Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas gdy technologia mikroprzepływowa osiąga nowy poziom dojrzałości w odniesieniu do analiz makromolekularnych, testy oparte na komórkach znajdują się wciąż w początkowej fazie rozwoju1. Wynika to w dużej mierze z trudności w tworzeniu stabilnego mikrośrodowiska kompatybilnego z komórkami przy użyciu konwencjonalnych technik mikrofabrykacji i materiałów. Rozwiązujemy ten problem poprzez wprowadzenie nowego materiału do mikrofabrykacji – żelu agarozowego – jako materiału bazowego dla urządzenia mikroprzepływowego. Żel agarozowy jest wysoce plastyczny oraz przepuszczalny dla gazów i składników odżywczych niezbędnych do przeżycia komórek, co czyni go idealnym materiałem do analiz opartych na komórkach. Wykazaliśmy wcześniej, że urządzenia oparte na żelu agarozowym z powodzeniem stosowano w badaniach migracji bakterii i neutrofili2. W niniejszym raporcie w membranie z żelu agarozowego o grubości około 1mm uformowano trzy równoległe kanały mikroprzepływowe. Za pomocą pompy perystaltycznej w dwóch kanałach bocznych utrzymywany jest stały przepływ pożywki/buforu. Komórki są utrzymywane w kanale środkowym w celu obserwacji. Ponieważ składniki odżywcze i związki chemiczne z kanałów bocznych nieustannie dyfundują do kanału środkowego, środowisko chemiczne kanału środkowego jest łatwo kontrolowane poprzez przepływ w kanałach bocznych. Używając tego urządzenia, wykazujemy, że ruch komórek macierzystych neuronów można z łatwością monitorować optycznie w różnych warunkach chemicznych, a wyniki eksperymentalne pokazują, że nadekspresja receptorów epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR) zwiększa mobilność komórek macierzystych neuronów. Mobilność komórek macierzystych neuronów jest ważnym biomarkerem oceniającym agresywność komórek, a tym samym czynnik tumorigenny3. Zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw mobilności NSC dostarczy wiedzy zarówno na temat zaburzeń rozwoju układu nerwowego, jak i inwazji macierzystych komórek raka mózgu.
Protokół
Procedura
Powlekanie szkiełek fibronektyną
Przed montażem urządzenia mikroprzepływowego należy zsterylizować i pokryć szkiełka przedmiotowe fibronektyną. Powlekanie szkiełek powinno odbywać się w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności. Wzdłuż krawędzi szkiełka należy ułożyć sterylny dystans z PDMS i zaznaczyć markerem permanentnym stronę skierowaną ku górze. Do wnętrza dystansu z PDMS, na całą powierzchnię szkiełka przedmiotowego, należy nanieść pipetą 1 ml roztworu fibronektyny (Sigma) o stężeniu 5 μg/ml. Pozostawić szkiełka w spokoju na godzinę, a następnie całkowicie osuszyć za pomocą pistoletu z N2. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4oC do późniejszych eksperymentów.
Montaż urządzenia
Cały protokół montażu urządzenia jest przeprowadzany w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, zgodnie z poniższymi procedurami:
- Oczyścić matrycę krzemową z wytłoczonymi mikrokanałami, przecierając ją 70% etanolem i susząc pistoletem z N2. Za pomocą pęsety umieścić sterylny ogranicznik z PDMS o wysokości 1 mm wokół elementów wypukłych matrycy.
- Przygotować żel agarozowy stosowany w urządzeniu, odważając 0,3 g proszku agarozy (Fisher Scientific) i 10 ml pożywki niezależnej od CO2 (Invitrogen) w zlewce o pojemności 50 ml. Wymieszać zawiesinę szpatułką i podgrzać w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund na ustawieniu HIGH. Jeśli obecne są nierozpuszczone granulki, podgrzewać mieszaninę przez kolejne 10 sekund i zamieszać gorącą ciecz, aby pozbyć się ostatnich pozostałości granulek. Powtórzyć ten proces z czasem grzania 8 sekund, a następnie 5 sekund.
- Szybko wlać roztwór agarozy na matrycę krzemową otoczoną ogranicznikiem z PDMS i natychmiast przykryć mieszaninę agarozy sterylnym szkiełkiem podstawowym. Wywierać stały, delikatny nacisk na szkiełko przez około 2 minuty, aby zapewnić żelowanie agarozy do tej samej stałej wysokości 1 mm, co wysokość ogranicznika z PDMS.
- Po zgęlowaniu agarozy oddzielić uformowany żel agarozowy wraz z ogranicznikiem z PDMS od matrycy krzemowej i przenieść go na szkiełko podstawowe pokryte fibronektyną, tak aby mikrokanały w żelu agarozowym były skierowane w stronę szkiełka. Użyć końcówki strzykawki o rozmiarze 16 G do wykonania otworów w obszarach zbiorników mikrokanałów w celu uzyskania dostępu do wlotów i wylotów. Dodać 500 μl pożywki niezależnej od CO2 do uformowanego żelu agarozowego na szkiełku, aby zapobiec wysychaniu mikrokanałów.
- Umyć akrylowy kolektor stosowany w urządzeniu 70% etanolem i wypłukać wodą DI. Dopasować otwory w kolektorze do otworów wykonanych w żelu agarozowym z mikrokanałami. Następnie dopasować kolektor, ogranicznik z PDMS i szkiełko z fibronektyną do metalowej ramy urządzenia. Włożyć śruby do urządzenia i dokręcić śrubokrętem do momentu wystąpienia oporu. Przeciwdziała to zbyt mocnemu dokręceniu urządzenia, co mogłoby doprowadzić do odkształcenia mikrokanałów w agarozie. Śruby dokręcać zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby żel wewnątrz urządzenia nie przesunął się. Przetestować urządzenie pod kątem nieszczelności i zatorów w mikrokanałach za pomocą strzykawki 1 ml. Strzykawka jest wyposażona w dren Tygon z końcówką pipety do ładowania żelu na końcu drenu, aby wstrzyknąć pożywkę niezależną od CO2 do mikrokanałów. Mikrokanał uznaje się za prawidłowo uformowany, gdy po wstrzyknięciu pożywki do odpowiedniego wlotu pożywka wypływa wyłącznie z wylotu mikrokanału. Urządzenie jest teraz gotowe do użycia.
Przygotowanie i wysiewanie komórek do urządzenia
Gdy komórki osiągną 70% konfluencji (gęstość komórek około 100,000 cells/ml), są gotowe do wysiania do urządzenia.
Komórki przemyć dwukrotnie DPBS (Invitrogen). W celu ododerwania komórek dodać 200 μl trypsyny-EDTA (Invitrogen). Komórki przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki M2 z surowicą w celu inaktywacji trypsyny. Pożywkę wzrostową z komórkami wirować z prędkością 1000 RPM przez 5 minut. Odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 5 ml DPBS. Komórki w DPBS ponownie wirować w tych samych warunkach. Ponownie odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 500 μl pożywki niezależnej od CO2.
Przenieś otrzymaną zawiesinę komórek do środkowego mikrokanału urządzenia za pomocą przepływu grawitacyjnego. Do wlotu i wylotu środkowego mikrokanału dodaj odpowiednio 60 μl zawiesiny komórkowej oraz 20 μl pożywki niezależnej od CO2. Obserwuj środkowy mikrokanał pod mikroskopem w świetle przechodzącym, aby sprawdzić adhezję komórek. Komórki zazwyczaj przylegają po 10 minutach. Po osiągnięciu przez komórki odpowiedniej gęstości adhezji do dna kanału, odpipetuj pozostałą zawiesinę komórkową z wlotu oraz pożywkę z wylotu. Do wlotu i wylotu kanału środkowego wprowadź po 60 μl pożywki niezależnej od CO2. Na wlocie i wylocie kanału środkowego umieść przykrywki z PDMS, aby zminimalizować parowanie pożywki z kanału środkowego.
Obrazowanie komórek w urządzeniu
Przed montażem urządzenia przeciągnij sterylną dętkę pompy perystaltycznej przez stację pogodową mikroskopu (Olympus X81) i podłącz ją do pompy perystaltycznej (Watson-Marlow 205U/CA). Przepłucz dętkę roztworem PBS z prędkością 4 RPM. Po zmontowaniu urządzenia przygotuj odpowiednie stężenia roztworów epidermal growth factor (EGF) (Sigma) w pożywce niezależnej od CO2 w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml. Rozwiruj roztwory EGF w vorteksie przez 5 sekund i podłącz je do dętek. Podłącz dętki oznaczone odpowiednimi stężeniami EGF do urządzenia. Dyfuzja EGF przez grzbiet kanału i ustanowienie stabilnego gradientu chemicznego zajmuje około godziny.
Oprogramowanie do obrazowania Slidebook jest wykorzystywane do wykonywania serii zdjęć co 10 minut przez około 5 godzin w trakcie jednego przebiegu eksperymentalnego. Zautomatyzowany stolik x-y jest zaprogramowany tak, aby w danym punkcie czasowym obrazować dwa podobszary (każdy o powierzchni 400μm x400μm) tego samego kanału centralnego, przy czym obrazowanych jest łącznie trzy kanały centralne. Komórki w różnych kanałach centralnych (zazwyczaj 3 w jednym przebiegu) są poddawane działaniu różnych stężeń EGF, zgodnie z oznaczeniami na przewodach.
Materiały i sprzęt
Linie komórkowe: Komórki C17.2 to NSC pochodzące z zewnętrznej warstwy ziarnistej pozarodowego móżdżku myszy 6, 7. Wykorzystując tę linię komórkową, opracowaliśmy dwie inne mysie linie komórek macierzystych za pomocą metody transfekcji retrowirusowej. Te dwie stabilnie transfektowane linie komórkowe to (1) wtEGFR – nadwyrażająca ludzki EGFR typu dzikiego oraz (2) ΔEGFR – będąca konstytutywnie aktywnym mutantem EGFR. W celu ułatwienia detekcji retrowirusy przenoszą szkielet z genem zainteresowania, po którym następuje wewnętrzna sekwencja wiązania rybosomów (IRES) oraz zielone białko fluorescencyjne (GFP).
Hodowla komórkowa: Mysie komórki NSCs C17.2 oraz ich warianty hodowano w płytce 6-dołkowej w pożywce M2 (DMEM (Invitrogen) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Invitrogen), 5% surowicy końskiej (HS) (Invitrogen) oraz 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen).) Komórki utrzymywano w temperaturze 37oC w atmosferze 80% powietrza i 5% CO2.
Urządzenie mikrofluidyczne: plastikowy kolektor, przekładka z PDMS oraz stalowa ramka do stabilizacji urządzenia.
Obrazowanie
Stosuje się odwrócony mikroskop fluorescencyjny (Olympus IX-81) wraz z wzmocnioną kamerą CCD (Orca, Hamamatsu). Urządzenie mikroprzepływowe jest zamontowane na zautomatyzowanym stoliku x-y-z, a stolik znajduje się w komorze inkubacyjnej utrzymującej temperaturę 37oC. Zazwyczaj na jednym chipie znajduje się 3-4 urządzenia, które są filmowane w tym samym punkcie czasowym przy użyciu zautomatyzowanego stolika x-y-z.
Utrzymywanie przepływu
Do utrzymania przepływów we wszystkich kanałach odpływowych i dopływowych wykorzystuje się automatyczną pompę perystaltyczną z 8 równoległymi liniami (Watson-Marlow 205U/CA).
Rys. 1 Mobilność trzech szczepów NSC (rodzicielskiego, wtEGFR oraz DEGFR) w różnych stężeniach EGF Wszystkie trajektorie zostały uzyskane poprzez śledzenie filmu z 5 godzin (z wyjątkiem wtEGF 100ng/ml, 4 godziny), a początki wszystkich ścieżek zostały przesunięte do punktu (0,0) w celu porównania.
Rys. 2 Korelacja poziomu ekspresji EGFR i motywności (a) dwa obrazy NSC wtEGF na powierzchni kanału mikrofluidycznego z 100ng/ml EGF. Obraz po lewej to obraz fluorescencyjny, a po prawej obraz w prześwietlonym polu jasnym. Pasek skali wynosi 100µm, a szerokość kanału to 400 µm. Komórki zostały podzielone na dwie populacje na podstawie jasności ekspresji GFP. Komórki w niebieskich okręgach są ciemniejsze, co oznacza niższy poziom ekspresji EGFR; natomiast komórki w czerwonych okręgach są jaśniejsze, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji EGFR. (b) Trajektorie komórek o niskim i wysokim poziomie ekspresji EGFR. Trajektorie te zostały pobrane z czterogodzinnego filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rys. 1 przedstawia trajektorie trzech szczepów NSC: komórek macierzystych, wtEGFR oraz ΔEGFR (kontrola). Każdy zestaw trajektorii uzyskano z filmu trwającego 5 godzin. W przypadku komórek macierzystych ruchliwość komórek osiągnęła szczyt przy stężeniu EGF wynoszącym ~ 10ng/ml; dla komórek wtEGFR szczyt ruchliwości przesunął się na wartość 100ng/ml lub wyższą; w przypadku komórek ΔEGFR ruchliwość komórek była niezależna od stężenia EGF, zgodnie z oczekiwaniami.
Komórki wtEGF przy stężeniu 10...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta jest wspierana przez New York State Office of Science, Technology and Academic Research (NYSTAR) (w formie grantu Center for Advanced Technology) oraz przez granty z Nanobiotechnology Center (NBTC), programu STC National Science Foundation na podstawie umowy nr ECS-9876771, a także American Brain Tumor Association i New York Academy of Medicine (JAB).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Podłoże DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (1X) | Odczynnik | Invitrogen | 11971-025 | |
| Podłoże niezależne od CO2 | Odczynnik | Invitrogen | 18045-088 | Własnościowe podłoże bez HEPES, odpowiednie do wspierania wzrostu wielu linii komórek nabłonkowych, fibroblastów i limfocytów w warunkach atmosferycznych, nie zawiera L-glutaminy |
| Trypsyna-EDTA | Odczynnik | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Odczynnik | Invitrogen | 14190-144 | Fosforanowy bufor solny, bez wapnia i magnezu |
| Pen/Strep | Odczynnik | Invitrogen | 15140-122 | Zawiera 10 000 jednostek penicyliny (zasada) i 10 000 g streptomycyny (zasada)/ml z wykorzystaniem penicyliny G (sól sodowa) i siarczanu streptomycyny w 0,85% soli fizjologicznej |
| FBS | Odczynnik | Invitrogen | 10437-028 | Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana |
| Surowica konia | Odczynnik | Invitrogen | 16050-130 | Surowica konia, surowica przebadana w kierunku EIA (wynik negatywny) |
| Fibronektyna | Odczynnik | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronektyna z ludzkiej osocza, nazywana również globuliną nierozpuszczalną na zimno |
| EGF | Odczynnik | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermalny czynnik wzrostu z gruczołu podżuchwowego myszy, liofilizowany |
| Agaroza | Odczynnik | Fisher Scientific | BP1356-500 |
Bibliografia
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
