej wydajność transdukcji na poziomie około 20%, oblicz objętość wirusa niezbędną do transdukcji 1 × 106 komórki z MOI wynoszącym 0,3, korzystając z następującego wzoru:
    Obliczanie równowagi statycznej, równanie przedstawiające konwersję mikrolitrów dla analizy dynamiki płynów.

6. Faza produkcji komórek CART w badaniu przesiewowym CRISPR (dni 0 - 8)

UWAGA: Poniższy protokół opisuje przeprowadzenie przesiewu CRISPR w jednym powtórzeniu biologicznym. Jednak protokół ten został wcześniej zwalidowany przy użyciu trzech powtórzeń biologicznych i zalecamy stosowanie co najmniej trzech powtórzeń biologicznych osobom wykonującym tę procedurę30.

  1. Dzień 0: Wyizolować i stymulować limfocyty T z krwi zdrowego dawcy zgodnie z wcześniejszym opisem10.
    1. Wyizolować monocyty i limfocyty krwi obwodowej (PBMCs) z zanonimizowanej krwi zdrowego dawcy.
      1. Dodać 15 mL medium do gradientu gęstości do probówki do separacji gradientem gęstości.
      2. Dodać krew rozcieńczoną w stosunku 1:2 na górę probówki do separacji gradientem gęstości. Wirować przy 1 200 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Krew należy rozcieńczyć buforem do izolacji (2% FBS (v/v) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo [PBS]).
      3. Przenieść górną warstwę do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL i dwukrotnie zwiększyć objętość za pomocą buforu do izolacji. Wirować próbkę przy 300 × g przez 8 min w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
      4. Resuspendować osad komórkowy w buforze do izolacji i policzyć PBMC.
    2. Wyizolować limfocyty T z PBMC przy użyciu zestawu do selekcji negatywnej. Postępować zgodnie z instrukcją producenta zestawu.
      UWAGA: Przyjąć 10-20% odzysku limfocytów T z PBMC.
    3. Stymulować limfocyty T kuleczkami CD3+/CD28+.
      1. Policzyć limfocyty T.
      2. Odmierzyć odpowiednią ilość kuleczek CD3+/CD28+, aby stymulować limfocyty T w stosunku kuleczki:komórka 3:1. Na przykład, aby stymulować 110 × 106 limfocytów T, odmierzyć 330 × 106 kuleczek. Przemyć kuleczki 3x, najpierw oddzielając kuleczki z zawiesiny za pomocą separacji magnetycznej, a następnie dodając 1 000 µL TCM.
      3. Dodać kuleczki do zawiesiny limfocytów T. Resuspendować limfocyty T do stężenia 1 × 106 komórek/mL w TCM.
      4. Rozdzielić limfocyty T na płytki 6-dołkowe dla uzyskania najlepszej wydajności transdukcji. Dodać 5 × 106 limfocytów T do każdego dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 h.
  2. Dzień 1: W warunkach BSL-2+ rozmrozić odpowiednią ilość lentiwirusa CAR, aby przeprowadzić transdukcję limfocytów T przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 3,0. Delikatnie rozbić rozety limfocytów T przed dodaniem odpowiedniej ilości połączonego lentiwirusa w celu transdukcji 5 × 106 limfocytów T przy MOI 3,0. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C, 5% CO2.
    UWAGA: Połączyć lentiwirusy z wielu partii produkcji w jednej probówce przed transdukcją limfocytów T. Zapewnia to identyczne traktowanie wszystkich limfocytów T. Ponadto lentiwirus powinien być rozmrażany tylko raz.
  3. Dzień 2: W warunkach BSL-2+ rozmrozić odpowiednią ilość lentiwirusa CRISPR, aby przeprowadzić transdukcję limfocytów T przy MOI 0,3. Delikatnie rozbić rozety limfocytów T i resuspendować komórki przed dodaniem odpowiedniej ilości połączonego lentiwirusa w celu transdukcji 5 × 106 limfocytów T przy MOI 0,3. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C, 5% CO2.
    UWAGA: Połączyć lentiwirusy z wielu partii produkcji w jednej probówce przed transdukcją limfocytów T. Zapewnia to identyczne traktowanie wszystkich limfocytów T.
  4. Dni 3 - 5: Resuspendować komórki CART, aby rozbić rozety, i policzyć komórki. Doprowadzić do końcowego stężenia komórek 1 × 106 komórek/mL w TCM z dodatkiem 1 µg/mL puromycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C, 5% CO2.
  5. Dzień 6: Resuspendować komórki CART, aby rozbić rozety, usunąć kuleczki CD3+/CD28+ poprzez separację magnetyczną i policzyć komórki CART. Dodać TCM z 1 µg/mL puromycyny, aby doprowadzić do końcowego stężenia komórek 1 × 106 komórek/mL, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 ˚C, 5% CO2. Określić ekspresję CAR za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w kroku 4.4.

7. Faza selekcji gRNA w przesiewaniu CRISPR (dni 8–22)

  1. Dzień 8: Konserwacja próbek do sekwencjonowania następnej generacji (NGS) i rozpoczęcie kokultury.
    1. Przemyć komórki CART 3x w TCM, wirując próbki przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C, aspirując supernatant i resuspendując próbki w 20 mL TCM.
    2. Policzyć komórki CART.
    3. Zakonserwować próbki do NGS, wykonując następujące czynności:
      1. Odmierzyć do probówki stożkowej 50 mL odpowiednią liczbę komórek CART, aby zachować reprezentację gRNA na poziomie 500 komórek na gRNA (np. odmierzyć około 33 × 106 komórek CART w przypadku użycia biblioteki CRISPR z 65 383 gRNA). Odwirować próbkę przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C.
      2. Resuspendować osad komórkowy w 1 mL PBS i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Przemyć probówkę stożkową 50 mL za pomocą 1 mL PBS i przenieść roztwór płuczący do probówki do mikrocentryfugi 2 mL.
      3. Wirować próbki przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C. Usunąć supernatant. Przechowywać osady komórkowe w temperaturze -20 ˚C.
      4. Rozpocząć kokulturę, dodając komórki CART do komórek CD19+ JeKo-1 w stosunku 1:1. Na przykład dodać 80 × 106 komórek CART do 80 × 106 komórek JeKo-1. Doprowadzić całkowitą objętość kokultury do 160 mL za pomocą TCM. Przechowywać próbki w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, przy 5% CO2.
        UWAGA: Zalecamy rozpoczęcie z co najmniej 80 × 106 komórek CART, aby zachować reprezentację biblioteki i mieć wystarczającą liczbę komórek do konserwacji próbek w dniu 15 i dniu 22.
  2. Dzień 10: Aby restymulować komórki CART, zebrać kokultury do probówek stożkowych 50 mL i wirować próbki przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C. Resuspendować każdą próbkę w 80 mL TCM i dodać 80 × 106 komórek JeKo-1 w 80 mL TCM. Przechowywać próbki w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, przy 5% CO2.
  3. Dni 12 i 14: Restymulować komórki CART zgodnie z krokiem 7.2.
  4. Dzień 15: Zakonserwować próbki do NGS i restymulować komórki CART.
    1. Wyizolować komórki CART z kokultury, najpierw licząc komórki, a następnie łącząc zestaw do selekcji pozytywnej komórek T CD4+ z zestawem do selekcji pozytywnej komórek T CD8+, aby wyizolować limfocyty T z kokultur CART-JeKo-1. Policzyć limfocyty T.
    2. Zakonserwować próbki do NGS, odmierzając 33 × 106 komórek CART do probówki stożkowej 50 mL i wirując próbkę przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C. Resuspendować próbkę w 1 mL PBS i przenieść ją do probówki do mikrocentryfugi 2 mL. Przemyć probówkę stożkową 50 mL za pomocą 1 mL PBS i przenieść roztwór płuczący do probówki do mikrocentryfugi 2 mL. Wirować próbki przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 ˚C, usunąć supernatant i przechowywać osady komórkowe w temperaturze -20 ˚C.
    3. Przygotować kokultury, aby kontynuować model wyczerpania in vitro, dodając 80 × 106 komórek CART do 80 × 106 komórek JeKo-1. Następnie doprowadzić całkowitą objętość kokultury do 160 mL za pomocą TCM. Przechowywać próbki w inkubatorze w temperaturze 37 ˚C, przy 5% CO2.
  5. Dni 17, 19 i 21: Restymulować komórki CART zgodnie z krokiem 7.2.
  6. Dzień 22: Zakonserwować próbki do NGS.
    1. Wyizolować komórki CART z kokultury, najpierw licząc komórki. Następnie połączyć zestaw do selekcji pozytywnej komórek T CD4+ z zestawem do selekcji pozytywnej komórek T CD8+, aby wyizolować limfocyty T z kokultur CART-JeKo-1. Policzyć limfocyty T.
    2. Aby zakonserwować próbki do NGS, powtórzyć krok 7.4.2.

8. Przygotowanie genomowego DNA do sekwencjonowania następnej generacji

UWAGA: Aby zapewnić odpowiedni stopień pokrycia, genomowe DNA (gDNA) należy wyizolować z co najmniej 33 × 106 komórki CART. Ponadto całość gDNA z 33 × 106 Należy przygotować komórki CART do sekwencjonowania.

  1. Wyizoluj gDNA z zamrożonych peletów komórkowych, używając zestawu do izolacji gDNA.
  2. Oczyść gDNA poprzez wytrącanie etanolem.
    1. Wychłodź 100% EtOH do -20 °C.
    2. Rozdziel eluowany DNA w równych częściach do kilku probówek do mikrocentryfugi (200-250 µL). Do każdej porcji dodaj: dwie objętości 100% EtOH (500 µL dla porcji 250 µL lub 400 µL dla 200 µL); 0,1 objętości 3 M octanu sodu (25 µL dla porcji 250 µL lub 20 µL dla 200 µL) oraz 1 µL glikogenu o stężeniu 20 mg/mL. Inkubuj próbki przez noc w temperaturze -20 °C.
    3. Drugiego dnia wirowaj próbki przy 13 000 × g przez 20 min, aby wytrącić DNA w pelet. Usuń nadsącz. Przemyj pelety 1 mL 70% EtOH, wirując przy 7 500 × g przez 10 min.
    4. Całkowicie usuń pozostały EtOH. Pozostaw pelety do wyschnięcia na 30-45 min.
    5. Resuspenduj pelety w 50 µL sterylnej wody.
  3. Przygotuj gDNA do sekwencjonowania NGS.
    UWAGA: Primery NGS dla tej biblioteki CRISPR, które amplifikują gRNA z sekwencjami adapterów Illumina, zostały zaprojektowane w poprzedniej publikacji27. Zastosowanie innego primera odwrotnego dla każdej próbki pozwoli na nadanie im unikalnych kodów kreskowych (barcoding) i umożliwi łączenie próbek podczas sekwencjonowania.
    1. Przygotuj próbki do PCR z następującą mieszaniną reakcyjną (objętość całkowita = 50 µL): high-fidelity PCR master mix, 2x: 25 µL; połączone DNA matrycowe, 0,5 µg: 1 µL; forward primer biblioteki NGS, 10 µM: 1,25 µL; reverse primer biblioteki NGS, 10 µM: 1,25 µL; woda wolna od DNazy: 21,5 µL.
    2. Przeprowadź PCR zgodnie z następującymi warunkami cyklicznymi: cykl 1: denaturacja przy 98 °C przez 3 min; cykle 2-23: denaturacja 98 °C przez 10 s, przyłączanie przy 63 °C przez 10 s, elongacja przy 72 °C przez 25 s; cykl 24: elongacja przy 72 °C przez 2 min.
    3. Połącz reakcje PCR dla każdej próbki i oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcją producenta.
    4. Naniesiesz 3 µg produktu PCR dla każdej próbki na 2% (w/v) żel agarozowy.
    5. Wyizoluj produkt PCR (~260-270 bp) z żelu, stosując zestaw do ekstrakcji DNA z żelu zgodnie z instrukcją producenta. Przechowuj wyekstrahowane próbki w -20 °C.
    6. Przeprowadź sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) próbek. Dąż do uzyskania ponad 500 odczytów na gRNA w bibliotece.

9. Analiza wyników sekwencjonowania

  1. Do analizy NGS należy wykorzystać platformę MAGeCK-VISPR28. Należy zastosować standardowe ustawienia dla algorytmu maksymalnej wiarygodności (MAGeCK-MLE). W celu przygotowania plików wynikowych do analizy:
    1. Uruchomić program FASTQC, aby ocenić jakość plików z sekwencjonowaniem31.
    2. Scalić pliki z sekwencjonowaniem par końcowych (paired-end) dla każdej próbki za pomocą narzędzia bbmerge32.
    3. Przeanalizować próbki na platformie MAGeCK-VISPR przy użyciu algorytmu MAGeCK-MLE. W analizie MAGeCK-MLE należy znormalizować wszystkie liczby gRNA do listy 1 000 gRNA niecelujących (non-targeting).
    4. Ocenić jakość plików z sekwencjonowaniem, analizując zawartość GC, jakość zasad, odczyty z sekwencjonowania oraz odczyty zmapowane.
    5. Ocenić powodzenie fazy presji selekcyjnej w badaniu CRISPR, analizując zmiany w indeksie Gini, klastrowanie w analizie głównych komponentów (PCA) oraz szlaki sygnałowe powiązane z listą genów wyselekcjonowanych negatywnie32.
    6. Zweryfikować najważniejsze wyniki (top hits), przeprowadzając przegląd literatury oraz analizę szlaków sygnałowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby w sposób bezstronny zbadać geny i szlaki sygnałowe, których edycja może poprawić aktywność komórek CART, zaprojektowaliśmy in vitro genomowy screening CRISPR knockout (Rysunek 1). Przesiewanie to składa się z dwóch faz: fazy produkcji komórek CART oraz fazy presji selekcyjnej. W fazie produkcji komórek CART co najmniej 110 × 106 Limfocyty T są najpierw izolowane z PBMC zdrowego dawcy, a następnie aktywowane za pomocą CD3+/CD28+ kulek. Następnego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Edycja genów stała się potężnym narzędziem zarówno w zrozumieniu mechanizmów oporności na terapie, jak i w projektowaniu nowatorskich terapii komórkowych CART w celu poprawy długowieczności i aktywności komórek CART 16,17,26. Podczas gdy niektóre strategie edycji genów wykazały poprawę aktywności komórek CART zarówno w modelach przedklinicznych, jak i badaniach klinicznych, nadal pozostaje wiele do zrobienia w celu optymalizacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

SSK jest wynalazcą patentów w dziedzinie immunoterapii CAR, które są licencjonowane przez Novartis (na mocy umowy między Mayo Clinic, University of Pennsylvania i Novartis), Humanigen (poprzez Mayo Clinic), Mettaforge (poprzez Mayo Clinic) i MustangBio (poprzez Mayo Clinic) oraz Chymal therapeutics (przez Mayo Clinic). CS, CMR i SSK są wynalazcami patentów, na które licencja jest udzielona firmie Immix Biopharma. SSK otrzymuje fundusze na badania od Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. i Lentigen. SSK uczestniczyło w spotkaniach doradczych z Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio i Novartis. SSK zasiadała w radzie ds. bezpieczeństwa danych i monitorowania w firmach Humanigen i Carisma. SSK odłączyło się od konsultanta dla Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma i Humanigen. CMS i SSK są wynalazcami własności intelektualnej, która powstała w wyniku tego protokołu.

Podziękowania

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), National Institutes of Health K12CA090628 (SSK) i R37CA266344-01 (SSK), grant Departamentu Obrony CA201127 (SSK), Fundację Predolin (SSK) oraz Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics (SSK). CMS jest wspierany przez Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Schemat ekranu CRISPR (rysunek 1) został stworzony za pomocą BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki 293TATCCCRL-3216Komórki używane do produkcji lentiwirusa
Przeciwciało Biotyna BiałkoLGenScriptM00097przeciwciało łańcuchowe anty-kappa do wykrywania CAR
Surowica bydlęca AlbuminaMillipore SigmaA7906
Karbenicylina sól disodowaMillipore SigmaC1389-1GAntybiotyk karbenicylinowy
CD4 Izolacja KoralikiMiltenyi Biotec130-045-101 
Kulki izolacyjne CD8Miltenyi Biotec130-045-201
CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
Woda bez DNazInvitrogenAM9937
Zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM)Corning10-017-CV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy DulbeccoGibco14190-144
Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySepSTEMCELL Technologies17951RFZestaw do izolacji ujemnej
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1Elektrokompetentne ogniwa z pożywką regeneracyjną
EtanolMillipore SigmaE7023
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library AAddGene1000000048Biblioteka CRISPR plazmid
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105Elektroporator
glikogenMillipore Sigma10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ komórki docelowe 
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000075Zestaw odczynników do transfekcji z odczynnikiem do transfekcji (odczynnik Lipofectamine 3000) i neutralnym odczynnikiem kolipidowym (p3000)
ŻYWY/MARTWY AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851Gradient gęstości średni
Zestawy Machery-Nagel NucleoBond Xtra MaxiZestaw do przygotowania Maxi ThermoFisher Scientific12748412
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SMastermix do PCR o wysokiej wierności
Opti-MEM I Zredukowana pożywka w surowicyGibco31985-070Zredukowana pożywka w surowicy
pCMVR8.74AddGene22036Plazmid do pakowania lentiwirusowego
Pennicylina-streptomycyna-glutamina (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G otoczka z ekspresją plazmidu
Pooled Human AB Surowica Innowacyjne badaniaISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Zestaw do ekstrakcji Gek
Zestaw Qucik-DNA Midiprep Plus ZymoResearchD4075Zestaw służący do izolacji gDNA
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Automatyczny separator komórek
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450Rurka do separacji gradientu gęstości
Octan soduInvitrogenAM9740
Azydek soduFisher Scientific71448-16
Przeciwciało streptawidyny (PE)BioLegend405203Przeciwciało drugorzędowe używany do wykrywania CAR
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Ultrawirówka (Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
Systemy filtrów próżniowych, 0,22 i mikro; mThermoFisher Scientific567-0020
Systemy filtrów próżniowych, 0,45 &mikro; mThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 Pożywka z komórek krwiotwórczych bez surowicyLonza04-418QPożywka z komórek krwiotwórczych

Bibliografia

  1. Neelapu, S. S., et al. 5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1). Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).
  4. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  5. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).
  6. Bai, Z., et al. Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all. Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).
  7. Fraietta, J. A., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 24, 563-571 (2018).
  8. Gennert, D. G., et al. Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion. Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).
  9. Deng, Q., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).
  10. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  11. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  12. Cox, M. J., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  13. Ottaviano, G., et al. Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia. Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).
  14. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).
  15. Mccutcheon, S. R., et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens. Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).
  16. Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype. Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).
  19. Belk, J. A., et al. Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  20. Jiang, P., et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).
  21. Rossi, J., et al. Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL. Blood. 132 (8), 804-814 (2018).
  22. Beider, K., et al. Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies. Cells. 11 (7), 1140(2022).
  23. Wherry, E. J. T. cell exhaustion. Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).
  24. Prinzing, B., et al. Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity. Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).
  25. Lynn, R. C., et al. C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature. 576, 293-300 (2019).
  26. Tang, N., et al. TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).
  27. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  28. Li, W., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biol. 16, 281(2015).
  29. Sakemura, R., et al. Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma. Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).
  30. Stewart, C. M., et al. IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells. Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).
  31. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  32. Bbmerge. , https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh (2019).
  33. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  34. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  35. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  36. Zhou, P., et al. Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer. Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).
  37. Sutra Del Galy, A., et al. In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response. Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).
  38. Ramos, A., et al. Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening. Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki CAR-Tprzesiew genomowyimmunoterapia nowotworówedycja genówwyczerpanie komórek Tsekwencjonowanie następnej generacjiizolacja genomowego DNAantygen CD19pożywka do hodowli komórek T
Wykonywanie badania przesiewowego nokautującego CRISPR in vitro w całym genomie w limfocytach T z chimerycznym receptorem antygenowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.