Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjne znakowanie końcowe i enkapsulacja długich RNA w mikroskopii jednocząsteczkowej FRET-TIRF

DOI:

10.3791/67391

⸱

18 października 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje dwukolorowe znakowanie długich RNA na końcach i ich unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację w pęcherzykach fosfolipidowych dla zastosowań mikroskopii pojedynczej cząsteczki FRET TIRF. Połączenie tych technik umożliwia precyzyjną wizualizację i analizę dynamiki RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) przoduje w badaniu dynamicznych biomolekuł, umożliwiając precyzyjną obserwację ich zmian konformacyjnych w czasie. Aby monitorować dynamikę RNA za pomocą smFRET, opracowaliśmy metodę kowalencyjnego znakowania RNA na ich końcach za pomocą pary fluoroforów FRET. Ta strategia bezpośredniego znakowania końcowego jest ukierunkowana na 5'-fosforan przez aktywację karbodimidu (EDC)/N-hydroksysukcynimidu (NHS) oraz 3'-rybozy przez utlenianie periodyczne, które można dostosować do innych RNA niezależnie od ich wielkości i sekwencji, aby badać je niezależnie od sztucznych modyfikacji. Ponadto aktywacja 5'-EDC/NHS jest przedmiotem ogólnego zainteresowania wszystkich kwasów nukleinowych z 5'-fosforanem. Zastosowanie dostępnych na rynku substancji chemicznych eliminuje potrzebę syntezy sond specyficznych dla RNA.

Mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) wymaga, aby unieruchomione powierzchniowo cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania znajdowały się w polu ulotnym, które ma być oświetlone. Wyrafinowanym sposobem utrzymywania cząsteczek RNA w ulotnym polu jest zamknięcie ich w pęcherzykach fosfolipidowych. Hermetyzacja korzysta z tego, co najlepsze z obu światów, wiążąc cząsteczkę z powierzchnią, umożliwiając jednocześnie swobodną dyfuzję cząsteczki. Zapewniamy, że każdy pęcherzyk zawiera tylko jedną cząsteczkę RNA, co umożliwia obrazowanie pojedynczej cząsteczki. Po podwójnym znakowaniu końca i enkapsulacji interesującego RNA, pomiary smFRET oferują dynamiczny i szczegółowy wgląd w zachowanie RNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) to potężna i czuła technika do badania między- i wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań biomolekuł w nanoskali. Opiera się na nieradiacyjnym transferze energii ze wzbudzonej cząsteczki donorowej do pobliskiej cząsteczki akceptora, który zachodzi na odległościach zwykle od 1 nm do 10 nm. Odległość między barwnikami donorowymi i akceptorowymi decyduje o efektywności tego transferu energii, co sprawia, że FRET jest nieocenionym narzędziem do badania dynamiki molekularnej, zmian konformacyjnych i interakcji w szerokim zakresie systemów biologicznych1,2, w tym RNA. Mikroskopia z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencji (TIRF) okazała się potężną techniką do badań smFRET, ponieważ selektywnie oświetla cząsteczki tylko blisko powierzchni, umożliwiając dynamikę FRET poszczególnych cząsteczek z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Jednak przed wykonaniem eksperymentów smFRET-TIRF cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania musi najpierw zostać fluorescencyjnie znakowana odpowiednią parą FRET, a następnie unieruchomiona na powierzchni mikroskopii. Opisany tutaj protokół smFRET-TIRF został zwalidowany przy użyciu intronu Sc.ai5γ grupy II typu dzikiego z mitochondriów Saccharomyces cerevisiae, otoczonego przez jego dwie sekwencje egzoniczne (915 nukleotydów)3. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat intronów grupy II znakowania fluorescencyjnego i ich unieruchomienia w mikroskopii smFRET TIRF, zapoznaj się z naszą recenzją4.

Idealna strategia znakowania RNA specyficzna dla danego miejsca pozwoliłaby na precyzyjne wprowadzanie barwników donorowych i akceptorowych w określonych pozycjach bez zmiany struktury lub funkcji RNA, zapewniając dokładne i efektywne pomiary FRET. Jest to trudne ze względu na podobieństwa chemiczne między czterema zasadami nukleotydowymi, co komplikuje selektywne znakowanie. Znakowanie końcowe wiąże barwniki donorowe i akceptorowe z końcami RNA, celując w 5'-fosforan i 3'-rybozę. Podejście to oferuje minimalnie inwazyjne podejście, a jednocześnie dostarcza cennych informacji na temat dynamiki strukturalnej i interakcji. Zdolność intronu grupy II do samołączenia w obecności Mg2+ ogranicza stosowanie enzymów zależnych od jonów metali. W tym miejscu przedstawiamy podejście do podwójnie znakowanych końcowych długich i katalitycznie aktywnych RNA (rybozymów), które omijają potrzebę enzymów lub syntezy wyspecjalizowanych sond.

Powszechnym podejściem do przywiązania cząsteczek RNA do powierzchni dla mikroskopii TIRF jest kowalencyjne połączenie ugrupowania biotyny bezpośrednio z RNA lub hybrydyzacja antysensownego oligonukleotydu przenoszącego biotynę (ASO)5,6,7. Jednak ta metoda bezpośredniego unieruchomienia może wprowadzać artefakty spowodowane interakcjami RNA-powierzchnia, potencjalnie powodując nieprawidłowo sfałdowane RNAs8. Eleganckim rozwiązaniem łagodzącym te artefakty immobilizacji jest enkapsulacja RNA w powierzchniowo przyczepionych nanoskalowych pęcherzykach fosfolipidowych9,10,11. Te pęcherzyki, które mają średnicę około 100 nm, są zakotwiczone na powierzchni poprzez połączenie biotyna-streptawidyna12,13,14, umożliwiając swobodną dyfuzję RNA wewnątrz, umożliwiając jednocześnie wymianę jonów przez błonę lipidową10. Po kowalencyjnym znakowaniu dużego funkcjonalnego RNA3, przedstawiamy podejście do enkapsulacji takich RNA w pęcherzykach fosfolipidowych poprzez połączenie ustalonych protokołów pasywacji powierzchniowej i enkapsulacji pęcherzyków, dostosowanych do zachowania funkcjonalności RNA10,11,14. To podejście oparte na podwójnym znakowaniu i enkapsulacji pozwala osiągnąć wysoki wskaźnik monoenkapsulacji funkcjonalnych RNA w mikroskopii smFRET TIRF.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Podwójne znakowanie końcowe RNA

UWAGA: Poniższy protokół opisuje specyficzne dla miejsca znakowanie RNA parą fluoroforów FRET poprzez kowalencyjne dołączenie barwnika donorowego (sCy3) do 5'-fosforanu i barwnika akceptorowego (Cy5) do 3'-rybozy. Katalitycznie aktywny długi RNA, rybozym intron grupy II, jest wybierany jako RNA będący przedmiotem zainteresowania. Tabela 1 i Rysunek 1 podsumowują ten protokół etykietowania z podwójnym końcem. Wykonuj wszystkie kroki związane z fluoroforami w ciemnych warunkach.

Dzień 0 ▪ Porcja 50-75 μg RNA do całkowitej objętości 55 μL na probówkę 1,5 ml.
Dzień 15′-Aktywacja fosforanów
▪ Dodać 45 μL świeżo przygotowanego roztworu EDC-NHS, pH 6,0 do RNA w ddH2O do końcowej objętości 100 μL, dobrze wymieszać i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 25 °C i 500 obr./min.
▪ Oczyszczanie rundy 1: Nocne wytrącanie EtOH.
Dzień 2 ▪ Wytrącić aktywowane 5′ RNA, umyć i wysuszyć.
5′-Barwnik nasadka
▪ Zawiesić ponownie w 95 μL 100 mM MOPS, pH 7,5.
▪ Dodaj 5 μl 2 mM roztworu barwnika funkcjonalizowanego aminami.
▪ Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 16 godzin w temperaturze 25 °C i 500 obr./min.
Dzień 3 ▪ Runda oczyszczania 2: Wytrącanie EtOH.
Dzień 4 ▪ Wytrącić aktywowane 5′ RNA, umyć i wysuszyć.
Krok blokujący
▪ Zawiesić w 100 μL 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C i 500 obr./min.
▪ Runda oczyszczania 3: Filtracja odśrodkowa.
→ Rozpuść RNA znakowane 5′.
Dzień 53′-Okresowe utlenianie
▪ Inkubuj RNA z 20 mM NaIO4 w 50 mM buforze NaOAc, pH 5,5 w końcowej objętości 100 μL przez 2 godziny w temperaturze 25 °C i 500 obr./min.
▪ Ugasić nadmiar periodatu: Dodać 30 μl 50% glicerolu, dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C i 500 obr./min.
▪ Oczyszczanie runda 4: Nocne wytrącanie EtOH.
Dzień 6 ▪ Wytrącić utlenione 3′ RNA, umyć i wysuszyć.
3′-Barwnik
▪ Zawiesić ponownie w 95 μL 50 mM NaOAc, pH 6,0.
▪ Dodaj 5 μl 2 mM roztworu barwnika funkcjonalizowanego hydrazydem. Dobrze wymieszać i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 25 °C i 500 obr./min.
Dzień 7 ▪ Runda oczyszczania 5: Wytrącanie EtOH.
Dzień 8 ▪ Wytrącić oznaczone RNA, umyć i wysuszyć.
▪ Filtracja odśrodkowa.
→ Usuń podwójnie oznaczone RNA.

Tabela 1: Podsumowanie protokołu dla znakowania podwójnego końca RNA. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Eksperymentalny przebieg etykietowania na dwóch końcach poprzez celowanie w cukier 5'-fosforan i cukier 3'-rybozy. 5'-fosforan jest aktywowany za pomocą EDC w obecności NHS, a następnie jest sprzężony z barwnikiem funkcjonalizowanym aminami. Ugrupowanie 3'-diolu RNA jest utleniane przez aktywność periodyczną do dialdehydu, który dalej reaguje z barwnikiem funkcjonalizowanym hydrazydem. W przypadku etykietowania z podwójnym końcem ważne jest, aby rozpocząć od etykietowania 5', aby zapobiec etykietowaniu krzyżowemu, a następnie etykietowania 3' z pośrednim etapem blokowania. Skróty: EDC = karbokodiimid; NHS = N-hydroksysukcynimid; MOPS = kwas 3-morfolinopropano-1-sulfonowy; NaOAc = octan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Etykietowanie 5'-końca: Celowanie w 5'-fosforan przez aktywację EDC/NHS
    UWAGA: Ta metoda znakowania 5' ma zastosowanie nie tylko do RNA, ale do każdego jednoniciowego kwasu nukleinowego zawierającego 5'-fosforan. Specyficzność reakcji zależy od zależności pH, co pozwala na celowanie tylko w fosforan 5' w określone miejsce, pomimo obecności wielu fosforanów w szkielecie RNA. Przy pH 6,0 unikalna reaktywność 5'-fosforanu w stosunku do karbodiimidów wynika z jego specyficznego stanu protonowania, w którym dwa tleny są deprotonowane, a jeden pozostaje protonowany. To sprawia, że 5'-fosforan jest reaktywny, podczas gdy w pełni zdeprotonowane fosforany szkieletowe pozostają niereaktywne, umożliwiając selektywne znakowanie końca 5' poprzez celowanie EDC/NHS.
    1. Przygotować roztwór EDC-NHS-NaOAc o pH 6,0. Zmieszać 1,5 mg EDC i 2,0 mg NHS na podwielokrotność w 35 μL ddH2O i 10 μL 0,5 M NaOAc, pH 6,0 (pH skorygowane lodowatym kwasem octowym).
    2. Podwielokrotnić interesujący RNA na około 50-75 μg RNA na probówkę w 55 μl ddH2O. Dodać 45 μl mieszaniny EDC-NHS-NaOAc, pH 6,0 do RNA, osiągając całkowitą objętość 100 μl przy końcowych stężeniach 78 mM EDC, 174 mM NHS i 50 mM NaOAc, Odczyn pH 6,0. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 500 obr./min.
      UWAGA: Tutaj 70 μg odpowiada 250 pmol transkrybowanego in vitro 915 nt RNA i 2,5 μM w końcowej objętości reakcyjnej 100 μL.
    3. Runda oczyszczania 1: Oczyść RNA aktywowane 5'-fosforanem przez wytrącanie EtOH.
    4. Przygotować 2 mM sulfonowany roztwór cyjaniny3aminy (sCy3-aminy) w wodzie.
    5. Ponownie zawiesić aktywowany osad RNA w 95 μl 100 mM buforu kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS) o pH 7,5 (pH skorygowane za pomocą NaOH). Dodać 5 μl 2 mM roztworu sCy3-aminy do aktywowanego RNA. Sprzęgnąć fluorofor z aktywowanym 5'-fosforanem przez inkubację przez 16 godzin w temperaturze 25 °C, wytrząsając przy 500 obr./min.
      UWAGA: Przechowuj bufor MOPS w temperaturze 4 °C w ciemności. NaOH wybiera się do dostosowania pH, aby utrzymać nieaktywny rybozym intronu grupy II. Fluorofor powinien być co najmniej 40-krotnym nadmiarem RNA.
    6. Runda oczyszczania 2: Zwiększ objętość, dodając 200 μl ddH2O w celu poprawy separacji. Oczyść RNA znakowane 5'-fosforanem przez wytrącanie EtOH i powtarzaj, aż supernatant stanie się bezbarwny (zwykle potrzebne są dwie rundy).
    7. Etap blokowania: Zawiesić RNA w 100 μl 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C i 500 obr./min. Tylko w przypadku pojedynczego znakowania 5' należy pominąć etap blokowania, ponownie zawiesić RNA w ddH2O i przejść do kroku 1.1.8. Jednak dla uproszczenia, w przypadku podwójnego etykietowania, oddziel kontrolkę z pojedynczym znacznikiem na końcu 5' dopiero po kroku 1.1.9.
      UWAGA: Ten krok służy do blokowania aktywowanych 5'-fosforanów, które nie zostały sprzężone z fluoroforem funkcjonalizowanym aminami, poprzez reakcję ze stosunkowo mniejszym pierwotnym źródłem amin (np. Tris) w celu zminimalizowania ryzyka znakowania krzyżowego z fluoroforem funkcjonalizowanym hydrazydem, który jest używany w protokole znakowania końca 3'.
    8. Runda oczyszczania 3: Usunąć wolne barwniki, przemłukując znakowany RNA przez filtrację odśrodkową łącznie co najmniej 10 ml ddH2O, a następnie eluować w ddH2O.
      UWAGA: Odcięcie molekularne filtra powinno być mniejsze niż połowa wielkości kwasu nukleinowego. Zamiast ddH2O. Elucja powinna być zgodna z instrukcjami producenta, upewniając się, że próbka nie jest wirowana do całkowitego wyschnięcia.
    9. Określić stężenia RNA i sprzężonego barwnika za pomocą spektroskopii UV-Vis.
  2. Znakowanie końca 3': Celowanie w 3'-rybozę poprzez utlenianie periodyczne
    1. Podwielokrotnić RNA znakowany na końcu 5' w ddH2O, aby uzyskać około 50-75 μg RNA na probówkę w 90 μl. Jeśli objętość elucji w poprzednim etapie była wysoka, co skutkowało niskim stężeniem, zagęścić RNA, wytrącając i ponownie zawieszając osad w ddH2O. Dodać 5 μl 1,0 M buforu NaOAc o pH 5,5 (co odpowiada 50 mM NaOAc, pH 5,5 dla 100 μl objętości reakcji).
      UWAGA: Podobnie jak w przypadku pojedynczo znakowanego RNA na końcu 5', rutynowo przygotowujemy pojedynczo znakowany RNA na końcu 3' jako kontrolę. Aby to zrobić, podwielokrotn nieznakowany RNA, aby miał około 50-75 μg RNA na probówkę w 86 μl ddH2O.
    2. Dodać 4 μl świeżo przygotowanego 500 mM roztworu podstawowego metaperiodianu sodu (NaIO4) (co odpowiada 10 mM NaIO4 na 100 μl objętości reakcyjnej). W przypadku pojedynczego znakowania 3' dodać 8 μl roztworu podstawowego NaIO4 (co odpowiada 20 mM NaIO4 na 100 μl objętości reakcji). Dokładnie wymieszać i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 500 obr./min w ciemnych warunkach, ponieważ NaIO4 jest wrażliwy na światło.
      UWAGA: Nie zmieniaj kolejności dodawania ani nie wydłużaj czasu inkubacji, ponieważ może to spowodować fotowybielanie dołączonego barwnika dawcy. Stężenie NaIO4 stosowanego jest zmniejszane o połowę w przypadku etykietowania na dwóch końcach, aby zminimalizować hartowanie już dołączonego barwnika na końcu 5'.
    3. Zatrzymaj reakcję, dodając 30 μl 50% glicerolu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C, wytrząsając z prędkością 500 obr./min.
      UWAGA: Glicerol służy jako diol do gaszenia nadmiaru periodianu.
    4. Runda oczyszczania 4: Dodać 400 μl lodowatej mieszaniny wytrącającej EtOH-NaOAc i przeprowadzić wytrącanie etanolu.
    5. Zawiesić utlenioną osadę RNA w 95 μl 50 mM NaOAc, pH 6,0.
    6. Przyłączanie do barwnika hydrazydowego: Przygotować roztwór fluoroforu, rozpuszczając kilka kryształów hydrazydu cyjaniny5 (Cy5-hydrazydu) w DMSO, a następnie rozcieńczając ddH2O do stężenia 2 mM. Jeśli wybrany fluorofor jest rozpuszczalny w wodzie, przygotuj roztwór w ddH2O. Dodać 5 μl 2 mM roztworu cy5-hydrazydu do utlenionego RNA. Dobrze wymieszać i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 25 °C, wstrząsając z prędkością 500 obr./min.
      UWAGA: Fluorofor powinien być co najmniej 40-krotnie nadmiarem RNA.
    7. Runda oczyszczania 5: Oczyść podwójnie znakowany RNA (lub pojedynczo znakowany RNA na końcu 3') przez wytrącanie EtOH i filtrację odśrodkową, podobnie jak w krokach 1.2.6 i 1.2.8, odpowiednio, i eluuj w ddH2O.
    8. Obliczyć stężenia RNA i sprzężonego barwnika za pomocą spektroskopii UV-Vis.
    9. Scharakteryzować znakowany RNA za pomocą analitycznych testów na bazie żelu, zespołowej spektroskopii fluorescencyjnej (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki) i/lub analitycznej HPLC, jak pokazano w innym miejscu3.

2. Przygotowanie komory mikroprzepływowej

UWAGA: Zalecamy obsługę sześciu lub ośmiu komór na raz. Sonikacja odbywa się w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej. Protokół ten ogranicza stosowanie rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton, aby zapobiec rozpuszczalności śladowych zanieczyszczeń. Aby uzyskać alternatywy, zapoznaj się z odwołaniami15,16.

  1. czyszczenie
    1. Wywierć cztery otwory w szkiełkach kwarcowych za pomocą wiertła diamentowego zgodnie ze schematem podanym w Rysunek 2A, aby utworzyć dwa kanały.
      UWAGA: Chociaż szkiełka podstawowe mogą łatwiej pękać podczas wiercenia, są one opłacalną alternatywą dla szkiełek kwarcowych w obiektywnych konfiguracjach mikroskopowych TIRF, w których szkiełko nakrywkowe jest powierzchnią obrazowania (Rysunek 2B). Nie jest to opcja w przypadku konfiguracji TIRF opartych na pryzmacie, w których szkiełko mikroskopowe jest powierzchnią obrazowania ze względu na fluorescencję tła.
      UWAGA: Alternatywnie, zużyte komory mikroprzepływowe można poddać recyklingowi16. W tym celu zanurz używane komory na noc w acetonie (zawiń słoik do barwienia Coplin w folię aluminiową, aby zminimalizować parowanie) w dygestorium, a następnie poddaj sonikacji przez 5 minut. Zdemontuj komorę i wyrzuć szkiełka nakrywkowe i naklejki. Jeśli demontaż nie zadziała natychmiast, poddaj komorę sonikacji w acetonie jeszcze przez 10 minut. Przejdź do kroku 2.1.2.
    2. Umieść wywiercone szkiełka kwarcowe i około dwa razy więcej szkiełek nakrywkowych (ponieważ mogą łatwo pękać) w szklanym słoiku do barwienia Coplin z pokrywką. Przepłukać 3x ddH2O. Sonikować w ddH2O przez 5 min, następnie spłukać 3x ddH2O.
    3. Sonikować w 10% roztworze do czyszczenia szkła laboratoryjnego (patrz Tabela Materiałów) przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Płukać co najmniej 3 razy za pomocą ddH2O, aż znikną pęcherzyki detergentu. Sonikacja w ddH2O przez 5 min. Spłukać 3x za pomocą ddH2O.
    4. Sonikować w 1 M roztworze KOH przez 30 minut, a następnie pozostawić na noc. Płukać 3x za pomocą ddH2O. Sonicate w ddH2O przez 5 min. Przepłukać 3x środkiem ddH2O.
      UWAGA: Chociaż korozja spowodowana nadmierną inkubacją jest problemem wcześniej podniesionym przez Chandradoss et al.15, zalecamy tę długą inkubację, która pozwala uniknąć trawienia Piranii.
    5. Osuszyć szkiełka podstawowe i nakrywkowe roztworemN2g.
    6. Wysuszone szkiełka i szkiełka nakrywkowe należy traktować środkiem do czyszczenia plazmą tlenową przez 30 minut zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Aminozylanizacja
    1. Przygotować 3% roztwór APTES-EtOH, dokładnie mieszając 288,5 ml absolutnego EtOH, 1,5 ml ddH2O i 9 ml (3-aminopropylo)trietoksysilanu (APTES) w 500 ml kolby Erlenmeyera.
    2. Umieść czyste szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia Coplin, zanurz w 3% roztworze APTES-EtOH, sonikuj przez 1 minutę i inkubuj przez 30 minut.
    3. Przepłukać 3x absolutnym EtOH, a następnie 3x ddH2O.
    4. Wysuszyć szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe pod przepływemN2(g).
  3. Pasywacja powierzchniowa i biotynylacja
    1. Przygotuj wilgotny pojemnik, wypełniając puste pudełko z końcówką do pipet do połowy ddH2O. Umieść szkiełka wewnątrz pudełka, stroną przeznaczoną do leczenia.
    2. Świeżo przygotować mieszaninę bPEG-mPEG w sterylnie czystej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, delikatnie mieszając 2 mg walerianianu biotyny, glikolu polietylenowego i sukcynimidylu 5000 (biotyna-PEG-SVA) i 80 mg glikolu metoksypolietylenowego-walerianianu sukcynimidylu (mPEG-SVA) w 640 μl 100 mM buforu wodorowęglanu sodu (NaHCO3) o pH 8,3. Odwirować mieszaninę bPEG-mPEG o stężeniu 16 000 × g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
    3. Ostrożnie usunąć supernatant i dodać kroplę o wielkości 30 μl na środek szkiełka, aby pokryć oba kanały. Umieść dodatkową kroplę po jednej stronie szkiełka, aby mieć dodatkowe szkiełko nakrywkowe z PEGylacją, ponieważ łatwo się łamią, a zapasowe jest przydatne. Na koniec przykryj kroplę czystym szkiełkiem nakrywkowym, zamknij wilgotne pudełko i przeprowadź pegylację przez noc w ciemnych warunkach.
    4. Dokładnie spłukać pasywowane PEG i biotynylowane szkiełka nakrywkowe ddH2O. Zwrócić uwagę na zmianę hydrofobowości obrabianych powierzchni. Suszyć pod przepływemN2(g).
  4. Zespół komory mikroprzepływowej
    1. Wytnij dwustronną naklejkę, aby utworzyć kanały. Przymocuj naklejkę do slajdu, upewniając się, że zakrywa obszar zainteresowania. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, wyrównując je tak, aby powierzchnie PEGylowane były skierowane do siebie.
    2. Umieścić każdą zmontowaną komorę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, napełnić probówkiN2(g) i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Mikroskopia jednocząsteczkowa FRET-TIRF. (A) Komora mikroprzepływowa do obrazowania TIRF. (B) RNA znakowane FRET jest zamknięte w biotynylowanym pęcherzyku fosfolipidowym i unieruchomione na powierzchni szkła pokrytego steptawidyną. W ten sposób cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania pozostaje w ulotnym polu (szary gradient), które jest tworzone przez padające światło, które jest całkowicie odbijane pod krytycznym kątem w mikroskopii TIRF. W tym przypadku oba fluorofory są następnie wzbudzane za pomocą schematu ALEX. Skróty: FRET = Förster Resonance Energy Transfer; TIRF = całkowita fluorescencja odbicia wewnętrznego; ALEX = alternatywne wzbudzenie laserowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Enkapsulacja pęcherzyków fosfolipidowych

  1. Przygotowanie ciasta lipidowego
    UWAGA: Z chloroformem należy zawsze obchodzić się pod wyciągiem.
    1. Za pomocą sterylnej igły przebij otwory w pokrywie (od wewnątrz na zewnątrz) sterylnie czystych probówek do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml, jak pokazano na Rysunek 3A.
    2. Przygotować roztwór podstawowy biotynylu (bPE) 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-kap, rozpuszczając co najmniej 2 mg bPE w odpowiedniej ilości chloroformu do końcowego stężenia 1 mg/ml.
    3. Przygotować roztwór podstawowy 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DMPC), rozpuszczając co najmniej 10 mg DMPC w odpowiedniej ilości chloroformu do końcowego stężenia 10 mg/ml.
    4. Przygotować mieszaninę bPE-DMPC (zachowując stosunek 1:99 w/w), mieszając 100 μl bPE i 990 μl roztworów podstawowych DMPC. Rozprowadzić 109 μl mieszaniny bPE-DMPC w probówce o pojemności 2 ml.
    5. Umieść tekturową wkładkę do przegrody komórkowej w pudełku do przechowywania mikroprobówek w kolbie Schlenka, służąc jako uchwyt na probówkę. Za pomocą długiej pęsety umieść probówki zawierające mieszaninę lipidów w uchwycie probówki w kolbie Schlenka o pojemności 500 ml (Rysunek 3B).
      UWAGA: Upewnij się, że są ustawione pionowo i nie są przechylone.
    6. Odparować chloroform pod niskim przepływemN2(g) przez noc (lub przez co najmniej 2 godziny, aż rozpuszczalnik zostanie całkowicie odparowany).
    7. Uszczelnij rurki za pomocą Parafilm, aby zakryć otwory. Ciastka lipidowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca.
  2. Enkapsulacja RNA
    1. Przygotować następujące i roztwory, dostosowując stężenia K+ iMg2+ zgodnie z interesującym układem biologicznym.
      1. Przygotuj 5x bufor standardowy (5x SB): 2,5 M KCl, 400 mM MOPS; dostosuj pH do 6,9 za pomocą KOH, sterylnego filtra i przechowuj w temperaturze 4 °C w ciemności (odpowiednio 1x SB: 500 mM KCl, 80 mM MOPS, pH 6,9).
      2. Przygotować bufor zapobiegający mruganiu (AB): 100 mM MgCl2, Trolox, 1x SB, sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 tygodnia.
        UWAGA: Użyj końcówki szpatułki Trolox do uzyskania 10 ml końcowej objętości, wymieszaj i ponownie wyreguluj pH.
    2. Zmontować wytłaczarkę za pomocą membrany poliwęglanowej (PC) 100 nm i tarczy spustowej z poliestru (PE) o średnicy 10 mm, zrównoważyć strzykawkę i membrany za pomocą AB i podgrzać do 30 °C (lub zasadniczo powyżej temperatury zeszklenia DMPC wynoszącej 24 °C).
    3. Zmieszać 5 μl 1 μM znakowanego podwójnie końcowego RNA i 45 μL AB (do całkowitej objętości 50 μL).
    4. Uwodnić ciastko lipidowe tym roztworem RNA. W temperaturze 30 °C mieszać przez 5 minut, wstrząsając z prędkością 1 400 obr./min, a następnie przez 15 minut z prędkością 700 obr./min. Wirować przez 2 minuty przy 13 000 g i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki.
    5. Rozcieńczyć próbkę 250 μl AB.
    6. Napełnić strzykawkę zawiesiną RNA-lipid. Wytłaczaj 35x w temperaturze 30 °C na bloku grzewczym, aby zamknąć w kapsułkach RNA znakowane podwójnie końcami w pęcherzykach fosfolipidowych o średnicy 100 nm.
      UWAGA: Rozkład wielkości pęcherzyków po użyciu ekstrudera można zweryfikować za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), jak pokazano w reference11.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przygotowanie ciasta lipidowego. (A) Nasadki probówek są nakręcane, aby umożliwić odparowanie rozpuszczalnika. (B) Probówki zawierające mieszaninę lipidów umieszcza się w kolbie Schlenka, a chloroform odparowuje się w celu uzyskania zbryłku lipidowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. mikroskopia smFRET-TIRF

  1. Unieruchomienie powierzchni
    1. Przygotuj następujące i roztwory.
      1. Przygotować bufor przeciw mruganiu cukru (SAB): 1% D-glukozy (w/v) w AB, sterylnym filtrze i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 tygodnia.
      2. Przygotuj 100x OSS: 100x System oczyszczania tlenu (OSS): 3 mg oksydazy glukozowej (odpowiadającej 1,7 U), 10 μL katalazy (odpowiadającej 22 U) w 90 μL 1x SB, przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 tygodnia.
      3. Świeżo przygotować bufor do obrazowania (IB), mieszając 198 μl SAB i 2 μl 100x roztworu OSS.
    2. Pozwól, aby komora mikroprzepływowa osiągnęła temperaturę pokojową. Przepłukać komorę 2x 200 μL 1x SB.
    3. Napełnij komorę 50 μl 20 μl/ml roztworu streptawidyny i inkubuj przez 5 minut.
    4. Przepłukać komorę 200 μL 1x SB, a następnie 100 μL AB.
    5. Unieruchomić kapsułkowany RNA na powierzchni, dodając 75 μl zawiesiny pęcherzyków i inkubować przez 10 minut.
    6. Przepłukać komorę 200 μl świeżo przygotowanego IB i inkubować przez 5 minut.
    7. Komora jest teraz gotowa do akwizycji danych (Rysunek 2B). Aby zapobiec parowaniu podczas długich pomiarów, uszczelnij otwory, jak pokazano na Rysunek 2A. Jeśli nieszczelności z kanału do kanału są niepokojące, należy uszczelnić nieużywany kanał przed uruchomieniem protokołu unieruchomienia powierzchni.
      UWAGA: Zalecamy wykonanie ślepych pomiarów w celu sprawdzenia czystości komór mikroprzepływowych i pęcherzyków fosfolipidowych pod kątem zanieczyszczeń fluorescencyjnych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy specyficzne dla miejsca znakowanie pojedynczym i podwójnym fluorescencyjnym 915-nt RNA będącego przedmiotem zainteresowania, mitochondrialnego intronu drożdży Sc.ai5γ grupy II, otoczonego sekwencjami egzonicznymi. Para fluoroforów FRET jest umieszczana na końcach RNA poprzez aktywację EDC/NHS 5'-fosforanu i okresowe utlenianie 3'-rybozy, po którym następują odpowiednie przyłączenia barwnika. Następnie zweryfikowaliśmy koniugaty RNA-barwnik za pomocą fluorescencyjnej elektroforezy żelowej, jak przedstawiono w Rysunek 4A. Komigracja RNA i fluoroforów na żelu agarozowym potwierdza udane znakowanie. Następnie, jak pokazano w Rysunek 4B, do scharakteryzowania podwójnie znakowanego intronu grupy II użyto zespołowej spektroskopii fluorescencyjnej. Transfer energii, czyli FRET, zaobserwowano po wzbudzeniu barwnika dawcy, co dowodzi podwójnego znakowania RNA. Warto zauważyć, że zgodnie z zależnym od odległości charakterem FRET, fałdowanie intronu RNA grupy II w obecności jonów metali doprowadziło do wzrostu wydajności FRET, o czym świadczy spadek emisji donorów (zielona strzałka) i odpowiadający mu wzrost emisji akceptora (czerwona strzałka). Oznacza to, że to znakowanie FRET śledzi zmiany konformacyjne rybozymu.

figure-results-1
Rysunek 4: Charakterystyka koniugatów RNA-barwnik. (A) Analityczna analiza RNA znakowanego jedno- i podwójnie fluorescencyjnie za pomocą żelu pokazuje komigrację barwników z RNA na 2% żelu agarozowym. Kolokalizacja fluoroforów w podwójnie znakowanej próbce jest wskazywana przez żółty pasek na scalonym obrazie (na dole) kanałów Cy3 (górny, zielony) i Cy5 (środkowy, czerwony), uwidoczniony odpowiednio w oświetleniu 532 nm i 635 nm. Tor 1: 5'-sCy3 znakowany tylko RNA, tor 2: 3'-Cy5 znakowany tylko RNA, a tor 3: podwójny koniec (5'-sCy3 i 3'-Cy5) znakowany RNA. (B) Zespołowa spektroskopia fluorescencyjna potwierdza podwójne znakowanie. Transfer energii po wzbudzeniu donora (λex = 515 nm, λem = 670 nm) sprawdza, czy oba barwniki są pomyślnie sprzężone z RNA. Szara krzywa reprezentuje profil emisji prekatalitycznego RNA, podczas gdy krzywa pokazuje zwiększoną wydajność FRET w złożonym intronowym RNA grupy II (inkubowanym z 500 mM KCl w temperaturze 70 °C przez 3 min, schładzonym do 42 °C przez 5 min, a następnie dodawanym 100 mM MgCl2). Rysunek ten został zaadaptowany z Ahunbay et al.3 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Z fluorescencyjnie podwójnie znakowanym intronem grupy II typu dzikiego w ręku, jesteśmy teraz w stanie zbadać jego dynamikę na poziomie pojedynczej cząsteczki. Po zamknięciu w pęcherzykach fosfolipidowych, znakowany RNA jest unieruchamiany na powierzchni mikroskopowej przy bardzo niskiej gęstości powierzchni, aby osiągnąć rozdzielczość pojedynczej cząsteczki dla smFRET-TIRF. Jak widać na Rysunek 5A, kilka pojedynczych cząsteczek może być śledzonych jednocześnie. Mikroskopia TIRF umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wydajności FRET i jej zmian w czasie. Rysunek 5B ilustruje statyczne i dynamiczne ślady pojedynczej cząsteczki FRET znakowanego i kapsułkowanego RNA. Typowy ślad dynamiczny wykazuje antykorelację między sygnałami donorowymi i akceptorowymi, które zmieniają wydajność FRET. Gdy emisja akceptora po wzbudzeniu donora wzrasta, emisja donora odpowiednio maleje, wskazując na dynamiczną zmianę odległości między barwnikami. Ta antykorelacja sugeruje zmiany konformacyjne w cząsteczce RNA.

figure-results-2
Rysunek 5: Wysoce dynamiczne zachowanie RNA intronu grupy II ujawnione przez smFRET. Intron RNA grupy II znakowany podwójnym końcem jest zamknięty w pęcherzyku fosfolipidowym i unieruchomiony na powierzchni w celu obrazowania za pomocą obiektywnego mikroskopu TIRF. (A) Scalony obraz pojedynczych znakowanych cząsteczek RNA wykazujących emisję donorową (sCy3, zielony) i emisję akceptorową (Cy5, czerwony) po wzbudzeniu 532 nm. (B) Typowe trajektorie smFRET (po lewej) statycznej cząsteczki RNA, w której intensywność donora i akceptora nie zmienia się w czasie, oraz (po prawej) dynamicznej cząsteczki RNA, w której intensywności donora i akceptora są antykorelowane, z wydajnością FRET na żółto. Pojedyncze cząsteczki są lokalizowane i analizowane za pomocą MASH-FRET17. Stosowane jest wzbudzenie bezpośrednie, krwawienie i korekcje γ czynnikowe. Skróty: smFRET = jednocząsteczkowy transfer energii rezonansowej Förstera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest unikalny, ponieważ umożliwia obserwację i analizę pojedynczych cząsteczek, ujawniając niejednorodność próbki i wychwytując stany przejściowe, które mogą być przesłonięte w pomiarach zespołowych 1,2. Obserwacja pojedynczych cząsteczek RNA za pomocą smFRET dostarcza informacji o wysokiej rozdzielczości na temat ich ścieżek fałdowania i dynamiki. Protokół ten opisuje chemiczne znakowanie RNA na dwóch końcach i jego unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację pęcherzyków fosfolipidowych, które razem umożliwiają śledzenie dynamicznych zmian konformacyjnych za pomocą mikroskopii smFRET-TIRF.

Badanie dynamiki RNA to stale rozwijająca się dziedzina, w której potrzebne są nowe strategie znakowania fluorescencyjnego specyficzne dla danego miejsca. Znakujemy końce RNA, kierując 5'-fosforan za pomocą karbodiimidów, a cukier 3'-rybozy za pomocą periodatu. Podejścia te zostały opisane wcześniej (5'-koniec18,19 i 3'-koniec 19,20,21,22), ale nie były wcześniej stosowane do RNA o podobnej wielkości do dzikiego typu Sc.ai5γ grupy II intronu rybozymu, który wymagał optymalizacji. Aktywacja 5'-fosforanu przez karbodimid (np. EDC) jest odwracalna. Dlatego imidazol zastosowano do nieodwracalnej reakcji z produktem pośrednim O-acylisourea, tworząc wysoce reaktywny fosforymidazolid 19,20. Jednak obecnie wiadomo, że przy wyższym pH karbodiimidy mogą modyfikować zasady nukleotydowe, w szczególności guaniny i uracyle, co ostatnio doprowadziło do ich zastosowania jako strukturalnych środków sondujących23,24.

Aby uniknąć reaktywności krzyżowej, kluczowe znaczenie ma oczyszczenie aktywowanego RNA z EDC przed podniesieniem pH do 7,5 na etapie sprzęgania barwnika. Jednak kiedy wprowadziliśmy etap oczyszczania między aktywacją a nasadkąbarwnika 25, uzyskaliśmy bardzo niskie plony. Analogicznie, w znakowaniu białek, dostępne powierzchniowo reszty lizyny mogą być aktywowane za pomocą karbodiimidów. Jednak zamiast imidazolu, który zapobiega odwróceniu aktywacji, rutynowo stosuje się NHS. Przyjęliśmy również tę strategię, zastępując w ten sposób półprodukt fosforomidazolidu półproduktem fosforanowym NHS. W ten sposób uzyskaliśmy kontrolę pH, a także zwiększoną gęstość znakowania w niższych temperaturach i krótszy czas inkubacji, tj. 25 °C przez 4 godziny w porównaniu do 37 °C przez 16 godzin. Opracowana dla RNA, ta strategia znakowania 5' może być stosowana do dowolnego innego jednoniciowego kwasu nukleinowego z 5'-fosforanem.

Aktywacja 5'-fosforanu i utlenianie 3'-rybozy wzajemnie się wykluczały, ponieważ chemia nie jest ortogonalna. Aby sprostać temu wyzwaniu i uniknąć etykietowania krzyżowego, zaczęliśmy od końca 5', a następnie etapu blokowania, aby zahamować aktywowane, ale nie oznakowane miejsca, zanim przystąpiliśmy do etykietowania końca 3'. Podczas utleniania 3'-diolu, nadmiar metaperiodynianu sodu (NaIO4) może wygasić już przyłączony fluorofor na końcu 5'. W związku z tym zmniejszyliśmy stężenie NaIO4 używanego do pojedynczego etykietowania z 20 mM do 10 mM.

Zalecamy równoległą pracę z wieloma podwielokrotnościami zamiast skalowania reakcji w górę. Protokół ten wymaga wielu etapów wytrącania etanolu (EtOH). Pracując równolegle z kilkoma podwielokrotnościami, przygotuj mieszaninę wytrącania (30 ml 100% bezwzględnego EtOH i 1 ml 3 M NaOAc, pH 5,2). NaCl nie jest stosowany ze względu na niską rozpuszczalność w EtOH. Wytrącić RNA o stężeniu 3,1 obj. tej mieszaniny przez nocną inkubację w temperaturze -20 °C, a następnie odwirować. Przemyć osad RNA dwukrotnie 500 μl lodowatego 70% EtOH, za każdym razem odwirować w temperaturze 4 °C i wysuszyć w próżni. Wytrącanie EtOH wykorzystuje nierozpuszczalność RNA i rozpuszczalność wolnych barwników w 70% etanolu. Filtracja odśrodkowa skutecznie usuwa wolne barwniki ze względu na ich znaczną różnicę wielkości w stosunku do RNA i ułatwia wymianę buforową, eliminując sole. Oprócz metod wytrącania EtOH i filtracji odśrodkowej, wolne barwniki można również usuwać za pomocą technik ekstrakcji żelowej i/lub chromatografii (np. HPLC); Skala powinna być jednak odpowiednio dostosowana. Nie należy wirować długich RNA w celu ponownego zawieszenia, ponieważ może to spowodować mechaniczne ścinanie26. Optymalnym czasem na wstrzymanie protokołu jest moment granulowania RNA. Używamy probówek o niskim poziomie wiązania DNA, aby poprawić odzyskiwanie kwasów nukleinowych. Chociaż końcowa objętość reakcji wynosi 100 μl, probówki o pojemności 1,5 ml (a nie mniej) są preferowane w celu lepszego oczyszczania przez wytrącanie EtOH.

Po usunięciu nieprzereagowanych wolnych barwników przez wytrącanie i filtrację odśrodkową, potwierdziliśmy znakowanie za pomocą fluorescencyjnej elektroforezy żelowej (ryc. 4A), spektroskopii UV-Vis, analitycznej HPLC3. Należy jednak zauważyć, że metody te nie są w stanie odróżnić cząsteczki RNA przenoszącej oba fluorofory od mieszaniny RNA, z których każda jest znakowana jednym kolorem. Podobnie, nie można ich użyć do określenia, czy cząsteczka RNA zawiera wiele fluoroforów o tym samym kolorze. Spektrometria mas nie może być stosowana ze względu na ograniczenia rozmiaru. Spektroskopia Ensemble3 i jednocząsteczkowa spektroskopia FRET potwierdzają znakowanie podwójnie fluorescencyjne, jak pokazano na rysunkach 4B i 5B. Stechiometria 0,5 (stosunek sCy3 do Cy5 wynosi 1:1) w eksperymentach smFRET potwierdza równe sprzężenie dwóch fluoroforów. Jednym z problemów było podwójne etykietowanie na końcu 3' poprzez znakowanie obu aldehydów zamiast proponowanej cyklizacji. Brak gatunków o stechiometrii 0,25 (stosunek sCy3 do Cy5 wynosi 1:2) w eksperymentach smFRET sugeruje, że przyczepianie barwnika sterycznie utrudnia i zapobiega przyłączeniu drugiego barwnika.

Dzięki temu podwójnemu znakowaniu fluorescencyjnemu zmiany sygnału FRET można przypisać rearanżacjom strukturalnym podczas fałdowania RNA i katalizy. Aby utrzymać znakowany fluorescencyjnie RNA w ulotnym polu do obrazowania pojedynczych cząsteczek TIRF, enkapsulacja jest preferowana w stosunku do bezpośredniego wiązania powierzchniowego. Podejście to polega na uwięzieniu pojedynczych cząsteczek RNA w dwuwarstwach lipidowych pęcherzyków, tworząc kontrolowane środowisko sprzyjające obserwacji ich dynamicznego zachowania. Opisany protokół wzbogaca monokapsułkowanie, jak pokazuje fotowybielanie w jednym kroku11. Aby zrozumieć fałdowanie i funkcję RNA, niezbędne jest wypełnienie luki in vitro i in vivo 27. Molekularne środki tłumiące mogą naśladować warunki panujące wewnątrz komórek w celu zwiększenia katalizy RNA przez introny grupy II 7,28. Alternatywnie, enkapsulacja tworzy ograniczone mikrośrodowiska, które sprzyjają fałdowaniu RNA29, zbliżając nasze zrozumienie struktury i dynamiki RNA do realistycznego kontekstu komórkowego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki [200020_192153 dla RKOS], UZH Forschungskredit [FK-20-081 dla EA], UZH Stiftung für wissenschaftliche Forschung [dla RKOS i SZP], Graduate Research Campus (GRC) Short Grant [2024__SG_092 dla EA], Graduate School of Chemical and Molecular Sciences Zurych (CMSZH) oraz Uniwersytetu w Zurychu jest wdzięczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Znakowanie RNA
1.5  mL probówek DNA LoBind Eppendorf 
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC-HCl lub EDC)Thermo Scientific11844071Pierce EDC, format bez ważenia. Przechowywać w  -20 &stopni; Kwas
C 3-morfolinopropano-1-sulfonowy (MOPS)Sigma-Aldrich69947BioUltra, do biologii molekularnej, ≥ 99,5% (miareczkowanie)
Kwas octowy (lodowaty)Sigma-Aldrich1.00063100%, bezwodny do analizy EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Jednostka filtracji odśrodkowej SartoriusVS0132Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 μ L
Cyjanine5 hydrazyd (Cy5-hydrazyd)Lumiprobe230705 mg, numer CAS 1427705-31-4 
Dimetylosulfotlenek (DMSO)New England Biolabs12611PKlasa biologii molekularnej
EtanolVWR Chemicals20821.296PAbsolutny ≥ 99,8%
GlicerolSigma-AldrichG5516do biologii molekularnej, ≥ 99,0%
Kwas solny (HCl)Sigma-Aldrich1.00317dymiący 37%, do analizy EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
N-hydroksysukcynimid (NHS)Sigma-Aldrich13067298%
Octan sodu (NaOAc) Sigma-AldrichS8750bezwodny, ReagentPlus, ≥ 99,0%
Metaperiodynian sodu (NaIO4)Thermo Fisher Scientific, Life Technologies20504Linia produktów
Pierce Sulfo-cyjanininy3 amina (sCy3-amina)Lumiprobe213C05 mg, numer CAS 2183440-43-7
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Biosolve200923Biologia molekularna klasa
Przygotowanie komory
3-aminopropylo)trietoksysilan (APTES) Sigma-Aldrich44014099%
AcetonSigma-Aldrich1.00014do analizy EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Walerianian biotyny-glikolu polietylenowego-sukcynimidylu (biotyna-PEG-SVA, bPEG) i glikol metoksypolietylenowy-walerianian sukcynimidylu (mPEG-SVA)Laysan Bio, Inc.BIO-PEG-SVA, MW 5.000 i MPEG-SVA, MW 5.000 - Zestaw Combo
Szkiełka nakrywkoweCarl RothH876.224 x 24 mm, 0,13-0,16  mm grubości
Deconex 11 uniwersalnyBorer Chemie AG17416492Laboratoryjny roztwór do czyszczenia szkła
Wiertło rdzeniowe z powłoką diamentowąCrystalite corporationGrubość 1 mm
Wiertarka
EtanolVWR Chemicals20821.296PAbsolutny ≥ 99,8%
Szklany słoik do barwienia Coplin z pokrywą
Przekładka obrazowaniaGrace Bio-Labs654008SecureSeal, 8 dołków,  9  mm i razy; 0,12  mm
Tlenowy środek do czyszczenia plazmyZepto OneDiener
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-AldrichP9541do biologii molekularnej, ≥ 99.0%
Zjeżdżalnie kwarcoweG. Finkenbeiner, Inc.7,5  x  2,5  cm, grubość 1 mm
Wodorowęglan sodu (NaHCO3) Sigma-AldrichS6297BioXtra, 99.5-100.5%
Przygotowanie ciasta lipidowego
16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-(cap biotynyl) (sól sodowa), C53H98N4O11PNaS)Avanti Polar Lipids870277PStabilny przez 1 rok w temperaturze -20 ° C
14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradekanoilo-sn-glicero-3-fosfocholina lub 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina, C36H72NO8P)Avanti Polar Lipids850345P
2,0 ml probówki do mikrowirówek, autoklaw Safe-LockEppendorf0030120094do sterylizacji
500  ml kolba
ChloroformMerck1.02445do analizy EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Parafilm
Unieruchomienie powierzchni poprzez enkapsulację
(±)Kwas -6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Trolox®)Thermo Fischer53188-07-197%
Kwas 3-morfolinopropano-1-sulfonowy (MOPS)Sigma-Aldrich69947BioUltra, do biologii molekularnej, ≥ 99,5% (miareczkowanie). Przechowywać w temperaturze +4 & deg; C w ciemności.
Samoprzylepne zakładki uszczelniająceGrace Bio-Labs 629200
KatalazaSigma-Aldrich9001-05-2, C30z wątroby bydlęcej, zawiesina wodna, 10 000-40 000 jednostek/mg białka
D-glukozaSigma-AldrichG7528≥ 99,5% (GC), BioXtra
Extruder membrana poliwęglanowa (PC)Avanti Polar Lipids610005-1EA0,1 μ m, 19 mm
Zestaw ekstrudera z blokiem grzewczymAvanti Polar Lipids610000
Oksydaza glukozowaSigma-Aldrich9001-37-0od Aspergillus niger, Typ VII,  liofilizowany proszek, ≥ 100 000 jednostek/g ciała stałego (bez dodatku tlenu)
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3, M1028do biologii molekularnej, 1,00 M ± 0,01 M roztwór
Poliestrowy (PE), membranaWhatman, Cytiva23030010 mm
Chlorek potasu (KCl)Sigma-Aldrich60128BioUltra, do biologii molekularnej, ≥ 99,5% (AT)
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-AldrichP9541do biologii molekularnej, ≥ 99.0%
StreptawidynaThermo Fischer434301
30108035diamentowaSchlenka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eitan, L., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416(2021).
  2. Taekjip, H., et al. Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level. Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).
  3. Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Chemical dual end-labeling of large ribozymes. Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).
  4. Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Group II Introns: Highly structured yet dynamic. Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).
  5. Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. Single-molecule studies of group II intron ribozymes. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).
  6. Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding. Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).
  7. Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).
  8. Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer. Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).
  9. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  10. Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).
  11. Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).
  12. Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
  13. Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies. Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).
  14. Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects. J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).
  15. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549(2014).
  16. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).
  17. Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).
  18. Chu, B. C., Wahl, G. M. Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides. Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).
  19. Qin, P. Z., Pyle, A. M. Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes. Methods. 18 (1), 60-70 (1999).
  20. Whitfeld, P. R. A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides. Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).
  21. Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. Partial purification of soluble RNA. Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).
  22. Proudnikov, D., Mirzabekov, A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).
  23. Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells. RNA. 25 (1), 135-146 (2019).
  24. Mitchell, D., et al. In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC). RNA. 25 (1), 147-157 (2019).
  25. Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies. Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).
  26. Liu, T., Patel, S., Pyle, A. M. Making RNA: Using T7 RNA polymerase to produce high yields of RNA from DNA templates. Methods in Enzymology. , Academic Press. (2023).
  27. Leamy, K. A., Assmann, S. M., Mathews, D. H., Bevilacqua, P. C. Bridging the gap between in vitro and in vivo RNA folding. Q Rev Biophys. 49, e10(2016).
  28. Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity. Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).
  29. Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA. Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

znakowanie ko cowe RNAenkapsulacja RNAznakowanie fluorescencyjnep cherzyki fosfolipidowedynamika zwijania RNAkowalencyjne znakowanie FRETimmobilizacja powierzchniowaenkapsulacja RNA w p cherzykach

Powiązane artykuły