Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Walidacja koniugacji środka terapeutycznego z wyrobami medycznymi powlekanymi alkoholem winylowym

915 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67358

⸱

29 listopada 2024

 ,  , 
1Department of Surgery, LSU Health Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, LSU Health Shreveport

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół derywatyzacji wyrobów medycznych za pomocą terapii białkowych poprzez sprzężenie terapii białkowej z membraną z polialkoholu winylowego odlewaną na urządzeniach medycznych. Koniugacja terapii opartych na białkach pozwala na miejscowe i skoncentrowane dostarczanie i jest opłacalnym podejściem, które wymaga znacznie niższych ilości leków do dawkowania, przy jednoczesnej minimalizacji skutków niedocelowych.

Streszczenie

Terapie oparte na białkach są często ograniczone przez drogę podania i niemożność ograniczenia ich do miejsca działania. Jednym z opracowanych przez nas innowacyjnych podejść jest kowalencyjne wiązanie leków białkowych z wyrobami medycznymi, co pozwala na bardziej miejscowe i wysoce skoncentrowane dostarczanie tych środków do zamierzonego miejsca działania. Badanie to ma na celu ocenę, czy glukagonopodobny peptyd-2 (GLP-2) może być kowalencyjnie związany z urządzeniami do rozszerzania pochwy (VES) i rękawa rozszerzającego jelita (IES) w klinicznie istotnych i mierzalnych ilościach.

Tuleje rozprężne zostały pokryte alkoholem poliwinylowym (PVA) i usieciowane parami aldehydu glutarowego/kwasu siarkowego, aby stworzyć chemicznie aktywną powierzchnię zdolną do wiązania środków terapeutycznych zawierających aminy, takich jak GLP-2. Krzywa standardowa została utworzona przez związanie 250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg i 0 μg GLP-2 z dołkami pokrytymi PVA na płytce 24-dołkowej. Wzorzec ELISA stworzono przy użyciu króliczego przeciwciała anty-GLP-2, a następnie koziego przeciwciała drugorzędowego anty-króliczej fosfatazy alkalicznej IgG oraz substratu mikrostudzienki niebieskiej fosfatazy alkalicznej. Kolorymetria (od żółtej do niebieskiej przy 620 nm) była proporcjonalna do stężenia przeciwciał związanych z GLP-2, co umożliwiło obliczenie związanego stężenia GLP-2 na tulejach pokrytych PVA. Dodanie 50 μg GLP-2 do urządzeń IES/VES wiązało średnio 22,69 ± 9,32 μg/cm2 GLP-2 z zewnętrzną powierzchnią IES/VES (9,425 cm2), co wskazuje, że 44% dodanego GLP-2 zostało unieruchomione na tulejach IES/VES pokrytych PVA.

Obecna dawka GLP-2 dla ludzi wynosi 50 μg/kg. Ponieważ każdy rękaw przenosi 22 μg, stanowi to około 44% dawki ogólnoustrojowej w jednym urządzeniu. Metodologia ta umożliwia dodawanie znacznie niższych dawek środków terapeutycznych, aby uzyskać taki sam efekt jak przy ogólnoustrojowym podawaniu leku GLP-2, przy jednoczesnym uniknięciu skutków ogólnoustrojowych.

Wprowadzenie

Wykazano, że terapie oparte na białkach, takie jak enzymy, przeciwciała, cytokiny, hormony i czynniki wzrostu, są bardzo skuteczne w leczeniu wielu chorób1. Jeśli poprawimy naszą wiedzę na temat tego, jak dostarczać te środki terapeutyczne, możemy znacznie posunąć naprzód biotechnologię stosowania tych substancji jako leków/zabiegów medycznych1. Skuteczność terapii białkowych jest ograniczona przez ich biodystrybucję, koszt i efekty niezamierzone. Podjęto kilka prób poprawy farmakokinetyki i farmakodynamiki terapii białkowych, w tym pegylacji, glikozylacji, lipidacji i fuzji innych białek2. "Celowalność" jest kolejnym problemem, ponieważ większość obecnych terapii białkowych ma wiele miejsc działania, co skutkuje efektami niezamierzonymi. W szczególności, ukierunkowanie tych leków na pożądane miejsca może obniżyć wymaganą dawkę terapeutyczną i zmniejszyć skutki uboczne2. Gdyby udało się ograniczyć dostarczanie leków do zamierzonego miejsca działania, możliwe byłoby radykalne ulepszenie leczenia, przy jednoczesnym ograniczeniu niepożądanych skutków ubocznych tych leków.

Obecnie używanych jest wiele urządzeń medycznych, które zawierają środki terapeutyczne, takie jak stenty uwalniające leki z antyproliferacyjną powłoką zawierającą klopidogrel, winkrystynę i winblastynę, aby zapobiec restenozy i potrzebie powtórnej rewaskularyzacji po cewnikowaniu serca3. Dodatkowo, biodegradowalne stenty moczowodowe uwalniające leki zawierające paklitaksel, doksorubicynę, gemcytabinę i inne środki antyproliferacyjne zostały stworzone, aby pomóc w leczeniu raka urotelialnego górnych dróg moczowych4. W miarę degradacji tych stentów, leki przeciwnowotworowe są uwalniane miejscowo w kontrolowany sposób, przedłużając dostarczanie leku bez konieczności dodatkowego dawkowania4. Metodologia ta pozwala na długoterminowe działanie leków przeciwnowotworowych w zamierzonym miejscu działania, jednocześnie zapobiegając potrzebie ekspozycji ogólnoustrojowej, ograniczając działanie leku na komórki nienowotworowe i zmniejszając toksyczność leków. Ponadto biodegradowalny charakter stentu może również zapobiec konieczności procedury usuwania stentu4.

Zespół krótkiego jelita (SBS) to kolejny stan, w którym stosowanie terapii opartych na białkach wykazało znaczną poprawę u pacjentów5. ZKJ może występować poprzez różne mechanizmy, ale skutkuje niewystarczającą długością jelit, powodując złe wchłanianie i niedożywienie. Terapie, takie jak analogi glukagonopodobnego peptydu 2 (GLP-2), mogą być stosowane przed przejściem do chirurgicznego leczenia tego schorzenia5. Ludzki GLP-2, ogólnoustrojowy hormon peptydowy składników odżywczych, jest wytwarzany w dystalnym jelicie cienkim i okrężnicy przez komórki endokrynne typu L. GLP-2 indukuje proliferację komórek kryptowych jelit, wspomaga naprawę uszkodzonej błony śluzowej, hamuje apoptozę komórek nabłonka jelitowego i poprawia ukrwienie jelit5. Analogi GLP-2, takie jak teduglutyd, zostały zatwierdzone do leczenia ZKJ u pacjentów w wieku 1 roku lub starszych, aby wspomóc naturalną adaptację jelitową6. Naturalnie, adaptacja jelit może trwać latami i powoduje opóźnione opróżnianie żołądka w celu wydłużenia czasu wchłaniania i zwiększenia średnicy przez rozszerzenie jelit w celu zwiększenia powierzchni wchłaniania7. Analogi GLP-2 mają taką samą aktywność farmakologiczną jak naturalny GLP-2, a jednocześnie mają bardziej stabilną strukturę, co pozwala na dłuższy okres półtrwania i silniejsze powinowactwo do celów5. Obecnie roczny koszt teduglutydu wynosi 295 000 USD, a dawka dla pacjenta wynosi 0,05 mg/kg dziennie5. Skutki uboczne teduglutydu obejmują nudności, wymioty, biegunkę, ból brzucha, utratę masy ciała, polipy żołądkowo-jelitowe i zwiększony wzrost istniejących guzów5.

Poprzednio nasze laboratorium wykazało, że zastosowanie rękawa rozszerzającego jelito (IES) (Rysunek 1) było w stanie spowodować natychmiastowe wydłużenie jelita cienkiego ex vivo o 36,2% i wydłużenie jelita cienkiego o 30,2% po miesięcznym wdrożeniu in vivo6,8. To urządzenie może stać się terapią dla pacjentów z ZKJ, która może skrócić zależność od żywienia pozajelitowego. Możliwość biokoniugacji środków terapeutycznych z urządzeniem IES może jeszcze bardziej poprawić zdolność enterogenezy rozpraszającej poprzez dodanie do urządzenia agonisty wzrostu błony śluzowej jelit GLP-2. Membrany z alkoholu poliwinylowego (PVA) to hydrofilowe polimery, które można wytworzyć poprzez rozpuszczenie PVA w wodzie, odlewanie go na podłożu strukturalnym, a następnie sieciowanie aldehydem glutarowym przy użyciu kwasu siarkowego jako katalizatora9. Wykazano, że te nanocząsteczki hydrożelu mają potencjał jako systemy dostarczania leków poprzez dyfuzję leków, pęcznienie matrycy hydrożelowej i reaktywność chemiczną leku/matrycy10. PVA został zatwierdzony przez FDA do użytku klinicznego u ludzi ze względu na doskonałą biokompatybilność i bezpieczeństwo11. Polimeryzacja PVA prowadzi do powstania grup końcowych, które pozwalają na biokoniugację12.

Urządzenia IES/VES mają 3 cm długości i powierzchnię zewnętrzną 9,425cm2, które można odlewać z membranami PVA. Te membrany PVA mogą być biosprzężone z GLP-2, aby umożliwić miejscowe i skoncentrowane dostarczanie środków terapeutycznych. Obniżenie wymaganej dawki leku i ominięcie konieczności podawania ogólnoustrojowego, unikanie negatywnych skutków leczenia poza miejscem leczenia. Może to pomóc w obniżeniu kosztów tych drogich leków, wymagając mniejszej dawki, a opóźnione uwalnianie leku może zmniejszyć częstotliwość dawkowania, co jeszcze bardziej obniża koszty. Pokrycie urządzenia IES GLP-2 może obniżyć wymagane dawki, zaoszczędzić pieniądze pacjentów, uniknąć podawania ogólnoustrojowego, zapobiec negatywnym skutkom leczenia i utrzymać ciągłe dostarczanie leku do miejsca docelowego. Niniejszy raport ocenia stopień, w jakim białko terapeutyczne, takie jak GLP-2, może być kowalencyjnie wiązane z wyrobami medycznymi, takimi jak urządzenia IES/VES, w fizjologicznie znaczących ilościach, aby zapewnić lokalne korzyści płynące z tych leków, unikając jednocześnie skutków niedocelowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Sekcje 1 i 2 są ukończone w tym samym czasie. Powlekanie PVA i sieciowanie membrany PVA powinno być wykonane w tym samym czasie zarówno dla tulei rozprężnych, jak i płytki 24-dołkowej. Dzięki temu mogą być w tym samym czasie gotowi do stworzenia krzywej wzorcowej z 24-dołkową płytką, aby wykorzystać absorbancję do obliczenia stężenia GLP-2 w każdej osłonie.

1. Tworzenie urządzeń IES i VES z powłoką GLP-2

  1. Przygotuj 5% roztwór PVA, dodając 5 g PVA do 100 ml wody dejonizowanej. Aby pomóc się rozpuścić, rozważ wymieszanie na płycie grzejnej. Następnie przygotuj 1 mg/ml roztworu GLP-2, dodając 1 mg GLP-2 do 1 ml wody dejonizowanej.
  2. Rękawy rozprężne jelitowe i rękawy rozprężne dopochwowe przed zawarciem na szklanej pipecie, stabilizując końce plastikowymi pipetami przyciętymi tak, aby ściśle przylegały do szklanej pipety wokół wstępnie zaciśniętych rękawów.
  3. Pomaluj wstępnie zakontraktowane rękawy wstępnie przygotowanym 5% PVA za pomocą małego pędzla. Po pomalowaniu warstwy PVA pozostaw rękawy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut, a następnie pomaluj kolejną warstwę, co daje łącznie 5 warstw PVA na każdym rękawie.
  4. Po wyschnięciu 5. warstwy umieść wstępnie skurczone rękawy w eksykatorze pod kapturem bezpieczeństwa chemicznego, aby umożliwić ich sieciowanie w temperaturze pokojowej. Zainicjuj sieciowanie, dodając 3 ml 25% aldehydu glutarowego i 3 ml 94%-98% kwasu siarkowego, aby oddzielić otwarte zlewki w eksykatorze, aby opary zareagowały i usieciowały membrany PVA na tulejach.
  5. Po usieciowaniu tulei w komorze przez 48 godzin, należy wyjąć je z komory i pozostawić aldehyd glutarowy do odparowania z tulei przez 15 min.
  6. Następnie dodać 50 μl roztworu GLP-2 o stężeniu 1 mg/ml, ostrożnie pipetując na każdy rękaw. Pozostawić do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej przed zdjęciem wstępnie zaciśniętych rękawów ze szklanej pipety i dodaniem każdej tulei do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej.

2. Tworzenie płytki 24-dołkowej pokrytej GLP-2

  1. Aby związać krzywą wzorcową GLP-2 z PVA, należy odpipetować 50 μl 5% PVA na dno 18 przeznaczonych do użycia studzienek na płytce 24-dołkowej. Pozostaw 6 studzienek pustych, aby pomieścić urządzenia IES i VES (po 3 dla każdego typu urządzenia).
  2. Pozostawić warstwę PVA do wyschnięcia na 24-dołkowej płytce przez noc w suszarce w temperaturze 120 °C.
  3. Umieść 24-dołkową płytkę w eksykatorze pod osłoną bezpieczeństwa chemicznego, aby umożliwić PVA sieciowanie przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpocznij sieciowanie, dodając 3 ml 25% aldehydu glutarowego i 3 ml 94%-98% kwasu siarkowego w celu oddzielenia otwartych zlewek, aby opary mogły reagować wewnątrz komory i sieciować PVA na płytce 24-dołkowej.
  4. Po sieciowaniu przez 48 godzin wyjąć płytkę 24-dołkową z komory i pozostawić aldehyd glutarowy do odparowania z płytki przez 15 minut.
  5. Następnie wykonaj gradient stężeń, dodając 250 μl, 100 μl, 50 μl, 25 μl i 0 μl 1 mg/ml roztworu GLP-2 do ich oznakowanych studzienek, tworząc 24-dołkową płytkę z 3 dołkami dla każdego stężenia GLP-2 (250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg, i 0 μg) oraz 3 dołki dla każdego rodzaju tulei (IES i VES).

3. Tworzenie krzywej standardowej i rozróżnianie stężenia GLP-2 w tulei

  1. Po dodaniu odpowiednich rozcieńczeń GLP-2 do studzienek i dodaniu do studzienek rękawów pokrytych lekiem, należy schłodzić płytkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wiązanie leku.
  2. Następnego dnia dodaj 2 ml 1 mg/ml mleka w proszku w dejonizowanym roztworze blokującym wodę do każdej studzienki przez 1 godzinę. Po zablokowaniu umyj każdą studzienkę 3 razy PBS przez 5 minut każde mycie.
  3. Przygotować roztwór przeciwciała królika anty-GLP-2, dodając 40 μl króliczego przeciwciała anty-GLP-2 do 50 ml wody dejonizowanej. Następnie dodać 2 ml roztworu przeciwciała GLP-2 królika do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i wstawić do lodówki na noc w temperaturze 4 °C.
  4. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyj każdą studzienkę kolejne 3x PBS przez 5 minut każde płukanie. Wytwarzać fosfatazę alkaliczną anty-króliczą IgG w roztworze przeciwciał drugorzędowych kóz, dodając 20 ml przeciwciała drugorzędowego do 40 ml wody dejonizowanej. Następnie dodaj 2 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki i pozostaw na 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć każdą studzienkę kolejnym 3x PBS płukaniem przez 5 minut każde. Następnie dodaj niebieski substrat mikrostudzienki fosfatazy alkalicznej do każdej studzienki.
  6. Pozwolić, aby fosfataza alkaliczna sprzężona z przeciwciałem drugorzędowym reagowała z substratem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W miarę postępu reakcji obserwuj, czy kolor roztworu zmieni się z żółtego na niebieski.
  7. Zatrzymaj reakcję, pipetując 200 μl roztworu z każdej studzienki i umieść ją w 96-dołkowej płytce oznaczonej tak samo jak płytka 24-dołkowa. Po usunięciu odczynnika z płytki 24-dołkowej z membraną PVA sprzężoną z enzymem fosfatazy alkalicznej, reakcja zostanie zatrzymana, a kolor nie ulegnie zmianie.
  8. Odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji o długości fali 620 nm, aby wygenerować krzywą wzorcową i obliczyć stężenie GLP-2 na tulejach pokrytych PVA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje powlekanie i sieciowanie urządzeń IES oraz VES polimerem PVA w celu umożliwienia koniugacji GLP-2. Rysunek 2 przedstawia krzywą wzorcową wygenerowaną w celu określenia stężenia GLP-2 na każdym urządzeniu. Rysunek 3 przedstawia stężenie GLP-2 w każdym urządzeniu IES i VES oraz stężenie w dołkach wykorzystanych do stworzenia krzywej wzorcowej. Osłonki miały średnie stężenie GLP-2 wynoszące 22,69 ± 9,32 µg/cm2, co od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj metodologię wiązania leków opartych na białkach, takich jak GLP-2, z wyrobami medycznymi pokrytymi PVA i usieciowanymi. Stężenie związanego GLP-2 określono przez utworzenie standardowej krzywej stężenia GLP-2 na 24-dołkowych płytkach pokrytych PVA przez dodanie króliczego przeciwciała anty-GLP-2, koziej fosfatazy alkalicznej anty-króliczej IgG i niebieskiego substratu mikrostudzienki fosfatazy alkalicznej. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem fosfatazy alkalicznej pozwoliło na dodanie substra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Jonathan Steven Alexander i Christen J. Boyer posiadają patent US10537659B2, drukowane w 3D urządzenia medyczne z polialkoholu winylowego i metody aktywacji (2017). Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez R. Keitha White'a, MD, za pośrednictwem Department of Surgery John C. McDonald Chair Fund, W. Reid Grimes, MD za pośrednictwem Department of Surgery Whitney Boggs Endowed Professorship Fund, oraz LSU LIFT2 grant, HSCS-2022-LIFT-002.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anti-Rabbit IgG (cała cząsteczka)– Przeciwciało peroksydazy wytwarzane w kozieSigma-AldrichA0545-1ML
BluePhos Microwell Substrate KitSera Care5120-0059
GenClone 25-107, 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych Studzienki z płaskim dnem, poddane działaniu TC, 100 płytek/jednostkęGenesee Scientific 25-107
GLP-2 Rekombinowane królicze przeciwciało monoklonalne (3K3P5)Invitrogen MA5-42869
Peptyd podobny do glukagonu-2 (GLP-2) (1-33), szczurEchelon Biosciences195262-56-7
Aldehyd glutarowy, 25% roztwór wodnySigma-Aldrich111-30-8
Eksykator polipropylenowy Nalgene z kranemThermoFisher Scientific5310-0250
Poli(alkohol winylowy)Sigma-Aldrich9002-89-5
Kwas siarkowy (klasa metali śladowych), Fisher ChemicalFischer ScientificA510-P212

Bibliografia

  1. Conner, K. P., Devanaboyina, S. C., Thomas, V. A., Rock, D. A. The biodistribution of therapeutic proteins: Mechanism, implications for pharmacokinetics, and methods of evaluation. Pharmacol Ther. 212, 107574(2020).
  2. Ebrahimi, S. B., Samanta, D. Engineering protein-based therapeutics through structural and chemical design. Nat Commun. 14 (1), 2411(2023).
  3. Senst, B., Goyal, A., Basit, H., Borger, J. Drug Eluting Stent Compounds. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2024).
  4. Shan, H., et al. Advances in drug delivery via biodegradable ureteral stent for the treatment of upper tract urothelial carcinoma. Front Pharmacol. 11, 224(2020).
  5. Zhu, C., Li, Y. An updated overview of glucagon-like peptide-2 analog trophic therapy for short bowel syndrome in adults. J Int Med Res. 50 (3), 3000605221086145(2022).
  6. Clayton, S., et al. Self-expanding intestinal expansion sleeves (IES) for short gut syndrome. Pediatr Surg Int. 38 (1), 75-81 (2022).
  7. Rosete, B. E., Wendel, D., Horslen, S. P. Teduglutide for pediatric short bowel syndrome patients. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (7), 727-733 (2021).
  8. Novel Intestinal Expansion Sleeve (IES): promoting distraction enterogenesis in a live animal model. Colvin, J. C., et al. 39th Southern Biomedical Engineering Conference, , (2023).
  9. Kim, K. J., Lee, S. B., Han, N. W. Kinetics of crosslinking reaction of PVA membrane with glutaraldehyde. Korean J Chem Eng. 11 (1), 41-47 (1994).
  10. Hamidi, M., Azadi, A., Rafiei, P. Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 60 (15), 1638-1649 (2008).
  11. Chong, S. F., Smith, A. A., Zelikin, A. N. Microstructured, functional PVA hydrogels through bioconjugation with oligopeptides under physiological conditions. Small. 9 (6), 942-950 (2013).
  12. Jensen, B. E., Dávila, I., Zelikin, A. N. Poly(vinyl alcohol) physical hydrogels: Matrix-mediated drug delivery using spontaneously eroding substrate. J Phys Chem B. 120 (26), 5916-5926 (2016).
  13. Teduglutide for short bowel syndrome. Aust Prescr. 43 (2), 72-73 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Powłoka z alkoholu poliwinylowegoterapeutyki oparte na białkachglukagonopodobny peptyd-2urządzenia typu expansion sleevekowalencyjne wiązanie lekukolorymetria ELISAreakcja sieciowaniamiejscowe uwalnianie lekupowłoka wyrobów medycznych
Walidacja koniugacji środka terapeutycznego z wyrobami medycznymi powlekanymi alkoholem winylowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.