Artykuł metodologiczny

In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/67382

⸱

7 marca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Neurobiology Lab, National Centre for Cell Science, S.P. Pune University Complex, 2Regional Centre for Biotechnology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodologię rekapitulacji upośledzonej neurogenezy zespołu Downa (DS) przy użyciu ludzkich iPSC DS. W protokole zidentyfikowano dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzenia neurogenezy w zespole Downa. Stanowi solidną platformę do zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw nieprawidłowej neurogenezy związanej z ZD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół Downa (DS), spowodowany dodatkową kopią chromosomu 21, jest główną przyczyną niepełnosprawności intelektualnej. Jednym z kluczowych czynników przyczyniających się do tej niepełnosprawności intelektualnej jest upośledzona neurogeneza obserwowana od etapów płodowych. Aby zbadać te nieprawidłowości neurorozwojowe, cenny i istotny model stanowią indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) generowane przy użyciu komórek uzyskanych od pacjentów z ZD. W tym miejscu opisano kompleksowy protokół podsumowujący neurogenezę upośledzoną przez ZS obserwowaną w stadiach płodowych ZD. Protokół ten wykorzystuje parę DS-hiPSC mających trzy kopie chromosomu 21 i jego izogeniczne euploidalne hiPSC mające dwie kopie chromosomu 21. Co ważne, opisany tutaj protokół podsumowuje neurogenezę upośledzoną przez DS i stwierdza, że dwufazowy defekt cyklu komórkowego, tj. zmniejszona proliferacja nerwowych komórek progenitorowych DS (NPC) we wczesnej fazie stadium neurogennego, a następnie zwiększona proliferacja NPC DS w późnej fazie stadium neurogennego jest przyczyną upośledzonej neurogenezy DS. Zwiększona proliferacja DS NPC w późnej fazie neurogennej prowadzi do opóźnionego wyjścia z cyklu komórkowego, powodując zmniejszone wytwarzanie neuronów postmitotycznych z NPC DS. Protokół ten zawiera szczegółowe kroki dotyczące utrzymania hiPSC, ich różnicowania w linie nerwowe wykazujące dwufazowy defekt cyklu komórkowego w stadium neurogennym, a następnie walidacji zmniejszonego różnicowania neuronalnego w komórkach DS. Postępując zgodnie z tą metodologią, naukowcy mogą stworzyć solidny system eksperymentalny, który naśladuje neurorozwojowe warunki DS, umożliwiając im zbadanie konkretnych zmian w rozwoju mózgu spowodowanych trisomią 21.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół Downa (DS), czyli trisomia 21, jest najczęstszą nieprawidłowością chromosomalną i główną przyczyną niepełnosprawności intelektualnej (ID)1. Upośledzona neurogeneza podczas rozwoju płodu z ZD jest jedną z przyczyn niepełnosprawności intelektualnej w DS2. Badania płodu u ludzi wykazały zmniejszenie masy i objętości mózgu, zmniejszenie liczby neuronów, zwiększenie liczby astrocytów3,4 oraz nieprawidłowy rozkład neuronów w warstwach II i IV5,6. Dodatkowo, druga faza rozwoju kory mózgowej, tj. pojawienie się laminacji, jest zarówno opóźniona, jak i zdezorganizowana w DS7.

Defekty neurorozwojowe w DS były badane głównie przy użyciu mysich modeli DS, takich jak Ts65Dn, Ts1Rhr i Ts1cje8. Jednak te modele myszy nie były w stanie w pełni podsumować różnych fenotypów obserwowanych w badaniach DS ze względu na fizjologiczne i rozwojowe różnice między myszami a ludźmi9, co doprowadziło do nieudanych badań klinicznych10. Wynalezienie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych11,12 dało możliwość modelowania zaburzeń neurologicznych zespołu Downa przy użyciu komórek pochodzących bezpośrednio od osób z ZD. Jednak wcześniejsze próby modelowania wad neurorozwojowych DS przy użyciu ludzkich iPSC spotkały się z niespójnymi wynikami i nie mogły w pełni wyjaśnić wad neurorozwojowych obserwowanych w sekcjach mózgu płodu DS13,14,15,16. Na przykład raport opublikowany przez Shi i wsp. znalazł fenotypy związane z chorobą Alzheimera, ale nie wykazał różnicy w neurogenezie DS w porównaniu z kontrolami euploidalnymi15. Podobnie, Weick i wsp. zgłosili zmniejszoną aktywność synaptyczną, ale normalną neurogenezę w DS w porównaniu z kontrolami euploidalnymi16. Jednak prawidłowa neurogeneza w ZD opisana w tych publikacjach nie była zgodna z obserwacją z odcinków mózgu płodu DS. Późniejszy raport Hibaoui i wsp. donosił o zmniejszonej neurogenezie w DS, co było zgodne z obserwacją z sekcji mózgu płodu DS14. Jednak ten raport i inny niedawny raport opisały zmniejszoną proliferację NPC DS jako przyczynę zmniejszonej neurogenezy w DS14,17. Jednak tylko zmniejszona proliferacja NPC DS nie może wyjaśnić zwiększonej liczby komórek astroglejowych i opóźnionego pojawiania się laminacji podczas rozwoju mózgu płodu DS.

W ostatnio opublikowanej pracy, opracowano model neurogenezy upośledzonej przez DS u u ludzi, który wykazał zmniejszoną neurogenezę. Model ten wykazał, że upośledzona neurogeneza w ZD jest spowodowana dwufazowymi defektami cyklu komórkowego na etapie neurogennym (etap, podczas którego neuronalne komórki progenitorowe są generowane z pluripotencjalnych komórek macierzystych). W pierwszej fazie w stadium neurogennym NPC DS wykazują zmniejszoną proliferację w porównaniu z izogenicznymi euploidalnymi komórkami nerwowymi, a następnie zwiększoną proliferację NPC DS w porównaniu z izogenicznymi komórkami euploidalnymi w późnej fazie stadium neurogennego18.

W tym manuskrypcie opisano krok po kroku szczegółowy protokół różnicowania hiPSC zespołu Downa i jego izogenicznych euploidalnych hiPSC w neurony korowe. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku protokołu różnicowania pary hiPSC DS i jego izogenicznych euploidalnych hiPSC w neurony korowe, ze szczególnym uwzględnieniem modelowania defektów neurogenezy związanych z DS. Protokół ten ma na celu zaoferowanie solidnego i powtarzalnego systemu do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw nieprawidłowości powodujących neurogenezę upośledzoną przez DS.

Uzasadnieniem dla rozwoju tego protokołu jest umożliwienie różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony korowe poprzez wykorzystanie zasad neurobiologii rozwojowej, co pozwala na identyfikację fenotypów, które powstają w wyniku choroby/zaburzenia. Jego celem było przyjęcie minimalistycznego podejścia do różnicowania neuronalnego iPSC poprzez unikanie związków takich jak cAMP lub DAPT, które mogą maskować fenotypy chorobowe powstające w wyniku defektów odpowiednio w kanale Ca++ lub szlaku NOTCH. Podobnie unikano stosowania kwasu askorbinowego, BDNF i GDNF, które mogą maskować inne fenotypy związane z chorobami neurologicznymi poprzez nasilanie neurogenezy.

Przewaga tej techniki nad alternatywnymi metodami polega na dostarczeniu solidnej rekapitulacji neurologicznych fenotypów obserwowanych w sekcjach mózgu płodu DS. Warto zauważyć, że w porównaniu z modelami mysimi, ludzki system oparty na iPSC eliminuje różnice międzygatunkowe, zapewniając bardziej odpowiedni model do badania procesów neurorozwojowych specyficznych dla człowieka9, ale do tej pory nie udało mu się podsumować upośledzonej neurogenezy DS obserwowanej w stadiach płodowych DS. Co więcej, zastosowanie izogenicznych par hiPSC zmniejsza zmienność i zwiększa wiarygodność obserwowanych różnic fenotypowych. Protokół ten będzie szczególnie interesujący dla naukowców zajmujących się zaburzeniami neurorozwojowymi i neurogenezą człowieka. Jest to szczególnie istotne dla osób dążących do modelowania specyficznych dla człowieka aspektów ZD lub zainteresowanych opracowywaniem interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na defekty neurogenezy związane z trisomią 21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został zastosowany z dwiema parami zespołu Downa i jego izogenicznymi euploidalnymi ludzkimi iPSC. Jedna para została wygenerowana przy użyciu metody dostarczania za pośrednictwem retrowirusa reprogramming19, a druga para (NSi003-A i NSi003-B) została wygenerowana przy użyciu nieintegrującej metody dostarczania wirusa Sendai20. Protokół zasadniczo składa się z dwóch etapów: etapu neurogennego (etap 1) i etapu różnicowania neuronalnego (etap 2). Ponadto w stadium neurogennym obserwuje się dwie fazy oparte na różnicach w proliferacji zespołu Downa i izogennych euploidalnych linii komórkowych, tj. fazę wczesną i późną. Szczegółowe informacje na temat odczynników, pożywek i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla i utrzymanie hiPSC zespołu Downa oraz izogeniczne euploidalne hiPSC

  1. Poszycie podajnika dla hiPSCs
    UWAGA: Jakość i gęstość karmnika są niezwykle ważne dla dobrej jakości hodowli ludzkich iPSC.
    1. Dodać 2 ml 0,1% żelatyny, aby pokryć 6-dołkową płytkę przez co najmniej 1-2 godziny w temperaturze 37 °C przed wysiewem z komórkami zasilającymi.
    2. Płytkę pokrytą żelatyną należy przechowywać w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.
    3. Ciepłe mysie pożywki z fibroblastami embrionalnymi (MEF) do stosowania do odrodzenia w kąpieli perełkowej/kąpieli wodnej.
    4. Porcjować 5 ml pożywki MEF do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    5. Wyjąć fiolkę z komórkami zasilającymi ze zbiornika ciekłego azotu (zbiornik LN2).
      UWAGA: Komórki karmicielskie uzyskano przez traktowanie mysich fibroblastów embrionalnych E13.5 10 μg / ml mitomycyny C przez 3 godziny, a następnie 2-3 razy płukanie DPBS18. Ogniwa zasilające mogą być używane bezpośrednio lub zamrożone w zbiorniku LN2 do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie myszy wykorzystano po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt.
    6. Przechowywać fiolkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej za pomocą pływającego rusztu, aż pozostanie mały kawałek lodu.
    7. Weź fiolkę do szafki bezpieczeństwa biologicznego i wysterylizuj ją alkoholem przed włożeniem do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    8. Dodawać kroplą 1 ml ciepłej pożywki MEF (patrz tabela materiałów).
    9. Delikatnie wyjąć pożywkę z fiolki i wlać kropla po kropli do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej pożywkę MEF.
    10. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g.
    11. Zassać supernatant za pomocą systemu aspiracji próżniowej (VAS).
    12. Dodaj 1 ml pożywki MEF i delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-4 razy.
    13. Weź liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Martwe komórki wykluczono za pomocą błękitu trypanowego.
    14. Płytka 3,1-3,3 x 105 żywych komórek zasilających na dołek płytki 6-dołkowej lub 2 x 106 komórek na płytkę 6-dołkową w pożywce MEF.
    15. Przechowywać płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przy wilgotności 85% przez noc. Potrząśnij płytką wewnątrz inkubatora CO2 przód-tył i boki 2-3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek zasilających.
  2. Odrodzenie hiPSC zespołu Downa i izogennych euploidalnych hiPSC
    UWAGA: Podgrzej wymaganą objętość pożywki hiPSC w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 °C.
    Pożywka dla ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC): Świeżo dodaj 25 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i inhibitora 10 μM Rock (RI) (Y-27632 2HCl) w pożywce hiPSC.
    1. Dobrze usuń pożywkę MEF z karmników i przepłucz je jednym myciem, delikatnie dodając 1 ml / studzienkę ciepłego DMEM / F12 z boków studzienki. Odessać pożywkę i dodać 2 ml / dobrze ogrzaną pożywkę ożywiającą hiPSC. Pozostawić płytkę w inkubatorze na co najmniej 2 godziny przed posiewem hiPSC.
    2. Wyjmij fiolkę z hiPSC.
    3. Przechowywać fiolkę na pływającym ruszcie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie mały kawałek lodu.
    4. Przed umieszczeniem fiolki w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy ją wysterylizować 70% alkoholem.
    5. Dodaj 1 ml ciepłej pożywki hiPSC.
    6. Delikatnie wyjąć pożywkę z fiolki i wlać kropla po kropli do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 5 ml pożywki ożywiającej hiPSC.
    7. Wirować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przy 100 x g.
    8. Odessać supernatant za pomocą VAS i usunąć osad, delikatnie stukając w rurkę.
    9. Wlać 500 μl pożywki hiPSC z 10 μM RI i zalać płytką podającą zawierającą pożywkę ożywiającą hiPSC. Oznacz tabliczkę nazwą komórki, numerem przejścia, nazwiskiem badacza i datą.
    10. Obserwuj kolonie hiPSC pod odwróconym mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu; powinny być tam skupiska komórek.
    11. Trzymając płytkę w inkubatorzeCO2, potrząśnij płytką przód-tył i boki 2-3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek. Nie naruszaj płyty przez 24 godziny.
    12. Następnego dnia niektóre kolonie mogą wyglądać na przylegające do karmników, a niektóre będą pływać. Nie odsysając żadnej pożywki, dodać świeżą pożywkę hiPSC uzupełnioną 25 ng/ml bFGF i 10 μM RI.
    13. Na drugi dzień po przebudzeniu większość kolonii była przyczepiona do powierzchni. Zamień kompletną pożywkę na pożywkę hiPSC z 25 ng/ml bFGF. W kolejnych dniach będą widoczne kolonie hiPSC.
      UWAGA: HiPSC potrzebują co najmniej tygodnia, aby się ożywić i utworzyć kolonie z gładkimi, dobrze zdefiniowanymi granicami, jednolitą morfologią komórek i gęstym centrum kolonii.
  3. Pasażowanie hiPSC zespołu Downa i izogeniczne euploidalne hiPSC na karmnikach
    UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być ciepłe przed rozpoczęciem. Należy unikać nadmiernego pipetowania komórek. Z komórkami obchodzić się bardzo delikatnie.
    1. Przejście hiPSC gdy większość kolonii zaczyna łączyć się ze sobą lub gdy pojawia się zbyt wiele zróżnicowanych kolonii. Ogólnie rzecz biorąc, rozłupywanie należy wykonać w ciągu 5-7 dni po pierwszym pasażu.
    2. Ożyw fiolkę z karmnikami na dzień przed podziałem.
    3. Podać jedno przemycie do karmników 1 ml / studzienkę ciepłego DMEM / F12 i dodać 2 ml / studzienkę ciepłej pożywki hiPSC uzupełnionej 25 ng / ml bFGF. Pozostawić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na co najmniej 2 godziny przed posiewem hiPSC.
    4. Obserwować płytkę z hiPSC pod kątem zróżnicowanych kolonii i usunąć zróżnicowaną kolonię, złomując ją za pomocą pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem stereoskopowym.
    5. Wykonać jedno przemycie hiPSC 1 ml/dobrze ciepły DMEM/F12.
    6. Wlać 1 ml/dołek 1 mg/ml roztworu kolagenazy. Trzymaj płytkę w inkubatorze przez 8-10 minut, a następnie obserwuj pod odwróconym mikroskopem luźne krawędzie kolonii.
    7. Odessać kolagenazę i podać 2 płukania DMEM/F12. Następnie dodać 1 ml/dołek hiPSC Medium.
    8. Delikatnie pokrój kolonie poziomo i pionowo 8-10 razy w dołku za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 2 ml. Obserwuj kolonie pod odwróconym mikroskopem, aby sprawdzić, czy większość kolonii została przycięta do odpowiedniego rozmiaru.
    9. Jeśli kolonie są wystarczająco pocięte, delikatnie podnieś je za pomocą podnośnika komórkowego.
    10. Delikatnie odpipetuj kolonie w studzience za pomocą końcówki o pojemności 1 ml, 5-8 razy, w zależności od wielkości kolonii.
    11. Zebrać wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przy 100 x g.
    12. Delikatnie odessać supernatant za pomocą pipety, usunąć osad komórkowy, delikatnie stukając w probówkę, a następnie dodać 200 μl pożywki hiPSC z 25 ng/ml bFGF i 10 μM RRI. Odpipetować 2-3 razy pipetą o pojemności 200 μl i dodać 300 μl więcej pożywki hiPSC z 25 ng/ml bFGF i 10 μM RRI.
    13. Teraz delikatnie umieść te komórki na podajnikach zawierających pożywkę hiPSC + 25 ng / ml bFGF. Jedną studzienkę można podzielić na 1:2 lub 1:3, w zależności od liczby kolonii obecnych po usunięciu zróżnicowanych kolonii. Oznacz tabliczkę nazwą komórki, numerem przejścia, nazwiskiem badacza i datą.
    14. Trzymając płytkę w inkubatorzeCO2, potrząśnij płytką przód-tył i boki 2-3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek.
    15. Następnego dnia delikatnie przemyj ciepłym DMEM/F12 i dodaj 2,5 ml pożywki hiPSC z 25 ng/ml bFGF.
  4. HiPSC zespołu Freezing Downa i izogeniczne euploidalne hiPSC z karmników
    UWAGA: Podczas procedury zamrażania należy unikać nadmiernego pipetowania ludzkich iPSC.
    1. Podziel hiPSC, gdy są jeszcze w fazie logarytmicznej, tj. 4-5 dni po przejściu.
    2. Obserwować płytkę z hiPSC pod kątem zróżnicowanych kolonii i usunąć zróżnicowane kolonie za pomocą pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem stereoskopowym.
    3. Wykonać jedno przemycie hiPSC 1 ml/dobrze ciepły DMEM/F12.
    4. Dodać 1 ml/dołek 1 mg/ml roztworu kolagenazy. Trzymaj płytkę w inkubatorze przez 8-10 minut, a następnie obserwuj pod odwróconym mikroskopem w celu podniesienia krawędzi kolonii.
    5. Odessać kolagenazę i podać 2 płukania DMEM/F12. Następnie dodać 1 ml/dołek hiPSC Medium.
    6. Delikatnie podnieś kolonie za pomocą podnośnika komórkowego.
    7. Delikatnie odpipetuj kolonie w studzience za pomocą końcówki o pojemności 1 ml 5-8 razy, w zależności od wielkości kolonii.
    8. Zebrać wszystkie komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty przy 100 x g.
    9. Delikatnie odessać supernatant za pomocą pipety, usunąć osad komórkowy, delikatnie stukając w probówkę, i dodać 1 ml pożywki hiPSC bez antybiotyku uzupełnionej 25 ng/ml bFGF zgodnie z liczbą dołków. Dozuj komórki do kriowialiów.
    10. Dodaj pożywkę hiPSC bez antybiotyku uzupełnioną 25 ng / ml bFGF i 20% DMSO do kriowialiów, aby uzyskać 10% końcowe stężenie DMSO.
    11. Umieść kriowiale w mroźnym pomieszczeniu z kąpielą izopropanolową, aby zapewnić powolne zamrażanie.
    12. Przechowywać mróz w temperaturze -80 °C przez noc. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika LN2.

2. Różnicowanie neuronalne

UWAGA: Przygotowanie pożywki kondycjonowanej przez pożywkę (FCM): Użyj kolby T-75 i płytki 4 x 106 komórek podajnika na kolbę. Następnego dnia dodaj 40 ml pożywki hiPSC z 4 ng/ml bFGF. Zbieraj przez 7 dni. Probówkę należy przechowywać codziennie w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca. Posmaruj 15-centymetrowe naczynie 10 ml 0,1% żelatyny w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny przed dysocjacją komórek. Pokryj 6-dołkową płytkę matrycą błony podstawnej kwalifikowaną do hESC (zwaną dalej "kwalifikowaną matrycą") na 1 dzień przed dysocjacją komórek. Podczas dysocjacji komórek w całym protokole dodaj 10 μM RI do roztworu do odłączania komórek (patrz tabela materiałów), DPBS i pożywki galwanicznej (FCM uzupełniony 25 ng / ml bFGF). Przygotuj świeżą pożywkę kondycjonowaną w podajniku (FCM) dla każdego różnicowania. Należy unikać nadmiernego pipetowania hiPSC.

  1. Dzień In vitro (DIV) 2: Tworzenie pojedynczych komórek i wysiewanie hiPSC w celu neuroróżnicowania
    1. Dodaj 10 μM RI do pożywki hiPSC uzupełnionej 25 ng / ml bFGF, DPBS, roztworem do odrywania komórek i pożywką kondycjonowaną przez zasilacz uzupełnioną 25 ng / ml bFGF. Ogrzać wszystkie te odczynniki w temperaturze 37 °C.
    2. Weź 6-dołkową płytkę iPSC na karmnikach, usuń zróżnicowane kolonie i dodaj świeże podłoże hiPSC uzupełnione 25 ng / ml bFGF i 10 μM RI. Przechowywać płytkę przez 2 godziny w inkubatorze.
    3. Po 2 godzinach wyjąć płytkę iPSC i przemyć ją jednym roztworem DPBS bez Ca++ i Mg++.
    4. Dodać 1 ml/studzienkę roztworu do odrywania komórek (+ 10 μM RRI) i trzymać płytkę w inkubatorze CO2 przez 12-14 minut.
    5. Po 12-14 minutach obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem; większość komórek zaczyna odłączać się od płytki. Jeśli niektóre komórki nadal przylegają, delikatnie postukaj w płytkę z boków.
    6. Rozcieńczyć roztwór do odrywania komórek, dodając 3 ml / basenik DPBS z Ca++ i Mg++ (+ 10 μM RI). Używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie pipetuj 2-3 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków.
    7. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 40 μM.
    8. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    9. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g i delikatnie zassać pożywkę za pomocą VAS.
    10. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki hiPSC (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI). Umieść komórki na 0,1% pokrytym żelatyną naczyniu o średnicy 15 cm na 1,5 godziny, aby usunąć karmniki, ponieważ karmniki mają preferowaną przyczepność do powierzchni pokrytej żelatyną w porównaniu z hiPSC.
    11. Po 1,5 h delikatnie zebrać pożywkę z komórkami i odwirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g. Zasysać pożywkę za pomocą VAS.
    12. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml FCM (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI) i pobrać liczbę komórek.
    13. Używając FCM (+ 25 ng / ml bFGF + 10 μM RI), wykonaj zawiesinę komórek 30 000-50 000 komórek/ml i zasiew 5 ml zawiesiny komórek/płytkę 60 mm lub 2 ml / dołek płytki 6-dołkowej lub 500 μl / dołek płytki 24-dołkowej. Płyty powinny być pokryte kwalifikowaną matrycą (patrz Tabela Materiałów).
  2. DIV 0: (~48 h później): Zmień pożywkę kondycjonowaną przez podajnik na pożywkę NPC (DDM + B27 bez witaminy A + N2) (patrz Tabela materiałów).
  3. DIV 2: Dodaj pożywkę NPC z 0,125 μM Dorsomorphin co drugi dzień do DIV 18.
  4. DIV 18: Dodaj pożywkę NPC bez Dorsomorphiny i uzupełniaj co drugi dzień aż do DIV 28.
  5. DIV 28-30: Tworzenie pojedynczych komórek i rozsiewanie NPC dla Etapu 2
    1. Na DIV 28 wyjmij płytkę (zawierającą NPC) i zastąp ją nośnikiem NPC (+ 10 μM RI). Umieść płytkę w inkubatorze CO2 na 2 godziny.
    2. Po 2 godzinach odessać pożywkę i przepłukać ją jednym roztworem DPBS (bez Ca++ i Mg++).
    3. Dodać 1 ml/studzienkę roztworu do odrywania komórek (+ 10 μM RRI) i trzymać płytkę w inkubatorze przez 14 minut.
    4. Po 14 minutach obserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym pod kątem 4x. Większość komórek zaczyna odłączać się od płytki. Jeśli niektóre komórki nadal przylegają, delikatnie postukaj w płytkę z boków.
    5. Rozcieńczyć roztwór do oddzielania komórek, dodając 3 ml / basenik DPBS z Ca++ i Mg++ (+ 10 μM RI). Używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie pipetuj 2-3 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków.
    6. Przepuścić przez sitko o pojemności 40 μM umieszczone na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    7. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 200 x g. Delikatnie zassać pożywkę za pomocą VAS.
    8. Ponownie zawiesić komórki w DDM + B27 z witaminą A (+ 10 μM RRI).
    9. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego z hemocytometrem.
    10. Wysiewaj 50 000 komórek/studzienkę na kwalifikowanej płytce pokrytej matrycą (1x) z płytki 48-dołkowej.
  6. DIV 33: Zmiana pożywki na pożywkę różnicującą neurony (patrz Tabela materiałów). Zmieniaj podłoże co 5 dni. Uzupełniaj nośniki do DIV 85/90.

3. Immunocytochemia (ICC)

UWAGA: Dodaj wystarczająco dużo buforu na wszystkich etapach, aby pokryć komórki i uniknąć wysuszenia studzienki podczas zasysania podczas etapu mycia.

  1. Wyjąć zróżnicowaną płytkę komórkową poza obszar hodowli komórkowej.
  2. Odessać pożywkę i przepłukać DPBS.
  3. W celu utrwalenia dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) do komórek. Przykryj talerz folią aluminiową i umieść go na wytrząsarce kołyskowej w temperaturze 37 °C na 30 minut.
  4. Odessać PFA i wykonać trzy płukania DPBS przez 15 minut (bez Ca++ i Mg++).
  5. Dodać bufor blokujący (3% BSA + 5% surowicy osła (lub surowicy od zwierzęcia gospodarza przeciwciała drugorzędowego) + 0,2% Triton-X w DPBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać 250 μl/basenik przeciwciał pierwszorzędowych [Ki67 (rozcieńczenie 1:100), TUBB3 (rozcieńczenie 1:500), PAX6 (1:100)] i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce kołyskowej. Rozcieńczenie przeprowadzono w roztworze blokującym.
  7. Przemyć trzykrotnie DPBS po inkubacji przeciwciał pierwotnych.
  8. Dodać 250 μl/basenik przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego 1:250 w 3% BSA + 0,2% Triton-X w DPBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Przemyć 3 razy DPBS po wtórnej inkubacji przeciwciał.
  10. Dodać DAPI (1: 1000 rozcieńczenie 5 mg/ml bulionu w DPBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy za pomocą DPBS. Pozostaw ostatnie płukanie na płytce hodowlanej i obserwuj pod mikroskopem.

4. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w rozdzielczości 20x.
  2. Rejestruj obrazy Ki67, a także obrazy barwienia TUBB3 przy użyciu filtra wzbudzenia 540 nm, PAX6 przy użyciu filtra wzbudzenia 488 nm oraz obrazy DAPI przy użyciu filtra wzbudzenia 358 nm.
  3. Przechwytuj obrazy z dziesięciu różnych losowych pól do analizy.
  4. Analizuj obrazy ICC za pomocą oprogramowania ImageJ.
  5. W przypadku analizy TUBB3 i PAX6 należy wykonać progowanie wszystkich obrazów odpowiednio dla sygnałów czerwonego i zielonego oraz intensywności sygnału niebieskiego dla DAPI. Średnia intensywność czerwonych pikseli TUBB3 i zielonych pikseli PAX6 została znormalizowana średnią intensywnością niebieskich pikseli DAPI.
  6. W przypadku analizy Ki67 policz komórki za pomocą funkcji automatycznego liczenia komórek w oprogramowaniu ImageJ. Znormalizuj liczbę komórek Ki67-dodatnich liczbą komórek DAPI-dodatnich.
  7. Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego, porównując dwie grupy za pomocą niesparowanych testów t. Dane powinny być wyrażone jako średnia ± SEM z trzech niezależnych doświadczeń. Wartość p mniejsza niż 0,05 jest uważana za statystycznie istotną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedyncze ludzkie iPSC zostały umieszczone na kwalifikowanych naczyniach pokrytych matrycą jako zawiesiny jednokomórkowe, a różnicowanie zostało zainicjowane przez usunięcie bFGF. Aby zahamować różnicowanie nieektodermalne, dodano Dorsomorphinę, inhibitor sygnalizacji BMP, z DIV 2-1821. W celu dalszego różnicowania komórek progenitorowych od stadium neurogennego, zawiesiny pojedynczych komórek ponownie powlekano w niskiej gęstości na kwalifikowanej matrycy (Ryc. 1) przez dodat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisano skuteczny nieskierowany monowarstwowy protokół neuroróżnicowania kory mózgowej dla izogenicznej pary euploidalnych hiPSC i DS hiPSC. Ponieważ komórki są hodowane jako monowarstwy, są bardziej narażone na warunki hodowli, co nie jest możliwe w takim samym stopniu, jak użycie ciał embrionalnych do różnicowania iPSC, które są zwykle stosowane w innych protokołach14,16. Podczas gdy użyteczność systemów organoidowych rośnie, jednowarstwowy s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują prof. Stuartowi H. Orkinowi za dostarczenie nam pary zespołów Downa i izogennych euploidalnych hiPSC. Autorzy są również wdzięczni Narodowemu Centrum Nauk o Komórkach (BRIC-NCCS) w Pune za zapewnienie funduszy na przeprowadzenie tych prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< strong>MEF medium: < / strong>
DMEM o wysokiej glukozieGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% stężenie końcowe
Aminokwasy endogenneHyklonSH30238.011X stężenie końcowe
Penicylina / StreptomycynaHyklonSV300101X stężenie końcowe
β-MerkaptoetanolGibco21985-0231X stężenie końcowe
hiPSC średni:< / mocny>
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Zamiennik surowicy nokautującej (KOSR)Gibco10828-02820% stężenie końcowe
Aminokwasy endogenneHyclonSH30238.011X stężenie końcowe
GlutamaxGibco 350500611X stężenie końcowe
Hyklon penicyliny/streptomycynySV300101X stężenie końcowe
β-Merkaptoetanol (1000X)Gibco21985-0231X stężenie końcowe
DDM średni:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Aminokwasy endogenneHyclonSH30238.011X końcowe stężenie
GlutamaxGibco 350500611X stężenie końcowe
Penicylina/StreptomycynaHyklonSV300101X stężenie końcowe
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210,5 X 10% Albumax to stężenie końcowe
NPC podłoże:
DDM medium
N2 SuplementGibco 17502048stężeniu końcowym
(50X), bez witaminy AGibco 125870101X stężenie końcowe
Pożywka różnicowania neuronalnego (ND):
pożywka1/2 objętości
Pożywka neurobazalnaGibco 21103-0491/2 tomu
N2 SuplementGibco 175020480,5 X Stężenie końcowe
Suplement B-27 (50X)Gibco 175040440,5 X stężenie końcowe
GlutamaxGibco 350500611X pożywki neuropodstawowej
Hyklon penicyliny/streptomycynySV300101X pożywki neurobazalnej
przeciwciała i odczynniki do barwienia immunologicznego:
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, bez wapnia, bez magnezuSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 RoztwórSigma-AldrichX100-500ML0,20%
BSAHyclonA7979-50ML1,00%
Oczyszczona antytubulina β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 rozcieńczenie
Donkey anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, koniugat Alexa fluor 594Tech Invitrogen A21203Rozcieńczenie 1:250
Oczyszczona mysz anty-ludzka Ki67BD Pharmingen550609rozcieńczenie 1:100
Oczyszczony anty-PAX6BioLegends901302rozcieńczenie 1:100
Alexa fluor 488 Osioł (anty-królik)Life Tech Invitrogen A21206Rozcieńczenie 1:250
Roztwór DAPI (5 mg/ml)SigmaD95421:1000 rozcieńczenie
Inne
Roztwór do odrywania komórek (Accutase) Gibco A11105-01Gotowe do użycia roztwór roboczy
Inhibitor skał (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml stężenie końcowe
Dorsomorfina Sellechckem S73060,125 nM/ml stężenie końcowe
DPBS z wapniem i magnisium (DPBS+Ca, Mg)Gibco 14040133Gotowe do użycia rozwiązanie robocze
DPBS bez wapnia i magnisiumGibco 14190136Gotowy do użycia roztwór roboczy
Żelatyna Typ ASigma G2500-100G
Matryca membrany podstawnej z kwalifikacją 0,10%hESC (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg fiolka podstawowa rozcieńczona 1:240
Trypsyna 0,05%Gibco25300054
Błękit trypanowyGibco15250-0610,40%
Podstawowy czynnik wzrostu fibrabblastów (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml stężenie końcowe
Kolagenaza Gibco 17104-019Stężenie końcowe 1mg/ml
1X Suplement B-27 o DDM Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapman, R. S., Hesketh, L. J. Behavioral phenotype of individuals with Down syndrome. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 6 (2), 84-95 (2000).
  2. Haydar, T. F., Reeves, R. H. Trisomy 21 and early brain development. Trends Neurosci. 35 (2), 81-91 (2012).
  3. Wisniewski, K. E. Down syndrome children often have brain with maturation delay, retardation of growth, and cortical dysgenesis. Am J Med Genet Suppl. 7, 274-281 (1990).
  4. Guidi, S., et al. Neurogenesis impairment and increased cell death reduce total neuron number in the hippocampal region of fetuses with Down syndrome. Brain Pathol. 18 (2), 180-197 (2008).
  5. Lott, I. T. Neurological phenotypes for Down syndrome across the life span. Prog Brain Res. 197, 101-121 (2012).
  6. Stagni, F., Giacomini, A., Emili, M., Guidi, S., Bartesaghi, R. Neurogenesis impairment: An early developmental defect in Down syndrome. Free Radic Biol Med. 114, 15-32 (2018).
  7. Golden, J. A., Hyman, B. T. Development of the superior temporal neocortex is anomalous in trisomy 21. J Neuropathol Exp Neurol. 53 (5), 513-520 (1994).
  8. Gupta, M., Dhanasekaran, A. R., Gardiner, K. J. Mouse models of Down syndrome: Gene content and consequences. Mamm Genome. 27 (11-12), 538-555 (2016).
  9. Wu, Y., West, N. R., Bhattacharyya, A., Wiseman, F. K. Cell models for Down syndrome-Alzheimer's disease research. Neuronal Signal. 6 (1), NS20210054(2022).
  10. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. Am J Hum Genet. 103 (6), 829-857 (2018).
  11. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  12. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  13. Briggs, J. A., et al. Integration-free induced pluripotent stem cells model genetic and neural developmental features of Down syndrome etiology. Stem Cells. 31 (3), 467-478 (2013).
  14. Hibaoui, Y., et al. Modeling and rescuing neurodevelopmental defect of Down syndrome using induced pluripotent stem cells from monozygotic twins discordant for trisomy 21. EMBO Mol Med. 6 (2), 259-277 (2014).
  15. Shi, Y., et al. A human stem cell model of early Alzheimer's disease pathology in Down syndrome. Sci Transl Med. 4 (124), 124ra29(2012).
  16. Weick, J. P., et al. Deficits in human trisomy 21 iPSCs and neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9962-9967 (2013).
  17. Meharena, H. S., et al. Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors. Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).
  18. Sharma, V., et al. Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome. Front Genet. 13, 1007519(2022).
  19. Maclean, G. A., et al. Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).
  20. Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 67, 103041(2023).
  21. Yu, P. B., et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).
  22. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
  23. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  24. Gaspard, N., et al. Generation of cortical neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 4 (10), 1454-1463 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

neuronalne kom rki progenitorowedwufazowy cykl kom rkowyr nicowanie neuronalnetrisomia chromosomu 21neurony TUBB3 dodatniekom rki PAX6 dodatniedefekt cyklu kom rkowegoniepe nosprawno intelektualna

Powiązane artykuły