Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Streszczenie

(Makro)autofagia reprezentuje fundamentalny szlak degradacji komórkowej. W tym procesie pęcherzyki o podwójnej błonie, znane jako autofagosomy, pochłaniają zawartość cytoplazmatyczną, a następnie łączą się z lizosomami w celu degradacji. Poza rolą kanoniczną, geny związane z autofagią modulują również szlak wydzielniczy obejmujący uwalnianie cząsteczek zapalnych, czynników naprawy tkanek i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Warto zauważyć, że proces rozprzestrzeniania się patologicznych białek między komórkami, szczególnie w chorobach neurodegeneracyjnych wpływających na mózg i rdzeń kręgowy, podkreśla znaczenie zrozumienia tego zjawiska. Ostatnie badania sugerują, że białko wiążące DNA 43 kDa (TDP-43), odgrywające kluczową rolę w stwardnieniu zanikowym bocznym i zwyrodnieniu płata czołowo-skroniowego, jest uwalniane w sposób zależny od autofagii za pośrednictwem EV wzbogaconych o marker autofagosomów mikrotubul białka 1A/1B łańcuch lekki 3B-II (LC3-II), zwłaszcza gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest zahamowana.

Aby wyjaśnić mechanizm leżący u podstaw powstawania i uwalniania LC3-II-dodatnich EV, konieczne jest ustanowienie dostępnej i powtarzalnej metody oceny zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-II-dodatnich. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół oceny poziomów LC3-II poprzez immunoblotting we frakcjach komórkowych i EV uzyskanych w wyniku wirowania różnicowego. Bafilomycyna A1 (Baf), inhibitor fuzji autofagosomu z lizosomem, służy jako kontrola pozytywna w celu zwiększenia poziomu wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-II-dodatnich. Gen podatności guza 101 (TSG101) jest używany jako marker ciał wielopęcherzykowych. Stosując ten protokół, wykazano, że knockdown syntaksyny-6 (STX6) za pośrednictwem siRNA, genetycznego czynnika ryzyka sporadycznej choroby Creutzfeldta-Jakoba, zwiększa poziomy LC3-II we frakcji EV komórek leczonych Baf, nie wykazując znaczącego wpływu na poziomy TSG101. Odkrycia te sugerują, że STX6 może negatywnie regulować zewnątrzkomórkowe uwalnianie LC3-II przez EV, szczególnie w warunkach, w których fuzja autofagosomu z lizosomem jest upośledzona. W połączeniu z uznanymi metodami oceny autofagii, protokół ten dostarcza cennych informacji na temat roli określonych cząsteczek w tworzeniu i uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV.

Wprowadzenie

Białko wiążące DNA odpowiedzi transaktywacyjnej 43 (TDP-43) jest szeroko wyrażaną heterogeniczną rybonukleoproteiną jądrową zaangażowaną w regulację splicingu egzonów, transkrypcji genów i stabilności mRNA, wszystko niezbędne dla przetrwania komórki1^,2. W stanach neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i zwyrodnienie płata czołowo-skroniowego (FTLD), białko jądrowe TDP-43 nieprawidłowo gromadzi się w cytoplazmie. Ta zmiana powoduje utratę funkcji TDP-43 w jądrze i toksyczne wzmocnienie funkcji w cytoplazmie. Patologiczna akumulacja TDP-43 rozpoczyna się w określonych obszarach mózgu i rdzenia kręgowego, rozprzestrzeniając się przez te obszary w sposób podobny do prionów, proces ściśle związany z postępem choroby³. Jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego patologia TDP-43 rozprzestrzenia się w mózgu i rdzeniu kręgowym, pozostaje nieznany.

TDP-43 jest wydzielany przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), a podwyższone poziomy TDP-43 są wykrywane w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) pacjentów z ALS i FTLD-TDP4^,5,6. Płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjentów, u których zdiagnozowano ALS i FTLD, indukuje wewnątrzkomórkową błędną lokalizację i agregację endogennego TDP-43 w ludzkich komórkach glejaka⁷. W ten sposób TDP-43 uwalniany poza komórką przez EV może pośredniczyć w rozprzestrzenianiu się patologii TDP-43 z komórki między komórkami.

Autofagia to dobrze zachowany mechanizm degradacji komórkowej, który polega na zamknięciu niechcianych substancji w pęcherzykach o podwójnej błonie, znanych jako autofagosomy, które są oznaczone przez LC3. Te autofagosomy łączą się z lizosomami dodatnimi związanymi z lizosomem białka błonowego 1 (LAMP1), tworząc autolizosomy (LC3⁺/LAMP1⁺), co prowadzi do degradacji ich zawartości⁸. Analizy histologiczne wskazują, że autofagosomy pochłaniające inkluzje gromadzą się w neuronach sporadycznych pacjentów z ALS⁹. Niektóre geny powodujące rodzinne ALS i FTLD-TDP są związane z regulacją autofagii^10,11,12. Wyniki te sugerują, że autofagia jest tłumiona u pacjentów z ALS i FTLD-TDP.

Poprzednie badanie wykazało, że TDP-43 jest wydzielany przez EVs dodatnie dla markera autofagosomu LC3-II, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana¹³. Rozregulowanie szlaku autofagia-lizosom może powodować nie tylko wewnątrzkomórkową akumulację TDP-43, ale także zewnątrzkomórkowe uwalnianie TDP-43 przez EVs¹⁴. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób uwalniane są dodatnie EV LC3-II i jak ważne jest to w rozprzestrzenianiu się patologii TDP-43.

EVs dzielą się na duże EV (o średnicy od 100 do 1000 nm), które powstają z pączkowania na powierzchni komórki, oraz małe EV (o średnicy od 50 do 150 nm), które powstają w wyniku pączkowania błon endosomalnych w kierunku wnętrza endosomu (znanych jako egzosomy) i aparatu Golgiego. Aby oddzielnie zbierać duże i małe pojazdy elektryczne, przeprowadzamy wirowanie sekwencyjne i zbieramy granulki przez odwirowanie odpowiednio przy 20 000 × g i 110 000 × g. Frakcja P1 EV (granulki 20 000 × g) jest przygotowana do zbierania dużych EV, a frakcja P2 EV (110 000 × g granulek) jest przygotowana do zbierania małych EVs¹⁵. Metodologia oceny poziomów LC3-II w dużych i małych EV pochodzących z sekwencyjnego wirowania za pomocą immunoblottingu jest stabilna i odtwarzalna¹⁶. Oprócz analizy poziomów LC3-II w EV, analiza tworzenia autolizosomów i omegasomów zwiększa zrozumienie, w jaki sposób dysregulacja autofagii prowadzi do uwalniania LC3-II dodatnich EV. W tym przypadku niniejsze badanie pokazuje supresyjną rolę syntaksyny 6 (STX6), białka SNARE, które promuje ruch pęcherzyków transportowych do błon docelowych¹⁷, w uwalnianiu dodatnich EV LC3-II, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest zahamowana.

Protokół

1. Przygotowanie frakcji EV komórki, P1 i P2 z pożywki hodowlanej komórek HeLa

1. Przygotowanie frakcji P1 i P2 EV z pożywki hodowlanej komórek HeLa
   1. Dzień 1
      1. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zasiewu 1 ×^{10 6} komórek na 6 cm płytce zawierającej pożywkę hodowlaną złożoną z DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
   2. Dzień 2 (opcjonalnie)
      1. Przygotować 20 μM roztwór siRNA.
      2. Zmieszać 100 μl zredukowanej pożywki surowicy i 3 μl siRNA w probówce o niskiej retencji, aby przygotować roztwór A.
      3. Zmieszać 100 μl zredukowanej pożywki surowicy i 5 μl odczynnika do transfekcji w probówce o niskiej retencji, aby przygotować roztwór B.
      4. Wymieszać roztwór A i roztwór B, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
      5. Dodać mieszaninę roztworów A i B do pożywki używanej do hodowli komórek HeLa. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
   3. Dzień 3
      1. Umyj komórki PBS i wystawij je na działanie 500 μl 0,25% trypsyny i 1 mM roztworu EDTA w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowanej wilgotności przez 5 minut.
      2. Dodać 2,5 ml pożywki hodowlanej do komórek i użyć pipety transferowej Pasteura z dołączoną końcówką do pipety o pojemności 200 μl, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową.
      3. Policz komórki za pomocą licznika komórek i wysiej 1 ×^{10 6} komórek na 10 cm płytce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny
         UWAGA: Konieczne jest przygotowanie co najmniej 1 × 10⁶ komórek w celu pobrania EV z pożywki hodowlanej wymaganej do analizy immunoblottingu.
   4. Dzień 4
      1. Przygotować pożywkę hodowlaną (patrz etap 1.1.1.1) zawierającą nośnik (DMSO) lub 100 nM bafilomycyny A1 (Baf).
      2. Wystawić komórki na działanie pożywki zawierającej nośnik lub 100 nM Baf i inkubować je w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
   5. Dzień 5
      1. Zebrać całą pożywkę hodowlaną z płytki o średnicy 10 cm, przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
         UWAGA: Pozostałe komórki na płytce o średnicy 10 cm zostaną wykorzystane w sekcji 1.2.1.
      2. W celu wyizolowania frakcji P1 EV supernatant po odwirowaniu w ilości 3 000 × g przenieść do probówki wirówkowej, a następnie odwirować go w temperaturze 20 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
      3. W celu wyizolowania frakcji P2 EV supernatant po odwirowaniu w stężeniu 20 000 × g należy przenieść do probówki ultrawirówkowej, a następnie odwirować go w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
      4. Po zetarciu nadmiaru wilgoci z wnętrza probówki chusteczką laboratoryjną, pozostałe granulki należy ponownie zawiesić w probówce wirówkowej w 50 μl 2x buforu do próbek [2,5% SDS, 125mM bufor Tris-HCl (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,4% błękit bromofenolowy] w celu przygotowania frakcji P1 EV.
      5. Usunąć supernatant przez dekantację, zetrzeć nadmiar wilgoci z wnętrza probówki chusteczką laboratoryjną, a następnie ponownie zawiesić pozostałe granulki w probówce ultrawirówki w 50 μl 2x buforu do próbek w celu przygotowania frakcji P2 EV.
      6. Inkubować frakcje P1 i P2 EV w temperaturze 100 °C na bloku grzewczym przez 10 min.
         UWAGA: Nie potrząsaj probówkami po odwirowaniu przy 20 000 × g i 110 000 × g, aby uniknąć przypadkowego wyrzucenia pozostałych granulek. Po przechyleniu probówki w celu przeniesienia supernatantu, należy utrzymać pozycję probówki, aby zapobiec ponownemu zanurzeniu osadu w pozostałym supernatantze.
2. Przygotowanie frakcji komórkowej z hodowanych komórek HeLa
   1. Dzień 5
      1. Po przeniesieniu pożywki hodowlanej z płytki o średnicy 10 cm do probówki o pojemności 15 ml, umyć komórki w naczyniu o średnicy 10 cm PBS i wystawić je na działanie 2 ml 0,25% trypsyny i 1 mM roztworu EDTA w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowanej wilgotności przez 5 minut.
      2. Dodać 8 ml pożywki wzrostowej do komórek, a następnie użyć pipety transferowej Pasteura z końcówką do pipety o pojemności 200 μl, aby pipetować komórki i przygotować zawiesinę jednokomórkową.
      3. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją w temperaturze 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora, dodać PBS do osadu komórkowego, a następnie odwirować w stężeniu 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Usunąć PBS za pomocą aspiratora i poddać sonikacji osad komórkowy w 1 ml buforu A68 [10 mM bufor Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM glikol etylenowy bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N,N-tetraoctowy (EGTA)] zawierający 1% sarkozylu.
      6. Zmierz stężenie białka w lizacie komórkowym za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
      7. Zmieszać 300 μl lizatu komórkowego ze 100 μl 4x buforu do próbki i inkubować mieszaninę w temperaturze 100 °C na bloku grzewczym przez 10 minut w celu przygotowania frakcji komórkowej.

2. Analiza immunoblottingu

1. Oddziel równoważne ilości białek w próbkach według SDS-PAGE¹⁸.
2. Przenieść oddzielone białka na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).
3. Po przeniesieniu zablokować membrany środkiem blokującym na 20 minut.
4. Inkubować zablokowaną błonę przez noc ze wskazanym pierwszorzędowym przeciwciałem w buforze Tris zawierającym 10% (v/v) surowicy cielęcej w temperaturze pokojowej.
5. Przemyć błonę buforem Tris przez 5 s, a następnie inkubować ją z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z biotyną w RT przez 2 godziny.
6. Przemyć membranę buforem Tris przez 5 s, a następnie inkubować ją z buforem Tris zawierającym 0,4% (v/v) roztwory A i roztwór B z zestawu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
7. Przemyć membranę PBS, a następnie inkubować ją z PBS zawierającym 0,04% (m/v) diaminobenzydyny, 0,8% (w/v) NiCl₂·_6H2O, i 0,3% (v/v)_H2O2 w celu kolorymetrycznego wykrywania pasm.
   UWAGA: Do wykrywania sygnałów dopuszczalna jest również metoda chemiluminescencyjna.
8. Zdigitalizuj obraz membrany za pomocą skanera i poddaj go analizie densytometrycznej przy użyciu Fidżi.
   1. Otwórz zdigitalizowany obraz za pomocą Fidżi i przekonwertuj obraz w kolorze RGB na obraz 8-bitowy, klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy.
   2. Kliknij narzędzie prostokąta i dostosuj rozmiar prostokąta, przeciągając go, aby otoczyć paski. Zidentyfikuj pasmo do analizy, klikając przycisk Analizuj | Żele | Wybierz opcję Pierwszy pas.
   3. Umieść prostokąt na drugim i kolejnych pasmach i zidentyfikuj pasma do analizy, klikając przycisk Analizuj | Żele | Wybierz pozycję Następny pas.
   4. Po rozpoznaniu ostatniego pasma zmierz densytometrię w poprzek prostokąta, klikając Analizuj | Żele | Działka: Pasy ruchu.
   5. Otocz obszar sygnału pasma linią prostą, kliknij narzędzie różdżki, a następnie kliknij obszar, aby obliczyć intensywność sygnału pasma.

3. Analiza liczby autofagosomów i autolizosomów

1. Dzień 1
   1. Policz liczbę komórek HeLa za pomocą licznika komórek i zasiewaj 1 × 10⁵ komórek HeLa eksprymujących LAMP1-GFP i mCherry-LC3 na 3,5 cm szalce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
2. Dzień 2 (opcjonalnie)
   1. Czynności opisane w sekcji 1.1.2 należy wykonać w szalkach o średnicy 3,5 cm.
3. Dzień 3
   1. Wyrzuć pożywkę hodowlaną z szalek o średnicy 3,5 cm.
   2. Umyj komórki PBS, wystawij je na działanie 400 μl 0,25% trypsyny i 1 mM roztworu EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 5 minut.
   3. Dodać 1,6 ml pożywki wzrostowej do komórek i odpipetować je pipetą transferową Pasteura, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową.
   4. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek i zasiej 1 ×^{10 4} komórki na 8-komorowym szkiełku nakrywkowym. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny
      UWAGA: Dwie studzienki komorowego szkiełka nakrywkowego są przygotowywane odpowiednio dla komórek kontrolnych i STX6 knockdown, po obróbce DMSO lub Baf, jak opisano w sekcji 3.4.2.
4. Dzień 4
   1. Przygotować pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej (DMEM bez czerwieni fenolowej, 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny), zawierającą nośnik (DMSO) lub 100 nM Baf rozpuszczony w DMSO.
   2. Zastąp pożywkę pożywką bez czerwieni fenolowej, zawierającą nośnik lub 100 nM Baf, i inkubuj przez 4 godziny
      UWAGA: Aby ocenić wpływ Baf na liczbę autofagosomów i autolizosomów, przygotuj komórki traktowane nośnikiem jako kontrole.
   3. Wybarwić jądra 0,33 μg/ml Hoechst 33342 przez 30 minut przed obserwacją.
   4. Przeprowadź obrazowanie żywych komórek za pomocą soczewki obiektywowej 60x w konfokalnym mikroskopie laserowym i uchwyć dziesięć różnych klatek.
      1. Otwórz scalony obraz RGB na Fidżi i podziel go na odpowiednie czerwone, zielone i niebieskie komponenty obrazu, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały.
      2. Ustaw stały próg dla sygnałów czerwonego i zielonego na każdym obrazie, klikając Obraz | Dostosuj | Próg dla każdego eksperymentu.
      3. Policz liczbę obszarów, w których sygnały są dodatnie dla sygnałów czerwonych lub zielonych, klikając przycisk Analizuj | Analizuj cząstki. Zaznacz pole Podsumuj, a następnie kliknij przycisk OK. Zapisz wartości z liczby, aby zidentyfikować pęcherzyki związane z autofagosomami i lizosomami.
      4. Aby nałożyć zielony obraz na czerwony obraz, ustaw tryb przesyłania na AND, klikając Edytuj | Kontrolka wklejania. Skopiuj zielony obraz, a następnie wklej go do czerwonego obrazu, aby je scalić, podświetlając obszary, które są pozytywne zarówno dla czerwonych, jak i zielonych sygnałów.
      5. Aby zidentyfikować liczby autolizosomów, policz liczbę obszarów dodatnich zarówno dla sygnałów czerwonych, jak i zielonych, klikając Analizuj | Analizuj cząstki. Zaznacz pole Podsumuj, kliknij przycisk OK i zapisz wartości w sekcji Liczba, aby zidentyfikować pęcherzyki związane z autofagosomami i lizosomami.
   5. Podziel całkowitą liczbę autolizosomów i autofagosomów przez całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć liczbę autolizosomów i autofagosomów na komórkę.
      UWAGA: Policz co najmniej 35 komórek w każdym z trzech niezależnych eksperymentów.

4. Analiza pod kątem powstawania omegasomów

1. Dzień 1
   1. Policz liczbę komórek HeLa za pomocą licznika komórek i zasiej 1 × 10⁵ komórek na szalce o średnicy 3,5 cm. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
2. Dzień 2 (opcjonalnie)
   1. Wykonaj czynności opisane w sekcji 1.1.2.
3. Dzień 3
   1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową zgodnie z opisem w krokach 3.3.1-3.3.2.
   2. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zasiej 1 ×^{10 5} komórek na 3,5 cm szalce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
4. Dzień 4
   1. Zmieszać 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl odczynnika do transfekcji DNA i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce o niskiej retencji. Inkubować mieszaninę przez 20 minut, a następnie dodać ją do pożywki.
   2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
5. Dzień 5
   1. Trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w krokach 3.3.1-3.3.2.
   2. Dodaj 2,5 ml pożywki wzrostowej do komórek. Odpipetować mieszaninę za pomocą pipety transferowej Pasteura w celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej.
   3. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zasiej 1 ×^{10 4} komórki na 8-komorowym szkiełku nakrywkowym. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
6. Dzień 6
   1. Wykonaj kroki 3.4.1-3.4.4, aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek z kroku 4.5.3 za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego. Uchwyć dziesięć różnych klatek obrazów.
      1. Wykonaj kroki 3.4.4.1-3.4.4.3, aby podzielić scalone obrazy RGB na odpowiednie czerwone, zielone i niebieskie komponenty obrazu, ustawić stały próg dla zielonych sygnałów na każdym obrazie i określić intensywność sygnału GFP. Zapisz wartości z sekcji Całkowita powierzchnia, aby określić intensywność sygnału GFP-ATG13.
      2. Podziel całkowitą intensywność sygnału przez liczbę badanych komórek, aby obliczyć intensywność sygnału na komórkę.
         UWAGA: Policz co najmniej 34 komórki w każdym z trzech niezależnych eksperymentów.

Wyniki

Jak wykazano w poprzednich badaniach, leczenie Baf zwiększyło poziomy TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, zgodnie z dwukierunkową ANOVA w EZR¹⁹) i LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, zgodnie z dwukierunkową ANOVA w EZR^{19) we frakcji} bogatej w EV. Warto zauważyć, że leczenie Baf zwiększyło również poziomy STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, zgodnie z dwukierunkową ANOVA w EZR¹⁹) we frakcji EV (Rysunek 1A), co sugeruje, że STX6 może być składnikiem EV. We frakcji EV nie zaobserwowano proliferującego antygenu jądrowego komórki (PCNA). Immunoblotting STX6 we frakcji komórkowej ujawnił, że poziomy STX6 spadły o połowę wraz z jego knockdownem siRNA (Figura 1B). Knockdown STX6 nie wpłynął na poziomy TSG101 we frakcjach ogniw i EV zarówno w warunkach traktowanych nośnikiem, jak i Baf (Rysunek 1C). Jednak knockdown STX6 zwiększył poziomy LC3-II we frakcji komórkowej w warunkach poddanych działaniu nośnika, ale nie w warunkach potraktowanych Baf. Knockdown STX6 zwiększył również poziomy LC3-II we frakcji EV w warunkach traktowanych Baf (Rysunek 1D). Wyniki te sugerują, że metody stosowane do wykrywania LC3-II w EV za pomocą immunoblottingu są wystarczająco czułe, nawet jeśli skuteczność knockdown nie jest znacząca. Ponadto wyniki te wskazują, że knockdown STX6 zwiększa wewnątrzkomórkową liczbę autofagosomów i zwiększa zewnątrzkomórkowe uwalnianie pęcherzyków związanych z autofagosomami podczas leczenia Baf.

Aby dokładniej zbadać, czy knockdown STX6 wpływa na wewnątrzkomórkowe liczby autofagosomów i autolizosomów, autofagosomy i lizosomy zostały zwizualizowane za pomocą markera autofagosomu mCherry-LC3 i markera lizosomów LAMP1-GFP. Konfokalne obrazowanie żywych komórek ujawniło pęcherzyki GFP- i mCherry-dodatnie w komórkach HeLa eksprymujących LAMP1-GFP i mCherry-LC3 (Figura 2A). Autolizosomy zidentyfikowano jako pęcherzyki GFP i mCherry-dodatnie, podczas gdy autofagosomy zidentyfikowano jako pęcherzyki GFP-ujemne i mWiśniowo-dodatnie. Knockdown STX6 zwiększył liczbę autofagosomów i autolizosomów w warunkach traktowanych nośnikiem (Rysunek 2B, C). Jednak knockdown STX6 nie wpłynął na liczbę autofagosomów i autolizosomów w warunkach traktowanych Baf (Rysunek 2B, C).

Aby ustalić, czy wzrost liczby wewnątrzkomórkowych autofagosomów spowodowany knockdownem STX6 wynikał ze zwiększonego tworzenia autofagosomów, badanie formacji omegasoomów, procesu wymaganego do tworzenia autofagosomu, przy użyciu intensywności sygnału markera omegasome'u GFP-ATG13. Konfokalne obrazowanie żywych komórek dostarczyło złożonego obrazu GFP-ATG13, wskazującego na tworzenie się omegasomów (Figura 3A). Knockdown STX6 zmniejszył intensywność sygnału GFP-ATG13 (P = 0,023, zgodnie z dwukierunkową ANOVA w EZR¹⁹). Podczas gdy knockdown STX6 nie wpłynął znacząco na intensywność sygnału GFP-ATG13 w warunkach potraktowanych nośnikiem, znacząco zmniejszył sygnał w warunkach traktowanych Baf (Rysunek 3B). Podsumowując, odkrycia te wskazują, że knockdown STX6 zwiększa uwalnianie pęcherzyków LC3-II dodatnich związanych z akumulacją pęcherzyków związanych z autofagosomami.

Rysunek 1: Wyniki immunoblottingu komórek, frakcji P1 i P2 z komórek HeLa transfekowanych kontrolą lub STX6 siRNA pod wpływem nośnika lub Baf. Komórki HeLa traktowano nośnikiem (DMSO) lub 100 nM Baf przez 24 godziny po transfekcji z kontrolą lub STX6 siRNA. Izolowano frakcje komórki, P1 (20 000 × g granulki) i P2 (110 000 × g granulki). (A) Reprezentatywne obrazy immunoblottingu każdej frakcji przedstawiające STX6, TSG101, LC3 i PCNA. (B-D) Analizę densytometryczną dla (B) STX6, (C) TSG101 i (D) LC3-II przeprowadzono na podstawie obrazów immunoblotów. Intensywność sygnału znormalizowano do komórek kontrolnych lub transfekowanych siRNA STX6 traktowanych nośnikiem lub Baf. Wykresy słupkowe przedstawiają średnie wartości ± S.E.M. (N = 3). * oznacza P < 0,05 przez dwustronny niesparowany test t w programie Excel. Skróty: STX6 = składnia 6; Baf = bafilomycyna A1; DMSO = sultlenek dimetylu; TSG101 = gen podatności na guz 101; LC3 = białka związane z mikrotubulami 1A/1B łańcuch lekki 3B; PCNA = antygen jądrowy proliferujący komórka; S.E.M. = błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfokalna analiza obrazu komórek HeLa z koekspresją Lamp1-GFP i mCherry-LC3 transfekowanych kontrolą lub STX6 siRNA w warunkach podłoże i Baf. (A) Konfokalne obrazy komórek HeLa stabilnie eksprymujących LAMP1-GFP i mCherry-LC3 transfekowano kontrolnym lub STX6 siRNA przez 48 godzin, a następnie eksponowano DMSO lub 400 nM Baf przez 4 godziny. Podziałka = 20 μm. (B,C) Qunacification autofagosomów (B) autofagosomów (kropki ujemne LAMP1-GFP i dodatnie mCherry-LC3) oraz autolizosomów (podwójnie dodatnie kropki LAMP1-GFP i mCherry-LC3) przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Fiji. Dane na wykresach słupkowych są prezentowane jako wartości średnie ± S.E.M. (N = 3). * oznacza P < 0,05 na podstawie dwustronnego niesparowanego testu t w programie Excel. Skróty: Lamp1 = białko błonowe związane z lizosomami 1; LC3 = białka związane z mikrotubulami 1A/1B łańcuch lekki 3B; STX6 = składnia 6; Baf = bafilomycyna A1; GFP = białko zielonej fluorescencji; S.E.M. = błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Konfokalne obrazowanie komórek HeLa wyrażających GFP-ATG13, transfekowanych kontrolnym lub STX6 siRNA i poddanych działaniu nośnika lub Baf. (A) Komórki HeLa transfekowano kontrolą lub STX6 siRNA, a następnie transfekcją pEGFP-C1-hAtg13 i traktowano DMSO lub 400 nM Baf przez 4 godziny. Pasek skali = 20 μm. (B) Względne intensywność sygnału określono poprzez normalizację sygnału w każdym stanie do kontrolnych komórek transfekowanych siRNA traktowanych Baf. Wykres słupkowy przedstawia dane jako średnie ± S.E.M. (N = 3). * oznacza P < 0,05 przez dwustronny niesparowany test t w programie Excel. Skróty: hAtg13 = ludzki gen związany z autofagią 13; STX6 = składnia 6; Baf = bafilomycyna A1; DMSO = sultlenek dimetylu; S.E.M. = błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Analiza immunoblot komórek, frakcji P1 i P2 z komórek HeLa transfekowanych kontrolnym siRNA i traktowanych Baf. Komórki HeLa transfekowano kontrolnym siRNA i wystawiono na działanie 100 nM Baf przez 24 godziny. Następnie przygotowano frakcje: komórkową, P1 (20 000 × g granulki) i P2 (110 000 × g granulki). Reprezentatywne obrazy immunoblot ULK1 i PCNA, pokazujące ich poziomy w każdej frakcji dla porównania. Skróty: Baf = bafilomycyna A1; ULK1 = unc-51 jak autofagia aktywująca kinazę 1; PCNA = proliferujący antygen jądrowy komórki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Badanie immunoblottingu wykazało poziomy LC3-II i TSG101 we frakcji komórkowej, frakcji P1 EV bogatej w mikropęcherzyki i frakcji P2 EV bogatej w egzosomy. Obrazowanie żywych komórek wykorzystano do zbadania autofagosomów, autolizosomów i omegasomów, dostarczając informacji na temat tego, czy knockdown STX6 wpływa na autofagię. Te połączone wyniki sugerują, że knockdown STX6 wpływa na uwalnianie LC3-II dodatnich EV, potencjalnie związanych z rozregulowaniem szlaku autofagii. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość rozróżnienia dużych i małych pojazdów elektrycznych pochodzących z różnych źródeł. Analiza cytometrii przepływowej przy użyciu specyficznych markerów dla mikropęcherzyków, egzosomów lub aparatu Golgiego może dodatkowo wyjaśnić, w jaki sposób knockdown STX6 wpływa na uwalnianie pęcherzyków LC3-II dodatnich.

Jednak ograniczeniem badania immunoblottingu jest to, że nie jest jasne, czy obserwowany wzrost poziomów LC3-II we frakcji EV po knockdown STX6 pod wpływem leczenia Baf jest spowodowany zwiększoną liczbą uwalnianych pęcherzyków LC3-II, czy wzrostem poziomów LC3-II na EV. Aby rozróżnić te możliwości, liczenie pęcherzyków za pomocą analizy śledzenia nanocząstek lub analizy cytometrii przepływowej może pomóc w ustaleniu, czy liczba pęcherzyków LC3-II dodatnich jest zwiększona lub czy poziomy LC3-II na pęcherzyk są podwyższone.

Krytycznym krokiem w protokole jest frakcjonowanie pożywki hodowlanej w celu przygotowania frakcji EV. EV są obserwowane jako maleńkie granulki w probówce wirówkowej. Aby przygotować porównywalną frakcję EV, ważne jest, aby ostrożnie przenieść lub wyrzucić supernatant po odwirowaniu, aby uniknąć rozcieńczenia stężenia białka w granulkach EV. Aby zbadać zanieczyszczenie z frakcji komórkowej do frakcji EV, poziomy białka cytoplazmatycznego, kinazy aktywującej autofagię podobną do unc-51 (ULK1) i białka jądrowego, PCNA porównano między frakcjami w tym badaniu (rysunek uzupełniający S1). Stężenie białka we frakcji komórkowej na ogół odzwierciedla liczbę komórek, ale na stężenie białka komórkowego mają wpływ etapy cyklu komórkowego²⁰ lub zaburzenia proteostazy²¹. Autofagia ma kluczowe znaczenie dla utrzymania proteostazy²². Rozregulowanie autofagii przez knockdown STX6 lub leczenie Baf może zmienić stężenie białka niezależnie od liczby komórek.

Nokaut STX6 osiąga się poprzez transfekcję siRNA, a nadekspresję GFP-ATG13 osiąga się poprzez transfekcję DNA. Na wydajność transfekcji ma wpływ typ, gęstość i liczba komórek. Skuteczne wyrównanie sekwencji siRNA może również wpływać na skuteczność knockdownu. Regulacje są konieczne, gdy wydajność transfekcji jest niska.

Obecne wyniki wskazują, że knockdown STX6 zwiększył poziom markera autofagosomu LC3-II we frakcji EV w warunkach traktowanych Baf, ale nie wpłynął na poziomy TSG101. Sugeruje to, że STX6 hamuje uwalnianie pęcherzyków pochodzących z autofagosomów, ale nie z MVB, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Nokaut STX6 zwiększył również poziomy komórkowe LC3-II w warunkach wzrostu, co sugeruje, że STX6 reguluje autofagię. Rzeczywiście, knockdown STX6 zwiększył liczbę autofagosomów i autolizosomów, podczas gdy nie zwiększył tworzenia omegasomów. Dojrzewanie autolizosomów powoduje autofagiczną reformację lizosomów²³. Możliwe, że STX6 pośredniczy w procesie dojrzewania autolizosomów, a jego utrata funkcji może zwiększać liczbę niedojrzałych autolizosomów, prowadząc do rozregulowania fuzji autofagosomu z lizosomem z powodu zahamowania autofagicznej reformacji lizosomów.

Leczenie Baf zwiększyło poziom STX6 we frakcji EV, nawet gdy jego ekspresja była obniżona. Wcześniejsze badania sugerowały, że pęcherzyki związane z autofagosomami są uwalniane jako EV, gdy funkcja lizosomów jest zahamowana^13,14. Wiadomo, że STX6 lokalizuje się w pęcherzykach związanych z autofagosomami, takich jak wakuole podobne do autofagosomów zawierające Streptococcus grupy A (GAS)²⁴. Dlatego STX6 może być zlokalizowany w pęcherzykach związanych z autofagosomami, które są uwalniane jako EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Rozprzestrzenianie się patologii TDP-43 jest ściśle związane z progresją ALS i FTLD-TDP³. Chociaż nie jest jasne, w jaki sposób patologia TDP-43 rozprzestrzenia się w mózgu i rdzeniu kręgowym, szlak EV może pośredniczyć w jej rozprzestrzenianiu się. Wcześniejsze badania wykazały, że rozregulowanie szlaku autofagia-lizosom powoduje uwalnianie LC3-II dodatnich EV zawierających TDP-43¹³. Niniejsze badanie sugeruje rolę STX6 w regulacji uwalniania EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana. Metodologia oceny poziomów LC3-II w komórkach i frakcji EV za pomocą immunoblottingu powinna okazać się pomocna w przyszłych badaniach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25 % Trypsyna EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Naczynie	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL	Rurka Thermo Fisher Scientific	339650
200 μ L Końcówka do pipet	Nippon Genetics	FG-301	pipetowanie
2-merkaptoetanolu	Nacalai Tesque	21417-52	materiał do próbki roztwór buforowy
3,3'-diaminobenzydyny Tetrachlorowodorek	Nacalai Tesque	11009-41	materiał do roztworu DAB
3,5 cm Naczynie	Naczynie Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm	TrueLine	TR4001
Wanny termostatyczne z blokiem aluminiowym (suche kąpiele termiczne)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	roztwór do inhalacji
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycyna A1	Adipogen	BVT-0252
anty-króliczej IgG koniugugowane biotyną	Laboratoria	BA-1000	2nd przeciwciało do immunoblottingu
Laboratoria wektorów	przeciwciał przeciwko mysim przeciwciałom IgG sprzężonym z biotyną	BA-2000	2. przeciwciało do immunoblottingu
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	materiał do immunoblottingu
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	materiał do roztworu buforowego próbki
Surowica cielęca	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Wirówka 5702 R	eppendolf	5703000039
Szkiełka zliczające Dwukomorowe	zliczanie komórek	Bio-Rad	1450015J
Cyfrowy sonifier 450	BRANSON
Dimetylosulfotlenek	Nacalai Tasque	09659-14	nośnik
DMEM Wysoka zawartość glukozy	Nacalai Tesque	08458-45	pożywka hodowlana
DMEM bez czerwieni fenolowej	Nacalai Tesque	08489-45	pożywka hodowlana
EGTA	Dojindo	348-01311	materiał do rozwiązania A68
Excel	Microsoft	wersja 16.16.27	analiza satystyczna
EZR	Nr referencyjny 24	wersja 1.68	analiza zadowalająca
FBS	Sigma	173012	Pożywka hodowlana
Fidżi	NIH		Narzędzie do analizy obrazu
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	materiał na roztwór buforowy do próbek
Hoehst33342	Dojindo	H342
Nadtlenek wodoru	Fujifilm Wako	080-0186	materiał do roztworu DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	chusteczka czyszcząca
Rurka o niskiej retencji	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	transfekcja siRNA i DNA
LSM780 Konfokalny mikroskop laserowy	Carl Zeiss
Anti-LC3 Przeciwciało	MBL	M186-3	1. przeciwciało do immunoblottingu
Chlorek niklu(II) sześciowodny	Fujifilm Wako	149-01041	materiał do roztworu DAB
N-lauroilsarkozyna sól sodowa	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultrawirówka	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Zredukowana surowica Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	transfekcja siRNA i DNA
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicylina/Streptomycyna	Nacalai Tesque	26253-84	Pożywka
hodowlana Zestawy do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23225
Poliklonalne przeciwciało anty-PCNA królika	BioAcademia	70-080	1. przeciwciało dla immunoblotting
Poliklonalne przeciwciało antysyntaksyny królika 6	ProteinTech	10841-1-AP	1. przeciwciało do immunoblottingu
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-TSG101	ProteinTech	28283-1-AP	1. przeciwciało do immunoblottingu
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-ULK1	ProteinTech	20986-1-AP	1. przeciwciało do immunoblottingu
Polifluorek winylidenu Membrana	Milliore	IPVH00010	materiał do immunoblottingu
R	Rozwój R Core Team	wersja 4.4.1	analiza satystyczna
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	odczynnik do transfekcji siRNA
STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA do transfekcji
Chlorek sodu	Nacalai Tesque	31320-05	materiał do buforu Tris i roztworu A68
Dodecyl siarczan sodu	Fujifilm Wako	192-13981	materiał do roztworu buforowego próbki
SPARK Czytnik mikropłytek	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	transfekcja siRNA
Sacharoza	Fujifilm Wako	193-00025	materiał do roztworu A68
Automatyczny licznik komórek TC20 z drukarką termiczną	Bio-Rad	1450109J1	zliczanie komórek
Kąpiel termiczna	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	inkubacja
TransIT-293	Odczynnik do transfekcji DNA	Mirus Bio	MIR 2700
TransIT-LT1	Odczynnik
do transfekcji DNA Mirus Bio MIR2300Tris(hydroksymetylo)aminometan	Nacalai Tesque	35406-75	materiał na bufor Tris, bufor próbki i roztwór A68
Trypan Blue Dye 0,40%	Bio-Rad	1450021	zliczanie komórek
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Zbieranie 361706 Beckman Coulter		do frakcji P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059	zbieranie do frakcji P2 EV
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	butelka do
mycia	As One	1-4640-02	membrana myjąca
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806