Artykuł metodologiczny

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67349

⸱

2 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Cancer Institute Australia, Lowy Cancer Research Centre, UNSW Sydney, 2School of Clinical Medicine, Faculty of Medicine & Health, UNSW Sydney, 3Kid's Cancer Centre, Sydney Children's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Streszczenie

Opracowanie klinicznie istotnych i wiarygodnych modeli nowotworów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) miało kluczowe znaczenie dla postępu w dziedzinie neuroonkologii. Jedną z najczęściej stosowanych technik jest ortotopowe wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe, metoda, która umożliwia badanie wzrostu, inwazji i rozprzestrzeniania się guza w kontrolowanych warunkach. Technika ta polega na przeszczepieniu komórek nowotworowych z określonego regionu pacjenta do odpowiedniego miejsca anatomicznego u zwierzęcia. W ten sposób te ortotopowe modele guzów mózgu oferują wyjątkową przewagę, ponieważ dokładniej odwzorowują biologiczne zachowanie raka i jego interakcje ze środowiskiem mózgu obserwowane u ludzi. To sprawia, że są one szczególnie cenne w przedklinicznych testach terapeutycznych, w których bliskie podobieństwo do scenariusza klinicznego ma zasadnicze znaczenie dla oceny potencjalnych metod leczenia. Protokół ten dzieli się doświadczeniami w opracowywaniu modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) dla guzów mózgu u dzieci, w tym rozlanego glejaka linii środkowej (DMG), glejaka (GBM), rdzeniaka zarodkowego i wyściółczaka. Metoda ta określa procedurę przeprowadzania wewnątrzczaszkowych wstrzyknięć stereotaktycznych u myszy, zapewniając prawidłowe ukierunkowanie miejsca wstrzyknięcia w mózgu. Dodatkowo opisujemy system monitorowania pozabiegowego stosowany do wykrywania oznak udanego wszczepienia guza. Po wstrzyknięciu guza wdrażany jest rygorystyczny system monitorowania w celu obserwacji zwierząt pod kątem wszelkich oznak upośledzenia neurologicznego, zmian behawioralnych i / lub utraty wagi, które są częstymi wskaźnikami progresji guza. System ten pozwala na szybką interwencję i dostarcza krytycznych danych dotyczących dynamiki wzrostu guza. Udoskonalając te modele i protokoły, dążymy do zwiększenia wiarygodności i potencjału translacyjnego badań przedklinicznych, przyczyniając się do opracowania skuteczniejszych metod leczenia nowotworów OUN u dzieci.

Wprowadzenie

Guzy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u dzieci są najczęstszymi guzami litymi u dzieci, stanowiącymi około 20%-25% pierwotnych guzów dziecięcych, o odmiennych cechach od guzów dorosłych pod względem częstości występowania i odpowiedzi na leczenie 1,2. Glejaki o wysokim stopniu złośliwości (HGG), takie jak glejak wielopostaciowy (GBM) i rozlany glejak mostu/rozlany glejak linii środkowej (DIPG/DMG), są szczególnie agresywne, z ponurymi rokowaniami i pomimo postępów w metodach leczenia, wskaźniki przeżycia pozostają niskie 3,4,5. Rdzeniaki, stanowiące prawie 20% nowotworów OUN u dzieci, osiągnęły wysoki wskaźnik 5-letniego przeżycia przy standardowej terapii, jednak niektóre podtypy stanowią wyzwanie, zwłaszcza w scenariuszach nawrotów 6,7. Wyściółczaki, stanowiące około 10% guzów ośrodkowego układu nerwowego u dzieci, wykazują zróżnicowane rokowanie w zależności od cech molekularnych i lokalizacji guza, a nawroty stanowią poważne wyzwanie kliniczne 8,9. Zrozumienie krajobrazu molekularnego i opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu (BT) daje nadzieję na opracowanie skutecznych terapii w celu poprawy wyników leczenia pacjentów pediatrycznych.

Opracowanie klinicznie istotnych modeli BT ma zasadnicze znaczenie dla postępu w badaniach neuroonkologicznych i odkryć terapeutycznych. Iniekcje ortotopowe przy użyciu urządzenia stereotaktycznego mają kluczowe znaczenie w tym podejściu, ponieważ pozwalają na precyzyjne umieszczenie komórek nowotworowych w mózgu, ściśle naśladując naturalne środowisko guzów mózgu10. Metoda ta zwiększa wiarygodność i odtwarzalność modeli nowotworów, ułatwiając dokładniejsze badania biologii guza i kluczowych cech, takich jak inwazja i angiogeneza, a także ocenę interwencji terapeutycznych11. Zdolność urządzenia stereotaktycznego do kontrolowania dokładnej lokalizacji i głębokości wstrzyknięć komórek zapewnia, że komórki nowotworowe są konsekwentnie umieszczane w zamierzonych obszarach mózgu, poprawiając w ten sposób wiarygodność wyników eksperymentalnych10. Modele podskórne stanowią bardziej dostępną i opłacalną opcję wstępnych badań przesiewowych środków terapeutycznych. W tych modelach komórki nowotworowe są wszczepiane pod skórę, co umożliwia proste monitorowanie wzrostu guza i reakcji na leczenie12. Chociaż brakuje im zdolności do replikowania złożonego mikrośrodowiska mózgu, modele podskórne pozostają bardzo cenne dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i wstępnych ocen skuteczności12,13.

Wiele badań wykazało pomyślny rozwój ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów (PDX) pochodzących od pacjentów z próbek guza mózgu, w tym bezpośredniej implantacji tkanek z próbek z autopsji lub biopsji oraz hodowli pierwotnego guza mózgu 11,14,15. Jednak ważne jest, aby przyznać, że wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie zdysocjowanej tkanki lub komórek nowotworowych nie zawsze gwarantuje wszczepienie, a przyczyny niepowodzenia nie są w pełni zrozumiałe15. Co ciekawe, próbki z biopsji HGG wykazują zwykle wyższy wskaźnik sukcesu w porównaniu z innymi podtypami guzów mózgu. Na przykład He i wsp. wykazali 56% wskaźnik sukcesu dla modeli ortotopowych HGG, podczas gdy badanie Brabetz i wsp. wykazało niższe wskaźniki wszczepienia, takie jak odpowiednio 43% i 30%, dla innych próbek guzów mózgu u dzieci, takich jak wyściółczak i rdzeniak zarodkowy 11,14,16. Warto zauważyć, że modele PDX guza mózgu wykazują szeroki zakres okresów utajenia, od 1 miesiąca do 11 miesięcy, przy czym późniejsze przeszczepy wykazują zmniejszoną użyteczność przedkliniczną. Pomimo ich zdolności do rekapitulacji choroby na poziomie molekularnym, zaobserwowano pewne rozbieżności genomiczne między biopsjami a ustalonymi modelami14,16.

Modele PDX służą jako niezbędne narzędzia w poszukiwaniu nowych strategii terapeutycznych przeciwko BT u dzieci. Są one uważane za złoty standard w przeprowadzaniu badań skuteczności leków, ponieważ modele wiernie odwzorowują ludzką chorobę pod względem wzrostu guza, objawów i farmakokinetyki leku ze względu na obecność bariery krew-mózg (BBB). Badania wykazały w dziedzinie glejaka pnia mózgu u dzieci, że zachowana integralność BBB i brak penetracji leków jest cechą, która prowadzi do zmniejszenia skuteczności terapeutycznej tych nowotworów 17,18,19. Jednak skuteczność można zaobserwować w wybranych terapiach, które wykazują odpowiednią penetrację leku, takich jak inhibitory epigenetyczne i metaboliczne17,20.

W badaniu przedstawiono metodę wykonywania wewnątrzczaszkowych wstrzyknięć komórek guza mózgu u zwierząt z obniżoną odpornością, mającą na celu ocenę wszczepienia w celu opracowania PDX i/lub oceny skuteczności terapeutycznej leku. Dostępne są również kompleksowe narzędzia do monitorowania progresji nowotworu aż do osiągnięcia etycznego eksperymentalnego punktu końcowego.

Protokół

Przedstawiony poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania, określonymi przez Uniwersytet Nowej Południowej Walii, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt. Dobrostan zwierząt był traktowany priorytetowo i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt wykorzystywanych podczas procedury iniekcji wewnątrzczaszkowej.

1. Hodowla w celu ekspansji kultur guzów mózgu tworzących neurosferę

UWAGA: Konkretne wymagania mogą się różnić w zależności od używanych kultur mózgu. Poniższe kroki przedstawiają ogólny protokół hodowli pierwotnych komórek guza mózgu jako neurosfer. Posiewy guzów mózgu można uzyskać od komercyjnych dostawców lub ustalić jako kultury pierwotne z biopsji guza mózgu pacjenta lub autopsji. Procedura zakładania posiewów pierwotnych z biopsji pacjenta lub próbek z autopsji została opisana w opublikowanym piśmiennictwie15,21.

  1. Umieścić kriokonserwowaną fiolkę z bulionem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu rozmrożenia zawartości. Przetrzeć zewnętrzne powierzchnie fiolki 70% etanolem, aby zapewnić sterylność.
  2. Przygotuj pożywkę neurosfery dla pierwotnych komórek guza mózgu, jak opisano w Mayoh i wsp.21. W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) użyj sterylnej pipety o pojemności 1 ml, aby przenieść rozmrożone komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki neurosferycznej.
  3. Odwirować stożkową probówkę o masie 300 x g przez 3 minuty, aby granulować komórki. Ostrożnie usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml lub 25 ml pożywki neurosferycznej. Zawiesinę komórek umieścić w kolbie T25 lub T75, w zależności od oczekiwanej liczby komórek z kriokonserwacji. Zazwyczaj komórki wyjściowe o gęstości 5x 105 komórek umieszcza się w kolbie T25.
  5. Umieścić kolbę w inkubatorze nastawionym na temperaturę 37 °C z 5% CO2 . Wymieniaj nośniki na świeże 1 lub 2 razy w tygodniu. Alternatywnie, uzupełnij czynniki wzrostu i B27 w razie potrzeby, w oparciu o tempo wzrostu komórek.
  6. Gdy neurosfery uformują się w kolbie T25, mogą być rozprężane w kolbach T75. Przenieść zawartość kolby T25 za pomocą pipety o pojemności 10 ml do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Obserwuj neurosfery pod mikroskopem świetlnym, a gdy osiągną wystarczająco duże rozmiary (około 500 μm), mogą być również widoczne gołym okiem.
  7. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 3-5 minut. Zassać pożywkę powyżej osadu komórkowego, pozostawiając około 1 ml w probówce.
  8. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół 12x-15x pipetą o pojemności 1 ml, aby dysocjować osad komórkowy. Użyj sitka komórkowego (40 μm), aby zdysocjować neurosfery w mieszaninę jednokomórkową.
  9. Umieść sitko na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj zdysocjowane sferoidy za pomocą pipety 10 ml na sitko. Większość pojedynczych komórek przejdzie przez siatkę do tuby, a grudki pozostaną na siatce.
  10. Policz komórki za pomocą komory do zliczania komórek. Ocenić żywotność komórek, mieszając równą ilość zawiesiny komórek (np. 5 μl) z błękitem trypanowym (5 μl). Martwe komórki będą niebieskie pod mikroskopem świetlnym, podczas gdy żywe komórki pozostaną niezabarwione.
  11. Oblicz gęstość komórek w następujący sposób:
    Koncentracja komórek = Średnia liczba komórek na siatkę × Współczynnik rozcieńczenia/ Objętość jednej siatki (ml). Objętość siatki ze standardowej komory do zliczania komórek wynosi 0,0001 ml.
  12. Aby przepuścić komórki, ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 25 ml świeżej, podgrzanej pożywki w kolbie T75. Po umieszczeniu komórek w kolbie T75 inkubować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 do momentu wzrostu neurosfer.
  13. Aby dokonać kriokonserwacji komórek guza mózgu, należy ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 1 ml roztworu do krioprezerwacji i umieścić na noc w pojemniku do zamrażania z kontrolowaną szybkością i przechowywać w temperaturze -80 °C. Umieść kriokonserwowane zapasy w zbiorniku ciekłego azotu o temperaturze -180 °C do długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Pożywka do kriokonserwacji składa się w 90% z płodowej surowicy cielęcej i w 10% z dimetylosulfotlenku (DMSO).

2. Przygotowanie komórek nowotworowych mózgu do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego

UWAGA: Chociaż poniższy protokół przedstawia przygotowanie hodowanych komórek z ustalonych lub krótkoterminowych hodowli do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego, można go również dostosować do innych typów komórek, w tym świeżo zdysocjowanej tkanki z ludzkich guzów mózgu22,23.

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego ostrożnie przenieść komórki i pożywkę hodowlaną z kolby do hodowli tkankowej za pomocą pipety serologicznej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Odwirować stożkową probówkę o sile 300 x g przez maksymalnie 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pipetą o pojemności 25 ml pożywkę powyżej osadu, pozostawiając około 0,5 ml w probówce.
  3. Delikatnie odpipetuj komórki w górę i w dół 10 razy pipetą o pojemności 1 ml, aby oddzielić osad komórek. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
  4. Po przeniesieniu żądanej liczby komórek do świeżej probówki, przemyć 2x PBS, ponownie zawieszając komórki i granulując je w ilości 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: liczbę komórek można określić zgodnie z opisem. Na przykład, jeśli 10 zwierząt musi zostać wstrzykniętych o gęstości komórek 200 000 komórek, to minimalna potrzebna liczba komórek wynosi 2 x 106.
  5. Podczas końcowego prania usuń jak najwięcej PBS. Delikatnie umieścić na lodzie osad komórkowy i podwielokrotność hydrożelu o objętości 50 μl macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
    UWAGA: Hydrożel ECM można wstępnie podzielić na porcje 50 μl na lodzie za pomocą pipet chłodzonych w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Hydrożel ECM może być tymczasowo przechowywany na lodzie w celu powolnego rozmrażania w celu późniejszego użycia eksperymentalnego.
  6. Wymieszać osad komórkowy z hydrożelem ECM do wstrzykiwań, dążąc do jak najszybszego wykonania tego etapu przed rozpoczęciem iniekcji wewnątrzczaszkowych. Standardowo stosuje się 2 μl zawiesiny zawierającej 200 000 komórek zawieszonych w hydrożelu ECM.
    UWAGA: Jeśli wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe trwają dłużej niż 2-3 godziny, należy przygotować nowy zapas komórek, ponieważ długotrwała inkubacja na lodzie może zmniejszyć żywotność komórek. Możliwe jest wstrzykiwanie wewnątrzczaszkowe do 1 000 000 komórek i w objętościach do 10 μL; będzie to jednak wymagało ponownego zawieszenia komórek w PBS, a nie w hydrożelu ECM, i dodawania z bardzo powolną szybkością wstrzykiwania.

3. Konfiguracja sprzętu stereotaktycznego i anestezjologicznego

UWAGA: Poniższa procedura może się nieznacznie różnić w zależności od producenta sprzętu stereotaktycznego i preferowanego rodzaju znieczulenia.

  1. Rozpocznij BSC, najpierw odkażając jego powierzchnię detergentem polisorbatowym 20 i pozostawiając go na 10 minut. Następnie przetrzyj powierzchnię 80% etanolem. Przed umieszczeniem w okapie BSC przetrzyj każdy element wyposażenia 80% etanolem (unikaj zwilżania jakichkolwiek wejść elektrycznych).
  2. Umieść płytę podstawy w osłonie BSC zgodnie z rysunkiem 1, tak aby stożek nosowy znajdował się po prawej stronie (dla użytkowników praworęcznych). Upewnij się, że manipulatory XYZ są już przymocowane do płyty podstawy i zabezpieczone.
  3. Podłącz konsolę wyświetlacza cyfrowego do wlotu z tyłu płyty podstawy i podłącz jej kabel zasilający do dostarczonego zasilacza w osłonie BSC (patrz Rysunek 1). Konsola ta rejestruje współrzędne ruchów manipulatora XYZ.
  4. Zabezpiecz kanister filtra węglowego (w celu uzyskania środka znieczulającego) i wejście środka znieczulającego do dwóch zaworów na odłączanej końcówce. Wsuń końcówkę nosa na sekcję montażową i dokręć do aparatu stereotaktycznego.
  5. Przymocuj nauszniki do odpowiednich uchwytów po obu stronach sekcji montażowej, zabezpieczając je na miejscu, dokręcając przymocowane do uchwytów. Nauszniki można przykryć gazikami lub taśmą izolacyjną.
  6. Wprowadź łóżko chirurgiczne do urządzenia, dostosowując jego wysokość do pasków usznych, które zabezpieczają zwierzę na miejscu. Owiń łóżko chirurgiczne gazikiem, aby utrzymać zwierzę w cieple.
  7. Podłącz poduszkę grzewczą do źródła zasilania i umieść ją pod zwierzęciem, aby utrzymać ciepło podczas zabiegu znieczulającego.
  8. Wewnątrz kaptura BSC ułóż sterylne bawełniane końcówki, końcówki do pipet o pojemności 20 μl, maść do oczu, indywidualnie pakowane chusteczki izopropanolowe, klej chirurgiczny i pipetę o pojemności 20 μl. Zwilż gazik 80% etanolem i połóż na nim sterylne kleszcze i skalpel.
  9. Wyczyść szklaną mikrostrzykawkę, przepłukując ją 5 razy w zimnym 80% etanolu, a następnie w zimnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
  10. W celu wiercenia podłącz silnik wiertarki do zasilania i zamontuj wiertarkę na manipulatorze XYZ, zapewniając bezpieczne dopasowanie poprzez mocne przykręcenie.
  11. Zastąp element wiertła szklanym uchwytem na mikrostrzykawkę w celu wstrzykiwania komórek. Wyjmij wiertło, poluzowując na manipulatorze XYZ i zastępując ją uchwytem strzykawki. Upewnij się, że śruba jest dokręcona przed wyrównaniem szklanej mikrostrzykawki z wcześniej wywierconym otworem.
  12. Po użyciu urządzenia stereotaktycznego zdemontuj wszystkie elementy i zdezynfekuj je 80% etanolem przed umieszczeniem ich w czystym pudełku lub szafce bezpyłowej. Wszystkie ostre przedmioty należy wyrzucić w bezpieczny i odpowiedni sposób do wyznaczonego pojemnika na ostre przedmioty.

4. Wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe

UWAGA: Wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe można wykonywać zarówno u samców, jak i samic myszy, chociaż samice myszy są ogólnie preferowane, ponieważ są mniej podatne na powikłania ran spowodowane agresją wśród samców. Zabieg jest zwykle przeprowadzany u myszy w wieku 7-10 tygodni, co daje wystarczająco dużo czasu na rozwój guza. Zazwyczaj zwierzęta są losowo przydzielane w grupach po 4-6 sztuk w klatce. Szczepy z obniżoną odpornością, takie jak BALB/c Nude, NOD-SCID i NSG, są powszechnie stosowane do rozwoju ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX), ponieważ ich stan niedoboru odporności wspiera wszczepienie i wzrost guza24. Chociaż protokół ten określa stosowanie izofluranu do indukcji znieczulenia, można również stosować alternatywne środki znieczulające, takie jak ketamina i ksylazyna25. Jeśli izofluran nie jest stosowany, czynności związane z komorą anestezjologiczną i związanym z nią sprzętem można pominąć w procedurze.

  1. Zważyć i monitorować ogólny dobrostan zwierząt przed zabiegiem wewnątrzczaszkowym. Zwierzętom należy podawać lek przeciwbólowy po klatce (np. buprenorfina 0,05 mg/kg mc., dootrzewnowo) przez okres do 1 godziny przed rozpoczęciem wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego.
  2. Ustaw sprzęt anestezjologiczny zgodnie z wytycznymi dostarczonymi z instrumentem. Przed rozpoczęciem procedury upewnij się, że waporyzator jest napełniony co najmniej do połowy. Upewnij się, że dopływ tlenu jest otwarty.
  3. Jeśli zwierzęta mają sierść, można ją usunąć dzień przed zabiegiem wewnątrzczaszkowym lub jednocześnie. Usuń sierść z miejsca operacji na grzbiecie lub czaszce myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia lub brzytwy.
  4. Przenieść zwierzę do anestezjologicznej komory indukcyjnej. Upewnij się, że przepływomierz w urządzeniu anestezjologicznym jest ustawiony na natężenie przepływu 1 l/min, a regulator tlenu znajduje się w zakresie 40-50 psi. Upewnij się, że utrzymywane jest średnie znieczulenie, sprawdzając, czy mięśnie są rozluźnione, a odruchy są nieobecne.
  5. Monitoruj reakcję zwierzęcia na bodźce i obserwuj ruchy ściany klatki piersiowej, aby zapewnić stabilny oddech. Jeśli wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe przekraczają 10 minut, należy monitorować temperaturę za pomocą sondy doodbytniczej i systemu monitorowania temperatury oraz śledzić puls za pomocą pulsoksymetru
  6. Zamontuj zwierzę na urządzeniu stereotaktycznym, upewniając się, że przednie zęby są zamocowane w siekaczu, a stożek nosowy zabezpieczył zwierzę na miejscu.
  7. Zdezynfekuj głowę myszy bawełnianą końcówką nasączoną jodem, a następnie chusteczką izopropanolową. Nałóż maść rogówkową na oko do obu oczu, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
  8. Rozpocznij nacięcie u podstawy móżdżku i rozciągnij je w poprzek czaszki do punktu środkowego, wykonując małe nacięcie o długości około 1 cm wzdłuż górnej części czaszki.
  9. Zaciśnij skórę między uszami, aby odsłonić czaszkę i zabezpieczyć głowę, zaciskając nauszniki. Oczyść powierzchnię czaszki i osusz ją wacikiem.
  10. Przymocuj wiertło do ramy stereotaktycznej i zlokalizuj bregmę (lub strukturę lambdoidalną) za pomocą wiertła.
    UWAGA: Konkretne współrzędne stereotaktyczne są wybierane na podstawie obszaru anatomicznego wymaganego do badania wszczepienia. Te dokładne współrzędne można uzyskać z opublikowanej literatury lub określić za pomocą zasobów, takich jak Mózg myszy w atlasie Stereotaxic Coordinates26 , zapewniając dokładne celowanie w celu udanej implantacji.
  11. Po ustaleniu współrzędnych użyj wiertła, aby ostrożnie utworzyć mały otwór w kości w wyznaczonym miejscu rozlanego glejaka linii środkowej (DMG): X = +0,5, Y = -5,5, Z = -3,1 od bregmy; Nadnamiotowy guz mózgu (GBM lub wyściółczak): X = +1,5, Y = +1, Z = -3 od bregmy; Podnamiotowy guz mózgu (rdzeniak zarodkowy, wyściółczak): X = +2, Y = - 2, Z = -2 ze struktury lambdoidalnej.
  12. Ponownie zawiesić komórki wiele razy za pomocą pipety, unikając pęcherzyków powietrza. Pobrać 2 μl mieszaniny komórek do wstępnie umytej mikrostrzykawki z zimnego szkła. Przymocuj strzykawkę do ramy stereotaktycznej i dopasuj igłę do końcówki czaszki.
  13. Wstrzyknąć komórki w ciągu 30 sekund do wywierconego obszaru, susząc zawiesinę komórek refluksowych podczas wstrzyknięcia.
    UWAGA: Ponieważ komórki są zawieszone w hydrożelu ECM, wstrzyknięcie musi nastąpić na tyle szybko, aby zawiesina komórek nie zestaliła się w strzykawce. Różne gęstości komórek można wykorzystać do oceny różnych wskaźników wszczepienia, przy czym wyższa gęstość komórek na ogół prowadzi do szybszego wszczepienia guza.
  14. Pozostawić strzykawkę na miejscu na 1 minutę, aby uniknąć przepływu wstecznego i pozwolić hydrożelowi ECM osiąść. Wyjąć strzykawkę i przetrzeć ranę chusteczką z izopropanolem. W razie potrzeby użyj kleju do skóry lub klipsów do ran, aby uszczelnić nacięcie.
  15. Umieść zwierzę w pozycji leżącej w czystej klatce regeneracyjnej z lampą grzewczą lub na poduszce grzewczej, aby utrzymać ciepło do czasu powrotu do zdrowia. Monitoruj zwierzę w sposób ciągły, dopóki nie zacznie poruszać się samodzielnie, a następnie często, dopóki nie wykaże normalnego zachowania.
  16. Jeśli okaże się, że zwierzę ma ponownie otwartą wcześniej zapieczętowaną ranę podczas rekonwalescencji, ponownie znieczulij zwierzę, oczyść ranę chusteczką izopropanolową, aby usunąć pozostały klej, a następnie ponownie zabezpiecz zszywkami.

5. Monitorowanie pooperacyjne pod kątem wszczepienia

  1. Po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym należy rozpocząć monitorowanie myszy 5 dni w tygodniu (lub częściej, jeśli jest to wymagane). Zapewnij pielęgnację po wstrzyknięciu, taką jak nasiona lub papkowate jedzenie, w ciągu pierwszych kilku tygodni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym. Uważnie obserwować zwierzęta pod kątem potencjalnego otwarcia rany. Zwierzęta mogą otrzymywać dodatkową buprenorfinę w ciągu pierwszych 24–48 godzin po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym.
    UWAGA: Jeśli samice mają obcięte rany, pozostają w kuwecie, ponieważ rzadko wykazują agresję. Dla samców zapewniamy dwa igloo w klatce wraz z dodatkowym urozmaiceniem, aby zmniejszyć agresję. W rzadkich przypadkach, gdy dochodzi do agresji i prowadzi do ponownego otwarcia ran, rany są ponownie zabezpieczane zszywkami, a agresor jest usuwany z grupy i umieszczany oddzielnie.
  2. Zapisuj ogólne parametry dobrego samopoczucia, takie jak utrata wagi, poziom aktywności, postawa, oznaki odwodnienia i stan sierści na arkuszu monitorowania.
  3. Zapisz w arkuszu monitorowania przerywane, łagodne lub ciężkie objawy neurologiczne, takie jak przechylanie głowy, ataksja i/lub krążenie.
  4. Zidentyfikuj objawy neurologiczne w następujący sposób:
    1. Obserwuj i kategoryzuj następujące objawy jako sporadyczne: Przechylanie głowy: Obserwowane 1-2 razy podczas 5-minutowej inspekcji, ogólne samopoczucie zadowalające. Ataksja: obserwowana 1-2 razy podczas 5-minutowej inspekcji; ogólne samopoczucie zadowalające. Krążenie: Obserwowane 1-2 razy podczas 5-minutowej inspekcji; ogólne samopoczucie zadowalające. Zachowanie: Myszy wykazują normalne zachowanie, są zdolne do sięgania po jedzenie/wodę i wspinania się.
    2. Obserwuj i kategoryzuj następujące objawy jako łagodne: Przechylanie głowy: Regularnie wyświetlane podczas 5-minutowej inspekcji, ogólne samopoczucie zadowalające. Ataksja: Regularnie wyświetlana podczas 5-minutowej inspekcji, ogólne samopoczucie zadowalające. Krążenie: Regularnie wyświetlane podczas 5-minutowej inspekcji, ogólne samopoczucie zadowalające. Zachowanie: Myszy mogą mieć potarganą sierść lub suchą skórę, ale nadal mogą wykazywać normalne zachowanie, żerować i wspinać się.
    3. Obserwuj i kategoryzuj następujące objawy jako ciężkie: Przechylanie głowy: Stale wyświetlane podczas inspekcji, nachylenie prawie 90°, potargana sierść, mniej aktywna. Ataksja: Stale wyświetlana podczas kontroli, pijane ruchy, potargana sierść, mniej aktywna. Krążenie: Stale wyświetlane podczas inspekcji, marszczony płaszcz, mniej aktywny. Zachowanie: Myszy mogą mieć bardzo potarganą sierść lub suchą skórę. Mogą wykazywać utratę masy ciała o ponad 15%. Na tym etapie podaj zwierzętom nasiona lub papkowaty pokarm.
  5. Ustal humanitarny punkt końcowy dla myszy, gdy wykazują którykolwiek z następujących objawów klinicznych wskazujących na wzrost guza, który wpływa na ich samopoczucie: utrata masy ciała o 20% lub więcej w stosunku do ich początkowej wagi, silne przechylanie głowy, ciężka ataksja, silne krążenie, letarg lub ciężkie oddychanie. Na tym etapie należy humanitarnie poddać myszy eutanazji za pomocą uduszenia CO2 .

6. Pobieranie mózgów

  1. Upewnij się, że zwierzę zostało humanitarnie uśpione przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Wykonaj 2 cm nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry głowy za pomocą nożyczek lub skalpela. Ostrożnie oddziel i oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.
  3. Za pomocą cienkich nożyczek lub skalpela wykonaj ostrożne 2 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki. Delikatnie podważ czaszkę za pomocą kleszczy, pracując od tyłu głowy w kierunku nosa.
  4. Kontynuuj cięcie wzdłuż boków czaszki, upewniając się, że nie ma uszkodzenia tkanki mózgowej pod spodem. Gdy czaszka zostanie całkowicie otwarta, ostrożnie odłącz mózg od nerwów czaszkowych i naczyń krwionośnych za pomocą kleszczy i nożyczek.
  5. Delikatnie unieś mózg z jamy czaszki, zaczynając od tyłu i przesuwając się do przodu. Przechowuj mózg w odpowiednich warunkach w oparciu o wymagania kolejnych procedur eksperymentalnych, takich jak szybkie zamrażanie lub fiksacja. Analiza immunohistochemiczna mózgu może się różnić w zależności od laboratorium. Typowy przebieg pracy dla proliferacyjnego markera komórkowego KI67 opisano w opublikowanej literaturze20.

Wyniki

Iniekcje ortotopowe za pomocą urządzenia stereotaktycznego stały się niezbędne do opracowania modeli guza mózgu. Technika ta pozwala na precyzyjne i powtarzalne umieszczanie komórek nowotworowych, co ma kluczowe znaczenie dla generowania spójnych i wiarygodnych danych w badaniach neuroonkologicznych. Pomyślne wdrożenie zastrzyków ortotopowych zależy w dużej mierze od dokładnej konfiguracji sprzętu stereotaktycznego, który zazwyczaj obejmuje ramę stereotaktyczną, cyfrowy mikromanipulator do precyzyjnych ruchów, strzykawkę do wstrzykiwań i system znieczulenia do unieruchamiania zwierzęcia (ryc. 1A, B). Użycie szklanej mikrostrzykawki umożliwia wstrzykiwanie wewnątrzczaszkowe małych objętości, zwykle od 2 do 5 μl. Właściwa konserwacja i częste mycie są niezbędne, aby zapobiec gromadzeniu się materiału biologicznego, który może blokować wstrzyknięcie (ryc. 1C).

Procedura wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania komórek guza mózgu za pomocą sprzętu stereotaktycznego u myszy obejmuje kilka kluczowych etapów. Po pierwsze, mysz jest znieczulana, aby pozostać nieruchomo i komfortowo przez cały zabieg. Typowe sygnały wskazujące, że zwierzę jest znieczulone, obejmują brak ruchu i odruchy po szczypnięciu palców, a także obecność regularnego wzorca oddychania. Następnie mysz umieszcza się w ramce stereotaktycznej, zabezpieczając jej głowę w ustalonej pozycji (Rysunek 2A). Za pomocą punktów orientacyjnych na czaszce, takich jak bregma i lambda, określa się dokładne współrzędne do wstrzyknięcia. W skórze głowy wykonuje się małe nacięcie, a w czaszce wierci się otwór na zadzior w wybranych współrzędnych (ryc. 2B). Igła do mikroiniekcji przymocowana do ramienia stereotaktycznego jest wprowadzana przez otwór w zadziorach, aby dostarczyć komórki nowotworowe do pożądanego obszaru mózgu (kory, móżdżku lub pnia mózgu; Rysunek 2C). Staranne monitorowanie i regulacja pozycji igły zapewniają dokładne celowanie. Po wstrzyknięciu igła jest powoli wycofywana, a nacięcie jest zamykane (ryc. 2D). Oczekuje się, że zapieczętowana rana zagoi się w ciągu dwóch tygodni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym.

Po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym zwierzęta wymagają starannego monitorowania ogólnego samopoczucia i rozwoju objawów neurologicznych, które często wskazują na progresję guza (Tabela uzupełniająca 1). Zazwyczaj zwierzęta mogą doświadczyć niewielkiej utraty masy ciała w ciągu 1. tygodnia po wstrzyknięciu (do 10% ich najwyższej masy), która zwykle stabilizuje się, gdy miejsca wstrzyknięcia zostaną w pełni uszczelnione pod koniec 2. tygodnia. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęta wykazują stały wzrost masy ciała i utrzymują dobry ogólny stan zdrowia, dopóki nie nastąpi progresja guza. Manifestacja objawów neurologicznych różni się w zależności od takich czynników, jak rodzaj guza mózgu, miejsce wstrzyknięcia i szczep zwierzęcy. Na przykład glejaki korowe lub wyściółczaki mogą wykazywać postępującą utratę masy ciała i potencjalne powiększenie przodomózgowia, podczas gdy glejaki pnia mózgu i rdzeniak zarodkowy mogą wykazywać objawy, takie jak ataksja i przechylanie głowy, szczególnie u zwierząt z obniżoną odpornością (ryc. 3A). Dodatkowo, zachowanie krążenia można zaobserwować u zwierząt z guzami pnia mózgu, zwłaszcza w szczepach NSG lub NOD/SCID. Postęp objawów neurologicznych często zbiega się ze stopniową utratą wagi. Odpowiednie środki pielęgnacyjne, takie jak zapewnienie butelek z wodą z długimi dyszami lub oferowanie miękkiego pokarmu (papkowatego granulatu żywności) lub nasion, są niezbędne do wspierania dobrostanu zwierząt. Po osiągnięciu eksperymentalnego punktu końcowego i następującej po nim humanitarnej eutanazji zwierząt, mogą stać się widoczne potencjalne zmiany w mózgu, w tym powiększenie w miejscu wstrzyknięcia i/lub obecność obszarów krwotocznych (ryc. 3B).

Wykresy Kaplana-Meiera są powszechnie stosowane do przedstawiania wyników przeżycia modeli zwierzęcych guzów mózgu. Oferują one wizualne przedstawienie prawdopodobieństwa przeżycia w czasie po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym lub leczeniu przeciwnowotworowym. Wykresy te służą jako kluczowe narzędzia do analizy i prezentacji danych dotyczących przeżycia w warunkach badań przedklinicznych15,27. Wykonaliśmy iniekcje wewnątrzczaszkowe hodowli komórkowej rdzeniaka zarodkowego D425 o różnej gęstości komórek w móżdżku. U wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto wewnątrzczaszkowo, rozwinęły się nowotwory. Nasze wyniki wskazały, że wyższe gęstości komórek, w szczególności 50 000 i 100 000 komórek na mysz, wszczepiały się szybciej niż 10 000 komórek na mysz (ryc. 4). Ponadto wstrzyknęliśmy doczaszkowo komórki glejaka o wysokim stopniu złośliwości (HGG) pochodzące od pacjenta do kory mózgowej i pnia mózgu, aby porównać całkowite przeżycie i wzorzec wzrostu guza, a także cechy immunohistochemiczne w tych różnych lokalizacjach. Niezależnie od lokalizacji, wszystkim zwierzętom wstrzyknięto guzy rozwijające się wewnątrzczaszkowo. Posiew komórek HGG przeprowadzono zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w krokach od 1.1 do 1.10. Przygotowanie komórek do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego przeprowadzono zgodnie z opisem w krokach 2.1 do 2.6, podczas gdy procedura iniekcji wewnątrzczaszkowej przebiegała zgodnie z metodą opisaną w krokach 4.1 do 4.1627. Po wstrzyknięciu do kory mózgowej komórki HGG wykazywały medianę przeżycia wynoszącą około 25 dni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym (ryc. 5A). Zwierzęta były monitorowane w sposób opisany w krokach od 5.1 do 5.4. Zwierzęta te nie wykazywały żadnych objawów neurologicznych, ale wykazywały postępującą utratę wagi. Zwierzęta zostały humanitarnie poddane eutanazji po osiągnięciu humanitarnego punktu końcowego opisanego w kroku 5.5. Mózgi pobrano zgodnie z protokołem opisanym w krokach od 6.1 do 6.5 i wysłano do dalszej analizy27. Analiza immunohistochemiczna ujawniła dużą, silnie jądrzastą masę guza z dowodami na zwiększone unaczynienie (Figura 5B) i wiele proliferacyjnych komórek Ki67 (Figura 5C). Po wstrzyknięciu do pnia mózgu komórki HGG wykazywały medianę przeżycia wynoszącą około 26 dni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym (ryc. 5D). Analiza immunohistochemiczna wykazała dużą masę guza w 4. komorze / górnym obszarze mostu, a także naciek opon mózgowo-rdzeniowych do komory bocznej (ryc. 5E). Dalsza analiza immunohistochemiczna wykazała wiele komórek proliferacyjnych w pniu mózgu i innych naciekanych obszarach (ryc. 5F). Eksperyment ten podkreśla, że wstrzykiwanie tych samych komórek nowotworowych w różne miejsca anatomiczne nie wpływa na tempo wzrostu guza, chociaż obserwuje się pewne różnice we wzorcu wzrostu.

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy układu stereotaktycznego do wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania komórek guza mózgu. (A) Aparat anestezjologiczny jest zwykle umieszczony obok kaptura BSC, co wymaga podwójnego podania znieczulenia zarówno do komory indukcyjnej, jak i aparatu stereotaktycznego. (B) Szklana stacja do mycia mikrostrzykawek i uchwyt stereotaktyczny; Strzykawka wymaga przepłukania solą fizjologiczną, etanolem, a następnie wodą po każdym wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym. (C) Konfiguracja stereotaktyczna wewnątrz okapu BSC, ilustrująca komorę anestezjologiczną, wiertarkę, urządzenie stereotaktyczne, konsolę współrzędnych stereotaktycznych, końcówki bawełniane, skalpel, pęsetę, pipetę i końcówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego wykonywanego na myszy z obniżoną odpornością. (A) Znieczulone zwierzę umieszczone w stożku znieczulającym. (B) Nacięcie skóry, a następnie zabezpieczenie skóry z każdej strony za pomocą nauszników. (C) Szklana mikrostrzykawka umieszczona na wywierconym otworze do wstrzykiwań. (D) Po sklejeniu skóra tworzy styl irokeza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Potencjalne objawy neurologiczne obserwowane po wszczepieniu komórek guza mózgu. (A) Zwierzę wykazujące pochylenie głowy po wewnątrzczaszkowym wstrzyknięciu komórek DMG do pnia mózgu. (B) Powiększenie prawej półkuli korowej po stronie iniekcyjnej ujawniające tworzenie się guza. Zwierzęciu wstrzyknięto komórki wyściółczaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Wszczepienie hodowli rdzeniaka zarodkowego D425 o różnej gęstości komórek. Komórki rdzeniaka wielopostaciowego wstrzykiwano doczaszkowo za pomocą sprzętu stereotaktycznego o gęstości 10 000 komórek w 2 μl hydrożelu ECM, 50 000 komórek i 100 000 komórek. Zwierzęta były monitorowane pod kątem postępującej utraty masy ciała i były humanitarnie poddawane eutanazji, gdy osiągnęły 20% poniżej najwyższej zarejestrowanej wagi. Mediana przeżycia dla zwierząt, którym wstrzyknięto 10 000 komórek, wynosiła 29 dni, podczas gdy mediana przeżycia dla zwierząt, którym wstrzyknięto komórki o większej gęstości wynoszącej 50 000 i 100 000 komórek, wynosiła odpowiednio 17,5 dnia i 15 dni. U wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto implant w tym badaniu, pomyślnie rozwinęły się nowotwory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywne krzywe przeżycia i analiza histologiczna zwierząt NSG, którym wstrzyknięto doczaszkowo komórki HGG w korze mózgowej i pniu mózgu. Około 100 000 komórek HGG (przejście 3) wstrzyknięto do 2 μl hydrożelu ECM przy użyciu sprzętu stereotaktycznego. Zwierzęta były monitorowane pod kątem postępującej utraty wagi i humanitarnie poddawane eutanazji, gdy osiągnęły 20% poniżej najwyższej zarejestrowanej wagi. Nie zaobserwowano żadnych objawów neurologicznych dla tego podtypu guza mózgu. (A) Mediana przeżycia zwierząt z komórkami HGG wstrzykniętymi do kory wynosi około 25 dni po wstrzyknięciu (N = 2). (B) Zabarwienie kory H&E wykazuje silnie jądrzasty obszar ze zwiększonym unaczynieniem, na co wskazuje obecność czerwonych krwinek. (C) Obszar wszczepiony przez guz w korze wykazuje wysoki poziom komórek proliferacyjnych, jak pokazuje barwienie KI67. (D) Mediana przeżycia zwierząt z komórkami HGG wstrzykniętymi do pnia mózgu wynosi około 26 dni po wstrzyknięciu (N = 2). U wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto implant w tym badaniu, pomyślnie rozwinęły się nowotwory. (E) Barwienie pnia mózgu metodą H&E wskazuje na silnie jądrzasty obszar z naciekiem guza obserwowanym w oponach mózgowych w komorze bocznej. (F) Obszar wszczepiony guzem w pniu mózgu wykazuje wysoki poziom komórek proliferacyjnych, jak pokazuje barwienie KI67. pasek skali na głównych obrazach wskazuje 2 mm, podczas gdy wstawione obrazy w powiększeniu wskazują 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Formularz monitorujący stosowany do kontroli wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych zwierząt i potencjalnego leczenia środkami przeciwnowotworowymi. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Chociaż technika iniekcji wewnątrzczaszkowej opisana w tym badaniu zapewnia solidną metodę tworzenia ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) dla guzów mózgu u dzieci, kilka obszarów wymaga poprawy. Jednym z podejść do ulepszenia tej techniki jest optymalizacja procesu przygotowania komórek nowotworowych. Obejmuje to udoskonalanie materiałów używanych do implantacji komórek nowotworowych. Podczas gdy hydrożel ECM jest uważany za złoty standard, stosowanie hydrożeli składających się ze składników, które bardziej przypominają te z mózgu lub guza, ECM może zwiększyć przeżywalność i wszczepianie komórek BT. Takie podejście jest szczególnie korzystne w przypadku typów nowotworów z dłuższymi okresami wszczepienia, takich jak rdzeniaki zarodkowe i wyściółczaki. Na przykład wykazano, że kolagen odgrywa kluczową rolę we wzroście rdzeniaka zarodkowego grupy 3, podczas gdy laminina wspiera typ rdzeniaka zarodkowegoSHH 28. Dodatkowo sztywność ECM może również wpływać na wzrost guza. Na przykład glejaki wielopostaciowy o wysokim stopniu złośliwości wykazuje większą sztywność rdzenia w porównaniu z normalną tkanką mózgową, co może wspierać wzrost guza i przeżycie29. Dostosowując skład i sztywność ECM do specyficznych wymagań różnych typów nowotworów, wszczepianie i wzrost modeli PDX może być znacznie poprawione.

Kilka ostatnich badań dostarczyło cennych informacji na temat obchodzenia się z próbkami guzów u pacjentów i opracowywania modeli PDX. Tsoli i wsp. podkreślili, że bezpośrednia implantacja tkanki DMG zazwyczaj skutkuje wyższymi wskaźnikami wszczepienia niż hodowle pierwotne15. Smith i wsp. ustanowili 37 modeli PDX poprzez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie biopsji guza mózgu lub próbek autopsyjnych, zgłaszając ogólny wskaźnik sukcesu na poziomie 43%, przy czym HGG wykazały najwyższy wskaźnik wszczepienia (100%), a następnie rdzeniaki zarodkowe (45%) i wyściółczaki (25%). Latencja guza była bardzo zróżnicowana, od 1 do 11 miesięcy, przy czym bardziej agresywne guzy wszczepiały się szybciej11. W przeciwieństwie do tego, Brabetz i wsp. zgłosili niższy ogólny wskaźnik sukcesu wynoszący 30%, przy czym HGG wykazywały 31% wskaźnik wszczepienia i niższe wskaźniki rdzeniaków zarodkowych (37%) i wyściółczaków (17%)16. Pomimo tych różnic, ostatnie dwa badania przeprowadzone przez Smitha i wsp. oraz Brabetza i wsp. potwierdziły, że modele PDX na ogół rekapitulowały guzy pacjenta na poziomie immunohistochemicznym i molekularnym, chociaż zaobserwowano niewielkie rozbieżności genomowe między oryginalnymi próbkami guza a ustalonymi modelami. Odkrycia te podkreślają wyzwania związane z opracowaniem reprezentatywnych modeli PDX i podkreślają zmienność w powodzeniu przeszczepu w różnych typach nowotworów11,16.

Jednym z istotnych ograniczeń podejścia ortotopowego jest niemożność dokładnego zmierzenia wielkości guza, chyba że stosuje się system obrazowania, taki jak obrazowanie ksenogenowe, jeśli komórki nowotworowe są znakowane lucyferazy lub rezonansem magnetycznym (MRI). Znakowanie komórek nowotworowych lucyferazyą może zapewnić rozwiązanie, umożliwiając obrazowanie bioluminescencyjne w celu potwierdzenia wszczepienia i nieinwazyjnego monitorowania progresji guza. Metoda ta zwiększyłaby zdolność do dynamicznego śledzenia odpowiedzi na leczenie, oferując w ten sposób bardziej precyzyjną ocenę skuteczności terapeutycznej17,30. Alternatywna metoda polega na wykorzystaniu technologii MRI; Jednak wykrywalność guzów zależy od ich wielkości. Większe guzy są łatwiejsze do zidentyfikowania, co często jest punktem końcowym eksperymentu, a wykrywanie może się również różnić w zależności od podtypu guza, przy czym GBM jest łatwiejszy do wykrycia niż rozlane glejaki27,31. Szczególnie w przypadku rozlanych glejaków obecność nienaruszonej bariery krew-mózg (BBB) prowadzi do braku wzmocnienia kontrastu. Jednak w GBM nieszczelne unaczynienie i obecność obrzęku mogą wzmacniać kontrast między tkanką nowotworową a otaczającą ją zdrową tkanką mózgową, potencjalnie pomagając w procesie wykrywania. Ogólnie rzecz biorąc, środki kontrastujące są potrzebne do poprawy wykrywalności 30,31,32. Alternatywne techniki obrazowania, takie jak obrazowanie dyfuzyjne (DWI) i odzyskiwanie inwersji atenuowanej płynem (FLAIR), są czasami stosowane w celu poprawy wykrywania niewzmacniających się regionów guza. Jednak metody te mają również swoje ograniczenia i nie zawsze mogą zapewnić precyzyjne wyznaczenie granic guza33. Obrazowanie z transferem protonów amidowych (APTw) to nieinwazyjna technika MRI, która wykrywa rozlane glejaki poprzez śledzenie wymiany protonów białko-woda, pomagając w klasyfikacji guza. Choć jest obiecująca, stoi przed wyzwaniami, takimi jak podatność na artefakty, i nie została jeszcze przystosowana do obrazowania małych zwierząt, co ogranicza jej szersze zastosowanie34.

Innym kluczowym aspektem, który należy wziąć pod uwagę przy wykorzystaniu ortotopowych modeli BT PDX do badań skuteczności leków, jest integralność BBB w zastosowanych modelach PDX. Przepuszczalność bariery krew-mózg znacząco wpływa na dostarczanie leków i skuteczność w leczeniu guza mózgu. Na przykład utrzymanie integralności bariery krew-mózg w glejakach pnia mózgu często skutkuje słabą penetracją leków, co ogranicza skuteczność terapii ogólnoustrojowych17. Z drugiej strony, w rdzeniakach zarodkowych grupy 3 zaobserwowano, że integralność BBB jest niejednorodna w obrazowaniu MRI i podobnie stwierdzono, że jest nieszczelna w modelach ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX)35. W związku z tym scharakteryzowanie statusu BBB – niezależnie od tego, czy jest on nienaruszony, czy nieszczelny – w każdym modelu PDX jest niezbędne do zaprojektowania odpowiednich strategii terapeutycznych i dokładnej interpretacji wyników badań skuteczności leków.

Ogólnie rzecz biorąc, opisana procedura wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego oferuje solidne podejście do ustanawiania modeli BT PDX i przeprowadzania badań skuteczności środków terapeutycznych. Ciągłe udoskonalenia, w połączeniu z kompleksowym zrozumieniem tych modeli, zwiększą ich użyteczność i ułatwią opracowanie interwencji terapeutycznych dla pediatrycznych pacjentów z BT.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują pacjentom, klinicystom i badaczom z Sydney Children's Hospital Network, Sydney Children's Tumour Bank Network oraz Zero Childhood Cancer Program za hojne dostarczenie próbek niezbędnych do ustalenia tej metodologii. Children's Cancer Institute Australia jest powiązany z Uniwersytetem Nowej Południowej Walii w Sydney i Siecią Szpitali Dziecięcych w Sydney. Protokół ten wynika z wysiłków badawczych wspieranych przez granty Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Synergy Grant #2019056, Leadership Grant APP2017898 dla DZ) oraz Cancer Institute New South Wales Program Grant (TPG2037 dla DZ i MT), a także wsparcie z Levi's Project, The Kids Cancer Project, The Cure Starts Now, DIPG Collaborative, Cure Brain Cancer Foundation, Fundacja Roberta Connora Dawesa i Fundacja Benny'ego Willsa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Środek znieczulający (np. izofluran)Merck792632
100% etanolMerck459844
70% etanoluNIENIEZrób 70% etanolu ze 100% etanolu, rozcieńczając go sterylną wodą
80% etanoluNIENIEZrób 80% etanolu ze 100% etanolu, rozcieńczając go sterylną wodą
Samoprzylepne szkiełka mikroskopoweMerckZ681156
Przeciwbólowe (buprenorfina 0,3 mg/ml)Jurox powiedział:NIE
Kanister z filtrem węglowymWyposażenie weterynarza931401
Probówki stożkowe 15 ml (Falcon)Fisher Naukowy14-959-53A
Probówki stożkowe 50 ml (Falcon)Fisher Naukowy14-432-22
DMSOMerck472301
Nakładki na uszyKopf powiedział:1921
Hydrożel ECM (Matrigel, Corning)MerckE1270 powiedział:
Maść do oczu (Poly Visc)ChemikBezpośredni 719986
Surowica cielęca płoduMerckF0926 powiedział:
szklana mikrostrzykawkaHamilton7002
Chusteczki z izopropanoluMedisaSUL_LWMS-1
Przeciwciało KI67Księga Abcamab209897 powiedział:
Probówki do mikrowirówekEppendorf powiedział:211-2130
Wiertło do mikrowiertła  0,028"Kopf powiedział:8170
Jednostka mikroiniekcyjnaKopf powiedział:5004
PBSMerckZobacz materiał P4474
Pipeta 10 mlCorningCLS4488
Pipeta 1mL Eppendorf powiedział:3123000063
Pipeta 200uLEppendorf powiedział:3123000055
Pipeta 20uLEppendorf powiedział:3123000098
Pipeta 25 mlCorningCLS4489
Końcówka do pipet 1 mlCorningCLS4868
Końcówka do pipet 200uLCorningCLS4860
Detergent do polisorbatu 20 (F10SC)Zdrowie i higienaKlasa G3070
Pulsoksymetr (MouseSTAT)Naukowy KentSPO2-MSE
Jod (powidon-jod)MerckY0000466
Skalpel (jednorazowy)MedisaSUL_SCALPEL
Klej do skóry VetbondMedisa3M_1469SB
Przyrząd stereotaktyczny Small Animal z cyfrowym wyświetlaczem konsola Kopf powiedział:940
Wiertarka stereotaktyczna Kopf powiedział:1474
System monitorowania temperatury Aparatura Harvarda55-7020
Błękit trypanowyMerck93595

Bibliografia

  1. Mueller, S., Chang, S. Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches. Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).
  2. Packer, R. J. Brain tumors in children. Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).
  3. Paugh, B. S., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).
  4. MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. Treatment of high-grade glioma in children and adolescents. Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).
  5. Rutka, J. T. Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives. J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).
  6. Cho, Y. J., et al. Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome. J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).
  7. Thomas, A., Noel, G. Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach. J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).
  8. Pajtler, K. W., et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).
  9. Thorp, N., Gandola, L. Management of ependymoma in children, adolescents and young adults. Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).
  10. Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors. Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).
  11. Smith, K. S., et al. Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource. Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).
  12. Akter, F., et al. Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).
  13. Stribbling, S. M., Ryan, A. J. The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research. Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).
  14. He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).
  15. Tsoli, M., et al. International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).
  16. Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).
  17. Khan, A., et al. Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas. Nat Commun. 12 (1), 971(2021).
  18. Chen, Y., et al. Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas. Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).
  19. Ung, C., et al. Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma. Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).
  20. Ehteda, A., et al. Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG. Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).
  21. Mayoh, C., et al. High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer. Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).
  22. Lin, G. L., Monje, M. A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). J Vis Exp. (121), e55360(2017).
  23. Whitehouse, J. P., et al. In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma. Front Oncol. 13, 1123492(2023).
  24. Hermans, E., Hulleman, E. Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy. Front Oncol. 9, 1418(2019).
  25. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  26. Paxinos, G., Franklin, K. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 5th edn, Academic Press. (2019).
  27. Tsoli, M., et al. Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer. Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).
  28. Yang, H., et al. Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics. Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).
  29. Kondapaneni, R. V., et al. Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales. Biomater Adv. 160, 213860(2024).
  30. Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts. Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).
  31. Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence. BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).
  32. Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies. Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).
  33. Lasocki, A., Gaillard, F. Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research. AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).
  34. Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. APT weighted imaging in diffuse gliomas. BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).
  35. Genovesi, L. A., et al. Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier. Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ortotopowy guz mózguwstrzyknięcie wewnątrzczaszkowepediatryczny guz mózgurozlany glejak linii środkowejbariera krew-mózgengraftment guzahodowla neurosferanaliza immunohistochemiczna
Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.