Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67405

⸱

7 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Streszczenie

Glikozylacja jest powszechną i strukturalnie zróżnicowaną modyfikacją białka, która wpływa na szeroki zakres procesów rakotwórczych. Glikomika i glikoproteomika sterowane spektrometrią mas okazały się potężnymi podejściami do analizy odpowiednio uwolnionych glikanów i nienaruszonych glikopeptydów, oferując głębsze zrozumienie heterogenicznego glikoproteomu w mikrośrodowisku guza (TME). Protokół ten szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną glikomikiem, zintegrowaną technologię omiczną, która po pierwsze wykorzystuje porowate grafityzowane glikomiki na bazie węgla LC-MS / MS w celu wyjaśnienia struktur glikanów i ich ilościowego rozmieszczenia w glikocie badanych tkanek nowotworowych, populacji komórek lub płynów ustrojowych. Pozwala to na porównawczą analizę glikomiczną w celu zidentyfikowania zmienionej glikozylacji w różnych grupach pacjentów, stadiach choroby lub stanach i, co ważne, służy usprawnieniu dalszej analizy glikoproteomicznej tej samej próbki (próbek) poprzez utworzenie biblioteki znanych struktur glikanów, skracając w ten sposób czas wyszukiwania danych i wskaźnik błędnej identyfikacji glikoproteiny. Koncentrując się na profilowaniu N-glikoproteomu, w niniejszym protokole szczegółowo opisano etapy przygotowania próbki do metody glikoproteomiki sterowanej glikomikiem oraz omówiono kluczowe aspekty gromadzenia i analizy danych. Metoda glikoproteomiki sterowana glikokomiką dostarcza ilościowych informacji na temat glikoprotein obecnych w TME i ich miejsc glikozylacji, zajętości miejsc i specyficznych dla danego miejsca struktur glikanów. Przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad tkankami nowotworowymi zatopionymi w parafinie utrwalonymi w formalinie od pacjentów z rakiem jelita grubego, co pokazuje, że metoda jest czuła i kompatybilna z wycinkami tkanek powszechnie znajdującymi się w biobankach. Glikoproteomika sterowana glikomiką oferuje zatem kompleksowe spojrzenie na niejednorodność i dynamikę glikoproteomu w złożonych TME, generując solidne dane biochemiczne niezbędne do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Wprowadzenie

Glikozylacja białek jest powszechnym i złożonym rodzajem modyfikacji ko- i potranslacyjnych białek wytwarzanych przez gatunki na całym drzewie filogenetycznym życia1,2,3. Wiadomo, że glikany związane z białkami wpływają na szeroki zakres procesów biologicznych istotnych dla zdrowia ludzi, w tym na mediację i regulację oddziaływań komórkowych oraz zdarzeń komunikacyjnych4,5. Przypuszcza się, że aberracyjna glikozylacja białek jest przyczyną transformacji złośliwej, progresji i rozprzestrzeniania się nowotworów6,7,8. Wskazuje to na udział glikanów w kluczowych procesach tumorigennych w mikrośrodowisku guza (TME) i oferuje znaczny, w dużej mierze niewykorzystany potencjał w odkrywaniu biomarkerów opartych na glikanach oraz w zastosowaniach terapeutycznych. Glikobiologia zyskuje zatem coraz większą uwagę w badaniach nad rakiem oraz w naukach o życiu9.

Dzięki kluczowym osiągnięciom w dziedzinie glikoanalityki i informatyki z ostatniej dekady10,11,12,13,14,15,16,17, glikomika i glikoproteomika oparta na cieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) stały się potężnymi narzędziami do systemowego profilowania uwolnionych glikanów i nienaruszonych glikopeptydów z kompleksowych mieszanin glikoprotein ekstrahowanych bezpośrednio z próbek biologicznych, takich jak różne rodzaje preparatów od pacjentów onkologicznych (np. tkanki nowotworowe, populacje komórek, płyny ustrojowe)3,13,18,19,20.

Glikomika dostarcza informacji o strukturze i ilości zestawu glikanów (glikomu), który jest dynamicznie wytwarzany przez komórki, tkanki, a nawet całe organizmy. Z drugiej strony, glikoproteomika dostarcza ilościowych informacji o białkach nośnikach i ich miejscach glikozylacji, stopniu zajętości tych miejsc (makro-heterogeniczność), składzie glikanów w konkretnych miejscach oraz wzorcu ich rozmieszczenia (mikro-heterogeniczność), przy ograniczonej informacji o strukturze glikanów (często ograniczonej do składu glikanów)15,16,21. Zatem glikomika i glikoproteomika są komplementarnymi podejściami do badania szczegółów biochemicznych glikoproteomu22.

W laboratoriach opracowano i zastosowano szereg projektów metodologicznych i strategii analitycznych w glikomice i glikoproteomice, w zależności od badanego glikoanalitu (np. wiązania N-/O-/C-, glikanu/glikopeptydu/glikoproteiny, znakowanego/nieznakowanego), charakteru próbki (np. komórki, tkanki, płyny ustrojowe), jej ilości (poziomy białka rzędu nanogramów/mikrogramów/miligramów) oraz dostępnego instrumentu analitycznego23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Pomimo uznanych korzyści wynikających z ich równoległego stosowania, glikomika i glikoproteomika nie są powszechnie stosowane wspólnie, lecz raczej jako odrębne podejścia w badaniach z zakresu glikobiologii i nowotworów, ze względu na wysokie wymagania dotyczące wiedzy analitycznej oraz specjalistycznej aparatury.

Dostrzegając tę lukę technologiczną, ponad dekadę temu wprowadziliśmy metodę glikoproteomiki wspomaganej glikomiką, która umożliwia integrację danych z glikomiki i glikoproteomiki uzyskanych ze złożonych próbek biologicznych33. W skrócie, technologia glikoproteomiki wspomaganej glikomiką (lub sterowanej glikomiką, jak w niniejszym protokole) profiluje N- i/lub O-glikany za pomocą uznanej metody LC-MS/MS z wykorzystaniem porowatego grafitowanego węgla (PGC)34,35, które są następnie wykorzystywane do analizy danych nienaruszonych N- i/lub O-glikopeptydów pozyskanych z tej samej próbki (próbek) poprzez zdefiniowanie granic przestrzeni przeszukiwania glikanów36. PGC-LC-MS/MS jest szczególnie potężną metodą glikomiczną, ponieważ zapewnia ilościowy wgląd w glikom z wysoką czułością i rozdzielczością strukturalną, dostarczając informacji o topologii (sekwencji monosacharydów i wzorcu rozgałęzień) oraz wiązaniach glikozydowych glikanów nawet w złożonych mieszaninach35,37,38. Przepływ pracy w glikoproteomice obejmuje generowanie peptydów, opcjonalne znakowanie peptydów, multipleksowanie i prefrakcjonowanie, a także wzbogacanie przed analizą LC-MS/MS w fazie odwróconej, w której idealnie stosuje się różne metody fragmentacji, w tym stopniową energię kolizyjną/dysocjację kolizyjną o wysokiej energii (sceHCD dla N-glikopeptydów) oraz transfer elektronów/dysocjację kolizyjną o wysokiej energii (EThcD dla O-glikopeptydów) w celu identyfikacji analitów. W przypadku analizy N-glikoproteomu, równoległa de-N-glikoproteomika może sterować analizą danych nienaruszonych N-glikopeptydów poprzez zdefiniowanie przestrzeni przeszukiwania białek/peptydów oraz dostarczenie szczegółowych informacji na temat zajętych miejsc N-glikozylacji i stopnia ich zajęcia, podczas gdy równoległa analiza peptydów niemodyfikowanych ujawnia wszelkie zmiany na poziomie białek pomiędzy badanymi warunkami.

Niniejsza praca przedstawia szczegółowy i łatwy do naśladowania protokół krok po kroku dla metody glikoproteomiki kierowanej glikomiką (przegląd schematu postępowania znajduje się na Rysunku 1). Protokół zawiera szczegóły eksperymentalne dotyczące etapów przygotowania próbek oraz eksperymentów glikomiki i glikoproteomiki opartych na LC-MS/MS, a także prezentuje reprezentatywne wyniki demonstrujące zastosowanie tej metody do przekrojów tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) z guzów wyciętych u pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC), co pozwala na uzyskanie wglądu w glikobiologię TME w cennym typie próbek archiwizowanych w biobankach nowotworowych na całym świecie. Krótko omówiono również analizę i integrację danych glikomiki i glikoproteomiki.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd metody glikoproteomiki kierowanej glikomiką. Schemat przedstawia szczegółowe kroki eksperymentalne w procesach glikomiki (po lewej) i glikoproteomiki (po prawej), wraz z zestawieniem uzyskanych informacji (pogrubione) oraz sposobem integracji obu podejść poprzez ulepszoną analizę i interpretację danych. Wstawka: Własnoręcznie wykonane mikrokolumny SPE użyte w procesach (i) glikomiki oraz (ii-iii) glikoproteomiki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych (Nauki Medyczne) na Uniwersytecie Macquarie, Sydney, Australia (Protokół 5201800073).

UWAGA: Metoda glikoproteomiki sterowana glikomikiem może być stosowana do różnorodnego zestawu próbek biologicznych, od niskiej do skrajnej złożoności glikoproteiny. W przypadku podejść glikoproteomicznych bez znaczników (w których nie przeprowadza się łączenia próbek) jako materiał wyjściowy wymagane jest około 100-200 μg białka całkowitego ze złożonych mieszanin, aby zapewnić wysokie pokrycie glikoproteomem po wzbogaceniu w glikopeptydy, które mogą stanowić tylko 1%-10% populacji peptydów. Ze względu na ograniczoną ilość miejsca, początkowa ekstrakcja białka z komórek lub tkanek jest pomijana, a czytelnicy są odsyłani do innych zasobów15. Glycomics konserwatywnie zużywa ~ 10-20 μg białka na analizę w celu głębokiego profilowania gliku, pozostawiając większość ekstraktu białkowego dla glikoproteomiki. Jeśli nie zaznaczono inaczej, podano końcowe stężenia, a chemikalia należy rozpuścić w wodzie o bardzo wysokiej jakości, aby uzyskać roztwory wodne w poniższym protokole.

1. Preparat białkowy

  1. Określić stężenie białka w ekstraktach przy użyciu ustalonej metody (np. kwas bicinchoninowy lub testy białek Bradforda). Dostosuj stężenie białka do 10 μg/μl w 50 mM TEAB (pH 8,5).
  2. Zredukować wiązania dwusiarczkowe poprzez inkubację próbek z 10 mM DTT przez 45 minut w temperaturze 56 °C. Wolne od alkilatów grupy tiolowe poprzez następną inkubację próbek z 40 mM IAA w ciemności przez 30 minut w temperaturze 20-25 °C. Stłumić reakcję alkilacji nadmiarem DTT (~40 mM).
  3. Podziel każdą próbkę białka. Dopuszczaj około 10-20 μg białka całkowitego dla glikomiki i 100-200 μg białka całkowitego dla przepływu pracy glikoproteomiki.
    UWAGA: Oprócz próbki (próbek) białka, które są przedmiotem zainteresowania, należy dołączyć znaną modelową glikoproteinę (np. fetuinę bydlęcą) lub mieszaninę białek (np. lizat linii komórkowej, osocze) w celu oceny skuteczności i odtwarzalności procedur oraz monitorowania wydajności LC-MS/MS.

2. Przepływ pracy N-glycomics

  1. Immobilizacja białek na membranie PVDF
    1. Użyj dziurkacza jednootworowego, aby przeciąć złączkę membrany PVDF z liczbą próbek białka, które mają zostać wykryte.
    2. Zwilż wycięte membrany etanolem lub metanolem, a następnie przenieś membrany na płaską płytkę 96-dołkową.
    3. Gdy membrany są prawie suche, umieść próbki białka w maksymalnej objętości 2,5 μl na miejsce, aby zminimalizować powierzchnię zdeponowanej próbki białka. W razie potrzeby należy ponownie pobrać próbki, tak aby całkowita ilość unieruchomionego białka na miejscu wynosiła ~10-20 μg. Aby to zrobić, pozwól punktowemu powietrzu wyschnąć przed powtórzeniem procedury nakrapiania.
      UWAGA: Podczas plamienia może być konieczne ponowne zwilżenie membrany etanolem lub metanolem, aby zapobiec wyschnięciu membran do końca.
    4. Membrany suszyć na powietrzu w temperaturze 20-25 °C przez co najmniej 3 godziny, najlepiej przez noc. Unikać zanieczyszczenia membran podczas suszenia.
      UWAGA: Jako opcjonalny etap kontroli jakości, białka zauważone na błonach można uwidocznić poprzez barwienie roztworem Direct Blue 71, jak opisano wcześniej34.
  2. Uwalnianie N-glikanów związanych z białkiem
    1. Dodać 100 μl 1% (w/v) PVP40 w metanolu do każdej studzienki zawierającej nakrapiane membrany. Upewnij się, że strona błony, na której zauważono próbkę białka, jest skierowana do góry przez cały czas przygotowania próbki.
    2. Potrząsać płytką w roztworze PVP40 przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C, a następnie wyrzucić roztwór PVP40.
      UWAGA: Roztwór PVP40 blokuje membrany PVDF i studzienki, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu PNGazy F (i wszelkich egzoglikozydazów, które mogą być stosowane w celu uzyskania informacji specyficznych dla sprzężenia w równoległych eksperymentach; patrz Dyskusja poniżej) w kolejnych krokach.
    3. Umyj każdą studzienkę zawierającą zablokowane plamki białkowe 100 μl ultraczystej wody i potrząsaj płytką przez 5 minut. Powtórz ten krok 3 razy. Upewnij się, że woda została całkowicie usunięta po każdym myciu.
    4. Dodać 15 μl roztworu PNGazy F (0,5 U/μL, rozcieńczonego w ultraczystej wodzie z roztworu podstawowego o stężeniu 10 U/μL) do każdego dołka, zakładając, że zdeponowano 15 μg białka na próbkę.
    5. Dodaj wodę do otaczających pustych studzienek, aby zapobiec odwodnieniu próbki podczas kolejnych etapów inkubacji, i użyj przezroczystej folii, aby ostrożnie uszczelnić płytkę. Inkubować płytkę przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 37 °C.
    6. Sonikuj płytkę przez 5 minut, aby pomóc w zebraniu się wszelkich odparowanych kropelek z boku studzienek na dnie płytki.
    7. Uwolnione próbki N-glikanu należy ostrożnie przenieść do poszczególnych probówek do mikrowirówek (1,5 ml). Umyj studzienki na próbkę 2x 20 μl ultraczystej wody, dozuj i kilkakrotnie zassaj. Połączyć pozostałą próbkę z każdej studzienki z probówkami mikrowirówkowymi zawierającymi próbki N-glikanu.
      UWAGA: Unikaj używania probówek o niskiej zawartości wiązania do przygotowania próbki N-glikomika, ponieważ hydrofilowe glikany mogą nieodwracalnie wiązać się z powlekanymi probówkami.
    8. Dodać 10 μl 100 mM octanu amonu o pH 5,0 i inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze 20-25 °C.
      UWAGA: Ten etap hydroksyluje amizowane reszty N-acetyloglukozaminy na końcu redukującym uwolnionych N-glikanów, umożliwiając wyczerpującą redukcję w następnym etapie. Dostosuj 100 mM octanu amonu do pH 5,0, ponieważ wysokie szybkości konwersji glikozyloaminy do hydroksylu w końcu redukującym odłączonych N-glikanów zależą od słabej kwasowości roztworu.
    9. Wysuszyć próbki N-glikanu w systemie koncentratora próżniowego.
  3. Redukcja uwolnionych N-glikanów
    1. Do wysuszonych próbek N-glikanu dodać 20 μl świeżo przygotowanego 1 M NaBH4 w 50 mM KOH i dokładnie wymieszać.
      UWAGA: NaBH4 powinien być świeżo przygotowany w KOH w dniu użycia.
    2. Szczelnie zamknąć pokrywki każdej probówki i inkubować próbki przez 3 godziny w temperaturze 50 °C.
      UWAGA: N-glikany ulegają redukcji, która przekształca anomery α i β końca redukującego w pojedynczą formę alditolu, co prowadzi do pojedynczego piku chromatograficznego w analizie PGC-LC-MS/MS.
    3. Po inkubacji należy obrócić probówki z próbkami w mikrowirówce, aby ciecz opadła na dno probówek.
    4. Do każdej próbki dodać 100 μl ultraczystej wody. Dodać 2 μl lodowatego kwasu octowego, aby zneutralizować próbki alkalicznej N-glikanów. Odwiruj probówki z próbkami w mikrowirówce, aby przenieść próbki na dno probówek.
      UWAGA: Lodowaty kwas octowy neutralizuje próbki alkaliczne, co prowadzi do powstania gazowego wodoru (H2), a następnie musowania podczas reakcji.
  4. Odsalanie N-glikanów za pomocą PGC-C18-SPE
    1. Przygotuj domowe mikrokolumny PGC-C18-SPE zgodnie z poniższym opisem.
      1. Za pomocą odpowiedniej strzykawki zatkać i przenieść krążki C18 do odpowiednich końcówek pipet (10 μl).
        UWAGA: W tym przypadku można również zastosować komercyjne mikrokolumny C18-SPE.
      2. Odpipetować 10 μl zawiesiny żywicy PGC zawieszonej w 50% (v/v) metanolu do mikrokolumn C18-SPE. Umieścić mikrokolumny w probówkach o pojemności 2 ml wyposażonych w adaptery do mikrowirówek. Zakręć rurkami, aby utworzyć mikrokolumny PGC-C18-SPE o wysokości kolumny ~0,5 cm (patrz Rysunek 1i). Przygotować jedną mikrokolumnę PGC-C18-SPE dla każdej próbki.
        UWAGA: Zastosowanie adapterów zapewnia, że mikrokolumny są zawieszone w środku rury.
      3. Dla kolejnych etapów mycia i ładowania próbki należy ustawić wirówkę stołową na 6 000 obr./min (~2 000 x g) i wirować przez 60 sekund, aby ułatwić przejście faz ruchomych przez mikrokolumny PGC-C18-SPE. Umyj i kondycjonuj każdą mikrokolumnę PGC-C18-SPE sekwencyjnie za pomocą 50 μl 0,1% (v/v) TFA w ACN trzykrotnie, a następnie trzykrotnie 50 μl 0,1% (v/v) TFA.
        UWAGA: Mikrokolumny PGC-SPE można przygotować z kilkugodzinnym wyprzedzeniem, ale przed użyciem należy je przechowywać w stanie uwodnionym w temperaturze pokojowej.
    2. Próbki N-glikanu należy nanieść na mikrokolumny PGC-C18-SPE w objętości ładunkowej do 40 μl i wirować z prędkością 6 000 obr./min (~ 2 000 x g) przez 60 s po każdym dodaniu. Powtarzaj etap ładowania, aż cała próbka N-glikanu zostanie nałożona na mikrokolumnę.
      UWAGA: Chociaż frakcje przepływowe nie powinny zawierać glikanów, zalecamy przechowywanie tych frakcji do czasu pomyślnego pozyskania danych glikomicznych w przypadku niepełnego przechowywania na mikrokolumnach PGC-C18-SPE.
    3. Umyj mikrokolumny PGC-C18-SPE 20 μl ultraczystej wody. Przenieść mikrokolumny PGC-C18-SPE do nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania do elucji N-glikanów.
    4. Eluować N-glikany, dodając 40 μl 0,1% TFA w 50% (oba v/v) ACN do każdej mikrokolumny PGC-C18-SPE, a następnie odwirować. Powtórz tę procedurę i połącz eluat.
      UWAGA: Ważne jest, aby monitorować mikrokolumny po każdym wirowaniu, aby upewnić się, że roztwór został całkowicie odwirowany, ponieważ ułatwi to wydajną elucję.
    5. Wysuszyć odsolone N-glikany w systemie koncentratora próżniowego.
  5. Akwizycja PGC-LC-MS/MS
    1. Przygotować rozpuszczalniki LC zgodnie z poniższym opisem.
      1. Rozpuszczalnik A: Przygotować 100 ml 100 ml roztworu podstawowego wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) w wodzie ultraczystej. Przefiltrować roztwór podstawowy przez nylonowy dysk filtracyjny o średnicy 0,2 μm za pomocą jednostki filtracji próżniowej w celu usunięcia cząstek stałych. Następnie przygotować 1 l 10 mM roztworu NH4HCO3 (rozpuszczalnik A), rozcieńczając 100 ml 100 mM roztworu podstawowego NH4HCO3 w 900 ml wody ultraczystej. Sonikować rozpuszczalnikiem A przez 15 minut w celu odgazowania roztworu. Rozpuszczalnik A można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 20-25 °C, natomiast roztwór podstawowy 100 mM NH4HCO3 można przechowywać przez 1 miesiąc w temperaturze 4 °C.
      2. Rozpuszczalnik B: Przygotować 1 l 10 mM NH4HCO3 w 70% (v/v) ACN w wodzie ultraczystej (rozpuszczalnik B) przez dodanie 100 ml 100 mM roztworu podstawowego NH4HCO3 (patrz poprzedni krok 2.5.1.2) do 700 ml ACN i rozcieńczyć do całkowitej objętości 1 l wodą ultraczystą. Sonikować rozpuszczalnik B przez 15 minut w celu odgazowania. Rozpuszczalnik B można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 20-25 °C.
    2. Ponownie zawiesić odsolone N-glikany w 10 μl ultraczystej wody i dokładnie wymieszać. Wirować próbki w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie przenieść supernatant do fiolek z próbkami MS, pozostawiając około 0,5 μl, aby uniknąć przeniesienia widocznych lub niewidocznych cząstek stałych i zanieczyszczeń, które mogłyby uszkodzić system LC-MS/MS.
    3. Wstrzyknąć i oddzielić N-glikany na kolumnie kapilarnej PGC-LC podgrzanej do 50 °C przy użyciu 60-minutowego liniowego (lub w inny sposób odpowiedniego) gradientu 0%-70% (v/v) rozpuszczalnika B w rozpuszczalniku A w systemie HPLC. Upewnij się, że system HPLC jest podłączony do spektrometru mas i działa ze stałym natężeniem przepływu 20 μl/min (dostosować natężenie przepływu do geometrii kolumny PGC-LC).
    4. Wykryć oddzielone N-glikany za pomocą liniowego spektrometru masowego z kwadrupolową pułapką jonową (lub innego odpowiedniego systemu MS o niskiej lub wysokiej rozdzielczości) zainstalowanego ze źródłem jonów do elektrorozpylania i pracującego w trybie polaryzacji jonów ujemnych.
    5. Ustaw zakres skanowania akwizycji MS1 na m/z 150-2 000 z maksymalną szerokością skanowania powiększenia wynoszącą m/z 0,25 pełnej szerokości połowy maksimum (FWHM) przy m/z 200. Ustaw napięcie źródła na 3,2 kV. W przypadku skanowania MS1 ustaw automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC) na 5 x 104 jonów z maksymalnym czasem akumulacji 50 ms (lub innymi odpowiednimi ustawieniami).
      UWAGA: Dolna początkowa m/z ma obejmować wykrywanie mono- i di-sacharydów, które często przyczyniają się do N- i O-glikomu.
    6. Dla MS/MS ustaw rozdzielczość na m/z 0,25 FWHM przy m/z 200, AGC na 2 x 104 jony, a maksymalny czas akumulacji na 300 ms. Włącz akwizycję zależną od danych (DDA) i wybierz pięć najliczniejszych prekursorów w każdym pełnym skanowaniu MS1 pod kątem fragmentacji przy użyciu dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID) aktywacji rezonansowej (pułapki jonowej) przy znormalizowanej energii zderzenia (NCE) wynoszącej 33%. Usuń zaznaczenie opcji wykluczenia dynamicznego, aby uniknąć pominięcia ściśle eluujących izobarycznych izomerów N-glikanu.
  6. Analiza danych glikomicznych LC-MS/MS
    1. Przeglądaj wygenerowane surowe dane LC-MS/MS za pomocą odpowiedniego oprogramowania, aby zapewnić wysoką jakość danych po potwierdzeniu wąskiej szerokości piku LC, efektywnej separacji izomerów N-glikanów, wysokiej dokładności MS, rozdzielczości i stosunku sygnału do szumu oraz wysokiej wydajności fragmentacji CID-MS/MS.
    2. Ręczna identyfikacja N-glikanów w próbce na podstawie ich monoizotopowej masy prekursorowej, wzorca fragmentacji CID-MS/MS oraz względnego i bezwzględnego czasu retencji PGC-LC.
      UWAGA: RawMeat v2.1, GlycoMod i GlycoWorkBench v2.1 mogą wspomóc proces identyfikacji zgodnie z opisem26. Znane ograniczenia biosyntetyczne i pokrewieństwo strukturalne wśród obserwowanych analitów mogą również zwiększyć pewność zidentyfikowanych N-glikanów26. Alternatywnie, półautomatyczna identyfikacja glikanów i adnotacja spektralna mogą być wykonane za pomocą komercyjnego oprogramowania.
    3. W celu względnego oznaczania ilościowego N-glikanu należy wygenerować listę przejść zawierającą monoizotopowy prekursor m/z wszystkich zidentyfikowanych izomerów N-glikanu i użyć komercyjnego oprogramowania do określenia wartości pola pod krzywą (AUC) na podstawie ekstrahowanych chromatogramów jonowych (EIC) wszystkich jonów prekursorowych N-glikanu, jak opisano26.

3. Przebieg pracy N-glikoproteomiki

  1. Trawienie mieszanki białkowej
    1. Strawić 100-200 μg zredukowanego i alkilowanego ekstraktu białkowego (z części 1), dodając trypsynę (stosunek enzymu do białka 1:50, w/w) i/lub inne wybrane proteazy do każdej próbki.
      UWAGA: W przeciwieństwie do przygotowania próbki glikomicznej, należy użyć, jeśli to możliwe, probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania do etapów przygotowania próbki glikoproteomicznej, aby uzyskać maksymalny odzysk peptydów.
    2. Inkubować próbki przez 8-12 godzin w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że pH wynosi ~8,5, ponieważ łagodnie zasadowy roztwór poprawia wydajność trawienia trypsyny.
      UWAGA: Preferowane są specyficzne proteazy, które wytwarzają przewidywalne wzorce rozszczepienia i pozostawiają większość N-glikopeptydów z pojedynczym cekonem (miejscem glikozylacji), takie jak trypsyna i Lys-C. Należy unikać nadmiernej inkubacji próbek w celu zmniejszenia niespecyficznego rozszczepienia białek przez trypsynę lub inne proteazy.
    3. Zatrzymaj trawienie przez zakwaszenie (aby uniknąć niespecyficznych rozszczepień wywołanych długotrwałym trawieniem) poprzez dodanie 1% (v/v) TFA.
  2. Odsalanie peptydów przy użyciu Oligo R3-C18-SPE
    1. Przygotuj domowe mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE zgodnie z poniższym opisem.
      1. Za pomocą odpowiedniej strzykawki zatkać i przenieść krążki C18 na końcówki do pipet o pojemności 10 μl.
        UWAGA: W tym przypadku można również zastosować komercyjne mikrokolumny C18-SPE.
      2. Umieść zawiesinę żywicy Oligo R3 zawieszoną w czystym ACN w mikrokolumnach C18-SPE. Umieść mikrokolumny w probówkach o pojemności 2 ml wyposażonych w adaptery do mikrowirówek, aby upewnić się, że mikrokolumny są zawieszone w środku probówki i obracaj, aby utworzyć mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE o wysokości kolumny ~1 cm (patrz Rysunek 1ii). Przygotować jedną mikrokolumnę Oligo R3-C18-SPE dla każdej próbki.
    2. Na kolejnych etapach mycia i ładowania próbki należy ustawić wirówkę stołową na 6 000 obr./min (~ 2 000 x g) i wirować przez 60 sekund, aby umożliwić przejście faz ruchomych przez mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE. Umyj i kondycjonuj kolejno każdą mikrokolumnę Oligo R3-C18-SPE za pomocą 50 μl czystego ACN, 3x, a następnie 50 μL 0,1% (v/v) TFA, 3x,
      UWAGA: Mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać uwodnione przez wiele godzin w temperaturze pokojowej przed użyciem.
    3. Umieść kondycjonowane mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE w nowych probówkach o pojemności 1,5 ml wraz z adapterami do mikrowirówek. Nałóż mieszaniny peptydów trawionych tryptycznie na mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE i wiruj z prędkością 2 000 x g przez 60 s. W przypadku próbek o objętości większej niż 50 μl może być wymagane wielokrotne ładowanie.
    4. Przemyć mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE 50 μl 0,1% (v/v) TFA, 3x. Przenieść mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE do nowych probówek o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania do elucji odsolonych peptydów.
    5. Eluować odsolone peptydy, stosując 50 μl 0,1% TFA w 50% (oba v/v) ACN, a następnie 50 μl 0,1% TFA w 70% (oba v/v) ACN do każdej mikrokolumny Oligo R3-C18-SPE. Wiruj po każdym kroku.
      UWAGA: Ważne jest, aby monitorować mikrokolumny po każdym wirowaniu, aby upewnić się, że roztwór został całkowicie odwirowany, ponieważ ułatwi to wydajną elucję.
    6. Zbierz, połącz i wysusz odsolone peptydy w systemie koncentratora próżniowego.
      UWAGA: W przypadku wykonywania równoległej proteomiki i de-N-glikoproteomiki (patrz Dyskusja), podziel odsolone próbki peptydów i odłóż oddzielne frakcje przed suszeniem.
  3. Wzbogacanie N-glikopeptydu za pomocą ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Przygotuj domowe mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE zgodnie z poniższym opisem.
      1. Za pomocą odpowiedniej strzykawki zatkać i przenieść krążki C8 na końcówki pipet o pojemności 10 μl.
      2. Osadzać zawiesinę żywicy ZIC-HILIC zawieszoną w metanolu w mikrokolumnach C8-SPE. Umieść mikrokolumny w probówkach o pojemności 2 ml wyposażonych w adaptery do mikrowirówek, aby upewnić się, że mikrokolumny są zawieszone w środku probówki i wiruj, aby utworzyć mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE o wysokości kolumny ~1 cm (patrz Rysunek 1iii). Przygotować jedną mikrokolumnę ZIC-HILIC-C8-SPE dla każdej próbki.
    2. Aby wykonać kolejne etapy mycia i ładowania próbki, ustaw wirówkę stołową na 6 000 obr./min (~2 000 x g) i wiruj przez 60 sekund, aby umożliwić przejście faz ruchomych przez mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE. Umyj i kondycjonuj każdą mikrokolumnę ZIC-HILIC-C8-SPE kolejno 50 μl metanolu, 3x, a następnie 50 μL wody ultraczystej, 3x, a na koniec 50 μL 1% TFA w 80% (oba v/v) ACN, 3x.
      UWAGA: Mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE można przygotować z kilkugodzinnym wyprzedzeniem, ale przed użyciem należy je przechowywać w stanie uwodnionym w temperaturze pokojowej.
    3. Wysuszone mieszaniny peptydów przeznaczone do wzbogacania N-glikopeptydem zawiesić ponownie w 50 μl 1% TFA w 80% (zarówno v/v) ACN i dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Jeśli peptydy są trudne do ponownego rozpuszczenia w rozpuszczalniku ładującym HILI, peptydy można najpierw ponownie rozpuścić w 10% (v/v) TFA, a następnie szybko rozcieńczyć w ACN, aby osiągnąć stężenia rozpuszczalnika ładującego HILI. Unikać podgrzewania próbki w wysokim stężeniu TFA, aby uniknąć indukowania hydrolizy.
    4. Umieść kondycjonowane mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE w nowych probówkach o pojemności 1,5 ml wraz z adapterami do mikrowirówek. Zawiesiny mieszanin peptydowych należy nałożyć na mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE i wirować z prędkością 2 000 x g przez 60 s. W przypadku próbek o objętości większej niż 50 μl może być wymagane wielokrotne ładowanie.
    5. Zebrać frakcję przepływową i ponownie nałożyć frakcję (frakcje) na tę samą mikrokolumnę ZIC-HILIC-C8-SPE. Powtórz ponowną aplikację 2x i zachowaj probówki przepływowe.
    6. Przemyć mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE 2x 50 μl 1% TFA w 80% (zarówno v/v) ACN, odwirować i połączyć ten przepływ z przepływem z kroku 3.3.4.
      UWAGA: Połączona frakcja przepływowa zazwyczaj zawiera ~ 90% całkowitego materiału peptydowego, skutecznie tworząc niemodyfikowaną frakcję peptydową, która w związku z tym może być wykorzystana do oddzielnej dalszej analizy (zamiast przeprowadzania oddzielnego eksperymentu proteomicznego).
    7. Przenieś mikrokolumny ZIC-HILIC-C8-SPE do nowych probówek wirówkowych o niskiej wiązalności 1,5 ml. Eluować zatrzymane N-glikopeptydy sekwencyjnie za pomocą 50 μl 0,1% (v/v) TFA, następnie 50 μl 25 mM wodorowęglanu amonu, a następnie 50 μl 50% (v/v) ACN. Wirować z prędkością 2 000 x g przez 60 s po każdym kroku.
      UWAGA: Eluat zazwyczaj zawiera ~ 10% całkowitego materiału peptydowego, z których większość powinny stanowić N-glikopeptydy, jeśli osiągnięto wysoką wydajność wzbogacania. Ważne jest, aby monitorować mikrokolumny po każdym wirowaniu, aby upewnić się, że roztwór został całkowicie odwirowany, ponieważ ułatwi to wydajną elucję.
    8. Zebrać, połączyć i wysuszyć wzbogacone N-glikopeptydy i (w razie potrzeby) niemodyfikowany peptyd przepływa przez frakcje w systemie koncentratora próżniowego.
  4. LC-MS/MS z odwróconymi fazami nienaruszonych N-glikopeptydów
    1. Przygotować rozpuszczalniki LC zgodnie z poniższym opisem.
      1. Rozpuszczalnik A: Przygotować 1 l 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w ultraczystej wodzie. Sonikować przez 15 minut, aby odgazować rozpuszczalnik. Rozpuszczalnik A można przechowywać przez miesiąc w temperaturze 20-25 °C.
      2. Rozpuszczalnik B: Przygotować 1 l 0,1% kwasu mrówkowego w 99,9% (oba v/v) ACN. Sonikować przez 15 minut, aby odgazować. Rozpuszczalnik B może być przechowywany przez miesiąc w temperaturze 20-25 °C.
    2. Wysuszone frakcje peptydowe zawiesić w 0,1% (v/v) kwasie mrówkowym do stężenia około 0,2-0,5 μg peptydu/μl i dokładnie wymieszać. Wirować próbki w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie przenieść supernatant do fiolek z próbkami MS, pozostawiając około 0,5 μl, aby uniknąć przeniesienia niepożądanych cząstek stałych i zanieczyszczeń.
    3. Dla każdej próbki wstrzyknąć ~0,5-1 μg całkowitego peptydu na kolumnę pułapkową C18-LC i oddzielić peptydy na kolumnie analitycznej C18-LC przy stałym natężeniu przepływu 250 nL/min za pomocą systemu UPHLC podłączonego do spektrometru mas o gradiencie 2%-30% rozpuszczalnika B przez 100 min, 30%-50% B przez 18 min, 50%-95% B w ciągu 1 minuty i 9 minut przy 95% (wszystkie v/v) B w rozpuszczalniku A (lub innym odpowiednim ustawieniu).
    4. Wykrywanie peptydów za pomocą spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości sprzężonego z systemem nanoLC wyposażonym w źródło jonów nano-elektronatryskowych i działającym w trybie polaryzacji jonów dodatnich.
    5. W przypadku MS1 użyj zakresu skanowania akwizycji m/z 350-1,800, wysokiej rozdzielczości 60,000-120,000 FWHM przy m/z 200 i napięcia źródła ~2,5 kV. Ustaw AGC na 3 x 106 jonów z maksymalnym czasem akumulacji 50 ms (lub innymi odpowiednimi ustawieniami).
    6. W przypadku MS/MS wybierz 20 najliczniejszych jonów prekursorowych z każdego pełnego skanowania MS1 pod kątem fragmentacji w trybie DDA z wykorzystaniem HCD-MS/MS ze stałym NCE 35% lub sceHCD z NCE 25%, 35% i 45%. Co ważne, ustal dolną wartość m/z na 110 (np. zakres skanowania m/z 110 - 1,800), aby obserwować wszystkie jony oksonium o niskiej masie w każdym widmie fragmentu.
    7. Wybierz prekursory, które przenoszą więcej niż 2 ładunki (Z ≥ 2) do fragmentacji. Uzyskanie widm (sce)HCD-MS/MS przy rozdzielczości 30 000-45 000 FWHM przy m/z 200 z AGC 1 x 105 jonów i czasem akumulacji 90 ms przy użyciu okna izolacji prekursora ± 1,0 Th. Włącz dynamiczne wykluczanie 30 s po pojedynczej izolacji i fragmentacji danego jonu prekursorowego.
      UWAGA: Jeśli ETD jest dostępny, rozważ również pobranie EThcD-MS/MS nienaruszonych próbek N-glikopeptydu za pomocą zależnego od produktu wyzwalania jonowego. Wykonaj ten krok, gdy diagnostyczne jony oksonium glikanu (np. m/z 138.0545, 204.0867 i 366.1396) znajdują się wśród 20 pierwszych jonów fragmentacyjnych w każdym spektrum HCD-MS/MS39. Wykrywanie fragmentów EThcD-MS/MS z rozdzielczością 30 000-45 000 FWHM przy m/z 200 z AGC 4 x 105 jonów, czasem wtrysku 250 ms, HCD NCE 15% i szerokością izolacji prekursora 1,6 Th.
  5. Analiza danych glikoproteomiki LC-MS/MS
    1. Potwierdzić wzbogacenie surowych danych LC-MS/MS o N-glikopeptydy, sprawdzając, czy większość widm HCD-MS/MS zawiera jony oksonium glikanu (np. m/z 138.0545, 204.0867 i 366.1396) oraz (dla strategii znakowania) cechuje się separacją linii bazowej jonów reporterowych TMT o niskiej masie, wysoką wydajnością fragmentacji w widmach MS/MS i wąską szerokością piku LC oraz wysoką dokładnością MS, rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu.
    2. Korzystając z wyszukiwarki (dostępnych jest wiele elementów; patrz poniżej), przeszukaj dane MS/MS w poszukiwaniu nienaruszonych N-glikopeptydów w odpowiedniej bazie danych białek/peptydów ukierunkowanej na badaną próbkę (np. uzyskaną z eksperymentu de-N-glikoproteomicznego) lub we wszystkich recenzowanych białkach ludzkich UniProtKB. Dostosuj wyszukiwanie przeciwko N-glikozylacji peptydów, szukając peptydów z Asn zlokalizowanym w sekgonie. Co ważne, należy wybrać bazę danych N-glikanów opartą na glikomikach, tj. glikanów zidentyfikowanych na podstawie danych glikomicznych w kroku 2, aby ograniczyć przestrzeń wyszukiwania do glikanów, o których wiadomo, że występują w próbce.
      UWAGA: Można rozważyć równoległe przeszukiwanie przy użyciu szerokiej, predefiniowanej bazy danych N-glikanów w celu wykluczenia istnienia dodatkowych kompozycji N-glikanów w danych.
    3. Dostosuj pozostałe zmienne wyszukiwania do badanej próbki, konkretnych procedur obsługi próbki oraz zastosowanych ustawień MS i używanego oprzyrządowania. Typowe ustawienia wyszukiwania danych N-glikoproteomiki obejmują:
      Tolerancja masy prekursora i produktu: 10 ppm i 20 ppm
      Specyficzność proteazy: w pełni specyficzna i/lub półspecyficzna (N-postrzępiona)
      Dopuszczalne nietrafione dekolty: 2
      Poprawiono modyfikacje: Cys karbamidometylacja (+57.021 Da)
      Różne modyfikacje: Met oxidation (+15,994 Da) (często 1)
      Dopuszczalne zmienne modyfikacje na peptyd: 1 lub 2
      Modyfikacje glikanów: Baza danych glikanów oparta na Glycomics (rzadka 1)
      Baza danych wabików białkowych i zanieczyszczeń: Włączone
    4. Filtruj wszystkie wyszukiwania do <1% wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) na poziomie białka i peptydu. Weź pod uwagę tylko N-glikopeptydy zidentyfikowane z dużą pewnością siebie (np. wyniki PEP 2D < 0,001) i wykonaj ręczną adnotację/selekcję przefiltrowanych danych wyjściowych, aby jeszcze bardziej zmniejszyć szybkość nieprawidłowej identyfikacji N-glikopeptydu, jak omówiono36,40,41.
      UWAGA: Glikopeptydy z sjalylowanymi i multifukozylowanymi N-glikanami oraz glikopeptydy przenoszące inne zmienne modyfikacje oprócz glikanów (tj. utlenianie Met i deamidacja Asn/Gln) są szczególnie podatne na błędną interpretację przez wyszukiwarki41. Szczególną uwagę należy zwrócić na walidację takich kandydatów przed dokonaniem zgłoszenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki metody glikoproteomiki kierowanej glikomiką, zastosowanej do preparatu tkankowego FFPE pobranego od pacjenta z rakiem jelita grubego (CRC) w stopniu II.

Aby uzyskać wystarczającą ilość materiału białkowego na potrzeby protokołu, połączono ekstrakty białkowe z dwóch slajdów (stosów z) pochodzących z tego samego bloku tkankowego FFPE, zgodnie z opublikowanym protokołem, a w celu zwiększenia czułości eksperymentu glikoproteomicznego zastosowano me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole
W tym artykule protokolarnym przedstawiliśmy krok po kroku metodę glikoproteomiki sterowanej glikoproteomem, która zapewnia kompleksowy wgląd w heterogeniczność i dynamikę glikoproteomu w kompleksie TME.

Krytycznym krokiem w protokole jest zapewnienie całkowitej proteolizy bez nadmiernego trawienia mieszanki białek. Niespecyficzne rozszczepienia białek z natury zwiększają przestrzeń wyszukiwania peptydów, co prowadzi do dłuższego czasu wyszukiw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

THC jest wspierane przez Stypendium Międzynarodowego Programu Szkoleń Badawczych ufundowane przez rząd australijski. NB jest wspierany przez Międzynarodowe Stypendia Doskonałości Badawczej Uniwersytetu Macquarie ufundowane przez Uniwersytet Macquarie. AC jest wspierany przez stypendium Research Training Program ufundowane przez rząd australijski. RK był wspierany przez Instytut Raka Nowej Południowej Walii (ECF181259). MTA jest laureatem stypendium Australian Research Council Future Fellowship (FT210100455).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia
octan amonu Sigma AldrichA1542Dostępne alternatywy
Wodorowęglan amonu, czystość ≥ 99.0%Sigma AldrichA6141Dostępne alternatywy
Bezwodny acetonitryl (ACN), klasa LC-MSSigma Aldrich34851Dostępne alternatywy
Płod bydlęcySigma AldrichF3004Dostępne alternatywy
Ditiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Dostępne alternatywy
EtanolSigma AldrichE7023Dostępne alternatywy
Kwas mrówkowy, klasa LC-MSSigma Aldrich00940Dostępne alternatywy
Lodowaty kwas octowySigmaAldrich A6283Dostępne alternatywy
Jodoacetamid (IAA)Sigma AldrichI1149Dostępne alternatywy
MetanolSigma AldrichM1775Dostępne
alternatywyPeptydo-N-glikozydaza F (PNGaza F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) rekombinacyjnie wyrażany w Escherichia coli 
Poliwinylopirolidon 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Dostępne alternatywy
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma Aldrich484016Dostępne alternatywy
Trypsyna wieprzowa do sekwencjonowania PromegaV5113Dostępne alternatywy
Borowodorek sodu (NaBH4)Sigma Aldrich213462Dostępne alternatywy
Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), klasa LC-MSSigma AldrichT7408Dostępne alternatywy
Kwas trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MSSigma AldrichT6508Dostępne
alternatywyNarzędzia/Materiały
C18 dyskiEmpore66883-U
Dyski C8Empore66882-U
Płaskodenna płytka 96-dołkowa z polipropylenu płaskim Membrana z3364
Immobilon-PSQMiliporyIPVH20200Wielkość porów: 0,45 μ m 
MikrowirówkaEppendorf5452000069Dostępne alternatywy
Adaptery do mikrowirówek The Nest Group, Inc., ObrożaSS18VMiniSpin, jest dostarczana z żywicą Microspin Columns
Oligo R3Thermo1133903Wielkość cząstek 30 i mu; m
ParafilmParafilm MPM996
Probówki białkowe LoBind 1,5 mlEppendorf0030108450
Probówki białkowe LoBind 2,0 mlEppendorf0030108442
Probówki Safe-lock 1,5 mlEppendorf0030120086
Probówki Safe-lock 2,0 mlEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Dostępne alternatywy
Dziurkacz jednootworowySwingline74005
Koncentrator SpeedVacMartin ChristRVC 2-25 CDplusDostępne alternatywy Żywica
Supelclean ENVI-Carb SPESupelco57088Wielkość cząstek 120-400 oczek. Żywica może być ręcznie ekstrahowana z wkładów i może być przechowywana przez długi czas w 50% (v/v) metanolu w wodzie MilliQ
Strzykawka 5 mlSigma AldrichZ116866Dostępne alternatywy
Inkubator z kontrolowaną temperaturąThermolineE7.30Dostępne alternatywy
Kąpiel ultradźwiękowaUnisonicsFXPDostępne alternatywy
Żywica ZIC-HILICMerck150455Wielkość cząstek/porów, 5 μ m/200 Å. Żywica może być ręcznie ekstrahowana z kolumny LC i może być przechowywana przez długi czas w 50% (v/v) metanolu w
mikrokolumnach MilliQ do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) ZipTip C18 MilliporeZTC18S096Alternatywnie, domowe mikrokolumny C18-SPE mogą zastąpić produkt komercyjny
< strong>LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Kapilarny system HPLC alternatywyAgilent
Analityczna kolumna LC wstępnie wypełniona żywicą ReproSil-Pur C18 AQDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Niemcyr13.aq.s2570Wielkość cząstek/porów: 3 i mu; m/120 Å, długość/średnica wewnętrzna: 25 cm/75 μm. Dostępne są również komercyjne kolumny C18 nano-LC/ 
System Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC alternatywytermiczne
HiperCarb KAPPA PGC kapilarna kolumna LC Przerwane termicznieWielkość cząstek/porów, 3 i mu; m/250 & Aring; długość kolumny, 30 mm; Średnica wewnętrzna, 0,180 mm. Większe geometrie kolumn HyperCarb PGC-LC, dające dane o podobnej jakości, są dostępne na rynku (np. Thermo #35003-031030). Kolumna SupelTMCarb LC firmy Merck o wielkości cząstek/porów, 2,7 μ Dostępne są również m/200 i o różnych długościach kolumn i średnicy wewnętrznej (np. Merck #59994-U). 
Acetonitryl klasy LCMSLiChrosolv100029Dostępne alternatywy Liniowy
kwadrupol pułapkowy (LTQ) Spektrometr masowy z pułapką jonową Velos Pro (glikomy) alternatywytermiczne
Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (glikoproteomika)ThermoDostępne są również inne systemy MS o wysokiej rozdzielczości z ETD lub bez (wymagane tylko dla O-glikoproteomiki) (np. Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker lub podobne wysokowydajne spektrometry masowe innych dostawców)
Fiolki z przezroczystą szklanką Total Recovery 0,9 mlThermoTHC11093563Dostępne alternatywy
Fiolki z zakrętką Total Recovery Clear Glass pasujące nakrętkiThermoTHC09150869Dostępne alternatywy
Kolumna Trap LC pakowana we własnym zakresie z żywicą ReproSil-Pur C18 AQ Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Niemcyr15.aq.s0202Wielkość cząstek/porów: 5 μ m/120 Å, długość/średnica wewnętrzna: 2 cm/100 μm. Dostępne są również komercyjne kolumny LC z pułapką C18. 
Software
ByonicProtein Metrics Incw wersji 2.6.46 lub nowszejKomercyjna wyszukiwarka glikopeptydów i PTM, akceptująca surowe dane LC-MS/MS od większości dostawców MS
ByosProtein Metrics Incw wersji 3.9-7 lub nowszejKomercyjne oprogramowanie do ręcznej kontroli kandydatów na glikopeptydy i automatycznej adnotacji widm glikanów MS/MS
GlycoModExpasyOprogramowanie otwartego dostępu, wspomagające adnotację danych glikomiksowych (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Oprogramowanie o otwartym dostępie, wspomagające adnotację danych glikomiksowych i rysowanie kreskówek glikanowych
RawMeatVAST Scientificv2.1Oprogramowanie o otwartym dostępie, wyodrębniające m/z jonów prekursorowych glikanów z surowych danych spektralnych
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 lub nowszyOtwarte oprogramowanie do względnego oznaczania ilościowego glikanów
XcaliburThermov2.2 lub nowszyDo przeglądania surowych danych LC-MS/MS
polifluorku winylidenu (PVDF) Corning kolumny MA Dostępne Dostępne Dostępne

Bibliografia

  1. Gagneux, P., Panin, V., Hennet, T., Aebi, M., Varki, A. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 265-278 (2022).
  2. Tjondro, H. C., Loke, I., Chatterjee, S., Thaysen-Andersen, M. Human protein paucimannosylation: Cues from the eukaryotic kingdoms. Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2068-2100 (2019).
  3. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, glycoproteomics, and glycogenomics: An inter-taxa evolutionary perspective. Mol Cell Proteomics. 20, 100024(2021).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  5. Reily, C., Stewart, T. J., Renfrow, M. B., Novak, J. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (6), 346-366 (2019).
  6. Leite-Gomes, E., et al. Bringing to light the risk of colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mucosal glycosylation as a key player. Inflamm Bowel Dis. 28 (6), 947-962 (2022).
  7. He, K., et al. Decoding the glycoproteome: A new frontier for biomarker discovery in cancer. J Hematol Oncol. 17 (1), 12(2024).
  8. Mereiter, S., Balmana, M., Campos, D., Gomes, J., Reis, C. A. Glycosylation in the era of cancer-targeted therapy: Where are we heading. Cancer Cell. 36 (1), 6-16 (2019).
  9. Seeberger, P. H., et al. What comes next in glycobiology. Cell. 187 (11), 2628-2632 (2024).
  10. Abrahams, J. L., et al. Recent advances in glycoinformatic platforms for glycomics and glycoproteomics. Curr Opin Struct Biol. 62, 56-69 (2020).
  11. Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Schulz, B. L. Maturing glycoproteomics technologies provide unique structural insights into the N-glycoproteome and its regulation in health and disease. Mol Cell Prot. 15 (6), 1773-1790 (2016).
  12. Gaunitz, S., Nagy, G., Pohl, N. L., Novotny, M. V. Recent advances in the analysis of complex glycoproteins. Anal Chem. 89 (1), 389-413 (2017).
  13. Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Towards structure-focused glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (1), 161-186 (2021).
  14. Hu, H., Khatri, K., Zaia, J. Algorithms and design strategies towards automated glycoproteomics analysis. Mass Spectrom Rev. 36 (4), 475-498 (2017).
  15. Bagdonaite, I., et al. Glycoproteomics. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 48(2022).
  16. Peng, W., et al. MS-based glycomics and glycoproteomics methods enabling isomeric characterization. Mass Spectrom Rev. 42 (2), 577-616 (2023).
  17. Aoki-Kinoshita, K. F., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 705-718 (2022).
  18. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: Growing up fast. Curr Opin Struct Biol. 68, 18-25 (2021).
  19. Thaysen-Andersen, M., Kolarich, D., Packer, N. H. Glycomics & glycoproteomics: From analytics to function. Mol Omics. 17 (1), 8-10 (2021).
  20. Trbojevic-Akmacic, I., et al. High-throughput glycomic methods. Chem Rev. 122 (20), 15865-15913 (2022).
  21. Oliveira, T., Thaysen-Andersen, M., Packer, N. H., Kolarich, D. The hitchhiker's guide to glycoproteomics. Biochem Soc Trans. 49 (4), 1643-1662 (2021).
  22. Rudd, P. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor. NY. 689-704 (2022).
  23. Madunić, K., et al. Colorectal cancer cell lines show striking diversity of their O-glycome reflecting the cellular differentiation phenotype. Cell Mol Life Sci. 78 (1), 337-350 (2021).
  24. Parker, R., et al. Mapping the SARS-CoV-2 spike glycoprotein-derived peptidome presented by HLA class II on dendritic cells. Cell Rep. 35 (8), 109179(2021).
  25. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  26. Chatterjee, S., et al. Serum N-glycomics stratifies bacteremic patients infected with different pathogens. J Clin Med. 10 (3), 516(2021).
  27. Osimanjiang, W., et al. Analysis of N- and O-linked glycosylation: Differential glycosylation after rat spinal cord injury. J Neurotrauma. 37 (18), 1954-1962 (2020).
  28. Chatterjee, S., et al. Trends in oligomannosylation and α1,2-mannosidase expression in human cancers. Oncotarget. 12 (21), 2188-2205 (2021).
  29. Chang, D., Klein, J. A., Nalehua, M. R., Hackett, W. E., Zaia, J. Data-independent acquisition mass spectrometry for site-specific glycoproteomics characterization of SARS-CoV-2 spike protein. Anal Bioanal Chem. 413 (29), 7305-7318 (2021).
  30. Pan, J., et al. Glycoproteomics-based signatures for tumor subtyping and clinical outcome prediction of high-grade serous ovarian cancer. Nat Commun. 11 (1), 6139(2020).
  31. Venkatakrishnan, V., et al. Glycan analysis of human neutrophil granules implicates a maturation-dependent glycosylation machinery. J Biol Chem. 295 (36), 12648-12660 (2020).
  32. Sethi, M. K., et al. In-depth matrisome and glycoproteomic analysis of human brain glioblastoma versus control tissue. Mol Cell Proteom. 21 (4), 100216(2022).
  33. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  34. Jensen, P. H., Karlsson, N. G., Kolarich, D., Packer, N. H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins. Nat Protoc. 7 (7), 1299-1310 (2012).
  35. Hinneburg, H., et al. Post-column make-up flow (pcmf) enhances the performance of capillary-flow PGC-LC-MS/MS-based glycomics. Anal Chem. 91 (7), 4559-4567 (2019).
  36. Chau, T. H., et al. Glycomics-assisted glycoproteomics enables deep and unbiased N-glycoproteome profiling of complex biological specimens. Meth Mol Biol. 2628, 235-263 (2023).
  37. Madunic, K., Wagt, S., Zhang, T., Wuhrer, M., Lageveen-Kammeijer, G. S. M. Dopant-enriched nitrogen gas for enhanced electrospray ionization of released glycans in negative ion mode. Anal Chem. 93 (18), 6919-6923 (2021).
  38. Zhang, T., Wang, W., Wuhrer, M., De Haan, N. Comprehensive O-glycan analysis by porous graphitized carbon nanoliquid chromatography-mass spectrometry. Anal Chem. 96 (22), 8942-8948 (2024).
  39. Wu, S. W., Pu, T. H., Viner, R., Khoo, K. H. Novel LC-MS2 product dependent parallel data acquisition function and data analysis workflow for sequencing and identification of intact glycopeptides. Anal Chem. 86 (2), 5478-5486 (2014).
  40. Kawahara, R., et al. The complexity and dynamics of the tissue glycoproteome associated with prostate cancer progression. Mol Cell Proteom. 20, 100026(2021).
  41. Chau, T. H., Chernykh, A., Kawahara, R., Thaysen-Andersen, M. Critical considerations in N-glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 73, 102272(2023).
  42. Carnielli, C. M., et al. Comprehensive glycoprofiling of oral tumors associates N-glycosylation with lymph node metastasis and patient survival. Mol Cell Proteom. 22 (7), 100586(2023).
  43. Sethi, M. K., et al. In-depth N-glycome profiling of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals cancer-, stage- and EGFR-specific protein N-glycosylation. Glycobiology. 25 (10), 1064-1078 (2015).
  44. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  45. Ostasiewicz, P., Zielinska, D. F., Mann, M., Wiśniewski, J. R. Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3688-3700 (2010).
  46. Tian, Y., Gurley, K., Meany, D. L., Kemp, C. J., Zhang, H. N-linked glycoproteomic analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J Proteome Res. 8 (4), 1657-1662 (2009).
  47. Cozzolino, F., et al. New label-free methods for protein relative quantification applied to the investigation of an animal model of huntington disease. PLoS One. 15 (9), e0238037(2020).
  48. Sethi, M. K., et al. Quantitative proteomic analysis of paired colorectal cancer and non-tumorigenic tissues reveals signature proteins and perturbed pathways involved in CRC progression and metastasis. J Proteomics. 126, 54-67 (2015).
  49. Rosati, D., et al. Differential gene expression analysis pipelines and bioinformatic tools for the identification of specific biomarkers: A review. Comput Struct Biotechnol J. 23, 1154-1168 (2024).
  50. Niu, B., et al. Nonspecific cleavages arising from reconstitution of trypsin under mildly acidic conditions. PLoS One. 15 (7), e0236740(2020).
  51. Delafield, D. G., Li, L. Recent advances in analytical approaches for glycan and glycopeptide quantitation. Mol Cell Proteom. 20, 100054(2021).
  52. Viner, R. I., Snovida, S., Bodnar, E., Perreault, H., Saba, J. A novel workflow for glycopeptide analysis using cellulose-based separation cartridges, TMT-labeling and LTQ Orbitrap ETD. J Biomol Tech. 21 (3 Suppl), S25(2010).
  53. Kawahara, R., et al. Community evaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies for serum glycopeptide analysis. Nat Meth. 18 (11), 1304-1316 (2021).
  54. Polasky, D. A., Nesvizhskii, A. I. Recent advances in computational algorithms and software for large-scale glycoproteomics. Curr Opin Chem Biol. 72, 102238(2023).
  55. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nat Meth. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  56. Goodson, H., et al. Α-mannosylated HLA-II glycopeptide antigens dominate the immunopeptidome of immortalised cells and tumour tissues. Glycobiology. 34 (11), cwae057(2024).
  57. Shajahan, A., Heiss, C., Ishihara, M., Azadi, P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 409 (19), 4483-4505 (2017).
  58. Rosenbalm, K. E., Tiemeyer, M., Wells, L., Aoki, K., Zhao, P. Glycomics-informed glycoproteomic analysis of site-specific glycosylation for SARS-CoV-2 spike protein. STAR Prot. 1 (3), 100214-100214 (2020).
  59. Zhao, P., et al. Virus-receptor interactions of glycosylated SARS-CoV-2 spike and human ACE2 receptor. Cell Host Microbe. 28 (4), 586-601.e6 (2020).
  60. Chandler, K. B., et al. Multi-isotype glycoproteomic characterization of serum antibody heavy chains reveals isotype- and subclass-specific N-glycosylation profiles. Mol Cell Proteomics. 18 (4), 686-703 (2019).
  61. Haab, B. B., Klamer, Z. Advances in tools to determine the glycan-binding specificities of lectins and antibodies. Mol Cell Proteom. 19 (2), 224-232 (2020).
  62. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins. MAbs. 8 (3), 524-535 (2016).
  63. Goumenou, A., Delaunay, N., Pichon, V. Recent advances in lectin-based affinity sorbents for protein glycosylation studies. Front Mol Biosci. 8, 746822(2021).
  64. Parker, B. L., et al. Terminal galactosylation and sialylation switching on membrane glycoproteins upon TNF-alpha-induced insulin resistance in adipocytes. Mol Cell Proteomics. 15 (1), 141-153 (2016).
  65. Blazev, R., et al. Integrated glycoproteomics identifies a role of N-glycosylation and galectin-1 on myogenesis and muscle development. Mol Cell Proteomics. 20, 100030(2021).
  66. Thaysen-Andersen, M., et al. Human neutrophils secrete bioactive paucimannosidic proteins from azurophilic granules into pathogen-infected sputum. J Biol Chem. 290 (14), 8789-8802 (2015).
  67. Loke, I., Ostergaard, O., Heegaard, N. H. H., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Paucimannose-rich N-glycosylation of spatiotemporally regulated human neutrophil elastase modulates its immune functions. Mol Cell Proteom. 16 (8), 1507-1527 (2017).
  68. Loke, I., Packer, N. H., Thaysen-Andersen, M. Complementary LC-MS/MS-based N-glycan, N-glycopeptide, and intact N-glycoprotein profiling reveals unconventional ASN71-glycosylation of human neutrophil cathepsin g. Biomolecules. 5 (3), 1832-1854 (2015).
  69. Tjondro, H. C., et al. Hyper-truncated Asn355- and Asn391-glycans modulate the activity of neutrophil granule myeloperoxidase. J Biol Chem. 296, 100144(2021).
  70. Kawahara, R., et al. Glycoproteome remodeling and organelle-specific N-glycosylation accompany neutrophil granulopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (36), e2303867120(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikrośrodowisko guzaspektrometria masstruktury glikanówprofilowanie N-glikoproteomuporowaty grafitowany węgielLC-MS/MSwzbogacanie glikopeptydówglikozylacja specyficzna dla miejscatkanka raka jelita grubego
Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.