Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Summary

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Abstract

Plasmodesmata to błoniaste nanopory, które łączą cytoplazmę sąsiednich komórek roślinnych i umożliwiają transport między komórkami składników odżywczych, makrocząsteczek, a także atakujących wirusów. Plazmodesmaty odgrywają fundamentalną rolę w regulacji komunikacji międzykomórkowej, przyczyniając się do rozwoju roślin, reakcji środowiskowych i interakcji z patogenami wirusowymi. Odkrycie plazmodalnej lokalizacji białek roślinnych lub wirusowych może dostarczyć użytecznych informacji funkcjonalnych na temat białka i jest ważne dla zrozumienia mechanizmów interakcji między roślinami a wirusami. Aby ułatwić te badania, opisujemy protokół analizy różnych białek plazmodesmalnych w oparciu o mikroskopię konfokalną w celu wybrania najlepszego markera plazmodesmalnego do badania interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego. W szczególności analizy tych zdarzeń zilustrowano przy użyciu białka ruchu między komórkami (MP) wirusa oczyszczania żył rzepy (TVCV), białka zlokalizowanego w miejscu plazmodesmy rzodkiewnika 5 (PDLP5) i białka wiążącego kallozę Plasmodesmata 1 (PDCB1). Dane dotyczące lokalizacji plazmodesmalnej białek są analizowane równolegle z globalną wizualizacją plazmodesmatów przy użyciu barwienia niebieskim anilinowym pobranych tkanek. Podejścia te można łatwo dostosować do analizy lokalizacji plazmodalnej dowolnych białek komórkowych lub patogenów w roślinach.

Introduction

Plasmodesmata (PD) odgrywają fundamentalną rolę w kontrolowaniu rozwoju roślin, reakcji środowiskowych i interakcji z patogenami wirusowymi poprzez regulację komunikacji międzykomórkowej^1,2. PD początkowo tworzy się podczas cytokinezy, z setkami PD wstawionymi do nowej komórki między dwiema komórkami potomnymi, dostarczając w ten sposób kanały do komunikacji między komórkami^3,4. PD to struktura bogata w błonę, zawierająca błonę pochodzącą z retikulum endoplazmatycznego (ER), desmotubulę trans-PD, w centralnej części porów, które są wyściełane błoną plazmatyczną^3,4. Porównawcze podejścia proteomiczne pozwoliły zidentyfikować liczne białka funkcjonalne PD, w tym β-1,3-glukanazy (BG), syntazy kalozy (CALS), białka zlokalizowane w plazmodesmacie (PDLP), białka wiążące modelozę (PDCB), białka regionu transbłonowego wielu domen C2 (MCTPs)³ oraz kinazy podobne do receptorów powtórzeniowych bogatych w leucynę (RLK)⁵. Niedawno Kirk i in. opracowali narzędzie o nazwie plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), które umożliwiło przewidywanie nowych białek PD u 22 gatunków roślin⁶. PD różni się przepuszczalnością i strukturą podczas rozwoju roślin i reakcji na różne stresy. Odkładanie się i hydroliza kalozy (β-1,3-glukanu) w obszarze szyi otaczającym PD jest jednym z szeroko znanych mechanizmów regulacji PD⁷.

Wiele chorobotwórczych mikrobów, w tym grzyby, bakterie i wirusy, może manipulować rozszerzeniem lub strukturą PD podczas infekcji^2,8,9. Magnaporthe oryzae, czynnik wywołujący wybuch ryżu, wykorzystuje wewnątrzkomórkowe inwazyjne strzępki, które przemieszczają się z komórki do komórki za pośrednictwem PD⁸. Patogen bakteryjny Pseudomonas syringae pv. pomidor wymaga białka efektorowego HopO1-1 do ruchu międzykomórkowego i rozprzestrzeniania się w roślinie gospodarza poprzez interakcję i destabilizację PDLP7, zwiększając w ten sposób strumień molekularny w sąsiednich komórkach w Arabidopsis⁹. Jednak wirusy roślinne są bardziej wszechstronne w regulacji PD podczas ich transmisji międzykomórkowej, a białko ruchu wirusa (MP) promuje ruch między komórkami². Ze względu na ich ważną funkcję w regulacji rozwoju i wzrostu roślin, a także ich interakcję z drobnoustrojami chorobotwórczymi roślin, choroba Parkinsona zyskuje w ostatnich latach coraz większe zainteresowanie. U Arabidopsis thaliana występują dwa główne typy funkcjonalnych białek PD, PDLP (1-8) i PDCB (1-5), a wiele z nich, np. PDLP5^1,10,11, PDLP1¹², PDLP6¹³, PDLP7¹⁴ i PDCB1¹⁵stwierdzono, że odgrywają rolę w manipulowaniu przepuszczalnością PD poprzez regulację osadzania kalozy. Stwierdzono jednak, że niektóre PDLP mają funkcjonalną redundancję, np. mutanty nokautujące pdlp1 i pdlp1,2 nie wpływały na transport molekularny, chociaż mutanty z podwójnym nokautem pdlp1,3 i PDLP2,3 wykazywały zwiększoną przepuszczalność plazmodesmalną¹⁶. Co ciekawe, regulacja w dół/nokaut lub nadmierna ekspresja samego PDLP5 powoduje odpowiednio wzrost lub spadek przepuszczalności plazmodalnej^1,17. Ostatnio Li i in. odkryli, że PDLP5 i PDLP6 działają na różnych interfejsach komórkowych¹³. Wyniki te wskazują, że PDLP5 może mieć nienadmiarowe funkcje z innymi PDLP.

Ze względu na krytyczną funkcję PD w komunikacji międzykomórkowej, opracowaliśmy protokół wdrażania roślinnych białek PD PDLP5 i PDCB1 oraz wirusowego białka ruchu komórka-komórka (MP) wirusa oczyszczającego żyły rzepy (TVCV) jako proste, wygodne i niezawodne markery PD do eksperymentów z biologią komórki. W celu dalszej weryfikacji równolegle przebiegała wizualizacja choroby Parkinsona za pomocą barwienia błękitem anilinowym pobranych tkanek. Protokoły opisane dla lokalizacji PD PDLP5, PDCB1 i TVCV MP można łatwo dostosować do analizy potencjalnej lokalizacji PD dowolnych białek komórkowych lub pochodzących z patogenów w żywych roślinach.

Protocol

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wzrost roślin

1. Nasiona Nicotiana benthamiana należy uprawiać w wilgotnej glebie w komorze o kontrolowanym środowisku w temperaturze 23 °C w świetle przez 16 godzin i w ciemności przez 8 godzin.
2. Po około 2 tygodniach ostrożnie przenieś sadzonki z granulkami torfu wokół ich korzeni do większych doniczek i kontynuuj wzrost w tych samych warunkach przez 4-5 tygodni w celu przeprowadzenia eksperymentów agroinfiltracji.
   UWAGA: Nie używaj roślin, gdy zaczną kwitnąć, ponieważ akumulacja GFP zmniejszy się na etapie kwiatostanu¹⁸.

2. Konstrukcja wektorowa

1. Użyj PCR, aby amplifikować interesujące sekwencje kodujące za pomocą polimerazy DNA Q5 o wysokiej wierności i sklonować je do wektora wejściowego pDONR207 za pomocą BP reaction¹⁹ przy użyciu dostępnego na rynku zestawu klonazy BP.
2. Przenieś docelowe geny w powstałych plazmidach wejściowych do wektora docelowego pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 za pomocą LR reaction¹⁹ przy użyciu dostępnego na rynku zestawu LR Clonase do produkcji plazmidów ze znacznikiem EGFP połączonym z C-końcem docelowych białek.
3. Zweryfikuj wszystkie konstrukcje za pomocą PCR i sekwencjonowania¹⁹.

3. Agroinfiltracja

1. Smuga Komórki Agrobacterium tumefaciens EHA105 zawierające różne wektory na płytkach agarowych LB i inkubowane przez 2 dni w temperaturze 28 °C.
2. Przenieść pojedynczą kolonię do 2 ml bulionu LB i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C z mieszaniem (250 obr./min).
3. Usunąć 1 ml z nocnej hodowli, a następnie dodać 4 ml świeżego bulionu LB i ponownie hodować przez 1 godzinę w tych samych warunkach.
4. Dostosować zawiesinę bakteryjną do OD₆₀₀ = 0,1 (OD₆₀₀ = 0,2 dla koekspresji dwóch białek) z buforem infiltracyjnym (MgCl₂, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
5. Wymieszać różne zawiesiny bakteryjne w stosunku 1:1 (v/v), aby uzyskać końcowe stężenie OD₆₀₀ = 0,1. (Opcjonalnie).
6. Zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny z delikatnym mieszaniem.
7. Naciekaj powierzchnię w pełni rozwiniętych liści różnych roślin za pomocą jednorazowej strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml i zaznacz infiltrowany obszar (ciemniejszy kolor niż otaczająca, nienaciekająca tkanka) wodoodpornym pisakiem.
8. Przejdź do sekcji Mikroskopia konfokalna tego protokołu (krok 5).
   UWAGA: Można również stosować inne szczepy Agrobacterium tumefaciens nadające się do przekształcania gatunków roślin będących przedmiotem zainteresowania.

4. Niebieska plama anilinowa

1. Dodać podwielokrotność 200 μl 1% błękitu anilinowego (w 50 mM buforze fosforanu potasu, pH 8,0) do szkiełka mikroskopowego²⁰.
2. Za pomocą ostrza należy wyciąć naciekany obszar w odległości około 0,5 cm × 0,5 cm od żyły i przenieść próbki tkanek liści do roztworu błękitu anilinowego (aosijalną stroną do góry) na szkiełku mikroskopowym i upewnić się, że próbki tkanek liści są zanurzone w roztworze błękitu anilinowego, a następnie przykryć je szkłem nakrywkowym (22 mm x 50 mm).
3. Umieścić szkiełka mikroskopowe z próbkami w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej i opróżniać przez 2 minuty (<0,8 Pa), a następnie powoli uwalniać ciśnienie i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Wizualizacja sygnału fluorescencyjnego błękitu anilinowego pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym za pomocą kompatybilnego oprogramowania.
   UWAGA: W tym przypadku zastosowano metodę barwienia błękitem anilinowym przez Huang et al.²⁰. W modyfikacji tej techniki, ten sam eksperyment przeprowadzono bez 2-minutowego kroku próżni, dając podobne wyniki i sugerując, że suszenie próżniowe nie jest niezbędne do barwienia aniliną. Również stężenie sinizny anilinowej i czas barwienia mogą się różnić w zależności od źródła tkanki liścia itp.

5. Mikroskopia konfokalna

1. Zbierz dwa liście z dwóch roślin w różnych punktach czasowych po infiltracji. Za pomocą ostrza przeciąć strefę infiltracji na około 0,5 cm × 0,5 cm plastry od żyły.
   1. Próbki tkanek umieścić w kropli sterylnej wody (aosijalną stroną do góry) w centralnej części szkiełka mikroskopowego i przykryć je szkłem nakrywkowym (22 mm x 50 mm), uważając, aby nie pozostały pęcherzyki.
2. Upewnij się, że długości fal wzbudzenia do wykrywania sygnałów CFP, GFP i RFP wynoszą odpowiednio 405 nm, 488 nm i 561 nm, a filtry emisyjne do wykrywania wynoszą 410-602 nm dla CFP i 400-602 nm dla EGFP i RFP, z otworkiem 1 AU i wzmocnieniem głównym ustawionym na 769 V.
3. Wizualizacja sygnału fluorescencyjnego znaczników autofluorescencyjnych w infiltrowanym obszarze za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z kompatybilnym oprogramowaniem po 1 dniu, 2 dniach, 3 dniach, 5 dniach, 7 dniach i 10 dniach po infiltracji.
   1. Użyj soczewki obiektywowej 10x i filtrów GFP, aby zlokalizować komórki z sygnałem fluorescencyjnym, a następnie przełącz się na soczewkę obiektywową 40x, aby zobaczyć lokalizację subkomórkową i rejestrować obraz.
4. Zbierz 20 obrazów dla każdego schorzenia, używając co najmniej dwóch niezależnych kontrprób biologicznych.
5. Oceń lokalizację PD badanego białka na podstawie diagnostycznego wyglądu punktowego sygnału na obrzeżach komórki^21,22.
   UWAGA: Podczas wykrywania subkomórkowej lokalizacji nieznanego białka zaleca się użycie co najmniej trzech roślin.

6. Analiza danych

1. Użyj oprogramowania Fiji, aby podzielić kanały i dodać pasek skali do obrazów w celu wizualizacji.
2. Użyj oprogramowania Fiji, aby podzielić kanały przed pomiarem średniej wartości skali szarości dla każdego obrazu, aby ocenić intensywność fluorescencji GFP (dla MP, PDCB1 i PDLP5) lub CFP (dla barwienia błękitem anilinowym) w różnych punktach czasowych.
3. Użyj oprogramowania Fidżi do podzielenia kanałów przed normalizacją obrazów GFP (dla MP, PDCB1 i PDLP5) lub CFP (dla barwienia błękitem anilinowym). Obszar obrazu został zmierzony, a punkty PD zostały policzone ręcznie. Obliczono liczbę PD puncta na 100^μm2.
4. Użyj dwukierunkowej ANOVA z wieloma porównaniami Tukey'a test²³, aby określić wartości P między różnymi próbkami i różnymi punktami czasowymi za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego.
   UWAGA: W przypadku jednokanałowego obrazu fluorescencyjnego wartość skali szarości każdego piksela reprezentuje intensywność fluorescencji tego point²⁴. W tym przypadku wykorzystano średnią wartość skali szarości do oceny intensywności fluorescencji każdej próbki w różnych punktach czasowych.

Results

Aby ułatwić badania funkcji PD w fizjologii roślin i interakcji z patogenami, opracowano trzy proste i niezawodne białka referencyjne do lokalizacji PD. Wybrano dwa komórkowe białka PD i białko MP pochodzące z patogenu, kodowane przez TVCV tobamowirusa roślinnego. Subkomórkową lokalizację tych białek uwidoczniono za pomocą autofluorescencyjnego reportera EGFP połączonego z C-końcem każdego białka. W alternatywnym podejściu, PD wizualizowano za pomocą barwienia błękitem anilinowym osadów kalozy związanych z PD. Eksperymenty wykazały, że zarówno PDLP5, jak i MP wykazywały punktową lokalizację PD, przy czym MP jest również zlokalizowane w jądrze komórkowym (Rysunek 1A), jak wcześniej wspomniano²⁵. W przeciwieństwie do tego, PDCB1 wydawał się dzielić między PD i ER (Rysunek 1A). Dla badaczy mniej doświadczonych w interpretacji subkomórkowej lokalizacji białek znakowanych GFP, Rysunek 1A ilustruje również charakterystyczny nukleocytoplazmatyczny wzór EGFP wyrażany w komórkach roślinnych. Aby potwierdzić sygnał ER PDCB1, poddaliśmy jednoczesną ekspresję PDCB1 z markerem ER i stwierdziliśmy, że sygnał PDCB1 nakładał się na sygnał markera ER (Rysunek 1B). Aby ocenić skuteczność lokalizacji PD badanych białek, obliczono odsetek komórek wyrażających sygnał fluorescencyjny, które wykazywały lokalizację PD tego sygnału (tab. 1).

Dla identyfikacji lokalizacji subkomórkowej za pomocą białek referencyjnych, przydatne jest zrozumienie skali czasowej ekspresji białka referencyjnego i potencjalnych zmian jego lokalizacji. Rysunek 2 pokazuje taką kinetykę dla MP, PDLP5 i PDCB1, gdy same PD były wizualizowane przez barwienie na niebiesko aniliną. Zarówno MP, jak i PDLP5 zaczęły gromadzić się w PD już w ciągu jednego dnia po infiltracji (dpi), a akumulacja ta osiągnęła pozorne maksimum przy 2 dpi, pozostając stabilnym przez kolejne 5 dni, po czym intensywność sygnału zmniejszyła się, najprawdopodobniej z powodu degradacji białka. Przebieg w czasie sortowania subkomórkowego PDCB1 był bardziej złożony: dla pierwszych 3 dpi PDCB1 wykazywał porównywalnie silny sygnał ER, który prawie całkowicie przesłaniał lokalizację sygnału specyficznego dla PD, podczas gdy przy 5 dpi ten ostatni sygnał stał się bardziej wyraźny (Rysunek 2), choć w mniejszej liczbie komórek. Co ciekawe, pojawienie się wyraźnego wzorca lokalizacji PDCB1 PDCB1 po 5 dpi zbiegło się w czasie ze znacznie mniejszą liczbą komórek wykazujących sygnał EGFP (rysunek uzupełniający 1). W ten sposób PDLP5 i MP mogą funkcjonować jako białka referencyjne PD z niewielkim tłem w większości innych przedziałów komórkowych, z optymalnym oknem czasowym wizualizacji wynoszącym 2-5 dpi. Z drugiej strony PDCB1 nie jest tak odpowiedni jak marker PD.

Następnie sprawdzono, że markery PD zachowują swoją subkomórkową specyficzność lokalizacyjną w obecności innych białek PD. W tym celu MP-EGFP lub PDLP5-EGFP uległ jednoczesnej ekspresji z PD-localizing²⁶ MP innego wirusa roślinnego, wirusa mozaiki tytoniu (TMV) oznaczonego CFP. Rysunek 3 pokazuje, że w obu przypadkach białka o koekspresji wykazywały wyraźny wzorzec lokalizacji PD. Podobnie, specyficzne dla PD histologiczne barwienie błękitem anilinowym tkanek wykazujących ekspresję MP-EGFP lub PDLP5-EGFP nie wykryło zakłóceń w lokalizacji PD sygnałów EGFP i błękitu anilinowego (Figura 3).

Badania lokalizacji PD często korzystają z bardziej ilościowego oszacowania ogólnej ekspresji białka referencyjnego i sygnału PD. To podejście do kwantyfikacji jest zilustrowane na Rysunek 4 i Rysunek 5. W celu ilościowego określenia wyrażenia ogólnego zmierzono intensywność sygnału PDLP5 i MP. Oba białka wykazywały silne sygnały we wszystkich punktach czasowych wizualizacji w okresie 10 dpi, z maksymalną intensywnością sygnału na poziomie 3 dpi dla PDLP5 i 2 dpi dla MP (Rysunek 4). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w intensywności sygnału pomiędzy PDLP5 a MP w żadnym z punktów czasowych wizualizacji. Intensywność sygnału PDCB1 wykazywała większe wahania między punktami czasowymi, przy czym najsilniejszy sygnał zaobserwowano przy 7 dpi (Rysunek 4), chociaż trudno było zebrać statystycznie istotne dane w tym momencie ze względu na niedobór ekspresji komórek. Zatem pierwsze 3 dpi reprezentują optymalny czas do wykrywania ekspresji PDCB1. Zgodnie z oczekiwaniami, próbki barwienia błękitem anilinowym wykazywały bardziej stabilny sygnał niż białka o przejściowej ekspresji (Rysunek 4).

Następnie określono ilościowo punkty PD utworzone przez PDLP5 i MP. PDLP5 wykazał stabilną liczbę punktów PD w całym okresie obserwacji, bez statystycznie istotnych różnic między dowolnymi dwoma badanymi punktami czasowymi (Rysunek 5). Największą liczbę punktów PD utworzonych przez MP wykryto przy 2 dpi i pozostały one względnie stabilne do końca okresu obserwacji. Porównanie liczby punktów PD między PDLP5 i MP nie wykazało statystycznie istotnych różnic w większości okresów próbkowania (Rysunek 5). Liczba PD puncta wybarwionych błękitem anilinowym również pozostała stabilna, choć nieznacznie zmniejszyła się przy 10 dpi. Liczby PD puncta ozdobionych błękitem anilinowym, PDLP5 lub MP były do siebie podobne pod względem istotności statystycznej (Rysunek 5), zgodne ze swoistością PD tych markerów. Liczby punktów PD dla PDCB1 nie były analizowane, ponieważ we wcześniejszych punktach czasowych sygnał PD był przesłonięty przez sygnał ER, a w późniejszych punktach czasowych obserwowano go tylko w stosunkowo niewielu komórkach (patrz Rysunek 2).

Rysunek 1: Lokalizacja plazmodesmatów (PD) TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 przejściowo eksprymowanych w Nicotiana benthamiana i barwienie niebieskim anilinowym PD. (A) Lokalizacja PD MP-EGFP, PDLP5-EGFP i PDCB1-EGFP oraz barwienie aniliną. Sygnał EGFP jest w kolorze zielonym, niebieski sygnał anilinowy jest w kolorze niebieskim, a autofluorescencja plastydów jest w kolorze czerwonym. (B) Koekspresja MP-EGFP, PDLP5-EGFP i PDCB1-EGFP z markerem retikulum endoplazmatycznego (ER) oznaczonym mRFP. Obrazy zostały zarejestrowane 2 dni po infiltracji (dpi) i są pojedynczymi przekrojami konfokalnymi reprezentatywnymi dla dwóch niezależnych eksperymentów (N = 20 obrazów z 2 roślin). Sygnał EGFP jest w kolorze zielonym, sygnał mRFP jest w kolorze fioletowym, a autofluorescencja plastydów jest w kolorze czerwonym. Żółte strzałki wskazują PDCB1 zlokalizowany w ER. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przebieg czasowy lokalizacji PD TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 przejściowo wyrażonych u Nicotiana benthamiana oraz barwienia niebieskim anilinowym PD. Obrazy zarejestrowano w rozdzielczości 2 dpi i są to pojedyncze sekcje konfokalne reprezentatywne dla dwóch niezależnych eksperymentów (N = 20 obrazów z 2 roślin dla wszystkich systemów, z wyjątkiem 7 dpi i 10 dpi dla PDCB1-EGFP, w których mniej komórek wykazywało sygnał). Sygnał EGFP jest w kolorze zielonym, a sygnał niebieski anilinowy jest w kolorze niebieskim. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: TVCV MP i PDLP5 zachowują swoją lokalizację PD po koekspresji z TMV MP zlokalizowanym PD i współbarwieniu z błękitem anilinowym. Obrazy zostały zarejestrowane w rozdzielczości 2 dpi i są pojedynczymi przekrojami konfokalnymi reprezentatywnymi dla N ≥ 10 obrazami z 4-6 roślin. Sygnał EGFP jest w kolorze zielonym, sygnał CFP i niebieski sygnał anilinowy są w kolorze niebieskim, a autofluorescencja plastydów jest w kolorze czerwonym. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przebieg w czasie intensywności fluorescencji TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 przejściowo wyrażonej w barwieniu Nicotiana benthamiana i błękitu anilinowego PD. Dane ilościowe zostały zebrane z eksperymentów opisanych w Rysunek 2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej z wielu eksperymentów. Poszczególne punkty danych są wskazywane jako średnia dla każdego pomiaru. Różnice między średnimi wartościami ocenianymi za pomocą dwukierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya są statystycznie istotne dla wartości P. *P < 0,05, **P < 0,01 oraz ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, nieistotne statystycznie. Niebieskie paski, barwienie anilinowe; jasnozielone paski, MP-EGFP, ciemnozielone paski, PDLP5-EGFP; żółte paski, PDCB1-EGFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przebieg czasowy powstawania PD puncta przez TVCV MP i PDLP5 przejściowo wyrażony u Nicotiana benthamiana oraz przez barwienie PD na niebiesko anilinowe. Dane ilościowe zostały zebrane z eksperymentów opisanych w Rysunek 2. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe średniej z wielu eksperymentów. Poszczególne punkty danych są wskazywane jako średnia dla każdego pomiaru. Różnice między średnimi wartościami ocenianymi za pomocą dwukierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya są statystycznie istotne dla wartości P. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Niebieskie paski, barwienie anilinowe; jasnozielone paski, MP-EGFP, ciemnozielone paski, PDLP5-EGFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt. punktu punktu

	Eksperyment I
	Łączna liczba komórek	Komórki z lokalizacją PD	Ogniwa o sygnale mieszanym	Komórki z lokalizacją PD (%)
Błękit anilinowy	Rozdział 40	Rozdział 40	4	100
MP-EGFP (Parlamentarz Europejski)	Rozdział 40	Rozdział 40	4	100
PDCB1-EGFP (Biblioteka PDCB1-EGFP)	Rozdział 40	3	38 Rozdział 38	7,5
PDLP5-EGFP	Rozdział 40	Rozdział 40	0	100
	Eksperyment II
	Łączna liczba komórek	Komórki z lokalizacją PD	Ogniwa o sygnale mieszanym	Komórki z lokalizacją PD (%)
Błękit anilinowy	Rozdział 40	Rozdział 40	8	100
MP-EGFP (Parlamentarz Europejski)	Rozdział 40	39 Rozdział 39	8	97,5
PDCB1-EGFP (Biblioteka PDCB1-EGFP)	Rozdział 40	12	Rozdział 31	Rozdział 30
PDLP5-EGFP	Rozdział 40	39 Rozdział 39	cyfra arabska	97,5

Tabela 1: Efektywność lokalizacji PD.

Rysunek uzupełniający 1: Lokalizacja PD TVCV MP, PDLP5 i PDCB1 przejściowo wyrażona u Nicotiana benthamiana. Obrazy były rejestrowane w rozdzielczości 5 dpi (A), 7 dpi (B) i 10 dpi (C). Sygnał EGFP jest zielony, a autofluorescencja plastydu jest czerwona. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Wszelkie badania biologiczne komórek dotyczące komunikacji międzykomórkowej roślin i transportu między komórkami podczas normalnego rozwoju i morfogenezy roślin, a także podczas interakcji roślina-patogen, wymagają wykrywania i monitorowania sortowania białek - zarówno endogennych, jak i kodowanych przez patogen - z roślinnymi połączeniami międzykomórkowymi, plazmodesmatami (PD). Eksperymenty te byłyby znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu białek referencyjnych, zarówno endogennych, jak i pochodzących od patogenów, które wiernie i konsekwentnie lokalizują się w PD, dekorując i wizualizując te struktury. Potrzeba ta została zaspokojona poprzez wybór trzech znanych białek lokalizujących chorobę Parkinsona: Arabidopsis PDLP5 i PDCB1 oraz MP z patogenu tobamowirusowego TVCV. Białka te zostały oznaczone na ich końcach C za pomocą autofluorescencyjnego reportera EGFP, a zdolność powstałych białek fuzyjnych do sortowania do PD określono po ich przejściowej ekspresji w liściach Nicotiana benthamiana i analizach mikroskopii konfokalnej tkanek wykazujących ekspresję. Do ogólnej wizualizacji PD w tych tkankach zastosowano standardową metodę barwienia błękitem anilinowym.

Uważa się, że wirusy roślinne MP dzielą się na dwie główne grupy ze względu na ich wpływ na strukturę i integralność PD: MP, które zwiększają przepuszczalność PD odwracalnie i bez żadnych zmian strukturalnych w PD oraz MP, które bramują PD poprzez modyfikację swojej struktury. Wirusy tobamowirusów, takie jak TVCV, należą do pierwszej grupy MP, co pozycjonuje je jako atrakcyjne markery PD do badań nad lokalizacją subkomórkową^27,28.

Eksperymenty te umieściły PDLP5-EGFP i MP-EGFP jako wiarygodne i powtarzalne markery biologiczne choroby Parkinsona, ze skutecznością wykrywania PD porównywalną ze skutecznością niebieskiego barwnika anilinowego. Lokalizacja PDLP5-EGFP i MP-EGFP w PD została wykryta przez cały okres obserwacji wynoszący 10 dpi, z optymalnym czasem obserwacji charakterystycznego wzorca lokalizacji PD między 2 dpi a 3 dpi. Chociaż ekspresja z promotora 35S może powodować potranskrypcyjne wyciszenie ekspresji genu, często występuje to po długotrwałej ekspresji w stabilnie przekształconych roślinach transgenicznych. Z drugiej strony, zastosowanie tego silnego promotora konstytutywnego jest ważne dla łatwego wykrycia białka markerowego. Jeżeli ekspresja białka referencyjnego spada po 7-10 dpi, należy stosować krótsze okresy, tj. 2-3 dpi. Nie wykryto tutaj istotnych różnic w ogólnym wzorcu lokalizacji subkomórkowej między PDLP5 i MP, z wyjątkiem tego, że MP gromadził się w jądrze komórkowym oprócz PD. I odwrotnie, PDCB1 nie jest zalecany do stosowania jako marker PD per se ze względu na złożoność jego subkomórkowego wzorca lokalizacji, który obejmuje znaczną lokalizację do ER.

Łatwość wykrywania sygnału fluorescencji EGFP zależała również od etapu wzrostu rośliny; w szczególności u N. benthamiana najniższą akumulację sygnału EGFP odnotowano w stadium^{kwiatostanu 18}.

Badanie to miało na celu opracowanie markerów lokalizacji PD maksymalnie wyłącznych dla innych przedziałów subkomórkowych. W związku z tym ich zastosowanie jako referencji do lokalizacji białek będących przedmiotem zainteresowania z dodatkowymi zdolnościami lokalizacji subkomórkowej powinno być połączone z ekspresją innych markerów subkomórkowych, takich jak te specyficzne dla ER, mitochondriów, błony plazmatycznej itp. W takim przypadku włączenie dodatkowych komórek Agrobacterium do ekspresji tych markerów powinno być brane pod uwagę przy obliczaniu końcowego stężenia kultur agroinfiltracyjnych, tj. OD₆₀₀ w kulturach płynnych. Oczywiście koncentracja komórek i czas wzrostu roślin powinny być dostosowane do maksymalnej ekspresji i wykrywania wzorca lokalizacji PD u innych gatunków roślin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silnik 1-fazowy ABT AC	BRANDTECH&	nbsp; ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Kontrola zanieczyszczeń	CCI
Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymów	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymów	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	Oprogramowanie GraphPad Inc.
Zdjęcie J	Narodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Gatunek
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności	Krajowy organ wykonawczy	#M0491S