Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plasmodesmata to błoniaste nanopory, które łączą cytoplazmę sąsiednich komórek roślinnych i umożliwiają transport między komórkami składników odżywczych, makrocząsteczek, a także atakujących wirusów. Plazmodesmaty odgrywają fundamentalną rolę w regulacji komunikacji międzykomórkowej, przyczyniając się do rozwoju roślin, reakcji środowiskowych i interakcji z patogenami wirusowymi. Odkrycie plazmodalnej lokalizacji białek roślinnych lub wirusowych może dostarczyć użytecznych informacji funkcjonalnych na temat białka i jest ważne dla zrozumienia mechanizmów interakcji między roślinami a wirusami. Aby ułatwić te badania, opisujemy protokół analizy różnych białek plazmodesmalnych w oparciu o mikroskopię konfokalną w celu wybrania najlepszego markera plazmodesmalnego do badania interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego. W szczególności analizy tych zdarzeń zilustrowano przy użyciu białka ruchu między komórkami (MP) wirusa oczyszczania żył rzepy (TVCV), białka zlokalizowanego w miejscu plazmodesmy rzodkiewnika 5 (PDLP5) i białka wiążącego kallozę Plasmodesmata 1 (PDCB1). Dane dotyczące lokalizacji plazmodesmalnej białek są analizowane równolegle z globalną wizualizacją plazmodesmatów przy użyciu barwienia niebieskim anilinowym pobranych tkanek. Podejścia te można łatwo dostosować do analizy lokalizacji plazmodalnej dowolnych białek komórkowych lub patogenów w roślinach.
Wprowadzenie
Plasmodesmata (PD) odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu rozwoju roślin, reakcji środowiskowych i interakcji z patogenami wirusowymi poprzez regulację komunikacji międzykomórkowej1,2. PD początkowo tworzy się podczas cytokinezy, z setkami PD wstawionymi do nowej komórki między dwiema komórkami potomnymi, dostarczając w ten sposób kanały do komunikacji między komórkami3,4. PD to struktura bogata w błonę, zawierająca błonę pochodzącą z retikulum endoplazmatycznego (ER), desmotubulę trans-PD, w centralnej części porów, które są wyściełane błoną pla....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Wzrost roślin
- Nasiona Nicotiana benthamiana należy uprawiać w wilgotnej glebie w komorze o kontrolowanym środowisku w temperaturze 23 °C w świetle przez 16 godzin i w ciemności przez 8 godzin.
- Po około 2 tygodniach ostrożnie przenieś sadzonki z granulkami torfu wokół ich korzeni do większych doniczek i kontynuuj wzrost w tych samych warunkach przez 4-5 tygodni w celu przeprowadzenia eksperymentów agroinfiltracji.
UWAGA: Nie używaj roślin, gdy zaczną kwitnąć, ponieważ ak....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ułatwić badania nad funkcją PD w fizjologii roślin oraz ich oddziaływaniem z patogenami, opracowano trzy proste i niezawodne białka referencyjne do lokalizacji PD. Wybrano dwa komórkowe białka PD oraz białko MP pochodzące z patogenu, kodowane przez tobamowirus roślin TVCV. Lokalizację subkomórkową tych białek zwizualizowano przy użyciu autofluorescencyjnego reportera EGFP połączonego z końcem C każdego białka. W alternatywnym podejściu PD zwizualizowano poprzez barwienie błękitem anilinowym złogów kalozy związanych z.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wszelkie badania biologiczne komórek dotyczące komunikacji międzykomórkowej roślin i transportu między komórkami podczas normalnego rozwoju i morfogenezy roślin, a także podczas interakcji roślina-patogen, wymagają wykrywania i monitorowania sortowania białek - zarówno endogennych, jak i kodowanych przez patogen - z roślinnymi połączeniami międzykomórkowymi, plazmodesmatami (PD). Eksperymenty te byłyby znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu białek referencyjnych, zarówno endogennych, jak i pochodzących od patogenów, któr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Praca w laboratorium VC była wspierana przez granty od NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 i IOS 1758046) oraz BARD (IS-5276-20) dla VC. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o publikacji.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Silnik 1-fazowy ABT AC | BRANDTECH& | nbsp; ABF63/4C-7RQ | |
| Agrobacterium tumefaciens EHA105 | |||
| Kontrola zanieczyszczeń | CCI | ||
| Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymów | Invitrogen | #11789020 | |
| Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymów | Invitrogen | #11791020 | |
| GraphPad Prism 8.0.1. | Oprogramowanie GraphPad Inc. | ||
| Zdjęcie J | Narodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania | ||
| Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM 900 | |
| Nicotiana benthamiana | Gatunek | ||
| pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
| Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności | Krajowy organ wykonawczy | #M0491S |
Bibliografia
- Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
- Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
