Ocena ruchliwości nerwowych komórek macierzystych za pomocą urządzenia mikroprzepływowego na bazie żelu agarozowego

Podsumowanie

Wykazujemy, że nadmierna ekspresja receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) zwiększa ruchliwość nerwowych komórek macierzystych (NSC) za pomocą nowego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozowym. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórkowych ssaków, w których źródła komórek są rzadkie, takich jak ludzkie nerwowe komórki macierzyste, a czas realizacji ma kluczowe znaczenie.

Streszczenie

Podczas gdy technologia mikroprzepływowa osiąga nowy poziom dojrzałości dla testów makromolekularnych, testy komórkowe są nadal na etapie^{niemowlęcym 1}. Wynika to w dużej mierze z trudności, z jaką można stworzyć kompatybilne z komórkami i stabilne mikrośrodowisko przy użyciu konwencjonalnych technik i materiałów mikrofabrykacji. Rozwiązujemy ten problem poprzez wprowadzenie nowego materiału do mikrowytwarzania, żelu agarozowego, jako materiału bazowego dla urządzenia mikroprzepływowego. Żel agarozowy jest wysoce plastyczny i przepuszczalny dla gazów i składników odżywczych niezbędnych do przetrwania komórek, a tym samym jest idealnym materiałem do testów komórkowych. Wykazaliśmy wcześniej, że urządzenia na bazie żelu agarozowego odniosły sukces w badaniu migracji komórek bakteryjnych i neutrofilowych². W tym raporcie trzy równoległe kanały mikroprzepływowe są wzorowane na membranie z żelu agarozowego o grubości około 1 mm. Stałe przepływy z mediami/buforem są utrzymywane w dwóch kanałach bocznych za pomocą pompy perystaltycznej. Komórki są utrzymywane w kanale środkowym do obserwacji. Ponieważ składniki odżywcze i chemikalia w kanałach bocznych stale dyfundują z kanału bocznego do środkowego, środowisko chemiczne kanału środkowego można łatwo kontrolować poprzez przepływ wzdłuż kanałów bocznych. Za pomocą tego urządzenia wykazaliśmy, że ruch nerwowych komórek macierzystych może być z łatwością monitorowany optycznie w różnych warunkach chemicznych, a wyniki eksperymentalne pokazują, że nadekspresja receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) zwiększa ruchliwość nerwowych komórek macierzystych. Ruchliwość nerwowych komórek macierzystych jest ważnym biomarkerem do oceny agresywności komórek, a tym samym czynnikiem rakotwórczym³. Rozszyfrowanie mechanizmu leżącego u podstaw ruchliwości NSC pozwoli uzyskać wgląd zarówno w zaburzenia rozwoju neuronalnego, jak i w inwazję komórek macierzystych raka mózgu.

Protokół

Procedura

Powlekanie szkiełek fibronektyną

Przed montażem urządzenia mikroprzepływowego, wysterylizuj szkiełka za pomocą fibronektyny. Pokryj szkiełka biokapturem, aby zachować sterylność. Dopasuj sterylną przekładkę PDMS wzdłuż krawędzi szkiełka i zaznacz stronę skierowaną do góry trwałym markerem. Odpipetować 1 ml roztworu fibronektyny (Sigma) o stężeniu 5 μg/ml wewnątrz przekładki PDMS na całej powierzchni szkiełka podstawowego. Pozostaw szkiełka w spokoju na godzinę, a następnie całkowicie wysusz za pomocą pistoletu N₂. Preparaty można przechowywać w temperaturze 4^oC do późniejszych eksperymentów.

Montaż urządzenia

Cały protokół montażu urządzenia odbywa się w kapturze biologicznym w sterylnych warunkach, przy użyciu następujących procedur:

1. Wyczyść silikonowy master z wzorowanymi na nim mikrokanalikami, przecierając go 70% etanolem i susząc pistoletem_N2. Umieść sterylną przekładkę PDMS o wysokości 1 mm za pomocą kleszczy wokół elementów reliefowych mistrza.
2. Przygotować żel agarozowy stosowany w urządzeniu, ważąc 0,3 g proszku agarozowego (Fisher Scientific) i 10 ml pożywki niezależnej od CO₂ (Invitrogen) w zlewce o pojemności 50 ml. Wymieszaj mieszaninę szpatułką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund na WYSOKIM POZIOMIE. Jeśli obecne są nierozpuszczone granulki, podgrzej mieszaninę przez kolejne 10 sekund i zamieszaj gorącą mieszaninę, aby pozbyć się ostatnich pozostałych granulek. Powtórz proces z czasem nagrzewania 8 sekund, a następnie 5 sekund.
3. Szybko wylej roztwór agarozy na wzorzec silikonowy otoczony przekładką PDMS i natychmiast przykryj mieszaninę agarozy sterylnym szkiełkiem podstawowym. Wywieraj stały, delikatny nacisk na szkiełko przez około 2 minuty, aby upewnić się, że agaroza zżeluje się na tę samą stałą wysokość 1 mm, co przekładka PDMS.
4. Po żelach agarozowych odklej wzorzysty żel agarozowy za pomocą przekładki PDMS z wzorca silikonowego i przenieś do szkiełka pokrytego fibronektyną tak, aby mikrokanaliki w żelu agarozowym były skierowane do szkiełka. Użyj końcówki strzykawki o rozmiarze 16, aby wybić otwory w obszarach zbiornika mikrokanałów dla dostępu wlotowego i wylotowego. Dodaj 500 μl pożywki niezależnej od CO₂ do wzorzystego żelu agarozowego na szkiełku, aby zapobiec wysuszeniu mikrokanałów.
5. Umyj akrylowy kolektor zastosowany w urządzeniu 70% etanolem i spłucz wodą DI. Wyrównaj otwory w kolektorze z otworami wybitymi w żelu agarozowym z mikrokanalikami. Następnie wyrównaj kolektor z żelem, przekładką PDMS, a szkiełko fibronektynowe z metalową ramką urządzenia. Umieść w urządzeniu i dokręć do oporu za pomocą śrubokręta. Ma to na celu zapewnienie, że urządzenie nie jest zbyt mocno dokręcone do tego stopnia, że odkształcają się mikrokanaliki w agarozie. Dokręć w kolejności zgodnej z ruchem wskazówek zegara, aby upewnić się, że żel wewnątrz urządzenia się nie przesuwa. Przetestuj urządzenie pod kątem wycieków i zatorów w mikrokanalikach za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Strzykawka jest wyposażona w rurkę Tygon z końcówką pipety z żelem na końcu rurki do wstrzykiwania mediów niezależnych od CO₂ do mikrokanałów. Mikrokanał uważa się za pomyślnie utworzony, gdy zaobserwuje się, że media wychodzą z wylotu mikrokanału tylko wtedy, gdy media są wstrzykiwane do odpowiedniego wlotu. Teraz urządzenie jest gotowe do użycia.

Przygotowanie i zasiewanie komórek w urządzeniu

Gdy komórki osiągną 70% zbieżności (gęstość komórek około 100 000 komórek/ml), są przygotowane do wprowadzenia do urządzenia.

Poddaj komórki dwóm myciom  DPBS (Invitrogen). Dodaj 200 μl trypsyny-EDTA (Invitrogen), aby odłączyć komórki. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki M2 zawierającej surowicę w celu dezaktywacji trypsyny. Odwirowywano  pożywkę wzrostową z komórkami z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut. Odessać z supernatantu i ponownie zawiesić osad komórek 5 ml DPBS. Ponownie odwirować komórki DPBS w tych samych warunkach. Ponownie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórki w 500 μl pożywki niezależnej od CO₂.

Umieść powstałą zawiesinę komórek w centralnym mikrokanale urządzenia za pomocą przepływu napędzanego grawitacją. Dodaj wlot i wylot środkowego mikrokanału odpowiednio 60 μl zawiesiny komórek i 20 μl pożywki niezależnej od CO₂. Obserwuj środkowy mikrokanał pod mikroskopią jasnego pola, aby znaleźć adhezję komórek. Komórki zwykle przylegają po 10 minutach. Po tym, jak komórki przylegają do dna kanału o odpowiedniej gęstości, wypipetuj pozostałą zawiesinę komórek na wlocie i pożywkę na wylocie. Umieść 60 μl mediów niezależnych od CO₂ zarówno na wlocie, jak i wylocie kanału środkowego. Umieść osłony PDMS nad środkowym wlotem i wylotem, aby zminimalizować parowanie mediów z kanału środkowego.

Obrazowanie komórek w urządzeniu

Przed montażem urządzenia, przeciągnij sterylną rurkę perystaltyczną przez stację pogodową mikroskopu (Olympus X81) i połącz z pompą perystaltyczną (Watson-Marlow 205U/CA). Przepłukać PBS przez rurkę z szybkością 4 obr./min. Po zmontowaniu urządzenia należy przygotować roztwory naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (Sigma) w pożywkach niezależnych od CO₂ w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml. Wiruj roztwory EGF przez 5 sekund i połącz z rurką. Podłącz rurki oznaczone odpowiednimi stężeniami EGF do urządzenia. Potrzeba około godziny, aby EGF dyfundował przez grzbiet kanału i tworzył stały gradient chemiczny.

Oprogramowanie do obrazowania, Slidebook, służy do wykonywania zestawu zdjęć co 10 minut przez około 5 godzin w eksperymentalnym przebiegu. Zautomatyzowany stolik x-y jest zaprogramowany w taki sposób, że w danym punkcie czasowym obrazowane są dwa podobszary (każdy o powierzchni 400 μm x 400 μm) tego samego kanału środkowego i łącznie trzy kanały centralne. Ogniwa w różnych kanałach środkowych (zwykle 3 w jednym przebiegu) mają różne stężenia EGF, jak oznaczono na rurce.

Materiały i sprzęt

Linie komórkowe: Komórki C17.2 to NSC pochodzące z zewnętrznej warstwy rozrodczej móżdżku myszy po urodzeniu ^{6, 7}. Korzystając z tej linii komórkowej, opracowaliśmy dwie inne linie mysich komórek macierzystych przy użyciu metody transfekcji retrowirusów. Te dwie stabilnie transfekowane linie komórkowe to (1) wtEGFR - który wykazuje nadmierną ekspresję ludzkiego dzikiego typu EGFR i (2) ΔEGFR - który jest konstytutywnie aktywnym mutantem EGFR. Aby ułatwić wykrycie, retrowirusy przenoszą szkielet z genem będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie wewnętrznym miejscem wiązania rybosomalnego (IRES) i białkiem zielonej fluorescencji (GFP).

Hodowla komórkowa: Mysie C17.2 NSC i ich warianty były hodowane na 6-dołkowej płytce w pożywce M2 (DMEM (Invitrogen) z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Invitrogen), 5% surowicy końskiej (HS) (Invitrogen) i 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen).) Komórki utrzymywano w temperaturze 37^oC w 80% powietrzu i 5% CO_{2 .}

Urządzenie mikroprzepływowe: Plastikowy kolektor, przekładka PDMS i nierdzewna ramka do przytrzymywania urządzenia na miejscu.

Obrazowanie

Używany jest odwrócony mikroskop fluorescencyjny (Olympus IX-81) w połączeniu ze wzmocnioną kamerą CCD (Orca, Hamamatsu). Urządzenie mikroprzepływowe jest zamontowane na zautomatyzowanym stoliku x-y-z, a stopień jest zamknięty w komorze środowiskowej, która utrzymuje temperaturę 37^oC. Zwykle na tym samym chipie znajdują się 3-4 urządzenia, które zostaną sfilmowane w tym samym punkcie czasowym za pomocą zautomatyzowanego stolika x-y-z.

Utrzymanie przepływu

Pompa perystaltyczna z 8 równoległymi liniami (Watson-Marlow 205U/CA) auto służy do utrzymywania przepływów we wszystkich kanałach zlewu i źródła.

 

Rys. 1 Ruchliwość trzech szczepów NSC (rodzicielskiego, wtEGFR i DEGFR) w różnych stężeniach EGF Wszystkie trajektorie pochodzą ze śledzenia filmu trwającego 5 godzin (z wyjątkiem wtEGF 100ng/ml, 4 godziny), a początek wszystkich ścieżek został przesunięty na (0,0) w celach porównawczych.

 

 

Rys. 2 Korelacja poziomu ekspresji EGFR i ruchliwości (a) dwa obrazy NSC wtEGF na powierzchni kanału mikroprzepływowego o 100ng/ml EGF. Lewy obraz jest obrazem fluorescencyjnym, a prawy jest przesyłanym obrazem w jasnym polu. Pasek skali wynosi 100 μm, a szerokość kanału wynosi 400 μm. Komórki są rozdzielane na dwie populacje na podstawie jasności wyrażonego GFP. Komórki w niebieskich kółkach są ciemniejsze, a zatem mają mniejszy poziom ekspresji EGFR; a komórki w czerwonych kółkach są jaśniejsze, a zatem mają wyższy poziom ekspresji EGFR. (b) Trajektorie komórek o niskim i wysokim poziomie ekspresji EGFR. Te trajektorie pochodzą z czterogodzinnego filmu.

Dyskusja

Ryc. 1 przedstawia trajektorie trzech szczepów NSC, komórek rodzicielskich, wtEGFR i ΔEGFR (kontrola). Każdy zestaw trajektorii został uzyskany z 5-godzinnego filmu. W przypadku komórek rodzicielskich ruchliwość komórek osiągała szczyt, gdy stężenie EGF wynosiło ~ 10 ng / ml; w przypadku komórek wtEGFR pik ruchliwości komórek przesunął się do 100 ng / ml lub więcej; w przypadku komórek ΔEGFR ruchliwość komórek była niezależna od stężenia EGF zgodnie z oczekiwaniami.

Komórki wtEGF o mocy 100...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) (1X)	Odczynnik	Invitrogen	11971-025
Pożywka niezależna od CO2	Odczynnik	Invitrogen	18045-088	Opatentowane podłoże bez HEPES odpowiednie do wspomagania wzrostu komórek nabłonkowych, fibroblastów i limfoidalnych w warunkach atmosferycznych, nie zawiera L-glutaminy
Odczynnik Trypsin-EDTA		Invitrogen	25200-072
PBS	Odczynnik	Invitrogen	14190-144	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez wapnia i magnezu
Odczynnik	Pen/Strep	Invitrogen	15140-122	Zawiera 10 000 jednostek penicyliny (zasada) i 10 000 g streptomycyny (zasada) / ml z wykorzystaniem penicyliny G (sól sodowa) i siarczanu streptomycyny w 0,85% soli fizjologicznej
Odczynnik	FBS	Invitrogen	10437-028	Bydło płodowe Surowica, kwalifikowany
odczynnik	do surowicy końskiej	Invitrogen	16050-130	Surowica końska, testowana przez EIA (ujemna) surowica
Odczynnik	fibronektyny	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronektyna z ludzkiego osocza, zwana również zimną nierozpuszczalną globuliną
Odczynnik EGF		Sigma-Aldrich	E4127	Naskórkowy czynnik wzrostu z mysiego gruczołu podszczękowego, liofilizowany
Odczynnik agarozowy		Fisher Scientific	BP1356-500