Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67385

⸱

18 października 2024

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodologię zwięzłej oceny poziomów markera autofagosomu LC3-II w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EVs) za pomocą immunoblottingu. Analiza poziomów LC3-II w EV, tworzeniu autolizosomów i tworzeniu omegasomów sugeruje nową rolę STX6 w uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana.

Streszczenie

(Makro)autofagia reprezentuje fundamentalny szlak degradacji komórkowej. W tym procesie pęcherzyki o podwójnej błonie, znane jako autofagosomy, pochłaniają zawartość cytoplazmatyczną, a następnie łączą się z lizosomami w celu degradacji. Poza rolą kanoniczną, geny związane z autofagią modulują również szlak wydzielniczy obejmujący uwalnianie cząsteczek zapalnych, czynników naprawy tkanek i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV). Warto zauważyć, że proces rozprzestrzeniania się patologicznych białek między komórkami, szczególnie w chorobach neurodegeneracyjnych wpływających na mózg i rdzeń kręgowy, podkreśla znaczenie zrozumienia tego zjawiska. Ostatnie badania sugerują, że białko wiążące DNA 43 kDa (TDP-43), odgrywające kluczową rolę w stwardnieniu zanikowym bocznym i zwyrodnieniu płata czołowo-skroniowego, jest uwalniane w sposób zależny od autofagii za pośrednictwem EV wzbogaconych o marker autofagosomów mikrotubul białka 1A/1B łańcuch lekki 3B-II (LC3-II), zwłaszcza gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest zahamowana.

Aby wyjaśnić mechanizm leżący u podstaw powstawania i uwalniania LC3-II-dodatnich EV, konieczne jest ustanowienie dostępnej i powtarzalnej metody oceny zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-II-dodatnich. W pracy przedstawiono szczegółowy protokół oceny poziomów LC3-II poprzez immunoblotting we frakcjach komórkowych i EV uzyskanych w wyniku wirowania różnicowego. Bafilomycyna A1 (Baf), inhibitor fuzji autofagosomu z lizosomem, służy jako kontrola pozytywna w celu zwiększenia poziomu wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-II-dodatnich. Gen podatności guza 101 (TSG101) jest używany jako marker ciał wielopęcherzykowych. Stosując ten protokół, wykazano, że knockdown syntaksyny-6 (STX6) za pośrednictwem siRNA, genetycznego czynnika ryzyka sporadycznej choroby Creutzfeldta-Jakoba, zwiększa poziomy LC3-II we frakcji EV komórek leczonych Baf, nie wykazując znaczącego wpływu na poziomy TSG101. Odkrycia te sugerują, że STX6 może negatywnie regulować zewnątrzkomórkowe uwalnianie LC3-II przez EV, szczególnie w warunkach, w których fuzja autofagosomu z lizosomem jest upośledzona. W połączeniu z uznanymi metodami oceny autofagii, protokół ten dostarcza cennych informacji na temat roli określonych cząsteczek w tworzeniu i uwalnianiu LC3-II-dodatnich EV.

Wprowadzenie

Białko wiążące DNA odpowiedzi transaktywacyjnej 43 (TDP-43) jest szeroko wyrażaną heterogeniczną rybonukleoproteiną jądrową zaangażowaną w regulację splicingu egzonów, transkrypcji genów i stabilności mRNA, wszystko niezbędne dla przetrwania komórki1,2. W stanach neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i zwyrodnienie płata czołowo-skroniowego (FTLD), białko jądrowe TDP-43 nieprawidłowo gromadzi się w cytoplazmie. Ta zmiana powoduje utratę funkcji TDP-43 w jądrze i toksyczne wzmocnienie funkcji w cytoplazmie. Patologiczna akumulacja TDP-43 rozpoczyna się w określonych obszarach mózgu i rdzenia kręgowego, rozprzestrzeniając się przez te obszary w sposób podobny do prionów, proces ściśle związany z postępem choroby3. Jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego patologia TDP-43 rozprzestrzenia się w mózgu i rdzeniu kręgowym, pozostaje nieznany.

TDP-43 jest wydzielany przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), a podwyższone poziomy TDP-43 są wykrywane w osoczu i płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) pacjentów z ALS i FTLD-TDP4,5,6. Płyn mózgowo-rdzeniowy od pacjentów, u których zdiagnozowano ALS i FTLD, indukuje wewnątrzkomórkową błędną lokalizację i agregację endogennego TDP-43 w ludzkich komórkach glejaka7. W ten sposób TDP-43 uwalniany poza komórką przez EV może pośredniczyć w rozprzestrzenianiu się patologii TDP-43 z komórki między komórkami.

Autofagia to dobrze zachowany mechanizm degradacji komórkowej, który polega na zamknięciu niechcianych substancji w pęcherzykach o podwójnej błonie, znanych jako autofagosomy, które są oznaczone przez LC3. Te autofagosomy łączą się z lizosomami dodatnimi związanymi z lizosomem białka błonowego 1 (LAMP1), tworząc autolizosomy (LC3+/LAMP1+), co prowadzi do degradacji ich zawartości8. Analizy histologiczne wskazują, że autofagosomy pochłaniające inkluzje gromadzą się w neuronach sporadycznych pacjentów z ALS9. Niektóre geny powodujące rodzinne ALS i FTLD-TDP są związane z regulacją autofagii10,11,12. Wyniki te sugerują, że autofagia jest tłumiona u pacjentów z ALS i FTLD-TDP.

Poprzednie badanie wykazało, że TDP-43 jest wydzielany przez EVs dodatnie dla markera autofagosomu LC3-II, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest hamowana13. Rozregulowanie szlaku autofagia-lizosom może powodować nie tylko wewnątrzkomórkową akumulację TDP-43, ale także zewnątrzkomórkowe uwalnianie TDP-43 przez EVs14. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób uwalniane są dodatnie EV LC3-II i jak ważne jest to w rozprzestrzenianiu się patologii TDP-43.

EVs dzielą się na duże EV (o średnicy od 100 do 1000 nm), które powstają z pączkowania na powierzchni komórki, oraz małe EV (o średnicy od 50 do 150 nm), które powstają w wyniku pączkowania błon endosomalnych w kierunku wnętrza endosomu (znanych jako egzosomy) i aparatu Golgiego. Aby oddzielnie zbierać duże i małe pojazdy elektryczne, przeprowadzamy wirowanie sekwencyjne i zbieramy granulki przez odwirowanie odpowiednio przy 20 000 × g i 110 000 × g. Frakcja P1 EV (granulki 20 000 × g) jest przygotowana do zbierania dużych EV, a frakcja P2 EV (110 000 × g granulek) jest przygotowana do zbierania małych EVs15. Metodologia oceny poziomów LC3-II w dużych i małych EV pochodzących z sekwencyjnego wirowania za pomocą immunoblottingu jest stabilna i odtwarzalna16. Oprócz analizy poziomów LC3-II w EV, analiza tworzenia autolizosomów i omegasomów zwiększa zrozumienie, w jaki sposób dysregulacja autofagii prowadzi do uwalniania LC3-II dodatnich EV. W tym przypadku niniejsze badanie pokazuje supresyjną rolę syntaksyny 6 (STX6), białka SNARE, które promuje ruch pęcherzyków transportowych do błon docelowych17, w uwalnianiu dodatnich EV LC3-II, gdy fuzja autofagosomu z lizosomem jest zahamowana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie frakcji EV komórki, P1 i P2 z pożywki hodowlanej komórek HeLa

  1. Przygotowanie frakcji P1 i P2 EV z pożywki hodowlanej komórek HeLa
    1. Dzień 1
      1. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zasiewu 1 ×10 6 komórek na 6 cm płytce zawierającej pożywkę hodowlaną złożoną z DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
    2. Dzień 2 (opcjonalnie)
      1. Przygotować 20 μM roztwór siRNA.
      2. Zmieszać 100 μl zredukowanej pożywki surowicy i 3 μl siRNA w probówce o niskiej retencji, aby przygotować roztwór A.
      3. Zmieszać 100 μl zredukowanej pożywki surowicy i 5 μl odczynnika do transfekcji w probówce o niskiej retencji, aby przygotować roztwór B.
      4. Wymieszać roztwór A i roztwór B, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
      5. Dodać mieszaninę roztworów A i B do pożywki używanej do hodowli komórek HeLa. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
    3. Dzień 3
      1. Umyj komórki PBS i wystawij je na działanie 500 μl 0,25% trypsyny i 1 mM roztworu EDTA w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowanej wilgotności przez 5 minut.
      2. Dodać 2,5 ml pożywki hodowlanej do komórek i użyć pipety transferowej Pasteura z dołączoną końcówką do pipety o pojemności 200 μl, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową.
      3. Policz komórki za pomocą licznika komórek i wysiej 1 ×10 6 komórek na 10 cm płytce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny
        UWAGA: Konieczne jest przygotowanie co najmniej 1 × 106 komórek w celu pobrania EV z pożywki hodowlanej wymaganej do analizy immunoblottingu.
    4. Dzień 4
      1. Przygotować pożywkę hodowlaną (patrz etap 1.1.1.1) zawierającą nośnik (DMSO) lub 100 nM bafilomycyny A1 (Baf).
      2. Wystawić komórki na działanie pożywki zawierającej nośnik lub 100 nM Baf i inkubować je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
    5. Dzień 5
      1. Zebrać całą pożywkę hodowlaną z płytki o średnicy 10 cm, przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
        UWAGA: Pozostałe komórki na płytce o średnicy 10 cm zostaną wykorzystane w sekcji 1.2.1.
      2. W celu wyizolowania frakcji P1 EV supernatant po odwirowaniu w ilości 3 000 × g przenieść do probówki wirówkowej, a następnie odwirować go w temperaturze 20 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
      3. W celu wyizolowania frakcji P2 EV supernatant po odwirowaniu w stężeniu 20 000 × g należy przenieść do probówki ultrawirówkowej, a następnie odwirować go w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
      4. Po zetarciu nadmiaru wilgoci z wnętrza probówki chusteczką laboratoryjną, pozostałe granulki należy ponownie zawiesić w probówce wirówkowej w 50 μl 2x buforu do próbek [2,5% SDS, 125mM bufor Tris-HCl (pH 6,8), 30% glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,4% błękit bromofenolowy] w celu przygotowania frakcji P1 EV.
      5. Usunąć supernatant przez dekantację, zetrzeć nadmiar wilgoci z wnętrza probówki chusteczką laboratoryjną, a następnie ponownie zawiesić pozostałe granulki w probówce ultrawirówki w 50 μl 2x buforu do próbek w celu przygotowania frakcji P2 EV.
      6. Inkubować frakcje P1 i P2 EV w temperaturze 100 °C na bloku grzewczym przez 10 min.
        UWAGA: Nie potrząsaj probówkami po odwirowaniu przy 20 000 × g i 110 000 × g, aby uniknąć przypadkowego wyrzucenia pozostałych granulek. Po przechyleniu probówki w celu przeniesienia supernatantu, należy utrzymać pozycję probówki, aby zapobiec ponownemu zanurzeniu osadu w pozostałym supernatantze.
  2. Przygotowanie frakcji komórkowej z hodowanych komórek HeLa
    1. Dzień 5
      1. Po przeniesieniu pożywki hodowlanej z płytki o średnicy 10 cm do probówki o pojemności 15 ml, umyć komórki w naczyniu o średnicy 10 cm PBS i wystawić je na działanie 2 ml 0,25% trypsyny i 1 mM roztworu EDTA w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowanej wilgotności przez 5 minut.
      2. Dodać 8 ml pożywki wzrostowej do komórek, a następnie użyć pipety transferowej Pasteura z końcówką do pipety o pojemności 200 μl, aby pipetować komórki i przygotować zawiesinę jednokomórkową.
      3. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją w temperaturze 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora, dodać PBS do osadu komórkowego, a następnie odwirować w stężeniu 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Usunąć PBS za pomocą aspiratora i poddać sonikacji osad komórkowy w 1 ml buforu A68 [10 mM bufor Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM glikol etylenowy bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N,N-tetraoctowy (EGTA)] zawierający 1% sarkozylu.
      6. Zmierz stężenie białka w lizacie komórkowym za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
      7. Zmieszać 300 μl lizatu komórkowego ze 100 μl 4x buforu do próbki i inkubować mieszaninę w temperaturze 100 °C na bloku grzewczym przez 10 minut w celu przygotowania frakcji komórkowej.

2. Analiza immunoblottingu

  1. Oddziel równoważne ilości białek w próbkach według SDS-PAGE18.
  2. Przenieść oddzielone białka na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).
  3. Po przeniesieniu zablokować membrany środkiem blokującym na 20 minut.
  4. Inkubować zablokowaną błonę przez noc ze wskazanym pierwszorzędowym przeciwciałem w buforze Tris zawierającym 10% (v/v) surowicy cielęcej w temperaturze pokojowej.
  5. Przemyć błonę buforem Tris przez 5 s, a następnie inkubować ją z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z biotyną w RT przez 2 godziny.
  6. Przemyć membranę buforem Tris przez 5 s, a następnie inkubować ją z buforem Tris zawierającym 0,4% (v/v) roztwory A i roztwór B z zestawu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  7. Przemyć membranę PBS, a następnie inkubować ją z PBS zawierającym 0,04% (m/v) diaminobenzydyny, 0,8% (w/v) NiCl2·6H2O, i 0,3% (v/v)H2O2 w celu kolorymetrycznego wykrywania pasm.
    UWAGA: Do wykrywania sygnałów dopuszczalna jest również metoda chemiluminescencyjna.
  8. Zdigitalizuj obraz membrany za pomocą skanera i poddaj go analizie densytometrycznej przy użyciu Fidżi.
    1. Otwórz zdigitalizowany obraz za pomocą Fidżi i przekonwertuj obraz w kolorze RGB na obraz 8-bitowy, klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy.
    2. Kliknij narzędzie prostokąta i dostosuj rozmiar prostokąta, przeciągając go, aby otoczyć paski. Zidentyfikuj pasmo do analizy, klikając przycisk Analizuj | Żele | Wybierz opcję Pierwszy pas.
    3. Umieść prostokąt na drugim i kolejnych pasmach i zidentyfikuj pasma do analizy, klikając przycisk Analizuj | Żele | Wybierz pozycję Następny pas.
    4. Po rozpoznaniu ostatniego pasma zmierz densytometrię w poprzek prostokąta, klikając Analizuj | Żele | Działka: Pasy ruchu.
    5. Otocz obszar sygnału pasma linią prostą, kliknij narzędzie różdżki, a następnie kliknij obszar, aby obliczyć intensywność sygnału pasma.

3. Analiza liczby autofagosomów i autolizosomów

  1. Dzień 1
    1. Policz liczbę komórek HeLa za pomocą licznika komórek i zasiewaj 1 × 105 komórek HeLa eksprymujących LAMP1-GFP i mCherry-LC3 na 3,5 cm szalce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
  2. Dzień 2 (opcjonalnie)
    1. Czynności opisane w sekcji 1.1.2 należy wykonać w szalkach o średnicy 3,5 cm.
  3. Dzień 3
    1. Wyrzuć pożywkę hodowlaną z szalek o średnicy 3,5 cm.
    2. Umyj komórki PBS, wystawij je na działanie 400 μl 0,25% trypsyny i 1 mM roztworu EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 5 minut.
    3. Dodać 1,6 ml pożywki wzrostowej do komórek i odpipetować je pipetą transferową Pasteura, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową.
    4. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek i zasiej 1 ×10 4 komórki na 8-komorowym szkiełku nakrywkowym. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny
      UWAGA: Dwie studzienki komorowego szkiełka nakrywkowego są przygotowywane odpowiednio dla komórek kontrolnych i STX6 knockdown, po obróbce DMSO lub Baf, jak opisano w sekcji 3.4.2.
  4. Dzień 4
    1. Przygotować pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej (DMEM bez czerwieni fenolowej, 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny), zawierającą nośnik (DMSO) lub 100 nM Baf rozpuszczony w DMSO.
    2. Zastąp pożywkę pożywką bez czerwieni fenolowej, zawierającą nośnik lub 100 nM Baf, i inkubuj przez 4 godziny
      UWAGA: Aby ocenić wpływ Baf na liczbę autofagosomów i autolizosomów, przygotuj komórki traktowane nośnikiem jako kontrole.
    3. Wybarwić jądra 0,33 μg/ml Hoechst 33342 przez 30 minut przed obserwacją.
    4. Przeprowadź obrazowanie żywych komórek za pomocą soczewki obiektywowej 60x w konfokalnym mikroskopie laserowym i uchwyć dziesięć różnych klatek.
      1. Otwórz scalony obraz RGB na Fidżi i podziel go na odpowiednie czerwone, zielone i niebieskie komponenty obrazu, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały.
      2. Ustaw stały próg dla sygnałów czerwonego i zielonego na każdym obrazie, klikając Obraz | Dostosuj | Próg dla każdego eksperymentu.
      3. Policz liczbę obszarów, w których sygnały są dodatnie dla sygnałów czerwonych lub zielonych, klikając przycisk Analizuj | Analizuj cząstki. Zaznacz pole Podsumuj, a następnie kliknij przycisk OK. Zapisz wartości z liczby, aby zidentyfikować pęcherzyki związane z autofagosomami i lizosomami.
      4. Aby nałożyć zielony obraz na czerwony obraz, ustaw tryb przesyłania na AND, klikając Edytuj | Kontrolka wklejania. Skopiuj zielony obraz, a następnie wklej go do czerwonego obrazu, aby je scalić, podświetlając obszary, które są pozytywne zarówno dla czerwonych, jak i zielonych sygnałów.
      5. Aby zidentyfikować liczby autolizosomów, policz liczbę obszarów dodatnich zarówno dla sygnałów czerwonych, jak i zielonych, klikając Analizuj | Analizuj cząstki. Zaznacz pole Podsumuj, kliknij przycisk OK i zapisz wartości w sekcji Liczba, aby zidentyfikować pęcherzyki związane z autofagosomami i lizosomami.
    5. Podziel całkowitą liczbę autolizosomów i autofagosomów przez całkowitą liczbę komórek, aby obliczyć liczbę autolizosomów i autofagosomów na komórkę.
      UWAGA: Policz co najmniej 35 komórek w każdym z trzech niezależnych eksperymentów.

4. Analiza pod kątem powstawania omegasomów

  1. Dzień 1
    1. Policz liczbę komórek HeLa za pomocą licznika komórek i zasiej 1 × 105 komórek na szalce o średnicy 3,5 cm. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
  2. Dzień 2 (opcjonalnie)
    1. Wykonaj czynności opisane w sekcji 1.1.2.
  3. Dzień 3
    1. Przygotować zawiesinę jednokomórkową zgodnie z opisem w krokach 3.3.1-3.3.2.
    2. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zasiej 1 ×10 5 komórek na 3,5 cm szalce. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
  4. Dzień 4
    1. Zmieszać 1 μg pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl odczynnika do transfekcji DNA i 100 μl zredukowanej pożywki surowicy w probówce o niskiej retencji. Inkubować mieszaninę przez 20 minut, a następnie dodać ją do pożywki.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
  5. Dzień 5
    1. Trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w krokach 3.3.1-3.3.2.
    2. Dodaj 2,5 ml pożywki wzrostowej do komórek. Odpipetować mieszaninę za pomocą pipety transferowej Pasteura w celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej.
    3. Policz komórki za pomocą licznika komórek i zasiej 1 ×10 4 komórki na 8-komorowym szkiełku nakrywkowym. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i kontrolowaną wilgotnością przez 24 godziny.
  6. Dzień 6
    1. Wykonaj kroki 3.4.1-3.4.4, aby przeprowadzić obrazowanie żywych komórek z kroku 4.5.3 za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego. Uchwyć dziesięć różnych klatek obrazów.
      1. Wykonaj kroki 3.4.4.1-3.4.4.3, aby podzielić scalone obrazy RGB na odpowiednie czerwone, zielone i niebieskie komponenty obrazu, ustawić stały próg dla zielonych sygnałów na każdym obrazie i określić intensywność sygnału GFP. Zapisz wartości z sekcji Całkowita powierzchnia, aby określić intensywność sygnału GFP-ATG13.
      2. Podziel całkowitą intensywność sygnału przez liczbę badanych komórek, aby obliczyć intensywność sygnału na komórkę.
        UWAGA: Policz co najmniej 34 komórki w każdym z trzech niezależnych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak wykazano w poprzednich badaniach, traktowanie Baf zwiększyło poziomy TSG101 (P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, określone za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA w programie EZR19) oraz LC3-II (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, określone za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA w programie EZR19) w frakcji bogatej w EV. Co istotne, traktowanie Baf zwiększyło również poziomy STX6 (P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, określone za pomocą dwukierunkowej analizy ANOVA w programie EZ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie immunoblottingu wykazało poziomy LC3-II i TSG101 we frakcji komórkowej, frakcji P1 EV bogatej w mikropęcherzyki i frakcji P2 EV bogatej w egzosomy. Obrazowanie żywych komórek wykorzystano do zbadania autofagosomów, autolizosomów i omegasomów, dostarczając informacji na temat tego, czy knockdown STX6 wpływa na autofagię. Te połączone wyniki sugerują, że knockdown STX6 wpływa na uwalnianie LC3-II dodatnich EV, potencjalnie związanych z rozregulowaniem szlaku autofagii. Kluczową zaletą tej metody j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Podziękowania

Ta praca została wsparta funduszami dla Y.T. od Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI [Numer grantu 23K06837] (Tokio, Japonia) i Takeda Science Foundation (Osaka, Japonia). Autorzy doceniają dr Davida C. Rubinszteina (Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, Wielka Brytania) za dostarczenie komórek HeLa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25 % Trypsyna EDTAFujifilm Wako201-16945
10 cm NaczynieThermo Fisher Scientific150464
15 mLRurka Thermo Fisher Scientific339650
200 μ L Końcówka do pipetNippon GeneticsFG-301pipetowanie
2-merkaptoetanoluNacalai Tesque21417-52materiał do
próbki roztwór buforowy
3,3'-diaminobenzydyny TetrachlorowodorekNacalai Tesque11009-41materiał do roztworu DAB
3,5 cm Naczynie Naczynie Thermo Fisher Scientific150460
6 cm TrueLineTR4001
Wanny termostatyczne z blokiem aluminiowym (suche kąpiele termiczne)EYELA273860
AspiratorSANSYOSAP-102roztwór do inhalacji
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomycyna A1AdipogenBVT-0252
anty-króliczej IgG koniugugowane biotyną Laboratoria BA-10002nd przeciwciało do immunoblottingu
Laboratoria wektorówprzeciwciał przeciwko mysim przeciwciałom IgG sprzężonym z biotynąBA-20002. przeciwciało do immunoblottingu
Blocking OneNacalai Tesque03953-95materiał do immunoblottingu
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61materiał do
roztworu buforowego próbki
Surowica cielęcacytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
Wirówka 5702 Reppendolf5703000039
Szkiełka zliczające Dwukomorowezliczanie komórekBio-Rad1450015J
Cyfrowy sonifier 450BRANSON
DimetylosulfotlenekNacalai Tasque09659-14nośnik
DMEM Wysoka zawartość glukozyNacalai Tesque08458-45pożywka hodowlana
DMEM bez czerwieni fenolowejNacalai Tesque08489-45pożywka hodowlana
EGTADojindo 348-01311materiał do rozwiązania A68
ExcelMicrosoftwersja 16.16.27analiza satystyczna
EZRNr referencyjny 24wersja 1.68analiza zadowalająca
FBSSigma173012Pożywka hodowlana
FidżiNIHNarzędzie do analizy obrazu
GlycerolNacalai Tesque09886-05materiał na
roztwór buforowy do próbek
Hoehst33342Dojindo H342
Nadtlenek wodoruFujifilm Wako080-0186materiał do roztworu DAB
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011chusteczka czyszcząca
Rurka o niskiej retencjiNippon GeneticsFG-MCT015CLBtransfekcja siRNA i DNA
LSM780 Konfokalny mikroskop laserowyCarl Zeiss
Anti-LC3 PrzeciwciałoMBLM186-31. przeciwciało do immunoblottingu
Chlorek niklu(II) sześciowodnyFujifilm Wako149-01041materiał do roztworu DAB
N-lauroilsarkozyna sól sodowaNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltrawirówkaBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Zredukowana surowica MediumThermo Fisher Scientific31985-070transfekcja siRNA i DNA
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penicylina/StreptomycynaNacalai Tesque26253-84Pożywka
hodowlana Zestawy do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
Poliklonalne przeciwciało anty-PCNA królikaBioAcademia70-0801. przeciwciało dla immunoblotting
Poliklonalne przeciwciało antysyntaksyny królika 6ProteinTech10841-1-AP1. przeciwciało do immunoblottingu
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-TSG101ProteinTech28283-1-AP1. przeciwciało do immunoblottingu
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-ULK1ProteinTech20986-1-AP1. przeciwciało do immunoblottingu
Polifluorek winylidenu MembranaMillioreIPVH00010materiał do immunoblottingu
RRozwój R Core Teamwersja 4.4.1analiza satystyczna
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778odczynnik do transfekcji siRNA
STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604siRNA do transfekcji
Chlorek soduNacalai Tesque31320-05materiał do buforu Tris
i roztworu A68
Dodecyl siarczan soduFujifilm Wako192-13981materiał do
roztworu buforowego próbki
SPARK Czytnik mikropłytekTECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific12935300transfekcja siRNA
SacharozaFujifilm Wako193-00025materiał do roztworu A68
Automatyczny licznik komórek TC20 z drukarką termicznąBio-Rad1450109J1zliczanie komórek
Kąpiel termicznaTOKYO RIKAKIKAIMG-3100inkubacja
TransIT-293Odczynnik do transfekcji DNAMirus BioMIR 2700
TransIT-LT1Odczynnik
do transfekcji DNA Mirus Bio MIR2300Tris(hydroksymetylo)aminometanNacalai Tesque35406-75materiał na bufor Tris, bufor próbki i roztwór A68
Trypan Blue Dye 0,40%Bio-Rad1450021zliczanie komórek
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm Zbieranie 361706 Beckman Coulterdo frakcji P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mmBeckman Coulter344059zbieranie do frakcji P2 EV
Vectastain ABC Standard KitVector Laboratories PK-4000butelka do
myciaAs One1-4640-02membrana myjąca
μ-Slide 8 Well Highibidi80806
Wektor przeciwciała   Mysz monoklonalna immunologicznego

Bibliografia

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550(2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Szlak autofagiipatologia TDP-43wirowanie różnicowebafilomycyna A1immunoblottingwyciszanie siRNAsyntaksyna-6ciała wielopęcherzykowe
Ocena uwalniania LC3-II przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w odniesieniu do akumulacji wewnątrzkomórkowych pęcherzyków LC3-dodatnich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.