Artykuł metodologiczny

Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67378

⸱

1 listopada 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Streszczenie

Plasmodesmata to błoniaste nanopory, które łączą cytoplazmę sąsiednich komórek roślinnych i umożliwiają transport między komórkami składników odżywczych, makrocząsteczek, a także atakujących wirusów. Plazmodesmaty odgrywają fundamentalną rolę w regulacji komunikacji międzykomórkowej, przyczyniając się do rozwoju roślin, reakcji środowiskowych i interakcji z patogenami wirusowymi. Odkrycie plazmodalnej lokalizacji białek roślinnych lub wirusowych może dostarczyć użytecznych informacji funkcjonalnych na temat białka i jest ważne dla zrozumienia mechanizmów interakcji między roślinami a wirusami. Aby ułatwić te badania, opisujemy protokół analizy różnych białek plazmodesmalnych w oparciu o mikroskopię konfokalną w celu wybrania najlepszego markera plazmodesmalnego do badania interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego. W szczególności analizy tych zdarzeń zilustrowano przy użyciu białka ruchu między komórkami (MP) wirusa oczyszczania żył rzepy (TVCV), białka zlokalizowanego w miejscu plazmodesmy rzodkiewnika 5 (PDLP5) i białka wiążącego kallozę Plasmodesmata 1 (PDCB1). Dane dotyczące lokalizacji plazmodesmalnej białek są analizowane równolegle z globalną wizualizacją plazmodesmatów przy użyciu barwienia niebieskim anilinowym pobranych tkanek. Podejścia te można łatwo dostosować do analizy lokalizacji plazmodalnej dowolnych białek komórkowych lub patogenów w roślinach.

Wprowadzenie

Plasmodesmata (PD) odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu rozwoju roślin, reakcji środowiskowych i interakcji z patogenami wirusowymi poprzez regulację komunikacji międzykomórkowej1,2. PD początkowo tworzy się podczas cytokinezy, z setkami PD wstawionymi do nowej komórki między dwiema komórkami potomnymi, dostarczając w ten sposób kanały do komunikacji między komórkami3,4. PD to struktura bogata w błonę, zawierająca błonę pochodzącą z retikulum endoplazmatycznego (ER), desmotubulę trans-PD, w centralnej części porów, które są wyściełane błoną plazmatyczną3,4. Porównawcze podejścia proteomiczne pozwoliły zidentyfikować liczne białka funkcjonalne PD, w tym β-1,3-glukanazy (BG), syntazy kalozy (CALS), białka zlokalizowane w plazmodesmacie (PDLP), białka wiążące modelozę (PDCB), białka regionu transbłonowego wielu domen C2 (MCTPs)3 oraz kinazy podobne do receptorów powtórzeniowych bogatych w leucynę (RLK)5. Niedawno Kirk i in. opracowali narzędzie o nazwie plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), które umożliwiło przewidywanie nowych białek PD u 22 gatunków roślin6. PD różni się przepuszczalnością i strukturą podczas rozwoju roślin i reakcji na różne stresy. Odkładanie się i hydroliza kalozy (β-1,3-glukanu) w obszarze szyi otaczającym PD jest jednym z szeroko znanych mechanizmów regulacji PD7.

Wiele chorobotwórczych mikrobów, w tym grzyby, bakterie i wirusy, może manipulować rozszerzeniem lub strukturą PD podczas infekcji2,8,9. Magnaporthe oryzae, czynnik wywołujący wybuch ryżu, wykorzystuje wewnątrzkomórkowe inwazyjne strzępki, które przemieszczają się z komórki do komórki za pośrednictwem PD8. Patogen bakteryjny Pseudomonas syringae pv. pomidor wymaga białka efektorowego HopO1-1 do ruchu międzykomórkowego i rozprzestrzeniania się w roślinie gospodarza poprzez interakcję i destabilizację PDLP7, zwiększając w ten sposób strumień molekularny w sąsiednich komórkach w Arabidopsis9. Jednak wirusy roślinne są bardziej wszechstronne w regulacji PD podczas ich transmisji międzykomórkowej, a białko ruchu wirusa (MP) promuje ruch między komórkami2. Ze względu na ich ważną funkcję w regulacji rozwoju i wzrostu roślin, a także ich interakcję z drobnoustrojami chorobotwórczymi roślin, choroba Parkinsona zyskuje w ostatnich latach coraz większe zainteresowanie. U Arabidopsis thaliana występują dwa główne typy funkcjonalnych białek PD, PDLP (1-8) i PDCB (1-5), a wiele z nich, np. PDLP51,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 i PDCB115stwierdzono, że odgrywają rolę w manipulowaniu przepuszczalnością PD poprzez regulację osadzania kalozy. Stwierdzono jednak, że niektóre PDLP mają funkcjonalną redundancję, np. mutanty nokautujące pdlp1 i pdlp1,2 nie wpływały na transport molekularny, chociaż mutanty z podwójnym nokautem pdlp1,3 i PDLP2,3 wykazywały zwiększoną przepuszczalność plazmodesmalną16. Co ciekawe, regulacja w dół/nokaut lub nadmierna ekspresja samego PDLP5 powoduje odpowiednio wzrost lub spadek przepuszczalności plazmodalnej1,17. Ostatnio Li i in. odkryli, że PDLP5 i PDLP6 działają na różnych interfejsach komórkowych13. Wyniki te wskazują, że PDLP5 może mieć nienadmiarowe funkcje z innymi PDLP.

Ze względu na krytyczną funkcję PD w komunikacji międzykomórkowej, opracowaliśmy protokół wdrażania roślinnych białek PD PDLP5 i PDCB1 oraz wirusowego białka ruchu komórka-komórka (MP) wirusa oczyszczającego żyły rzepy (TVCV) jako proste, wygodne i niezawodne markery PD do eksperymentów z biologią komórki. W celu dalszej weryfikacji równolegle przebiegała wizualizacja choroby Parkinsona za pomocą barwienia błękitem anilinowym pobranych tkanek. Protokoły opisane dla lokalizacji PD PDLP5, PDCB1 i TVCV MP można łatwo dostosować do analizy potencjalnej lokalizacji PD dowolnych białek komórkowych lub pochodzących z patogenów w żywych roślinach.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wzrost roślin

  1. Nasiona Nicotiana benthamiana należy uprawiać w wilgotnej glebie w komorze o kontrolowanym środowisku w temperaturze 23 °C w świetle przez 16 godzin i w ciemności przez 8 godzin.
  2. Po około 2 tygodniach ostrożnie przenieś sadzonki z granulkami torfu wokół ich korzeni do większych doniczek i kontynuuj wzrost w tych samych warunkach przez 4-5 tygodni w celu przeprowadzenia eksperymentów agroinfiltracji.
    UWAGA: Nie używaj roślin, gdy zaczną kwitnąć, ponieważ akumulacja GFP zmniejszy się na etapie kwiatostanu18.

2. Konstrukcja wektorowa

  1. Użyj PCR, aby amplifikować interesujące sekwencje kodujące za pomocą polimerazy DNA Q5 o wysokiej wierności i sklonować je do wektora wejściowego pDONR207 za pomocą BP reaction19 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu klonazy BP.
  2. Przenieś docelowe geny w powstałych plazmidach wejściowych do wektora docelowego pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 za pomocą LR reaction19 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu LR Clonase do produkcji plazmidów ze znacznikiem EGFP połączonym z C-końcem docelowych białek.
  3. Zweryfikuj wszystkie konstrukcje za pomocą PCR i sekwencjonowania19.

3. Agroinfiltracja

  1. Smuga Komórki Agrobacterium tumefaciens EHA105 zawierające różne wektory na płytkach agarowych LB i inkubowane przez 2 dni w temperaturze 28 °C.
  2. Przenieść pojedynczą kolonię do 2 ml bulionu LB i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C z mieszaniem (250 obr./min).
  3. Usunąć 1 ml z nocnej hodowli, a następnie dodać 4 ml świeżego bulionu LB i ponownie hodować przez 1 godzinę w tych samych warunkach.
  4. Dostosować zawiesinę bakteryjną do OD600 = 0,1 (OD600 = 0,2 dla koekspresji dwóch białek) z buforem infiltracyjnym (MgCl2, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
  5. Wymieszać różne zawiesiny bakteryjne w stosunku 1:1 (v/v), aby uzyskać końcowe stężenie OD600 = 0,1. (Opcjonalnie).
  6. Zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny z delikatnym mieszaniem.
  7. Naciekaj powierzchnię w pełni rozwiniętych liści różnych roślin za pomocą jednorazowej strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml i zaznacz infiltrowany obszar (ciemniejszy kolor niż otaczająca, nienaciekająca tkanka) wodoodpornym pisakiem.
  8. Przejdź do sekcji Mikroskopia konfokalna tego protokołu (krok 5).
    UWAGA: Można również stosować inne szczepy Agrobacterium tumefaciens nadające się do przekształcania gatunków roślin będących przedmiotem zainteresowania.

4. Niebieska plama anilinowa

  1. Dodać podwielokrotność 200 μl 1% błękitu anilinowego (w 50 mM buforze fosforanu potasu, pH 8,0) do szkiełka mikroskopowego20.
  2. Za pomocą ostrza należy wyciąć naciekany obszar w odległości około 0,5 cm × 0,5 cm od żyły i przenieść próbki tkanek liści do roztworu błękitu anilinowego (aosijalną stroną do góry) na szkiełku mikroskopowym i upewnić się, że próbki tkanek liści są zanurzone w roztworze błękitu anilinowego, a następnie przykryć je szkłem nakrywkowym (22 mm x 50 mm).
  3. Umieścić szkiełka mikroskopowe z próbkami w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej i opróżniać przez 2 minuty (<0,8 Pa), a następnie powoli uwalniać ciśnienie i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wizualizacja sygnału fluorescencyjnego błękitu anilinowego pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym za pomocą kompatybilnego oprogramowania.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano metodę barwienia błękitem anilinowym przez Huang et al.20. W modyfikacji tej techniki, ten sam eksperyment przeprowadzono bez 2-minutowego kroku próżni, dając podobne wyniki i sugerując, że suszenie próżniowe nie jest niezbędne do barwienia aniliną. Również stężenie sinizny anilinowej i czas barwienia mogą się różnić w zależności od źródła tkanki liścia itp.

5. Mikroskopia konfokalna

  1. Zbierz dwa liście z dwóch roślin w różnych punktach czasowych po infiltracji. Za pomocą ostrza przeciąć strefę infiltracji na około 0,5 cm × 0,5 cm plastry od żyły.
    1. Próbki tkanek umieścić w kropli sterylnej wody (aosijalną stroną do góry) w centralnej części szkiełka mikroskopowego i przykryć je szkłem nakrywkowym (22 mm x 50 mm), uważając, aby nie pozostały pęcherzyki.
  2. Upewnij się, że długości fal wzbudzenia do wykrywania sygnałów CFP, GFP i RFP wynoszą odpowiednio 405 nm, 488 nm i 561 nm, a filtry emisyjne do wykrywania wynoszą 410-602 nm dla CFP i 400-602 nm dla EGFP i RFP, z otworkiem 1 AU i wzmocnieniem głównym ustawionym na 769 V.
  3. Wizualizacja sygnału fluorescencyjnego znaczników autofluorescencyjnych w infiltrowanym obszarze za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z kompatybilnym oprogramowaniem po 1 dniu, 2 dniach, 3 dniach, 5 dniach, 7 dniach i 10 dniach po infiltracji.
    1. Użyj soczewki obiektywowej 10x i filtrów GFP, aby zlokalizować komórki z sygnałem fluorescencyjnym, a następnie przełącz się na soczewkę obiektywową 40x, aby zobaczyć lokalizację subkomórkową i rejestrować obraz.
  4. Zbierz 20 obrazów dla każdego schorzenia, używając co najmniej dwóch niezależnych kontrprób biologicznych.
  5. Oceń lokalizację PD badanego białka na podstawie diagnostycznego wyglądu punktowego sygnału na obrzeżach komórki21,22.
    UWAGA: Podczas wykrywania subkomórkowej lokalizacji nieznanego białka zaleca się użycie co najmniej trzech roślin.

6. Analiza danych

  1. Użyj oprogramowania Fiji, aby podzielić kanały i dodać pasek skali do obrazów w celu wizualizacji.
  2. Użyj oprogramowania Fiji, aby podzielić kanały przed pomiarem średniej wartości skali szarości dla każdego obrazu, aby ocenić intensywność fluorescencji GFP (dla MP, PDCB1 i PDLP5) lub CFP (dla barwienia błękitem anilinowym) w różnych punktach czasowych.
  3. Użyj oprogramowania Fidżi do podzielenia kanałów przed normalizacją obrazów GFP (dla MP, PDCB1 i PDLP5) lub CFP (dla barwienia błękitem anilinowym). Obszar obrazu został zmierzony, a punkty PD zostały policzone ręcznie. Obliczono liczbę PD puncta na 100μm2.
  4. Użyj dwukierunkowej ANOVA z wieloma porównaniami Tukey'a test23, aby określić wartości P między różnymi próbkami i różnymi punktami czasowymi za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego.
    UWAGA: W przypadku jednokanałowego obrazu fluorescencyjnego wartość skali szarości każdego piksela reprezentuje intensywność fluorescencji tego point24. W tym przypadku wykorzystano średnią wartość skali szarości do oceny intensywności fluorescencji każdej próbki w różnych punktach czasowych.

Wyniki

Aby ułatwić badania nad funkcją PD w fizjologii roślin oraz ich oddziaływaniem z patogenami, opracowano trzy proste i niezawodne białka referencyjne do lokalizacji PD. Wybrano dwa komórkowe białka PD oraz białko MP pochodzące z patogenu, kodowane przez tobamowirus roślin TVCV. Lokalizację subkomórkową tych białek zwizualizowano przy użyciu autofluorescencyjnego reportera EGFP połączonego z końcem C każdego białka. W alternatywnym podejściu PD zwizualizowano poprzez barwienie błękitem anilinowym złogów kalozy związanych z PD. Eksperymenty wykazały, że zarówno PDLP5, jak i MP wykazywały punktową lokalizację w PD, przy czym MP lokalizowało się również w jądrze komórkowym (Rycina 1A), co odnotowano wcześniej25. W przeciwieństwie do nich, PDCB1 wydawało się rozdzielać między PD a ER (Rycina 1A). Dla badaczy z mniejszym doświadczeniem w interpretacji lokalizacji subkomórkowej białek znakowanych GFP, Rycina 1A ilustruje również charakterystyczny wzorzec nukleocytoplazmatyczny EGFP ekspresowanego w komórkach roślinnych. Aby potwierdzić sygnał ER dla PDCB1, dokonano koekspresji PDCB1 z markerem ER, co wykazało, że sygnał PDCB1 pokrywał się z sygnałem markera ER (Rycina 1B). Aby ocenić efektywność lokalizacji PD testowanych białek, obliczono odsetek komórek wykazujących sygnał fluorescencyjny, w których sygnał ten był zlokalizowany w PD (Tabela 1).

W celu identyfikacji lokalizacji subkomórkowej przy użyciu białek referencyjnych, pomocne jest zrozumienie skali czasowej ekspresji białka referencyjnego oraz potencjalnych zmian jego lokalizacji. Rysunek 2 przedstawia taką kinetykę dla MP, PDLP5 i PDCB1, podczas gdy same PD były wizualizowane za pomocą barwienia anilinowym błękitem. Zarówno MP, jak i PDLP5 zaczęły kumulować się w PD już w pierwszym dniu po infiltracji (dpi), a akumulacja ta osiągnęła wyraźne maksimum w 2 dpi i pozostawała stabilna przez kolejne 5 dni, po czym intensywność sygnału spadła, najprawdopodobniej z powodu degradacji białek. Przebieg czasowy sortowania subkomórkowego PDCB1 był bardziej złożony: przez pierwsze 3 dpi białko PDCB1 wykazywało porównywalnie silny sygnał w ER, który prawie całkowicie przesłaniał lokalizację sygnału specyficznego dla PD, natomiast w 5 dpi ten drugi sygnał stał się bardziej wyraźny (Rysunek 2), choć w mniejszej liczbie komórek. Co ciekawe, pojawienie się wyraźnego wzorca lokalizacji PDCB1 w PD po 5 dpi zbiegło się w czasie ze znacznie mniejszą liczbą komórek wykazujących sygnał EGFP (Rysunek uzupełniający 1). Zatem PDLP5 i MP mogą pełnić funkcję białek referencyjnych PD z niewielkim tłem w większości innych przedziałów komórkowych, przy optymalnym oknie czasowym wizualizacji od 2 do 5 dpi. PDCB1 natomiast nie jest tak odpowiednim markerem PD.

Następnie zweryfikowano, czy markery PD zachowują swoistość lokalizacji subkomórkowej w obecności innych białek PD. W tym celu MP-EGFP lub PDLP5-EGFP koeksprymowano z białkiem MP innego wirusa roślin, wirusa mozaiki tytoniu (TMV), lokalizującym się w PD26  i znakowanym CFP. Rysunek 3 pokazuje, że w obu przypadkach koeksprymowane białka wykazywały wyraźny wzór lokalizacji w PD. Podobnie, specyficzne dla PD barwienie histologiczne tkanek eksprumujących MP-EGFP lub PDLP5-EGFP błękitem anilinowym nie wykazało zakłóceń w lokalizacji sygnałów EGFP i błękitu anilinowego w PD (Rysunek 3).

Badania nad lokalizacją PD często zyskują dzięki bardziej ilościowej ocenie ogólnej ekspresji białka referencyjnego oraz sygnału PD. Podejście do kwantyfikacji przedstawiono na Rysunku 4 oraz Rysunku 5. W celu kwantyfikacji ogólnej ekspresji zmierzono intensywność sygnału dla PDLP5 i MP. Oba białka wykazały silne sygnały we wszystkich punktach czasowych wizualizacji w okresie 10 dpi, przy czym maksymalna intensywność sygnału wystąpiła w 3 dpi dla PDLP5 i w 2 dpi dla MP (Rysunek 4). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w intensywności sygnału między PDLP5 a MP w żadnym z punktów czasowych wizualizacji. Intensywność sygnału PDCB1 wykazywała większe wahania między punktami czasowymi, a najsilniejszy sygnał zaobserwowano w 7 dpi (Rysunek 4), choć ze względu na niewielką liczbę wykazujących ekspresję komórek w tym punkcie czasowym trudno było zebrać statystycznie istotne dane. Zatem pierwsze 3 dpi stanowią optymalny czas dla detekcji ekspresji PDCB1. Zgodnie z oczekiwaniami, próbki barwione błękitem anilinowym wykazały bardziej stabilny sygnał niż białka o ekspresji przejściowej (Rysunek 4).

Następnie dokonano ilościowego oznaczenia punktów PD utworzonych przez PDLP5 i MP. PDLP5 wykazało stabilną liczbę punktów PD przez cały okres obserwacji, bez statystycznie istotnych różnic między dowolnymi dwoma badanymi punktami czasowymi (Rysunek 5). Najwyższą liczbę punktów PD utworzonych przez MP odnotowano w 2 dpi, a następnie pozostawały one względnie stabilne do końca okresu obserwacji. Porównanie liczby punktów PD pomiędzy PDLP5 a MP nie wykazało statystycznie istotnych różnic w większości terminów pobierania próbek (Rysunek 5). Liczba punktów PD barwionych błękitem anilinowym również pozostała stabilna, choć nieznacznie spadła w 10 dpi. Liczby punktów PD znakowanych błękitem anilinowym, PDLP5 lub MP były do siebie zbliżone z istotnością statystyczną (Rysunek 5), co jest zgodne ze specyficznością tych markerów względem PD. Liczby punktów PD dla PDCB1 nie zostały przeanalizowane, ponieważ w wcześniejszych punktach czasowych sygnał PD był przesłonięty przez sygnał ER, a w późniejszych punktach czasowych obserwowano go tylko w stosunkowo niewielu komórkach (patrz Rysunek 2).

Mikroskopia fluorescencyjna białek oznakowanych EGFP z autofluorescencją plastydów na obrazach scalonych.
Rysunek 1: Lokalizacja TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 w plasmodesmatach (PD) przejściowo eksprimowanych w Nicotiana benthamiana oraz barwienie PD błękitem anilinowym. (A) Lokalizacja MP-EGFP, PDLP5-EGFP i PDCB1-EGFP w PD oraz barwienie anilinowe. Sygnał EGFP jest zaznaczony na zielono, sygnał błękitu anilinowego na niebiesko, a autofluorescencja plastydów na czerwono. (B) Koekspresja MP-EGFP, PDLP5-EGFP i PDCB1-EGFP z markerem siateczki śródplazmatycznej (ER) oznakowanym mRFP. Obrazy zarejestrowano 2 dni po infiltracji (dpi); są to pojedyncze przekroje konfokalne reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów (N = 20 obrazów z 2 roślin). Sygnał EGFP jest zaznaczony na zielono, sygnał mRFP na fioletowo, a autofluorescencja plastydów na czerwono. Żółte strzałki wskazują PDCB1 zlokalizowane w ER. Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna, lokalizacja białek, badanie komórek; śledzenie znaczników GFP, wyniki time-lapse.
Rycina 2: Przebieg czasowy lokalizacji w połączeniach plazmapatycznych (PD) białek TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 przejściowo eksprymowanych w Nicotiana benthamiana oraz barwienie PD błękitem anilinowym. Obrazy zarejestrowano w 2 dpi; są to pojedyncze przekroje konfokalne reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów (N = 20 obrazów z 2 roślin dla wszystkich układów, z wyjątkiem 7 dpi i 10 dpi dla PDCB1-EGFP, w których sygnał występował w mniejszej liczbie komórek). Sygnał EGFP jest zielony, a sygnał błękitu anilinowego jest niebieski. Paski skali = 5 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna białek roślinnych, znakowanie EGFP/CFP, autofluorescencja plastydów, nałożenie obrazów.
Rycina 3: TVCV MP oraz PDLP5 zachowują swoją lokalizację w PD po koekspresji z lokalizującym się w PD TMV MP i kostainowaniu błękitem anilinowym.Obrazy zostały zarejestrowane przy 2 dpi i stanowią pojedyncze przekroje konfokalne reprezentatywne dla N ≥ 10 obrazów z 4-6 roślin. Sygnał EGFP jest zaznaczony kolorem zielonym, sygnał CFP oraz sygnał błękitu anilinowego kolorem niebieskim, a autofluorescencja plastydów kolorem czerwonym. Paski skali = 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy analizy statystycznej przedstawiający średnią wartość szarości w czasie dla różnych markerów EGFP.
Rysunek 4: Przebieg czasowy intensywności fluorescencji TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 przejściowo ekspresowanych w Nicotiana benthamiana oraz barwienie PD błękitem anilinowym. Dane ilościowe zostały zebrane z doświadczeń opisanych na Rysunku 2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej z wielu eksperymentów. Poszczególne punkty danych wskazują średnią dla każdego pomiaru. Różnice między wartościami średnimi ocenione za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya są istotne statystycznie dla podanych wartości P. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, brak istotności statystycznej. Słupki niebieskie, barwienie anilinowe; słupki jasnozielone, MP-EGFP, słupki ciemnozielone, PDLP5-EGFP; słupki żółte, PDCB1-EGFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający liczbę klastrów PD w czasie, z porównaniami dla błękitu anilinowego, TVCV MP-EGFP i PDLP5-EGFP.
Rycina 5: Przebieg czasowy tworzenia się punktów PD przez przejściowo ekspresowane w Nicotiana benthamiana białka TVCV MP i PDLP5 oraz przez barwienie PD błękitem anilinowym. Dane ilościowe zebrano z eksperymentów opisanych w Rycina 2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej z wielu eksperymentów. Pojedyncze punkty danych wskazują średnią dla każdego pomiaru. Różnice między wartościami średnimi oceniane za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya są istotne statystycznie dla następujących wartości P: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Słupki niebieskie – barwienie anilinowe; słupki jasnozielone – MP-EGFP, słupki ciemnozielone – PDLP5-EGFP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Doświadczenie I
Całkowita liczba komórekKomórki z lokalizacją PDKomórki z sygnałem mieszanymKomórki z lokalizacją PD (%)
Błękit anilinowy40404100
MP-EGFP40404100
PDCB1-EGFP403387.5
PDLP5-EGFP40400100
Eksperyment II
Całkowita liczba komórekKomórki z lokalizacją PDKomórki z mieszanym sygnałemKomórki z lokalizacją PD (%)
Błękit anilinowy40408100
MP-EGFP4039897.5
PDCB1-EGFP40123130
PDLP5-EGFP4039297.5

Tabela 1: Efektywność lokalizacji PD.

Rycina uzupełniająca 1: Lokalizacja w PD białek TVCV MP, PDLP5 oraz PDCB1 przejściowo ekspresowanych w Nicotiana benthamiana. Obrazy zarejestrowano w 5 dpi (A), 7 dpi (B) oraz 10 dpi (C). Sygnał EGFP jest zielony, a autofluorescencja plastydów czerwona. Paski skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wszelkie badania biologiczne komórek dotyczące komunikacji międzykomórkowej roślin i transportu między komórkami podczas normalnego rozwoju i morfogenezy roślin, a także podczas interakcji roślina-patogen, wymagają wykrywania i monitorowania sortowania białek - zarówno endogennych, jak i kodowanych przez patogen - z roślinnymi połączeniami międzykomórkowymi, plazmodesmatami (PD). Eksperymenty te byłyby znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu białek referencyjnych, zarówno endogennych, jak i pochodzących od patogenów, które wiernie i konsekwentnie lokalizują się w PD, dekorując i wizualizując te struktury. Potrzeba ta została zaspokojona poprzez wybór trzech znanych białek lokalizujących chorobę Parkinsona: Arabidopsis PDLP5 i PDCB1 oraz MP z patogenu tobamowirusowego TVCV. Białka te zostały oznaczone na ich końcach C za pomocą autofluorescencyjnego reportera EGFP, a zdolność powstałych białek fuzyjnych do sortowania do PD określono po ich przejściowej ekspresji w liściach Nicotiana benthamiana i analizach mikroskopii konfokalnej tkanek wykazujących ekspresję. Do ogólnej wizualizacji PD w tych tkankach zastosowano standardową metodę barwienia błękitem anilinowym.

Uważa się, że wirusy roślinne MP dzielą się na dwie główne grupy ze względu na ich wpływ na strukturę i integralność PD: MP, które zwiększają przepuszczalność PD odwracalnie i bez żadnych zmian strukturalnych w PD oraz MP, które bramują PD poprzez modyfikację swojej struktury. Wirusy tobamowirusów, takie jak TVCV, należą do pierwszej grupy MP, co pozycjonuje je jako atrakcyjne markery PD do badań nad lokalizacją subkomórkową27,28.

Eksperymenty te umieściły PDLP5-EGFP i MP-EGFP jako wiarygodne i powtarzalne markery biologiczne choroby Parkinsona, ze skutecznością wykrywania PD porównywalną ze skutecznością niebieskiego barwnika anilinowego. Lokalizacja PDLP5-EGFP i MP-EGFP w PD została wykryta przez cały okres obserwacji wynoszący 10 dpi, z optymalnym czasem obserwacji charakterystycznego wzorca lokalizacji PD między 2 dpi a 3 dpi. Chociaż ekspresja z promotora 35S może powodować potranskrypcyjne wyciszenie ekspresji genu, często występuje to po długotrwałej ekspresji w stabilnie przekształconych roślinach transgenicznych. Z drugiej strony, zastosowanie tego silnego promotora konstytutywnego jest ważne dla łatwego wykrycia białka markerowego. Jeżeli ekspresja białka referencyjnego spada po 7-10 dpi, należy stosować krótsze okresy, tj. 2-3 dpi. Nie wykryto tutaj istotnych różnic w ogólnym wzorcu lokalizacji subkomórkowej między PDLP5 i MP, z wyjątkiem tego, że MP gromadził się w jądrze komórkowym oprócz PD. I odwrotnie, PDCB1 nie jest zalecany do stosowania jako marker PD per se ze względu na złożoność jego subkomórkowego wzorca lokalizacji, który obejmuje znaczną lokalizację do ER.

Łatwość wykrywania sygnału fluorescencji EGFP zależała również od etapu wzrostu rośliny; w szczególności u N. benthamiana najniższą akumulację sygnału EGFP odnotowano w stadiumkwiatostanu 18.

Badanie to miało na celu opracowanie markerów lokalizacji PD maksymalnie wyłącznych dla innych przedziałów subkomórkowych. W związku z tym ich zastosowanie jako referencji do lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania z dodatkowymi zdolnościami lokalizacji subkomórkowej powinno być połączone z ekspresją innych markerów subkomórkowych, takich jak te specyficzne dla ER, mitochondriów, błony plazmatycznej itp. W takim przypadku włączenie dodatkowych komórek Agrobacterium do ekspresji tych markerów powinno być brane pod uwagę przy obliczaniu końcowego stężenia kultur agroinfiltracyjnych, tj. OD600 w kulturach płynnych. Oczywiście koncentracja komórek i czas wzrostu roślin powinny być dostosowane do maksymalnej ekspresji i wykrywania wzorca lokalizacji PD u innych gatunków roślin.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Praca w laboratorium VC była wspierana przez granty od NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 i IOS 1758046) oraz BARD (IS-5276-20) dla VC. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Silnik 1-fazowy ABT ACBRANDTECH&nbsp; ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Kontrola zanieczyszczeń CCI
Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymówInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymówInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.Oprogramowanie GraphPad Inc.
Zdjęcie JNarodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaGatunek
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościKrajowy organ wykonawczy#M0491S
Optycznego i Obliczeniowegorośliny

Bibliografia

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lokalizacja białekanaliza plasmodesmtransport międzykomórkowybarwienie błękitem anilinowyminfiltracja Agrobacteriumcelowanie w plasmodesmylokalizacja w retikulum endoplazmatycznymwirusowe białko ruchu
Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.