Artykuł metodologiczny

Metoda badania metabolizmu w komórkach limfoidalnych przy użyciu chemii do pomiaru inkorporacji puromycyny za pomocą cytometrii przepływowej

976 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67377

⸱

15 sierpnia 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół pokazuje metodę opartą na cytometrii przepływowej, wykorzystującą chemię do badania metabolizmu energetycznego w komórkach.

Streszczenie

Po stymulacji antygenowej, naiwne limfocyty T ulegają szybkiej proliferacji i ekspansji do efektorowych limfocytów T. Metabolizm odgrywa ważną rolę w wytwarzaniu biomasy potrzebnej dla tych szybko proliferujących komórek oraz do wytwarzania cząsteczek niezbędnych do różnicowania i funkcjonowania efektorowych limfocytów T, które wpływają na wynik adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej w zakażeniu lub nowotworach. Naiwne limfocyty T przeprogramowują swój metabolizm po stymulacji antygenowej, aby zwiększyć wytwarzanie ATP, które jest wymagane do wspierania ich wzrostu, biosyntezy i funkcji efektorowych. ATP może być wytwarzane w komórce albo przez szlak fosforylacji mitochondrialno-oksydacyjnej (OXPHOS), albo przez szlak glikolitycznego. Ponieważ większość ATP wytwarzanego w dzielącej się, rosnącej komórce jest zużywana do syntezy białek, synteza białek została wykorzystana jako substytut poziomów ATP. Syntezę białek można zmierzyć poprzez włączenie puromycyny, która naśladuje 3′ adenozynę tRNA naładowanego zmodyfikowaną tyrozyną i prowadzi do spontanicznego zakończenia translacji białek. Inhibitory metaboliczne, takie jak 2-deoksyglukoza (2DG), która blokuje szlak glikolityczny, i oligomycyna (O), która blokuje kompleks 5 łańcucha transportu elektronów (ETC), mogą być wykorzystywane do badania zależności komórkowego wytwarzania ATP od tych dwóch szlaków w połączeniu z oceną syntezy białek w metodzie zwanej SCENITH. Opisujemy tutaj odmianę tej metody, która wykrywa inkorporację puromycyny za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu chemii. Ta metoda badania metabolizmu jest stosunkowo łatwa i może być stosowana do oceny rzadkich populacji komórek, a także próbek pobranych od pacjentów, za pomocą cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

W ostatnich latach coraz bardziej docenia się ważną rolę metabolizmu w regulacji limfocytów T. Metabolizm komórkowy reguluje wiele krytycznych funkcji limfocytów, w tym klonalną ekspansję limfocytów T specyficznych dla patogenu i ich różnicowanie w podzbiory komórek efektorowych, które syntetyzują różne cząsteczki efektorowe, w tym cytokiny zapalne i cytolityczne granzymy wymagane do zabijania patogenów1. Badanie metabolizmu limfocytów T jest zatem ważne zarówno dla oceny prawidłowej funkcji limfocytów T, jak i dla opracowania potencjalnych środków terapeutycznych.

Naiwne limfocyty T są metabolicznie spokojne i polegają na metabolizmie katabolicznym i fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) dla swojego zapotrzebowania na energię1,2. Po aktywacji receptora limfocytów T (TCR) limfocyty T przechodzą szybkie przeprogramowanie metaboliczne napędzane częściowo przez regulację w górę transporterów składników odżywczych na powierzchni komórek, które zwiększają wychwyt glukozy i wielu aminokwasów, w tym glutaminy, ze środowiska. Te składniki odżywcze są następnie wykorzystywane w szlakach anabolicznych do wytwarzania makrocząsteczek, które przyczyniają się do wzrostu komórek i wspierają zwiększone zapotrzebowanie na energię związane ze zwiększonym wzrostem i podziałem komórek1,2,3. Przeprogramowanie metaboliczne w aktywowanych limfocytach T sprawia, że komórki są bardziej zależne od tlenowej glikolizy i glutaminolizy w zakresie ich potrzeb energetycznych1,2,3. Po stymulacji TCR, wychwyt składników odżywczych odgrywa również kluczową rolę w aktywacji dalszych szlaków molekularnych3. Na przykład wychwyt aminokwasów i zwiększone lokalne stężenie aminokwasów aktywują sygnalizację mTORC14. I odwrotnie, zmniejszenie dostępności aminokwasów wewnątrzkomórkowych zmniejsza szlak sygnałowy mTORC12,3,5,6,7. Tak więc metabolizm i funkcja komórkowa są ściśle powiązane w efektorowej limfocytach T.

Duży wzrost biomasy wymagany do szybko dzielących się limfocytów T wymaga regulacji syntezy białek/translacji8. Syntezę białek można określić ilościowo w komórce, badając włączenie puromycin9, naśladowcy tyrozylo-tRNA, który blokuje translację poprzez włączanie, oznaczanie i uwalnianie wydłużających się łańcuchów polipeptydowych z translujących rybosomów9. Translacja białek jest procesem zależnym od wysokiej energii; w rzeczywistości większość ATP wytwarzanego w dzielących się, rosnących komórkach jest wykorzystywana do syntezy białek. W związku z tym synteza białek została wykorzystana jako zastępczy pomiar dla komórkowego ATP10. Aby wytworzyć ATP, komórki często polegają na glikolizie i/lub mitochondrialnym szlaku OXPHOS11. Glikoliza generuje dwie cząsteczki ATP na cząsteczkę glukozy. Szlak OXPHOS generuje 36 ATP na glukozę12,13, ale glikoliza może generować ATP szybciej14. Tak więc szybko dzielące się aktywowane limfocyty T, takie jak komórki rakowe, w dużym stopniu polegają na szlaku glikolitycznym do wytwarzania ATP.

Zależność komórki od każdego szlaku metabolicznego może być badana za pomocą specyficznych inhibitorów. Inhibitor szlaku glikolitycznego 2-Deoksyglukoza (2-DG), który jest analogiem glukozy, działa jako inhibitor kompetycyjny dla enzymu glikolitycznego heksokinazy15. 2-DG jest fosforylowany do 2DG-fosforanu (2DG-P) przez heksokinazę. 2DG-P nie może być dalej metabolizowany przez izomerazę fosfoheksozy, która normalnie przekształca glukozo-6-fosforan (G-6-P) w fruktozo-6-fosforan16. 2DG-P jest zatem uwięziony i gromadzi się w komórkach, prowadząc do zahamowania glikolizy i wyczerpania komórkowego ATP, blokując w ten sposób syntezę białek17. W podobny sposób zależność komórek od mitochondrialnego szlaku OXPHOS można badać za pomocą oligomycyny, która wiąże się z kanałem protonowym syntazy ATP łańcucha transportu elektronów (ETC)18, blokując w ten sposób mitochondrialną syntezę ATP (Rysunek 1). Zastosowanie tych inhibitorów w połączeniu z oceną syntezy białek może dostarczyć obrazu stanu metabolicznego komórek i zostało wykorzystane w potężnej metodzie jednokomórkowej znanej jako SCENITH, która ocenia włączenie puromycyny za pomocą cytometrii przepływowej10. Jednak dostępność odczynników SCENITH może być ograniczona. Inne powszechnie stosowane techniki oceny glikolizy i OXPHOS obejmują analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse, które wymagają większej liczby komórek, co może nie być eksperymentalnie wykonalne. W tym artykule opisujemy alternatywną metodę oceny włączenia puromycyny przy użyciu dostępnego na rynku odczynnika chemicznego Click-it. Łatwość stosowania tej metody pozwala na szybką ocenę stanu metabolicznego limfocytów, w tym rzadkich populacji komórek i próbek pobranych od pacjentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Hodowla zwierząt i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem G98-3 przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami National Human Genome Research Institute, NIH, oraz zatwierdzonym protokołem LISB 22E przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases Animal Care and Use Committee, NIH. Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57Bl/6J w wieku 6-12 tygodni, wyhodowane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF). Podobne wyniki uzyskano u samic myszy. Ludzka krew pełna została uzyskana z Banku Krwi NIH w ramach zatwierdzonego przez IRB protokołu IRB Centrum Klinicznego NIH 99-CC-0168 Pobieranie i dystrybucja składników krwi od zdrowych dawców do badań in vitro. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Pierwotna izolacja i hodowla mysich limfocytów T CD4+

  1. Oczyść naiwne limfocyty T CD4 + przez selekcję negatywną z połączonych jednokomórkowych zawiesin śledziony myszy lub węzłów chłonnych myszy od 6 do 12 tygodni myszy płci męskiej za pomocą magnetycznego systemu separacji komórek zgodnie z protokołem producenta.
  2. Hodowla komórek (jak opisano poniżej) w pożywce IMDM zawierającej dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy i uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 0,05 mM 2-β-merkaptoetanolu.
  3. Współhodowla nieleczonych limfocytów T CD4 w stosunku 1:8 ze splenocytami zubożonymi w T traktowanymi mitomycyną C (opisanymi poniżej) jako APC na 48-dołkowych płytkach pod niespolaryzowanymi (1 μg/ml anty-CD3 [klon 2C11] i 3 μg/ml anty-CD28 [klon 37.51]) i Th0 (1 μg/ml anty-CD3, 3 μg/ml anty-CD28, Po 10 μg/ml anty-IFNg [klon XMG1.2], anty-IL-12 [klon C17.8] i anty-IL-4 [klon 11B11]) przez 72 godziny w temperaturze 37 °C. Ustawić hodowle przy użyciu 1 x 106 APC i 0,13 x 106 naiwnych limfocytów T CD4 na studzienkę 48-dołkowej płytki (tabela materiałów)
  4. Wytwarzanie splenocytów zubożonych w T traktowanych mitomycyną C jako APC: Krótko mówiąc, wybarwić jednokomórkową zawiesinę śledziony myszy przeciwciałami CD4 i CD8 sprzężonymi z FITC. Następnie oznacz ogniwa magnetycznie mikrokulkami anty-FITC (patrz tabela materiałów). Następnie, za pomocą magnetycznego systemu separacji komórek zgodnie z protokołem producenta, należy negatywnie wyselekcjonować APC z limfocytów T. Następnie potraktuj APC 50 μg/ml mitomycyny C przez 40 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, a następnie przemyj 3x 1x PBS.

2. Izolacja i kultura ludzkich PBMC

  1. Wyizolować PBMC z krwi pełnej za pomocą pożywek do separacji limfocytów i zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Hodowla PBMC w pożywkach RPMI uzupełniona 2 mM L-glutaminą, 0,01 M HEPES, 1 mM pirogronianem sodu, 1% aminokwasów endogennych, 100 U/ml penicyliny i streptomycyny, 0,05 mM 2-β-merkaptoetanolu i 5% surowicy ludzkiej.
  3. Hodowla 1 x 106 PBMC na basenik 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U z 5 μg/ml fitohemaglutyniny L (PHA-L) przez 18–24 godzin w temperaturze 37 °C.

3. Test metaboliczny

UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie komórki, inhibitory [oligomycyna (O), 2-deoksyglukoza (2-DG), DMSO (Co)] i odczynnik O-propargyl-puromycyny (OPP) były jak najbardziej zbliżone do 37 °C. Komórki, inhibitory i odczynnik OPP należy rozdzielić na 96 płytkach z dnem U i pozostawić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C tak bardzo, jak to możliwe. Podwielokrotne inhibitory 2-DG i O w mniejszych ilościach, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

  1. Przygotować 2 M (20x) roztwór podstawowy 2-DG i 40 μM (40x) roztwór podstawowy O. W przypadku OPP rozcieńczyć 1 μl OPP w 49 μl pożywki, tak aby stężenie wynosiło 400 μM - będzie to 20x roztwór podstawowy.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że wszystkie inne składniki zestawu do syntezy białek OPP (patrz tabela materiałów) mają temperaturę pokojową (RT).
  3. Przygotować 1x bufor reakcyjny OPP, rozcieńczając podwielokrotność z butelki składnika C w stosunku 1:10 wodą dejonizowaną. Po użyciu przechowywać pozostały roztwór 1x w temperaturze 2-8 °C.
  4. Wysiew: 0,1-2 x 106 komórek na studzienkę okrągłodennej 96-dołkowej płytki dla każdego warunku (Co / DG / O / DGO) w 100 μl kompletnego IMDM (dla mysich limfocytów T CD4) lub pełnego RPMI (dla ludzkich PBMC) lub dowolnego kompletnego podłoża do wyboru. Trzymaj płytkę w inkubatorze tak długo, jak to możliwe.
  5. Dodać 1x inhibitory z roztworów podstawowych (5 μL z 20x DG, Co), (2,5 μL z 40x O) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Końcowe stężenia na komórkach wynoszą 100 mM DG i 1 μM O. Inhibitory należy dokładnie wymieszać z komórkami za pomocą pipety. Dla ułatwienia, podwielokrotnić inhibitory na 96-dołkowej płytce i dodać komórki do inhibitorów i dobrze wymieszać, pipetując kilka razy w górę iw dół.
  6. Do próbki DGO dodać 1x DG (5 μl), dokładnie wymieszać pipetą i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Następnie dodać 1x O (2,5 μL), kilkakrotnie odpipetować i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. Nie wypłukując inhibitorów, dodać 5 μl OPP z 20x (400 μM) roztworu podstawowego do każdej próbki, tak aby stężenie w komórkach wynosiło 20 μM, kilkakrotnie pipetować w górę i w dół i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Dla ułatwienia rozmieść OPP na 96-dołkową płytkę, dodaj komórki z inhibitorami do odczynnika OPP i dobrze wymieszaj.
    UWAGA: W przypadku komórek mniej aktywnych metabolicznie i komórek izolowanych bezpośrednio ex vivo, należy wydłużyć czas inkubacji po dodaniu OPP. Czas inkubacji z OPP musi być ustandaryzowany dla każdego typu komórki.
  8. Po inkubacji z OPP dodać 100-150 μl lodowatego buforu FACS (2% FBS i 1 mM EDTA w 1x PBS). Wirować przy 750 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant i powtórzyć etap płukania.
  9. Wybarwić komórki odpowiednimi markerami powierzchniowymi, przeciwciałem anty-mysim CD4 (stosowanym w rozcieńczeniu 1/200) lub przeciwciałem anty-ludzkim CD4 (stosowanym w rozcieńczeniu 1/50), odczynnikiem żywym/martwym (stosowanym w rozcieńczeniu 1/600), w obecności bloku Fc (stosowanym w rozcieńczeniu 1/200). Inkubować przez 25-30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  10. Umyć płytkę 150-200 μl buforu FACS i odwirować przy 750 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Delikatnie przesunąć płytkę, aby usunąć supernatant, a następnie powtórzyć etap mycia. Na tym etapie komórki są barwione na powierzchni.
  11. Zawiesić komórki w 1% PFA w PBS, dobrze wymieszać i inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.
  12. Przemyć buforem FACS i odwirować przy 750 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie powtórzyć mycie.
  13. Zawiesić osad komórkowy w 200 μL zimnego 1x bufor permeabilizacyjny saponiny (0,1% (wag./obj.) Saponina + 3% FBS w 1x PBS). Inkubować w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez 5-15 min. W tym czasie komórki są utrwalone i przepuszczalne.
  14. Przygotować 1x dodatek buforu reakcyjnego OPP (składnik E), rozcieńczając 10x roztwór 1:10 w wodzie dejonizowanej. Przygotuj ten roztwór na świeżo i użyj go tego samego dnia.
  15. Przygotować koktajl reakcyjny OPP zgodnie z tabelą 1. Koktajl reakcyjny należy zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania.
  16. Odwirować próbki z etapu 3.13 przy 750 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant. Przemyć komórki 2x 200 μL 1x buforu do przepuszczalności saponin. Odwirować i wyrzucić supernatant.
  17. Dodać 50-100 μl koktajlu reakcyjnego OPP (przygotowanego w kroku 3.12) do każdej studzienki i dobrze wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Następnie obrócić płytki w temperaturze 750 x g lub 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  18. Zawiesić osad w 200 μl 1 x bufor do permeabilizacji saponin i odwirować próbki o stężeniu 750 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  19. Zawiesić w 50 μl buforu do płukania reakcyjnego (składnik F) na studzienkę i odwirować przy 750 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w 200 μl buforu FACS.
  20. Próbki należy analizować metodą cytometrii przepływowej (patrz rysunek uzupełniający 1) tego samego dnia lub przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C i analizować je następnego dnia.

4. Analiza testu metabolicznego

  1. Zmierzyć włączenie puromycyny (OPP) jako substytutu syntezy białek w następujących warunkach: 1) warunek kontrolny (Co); 2) w komórkach, w których szlak glikolityczny jest zablokowany przez 2-DG; 3) w komórkach, w których mitochondrialny szlak OXPHOS jest zablokowany przez O; i 4) w komórkach, w których zarówno szlak glikoliczny, jak i mitochondrialny są blokowane przez inhibitory (DGO), oceniając średnią intensywność fluorescencji (MFI) OPP (Rysunek 2).
  2. Przeanalizuj zależność komórek od określonej ścieżki, patrząc na MFI OPP w każdym warunku. Bezpośrednia ocena MIF jako miary syntezy białek. Oblicz zależność od glukozy, pojemność glikolityczną, zdolność utleniania kwasów tłuszczowych (FAO) i zdolność utleniania aminokwasów (AAO) oraz zależność mitochondrialną zgodnie z10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Naiwne limfocyty T CD4+ wyizolowano ze śledziony i węzłów chłonnych myszy, a następnie różnicowano w kierunku linii Th0 lub niepolaryzowanych (NP) przez 72 h. Komórki zbierano po 0 h, 48 h i 72 h hodowli, a wbudowywanie OPP mierzono, analizując MFI dla OPP. Naiwne limfocyty T CD4+ wykazywały niższą aktywność syntetyczną niż aktywowane limfocyty T, co potwierdziły wartości MFI dla OPP (Rysunek 3). Naiwne komórki były częściowo zależne od glikolizy, ale w większym stopniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono metodę badania metabolizmu w komórkach limfoidalnych za pomocą cytometrii przepływowej, opartej na technologii SCENITH, ale z wykorzystaniem chemicznego znakowania wbudowanej puromycyny. Chociaż skupiliśmy się na limfocytach, protokół ten można dostosować do badania metabolizmu w dowolnym typie komórki. Metoda ta jest również korzystna do badania metabolizmu w rzadkich populacjach komórek i próbkach pacjentów, gdzie inne techniki, takie jak Seahorse, wymagają większej liczby komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Qin Xu i Dr. Avik Dutta za dostarczenie próbek PBMC i cennych sugestii eksperymentalnych. Badania te były częściowo wspierane przez Wydział Badań Wewnętrznych NIAID, NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-PuromycynyBiolegend381506Zastosowane rozcieńczenie: 1/100
Alexa Fluor 647 anty-ludzkie przeciwciało CD4Biolegend357422Zastosowane rozcieńczenie:  1/50
BD Horizon BUV737 Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences612761Zastosowane rozcieńczenie:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Zestaw do oznaczania syntezy białekThermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
Ludzka surowicaMillipore SigmaH4522
IMDM, Suplement GlutaMAX, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb anty-mysz CD28, Klon:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb anty-mysie CD3ε, Klon:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb anty-mysie IFNγ, Klon:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb anty-mysz IL-12 p40, Klon:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb anty-mysi IL-4, klon:  11B11BioXcellBE0045
L-Glutamina (200 mM)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD Zestaw do utrwalania Aqua Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 405 nmThermo FisherL34966Zastosowane rozcieńczenie: 
Pożywka do separacji limfocytówMP Biomedicals50494X
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher11140050
Mitomycyna C ze Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naiwny zestaw izolacyjny CD4, myszMiltenyi Biotec130-104-453
Paraformaldehyd 16% roztwór wodny Mikroskopia elektronowa15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 mlWysokiej jakości produkty biologiczne114-058-101
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml). 100 mlThermo Fisher15140122
Fitohemaglutynina L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
Premium Grade Płodowa surowica bydlęca (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Medium, bez glutaminyThermo Fisher21870076
SaponinThermo FisherA18820.22
Pirogronian sodu (100 mM)Thermo Fisher11360070
1/600 LSM klasy EM

Bibliografia

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolizm kom rek limfoidalnychproliferacja limfocyt w Tsynteza bia ekprzeprogramowanie metaboliczneszlak glikolitycznyfosforylacja oksydacyjnainhibitory metabolicznemetoda SCENITH
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły