Artykuł metodologiczny

Inżynieria chimerycznych komórek NK z receptorem antygenowym ukierunkowanych na infekcje grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny

DOI:

10.3791/67424

⸱

4 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół transfekcji do produkcji komórek CAR-NK (chimeryczny receptor antygenu i naturalnego zabójcy) ukierunkowanych na patogeny grzybowe za pomocą niewirusowego systemu transpozonów Śpiącej Królewny. Aby ocenić aktywację specyficzną dla antygenu, przeprowadziliśmy wspólną hodowlę zmodyfikowanych komórek z probówkami rozrodczymi Aspergillus fumigatus i zmierzyliśmy wydzielanie IFN-γ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie komórkowe oparte na chimerycznym receptorze antygenowym (CAR) wykazały imponującą skuteczność w leczeniu nowotworów hematologicznych. Ostatnio terapie te są opracowywane dla chorób zakaźnych, jednak badania ukierunkowane na infekcje grzybicze pozostają nieliczne. Aby zidentyfikować optymalne cele i zoptymalizować produkty komórkowe, opracowaliśmy metodę inżynierii komórek CAR-NK (chimeryczny receptor antygenowy-naturalny zabójca) i oceniliśmy ich reakcję na stymulację przez grzyby. W artykule opisano prostą i solidną metodę generowania komórek CAR-NK dostosowanych do celów grzybów przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Sleeping Beauty. Komórki NK-92 są transfekowane hiperaktywną transpozazą SB100X wektoryzowaną jako minicircle DNA (MC) wraz z transpozonem CAR kodowanym plazmidem. Skuteczność transfekcji ocenia się 1 tydzień później za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Przed testami funkcjonalnymi komórki wykazujące ekspresję transgenu są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie i hodowane przez 1 kolejny tydzień. Aby ocenić aktywację specyficzną dla antygenu, zmodyfikowane komórki są hodowane wspólnie z probówkami rozrodczymi Aspergillus fumigatus przez co najmniej 6 godzin. Następnie mierzy się stężenie wydzielanego interferonu gamma (IFN-γ) za pomocą testu immunoenzymatycznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) jest wszechobecnym grzybem, a przeciętny człowiek wdycha od 100 do 1000 konidiów dziennie1. U pacjentów z nabytymi lub wrodzonymi niedoborami odporności, takich jak osoby poddawane chemioterapii lub cierpiących na białaczkę, A. fumigatus może prowadzić do ciężkiej inwazyjnej apsergilozy. Każdego roku ponad 200 000 osób na całym świecie zapada na aspergilozę. Pomimo stosowania leków przeciwgrzybiczych w profilaktyce i terapii pochodnymi azolu, śmiertelność utrzymuje się między 30% a 95%2,3. Dodatkowo leczenie ma znaczące skutki uboczne, a 7% kultur A. fumigatus jest już odpornych na azole4.

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) wykazała kliniczny sukces w leczeniu chorób nowotworowych i osiągnęła obiecujące wyniki przedkliniczne w zwalczaniu chorób zakaźnych, takich jak inwazyjna aspergiloza5,6,7,8. Nasze wcześniej opisane komórki Af-CAR-T celujące w białko w ścianie komórkowej strzępek A. fumigatus wykazały obiecujące wyniki w modelach przedklinicznych6.

Zmniejszone ryzyko choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, zespołu uwalniania cytokin i neurotoksyczności sprawia, że komórki CAR-NK są cenną alternatywą dla komórek CAR-T jako "gotowe" leczenie ostrych infekcji9. Ponadto wykazano, że komórki NK odgrywają kluczową rolę w przeciwgrzybiczej odpowiedzi immunologicznej. Po stymulacji A. fumigatus, komórki NK wydzielają cytokiny, takie jak IFN-ɣ i chemokiny, takie jak CCL-3 i CCL-4, i uwalniają cytotoksyczne granulki10,11.

Linia komórkowa NK-92 jest popularnym źródłem komórek NK do inżynierii genetycznej, oferując przewagę szybkiej proliferacji i ekspansji w stosunkowo prostych warunkach hodowli12. Kilka badań przedklinicznych wykazało potencjał terapeutyczny komórek NK-92 transdukowanych przez CAR w leczeniu zarówno guzów hematologicznych, jak i litych. Trwają liczne badania kliniczne mające na celu zbadanie ich bezpieczeństwa, skuteczności i potencjalnego zastosowania jako "gotowej" terapii komórkowej13.

Osiągnięcie wysokiej wydajności transfekcji i stabilnej ekspresji transgenu w komórkach NK jest wyzwaniem. Podczas gdy metody wirusowe obiecują wysoką skuteczność, niosą ze sobą ryzyko mutacji insercyjnych z późniejszą onkogenezą9,14. Najnowsza generacja wektorów transpozonów Śpiącej Królewny (SB) oferuje bezpieczny, silny i ekonomicznie opłacalny system stabilnego transferu genów, pokonując ograniczenia wirusowych i przejściowych metod dostarczania genów niewirusowych15.

Dlatego ten protokół przedstawia nowatorską metodologię generowania komórek Af-CAR-NK-92, które potencjalnie mogą służyć jako "gotowa" opcja terapeutyczna dla pacjentów z zagrażającą życiu inwazyjną aspergilozą. O skuteczności tego podejścia świadczy zwiększona produkcja IFN-ɣ po stymulacji strzępkami A. fumigatus.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty muszą być przeprowadzane w sterylnych warunkach. W tym protokole pokazujemy dwa warunki: (I) symulowaną transfekcję bez DNA, które posłuży jako kontrola, oraz (II) transfekcję CAR przy użyciu wcześniej opisanej klasy Af-CAR6. Plazmid Af-CAR zawiera sekwencję skróconego receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFRt) za CAR, która zostanie wykorzystana jako marker transfekcji (rysunek uzupełniający S1). Dla każdego warunku wymagane są 4 × 106 komórek NK-92.

1. Hodowla komórek NK-92

  1. Na jeden lub dwa dni przed transfekcją należy przygotować świeżą pożywkę do hodowli komórkowych o następującym składzie: 75% (v/v) pożywka alfa-MEM (z nukleozydami) + 12,5% (v/v) inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) + 12,5% (v/v) inaktywowana termicznie surowica konia + 2 mM L-glutamina.
  2. Ponownie zawieś co najmniej 107 komórek NK-92 o gęstości komórek 5 × 105 komórek/ml.
  3. Dodać IL-2 do zawiesiny komórek w stężeniu 150 UI/ml.
  4. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: IL-2 może być stosowana w końcowym stężeniu 5 ng/ml.

2. Transfekcja niewirusowa

  1. Sprawdź jakość komórek pod mikroskopem. Zawieszenie skupisk komórkowych i wyraźne tło wskazują na zdrową hodowlę komórkową.
  2. Na 6-dołkowej płytce dodaj 2 ml pożywki do hodowli komórkowych na dołek dla każdego stanu. Umieścić płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Antybiotyki mogą zmniejszać żywotność komórek po transfekcji. Pożywkę należy przechowywać w stanie wolnym od antybiotyków.
  3. Policz komórki i sprawdź ich żywotność za pomocą (np. barwienia błękitem trypanowym).
  4. Przenieś 8 × 106 komórek NK-92 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy ciśnieniu 200 × g przez 5 minut z przyspieszeniem i opóźnieniem 3. Użyj tego programu do wszystkich następujących etapów wirowania.
  5. Podczas wirowania przygotuj dwie probówki reakcyjne o pojemności 1,5 ml. Odpipetować DNA dla Af-CAR (8 μg plazmidu-DNA i 4 μg SB100X Mini Circle, Tabela 1) do jednej z probówek. Utrzymuj drugi wolny od DNA, aby był próbną kontrolą.
  6. Gdy wirówka jest gotowa, delikatnie wyrzucić supernatant i napełnić probówkę zawierającą komórki do 15 ml wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  7. Wirówka (krok 2.4).
  8. Podczas wirowania należy przygotować jedną probówkę systemu transfekcji dla każdego stanu, dodając 3 ml buforu elektrolitycznego do każdej probówki. Umieść pierwszą probówkę w stacji pipetowej.
  9. Gdy wirówka jest gotowa, delikatnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu do resuspensji (100 μl/4 × 106 komórek).
    UWAGA: Należy unikać pozostawiania komórek w buforze do rezawieszania na dłużej niż 15-30 minut, ponieważ obniża to żywotność komórek i skuteczność transfekcji.
  10. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch probówek reakcyjnych. Delikatnie wymieszaj.
    UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ powodują one iskrzenie, które prowadzi do śmierci komórek.
  11. Odpipetować mieszaninę DNA-komórka z pierwszej probówki reakcyjnej za pomocą pipety systemu transfekcji i włożyć pipetę pionowo do probówki umieszczonej w stacji pipetowej.
    UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest prawidłowo dopasowana.
  12. Ustaw pierwszy impuls na 1 650 V i czas impulsu na 20 ms i naciśnij Start.
  13. Po zakończeniu ustaw drugi impuls na 500 V i czas impulsu na 100 ms. Naciśnij przycisk Start.
  14. Po zakończeniu powoli wyjąć pipetę ze stacji pipetowania i natychmiast przenieść komórki do jednego dołka przygotowanej płytki hodowlanej zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek (patrz krok 2.2). Delikatnie przesuń płytkę po okręgu, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone.
  15. W przypadku próbki próbnej należy pobrać 100 μl zawiesiny komórek z probówki reakcyjnej bez DNA (patrz krok 2.9) i powtórzyć tę samą procedurę od kroku 2.11 do kroku 2.14, używając nowej probówki i nowej końcówki pipety.
  16. Inkubować płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  17. Po 30 minutach inkubacji dodać IL-2 w końcowym stężeniu 150 UI/ml.

3. Sprawdzanie skuteczności transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Po 1 tygodniu hodowli i dzielenia komórek co drugi dzień, weź 1-5 × 105 komórek każdego stanu do polistyrenowej probówki z okrągłym dnem.
  2. Przepłukać komórki, dodając 1 ml buforu (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); odwirować i odrzucić supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu. Dodaj 1 μl 7-AAD, aby wykryć martwe komórki.
  4. Dodać 5 μl przeciwciała anty-tEGFR-Alexa fluor 647, aby wybarwić transfekowane komórki.
  5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Umyj komórki (patrz krok 3.2).
  7. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu.
  8. Zmierzyć próbki za pomocą cytometru przepływowego.
    UWAGA: Jeśli wydajność transfekcji nie jest zadowalająca, przystąp do wzbogacania komórek wykazujących ekspresję transgenu.

4. Wzbogacanie komórek wykazujących ekspresję transgenu przez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS)

UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, rozpocznij protokół od 8-10 × 106 komórek. Wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 4 °C.

  1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.2. Rozcieńczyć komórki w stężeniu 1-2 × 106/100 μl z buforem w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  2. Dodaj 1 μl anty-EGFRt-biotyny na 1-2 × 106 komórek i delikatnie zakręć probówką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu.
  3. Inkubować przez 25 minut w temperaturze 4 °C, a następnie napełnić probówkę do 10 ml buforu.
  4. wirówka. Odrzucić supernatant.
  5. Dodać 8 μl/1 × 106 komórek zimnego buforu.
  6. Dodaj 2 μl kulek magnetycznych antybiotyny na 1 × 106 komórek.
  7. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Umyć, napełniając do 10 ml buforem.
  9. wirówka. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu.
  10. Umieść kolumnę LS w magnesie MACS i przemyj 3 ml buforu.
  11. Gdy tylko bufor całkowicie przeprowadzi się przez kolumnę, dodaj zawiesinę komórki.
  12. Przemyć kolumnę 3 razy, każdy z 3 ml buforu.
  13. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w czystej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  14. Dodać 5 ml buforu do kolumny. Za pomocą tłoka wypłukać ogniwa EGFR-dodatnie tak szybko, jak to możliwe.
  15. Hoduj komórki przez kilka dni, a następnie sprawdź wydajność za pomocą cytometrii przepływowej.

5. Testy funkcjonalne

UWAGA: Na nadchodzący eksperyment przygotuj i użyj następującego medium: RPMI + 20% FBS.

  1. Dzień 1 - Wysiew konidiów Aspergillus fumigatus
    1. Przygotować zawiesinę konidiów A. fumigatus o stężeniu 2,5 × 105 konidiów/ml w pożywce.
    2. Na 96-dołkowej płytce hodowlanej odpipetować 100 μl zawiesiny konidiów na basenik i inkubować w temperaturze 25 °C przez 16 h.
      UWAGA: Po okresie inkubacji konidia wykiełkują (Rysunek 1).
  2. Dzień 2 - Współhodowla z komórkami CAR NK-92
    1. Umyj ogniwa Mock i Af-CAR NK-92 2x za pomocą pożywki.
    2. Współhodowla z grzybem w stosunku efektora do celu 2:1 poprzez dodanie 5 × 104 komórek w 100 μl pożywki na studzienkę (Rysunek 2).
    3. W celu kontroli pozytywnej dodać 1 ng PMA i 100 ng jonomycyny na studzienkę w 100 μl pożywki. Używaj komórek w pożywce tylko jako kontroli negatywnej.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze CO2 przez co najmniej 6 godzin.
    5. Odwirować płytkę o masie 300 × g przez 5 minut.
    6. Zbierz 100 μl z każdej studzienki, unikając dotykania dna. Przenieść supernatanty do probówek reakcyjnych.
      UWAGA: Upewnij się, że pipetowany jest tylko supernatant, a nie wyrośnięty grzyb. W razie wątpliwości dodaj kolejny etap wirowania.
    7. Wykonaj test IFN-ɣ ELISA zgodnie z instrukcjami producenta lub przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cały proces generowania komórek Af-CAR NK-92, w tym transfekcja, odzyskiwanie, wzbogacanie i ekspansja, trwa około 14 dni. Po transfekcji komórki są hodowane i dzielone co drugi dzień. Żywotność komórek może się zmniejszyć podczas pierwszego rozszczepienia dwa dni po transfekcji. Zazwyczaj komórki regenerują się 4 dni po transfekcji i zaczynają się rozmnażać, z czasem podwojenia wynoszącym 48 godzin.

Po odzyskaniu, mierzone są wskaźniki efektywności transfekcji i oczekuje się, że osiągną one 10-20% (reprezentatywne wyniki pokazane w Rysunek 3). Wzbogacenie komórek EGFR-dodatnich za pomocą MACS zwiększa odsetek komórek Af-CAR NK-92 do ponad 95% (reprezentatywne wyniki pokazane w Rysunek 4).

Kultury z więcej niż 95% komórek Af-CAR zostały użyte do testów funkcjonalnych. Tutaj współhodowaliśmy komórki z probówkami rozrodczymi A. fumigatus przez 6 godzin i mierzyliśmy wydzielanie IFN-ɣ jako markera aktywacji. Jak pokazano na Rysunek 5, komórki Af-CAR wykazywały znaczne wydzielanie cytokin (średnia = 340,6 ± 86,5 pg/mL) w porównaniu z imitowanymi komórkami NK-92 (średnia = 75,6 ± 19,5 pg/mL), co wskazuje na znacznie wyższą aktywację komórek Af-CAR (wartość p = 0,03).

figure-results-1
Rysunek 1: Rurki zarodkowe Aspergillus fumigatus. Obraz mikroskopowy A. fumigatus po 16 godzinach inkubacji. Rurki zarodkowe/małe strzępki są obserwowane i rozprowadzane jednorodnie wokół studni. Podziałka = 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wspólna hodowla probówek zarodkowych Aspergillus fumigatus z komórkami NK-92. Obraz mikroskopowy kokultury. Komórki NK-92 tworzą klastry i są w kontakcie z rurkami rozrodczymi A. fumigatus. Podziałka = 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Efektywność transfekcji oceniana przez barwienie dla markera transfekcji EGFR. W 5 dniu, po elektroporacji, komórki NK-92 wybarwiono 7-AAD i anty-EGFR. Wyniki przedstawiono dla jednego reprezentatywnego eksperymentu dla komórek (A) Mock i (B) Af-CAR NK-92. Lewa kolumna przedstawia wykresy kropkowe rozmiaru komórki w funkcji szczegółowości komórki; bramka osadzona jest na ogniwach NK-92. Martwe komórki są bramkowane przy użyciu etykietowania 7-AAD (druga kolumna). Odsetek żywych komórek EGFR+ jest pokazany w trzeciej kolumnie. Skróty: EGFR = receptor naskórkowego czynnika wzrostu; 7-AAD = 7-aminoaktynomycyna D; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wyniki barwienia powierzchni komórek po wzbogaceniu komórek NK-92 wyrażających transgen. Po lewej stronie są wyświetlane makiety komórek. Po prawej stronie pokazane są komórki Af-CAR-NK. Czerwone histogramy reprezentują niezabarwione komórki. Niebieskie histogramy reprezentują odpowiednie wybarwione komórki. Bramka jest ustawiona na ogniwach EGFR+; Liczby pokazują procent komórek dodatnich. Skróty: EGFR = receptor naskórkowego czynnika wzrostu; CAR = chimeryczny receptor antygenowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wydzielanie cytokin w komórkach NK aktywowane przez rurki rozrodcze Aspergillus fumigatus. Na wykresach przedstawiono wyniki wydzielania IFN-ɣ komórek Af-CAR i Mock w kohodowli z grzybem mierzone metodą ELISA po 6 godzinach kohodowli. Przedstawione dane są średnią ± SD z trzech niezależnie przeprowadzonych eksperymentów (n = 3). Wartość p obliczona za pomocą testu t Welcha przy użyciu pryzmatu GraphPad 10, * p < 0,05. Skróty: NK = natural killer; IFN-ɣ = interferon gamma; CAR = chimeryczny receptor antygenowy; ELISA = test immunoenzymatyczny połączony z enzymem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

nazwafirmaKoncentracja zapasówodniesienie
TranspozazaSB100X Mini KołoFabryka plazmidów1 μg/μLRozdział 19
TranspozonPlazmid Af-CARWyprodukowano we własnym zakresie1 μg/μL6

Tabela 1: DNA użyte w tym protokole.

Rysunek uzupełniający S1: Mapa plazmidowa transpozonu Af-CAR: Schemat wektora plazmidu i projekt transpozonu CAR. Skróty: EF1 = promotor współczynnika wydłużenia-1 alfa; ORI = bakteryjne pochodzenie replikacji; LIR = powtórzenie odwrócone w lewo; RIR: powtórzenie odwrócone w prawo; Cyto = Cytoplazmatyczny; Tm = Transbłona. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczony protokół oferuje prostą i niezawodną metodę tworzenia komórek CAR-NK, które celują w patogeny grzybicze przy użyciu niewirusowego systemu transpozonów Sleeping Beauty. Metoda ta pozwala na stabilną i trwałą insercję dużych transgenów, co umożliwia ekspansję komórek w celu uzyskania niezbędnych ilości do dalszej analizy14,16.

Na powodzenie transfekcji może mieć wpływ kilka kluczowych czynników, w tym liczba i żywotność komórek, siła i czas trwania impulsu, a także jakość i ilość DNA17. Bardzo ważne jest, aby ocenić stan komórek przed rozpoczęciem, zapewniając ich żywotność na poziomie co najmniej 90%. Wykazano, że zwiększona siła impulsu może zwiększyć wydajność transfekcji populacji komórek. Jednak takie podejście może również skutkować znacznym zmniejszeniem żywotności komórek. W przypadku nadmiaru komórek i ograniczonej ilości lub jakości DNA, liczba komórek, które z powodzeniem pobierają plazmid, może być niewystarczająca17. Niemniej jednak wykazano, że wysokie stężenia DNA są toksyczne i zmniejszają żywotność komórek18.

Wcześniejsze badania osiągnęły wyższą skuteczność transfekcji, ale koncentrowały się wyłącznie na przejściowej ekspresji białka17. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół zapewnia stabilną insercję transgenu. Aby rozwiązać problem niskiej wydajności transfekcji, wdrożyliśmy wzbogacanie komórek dodatnio transfekowanych i uzyskaliśmy około 95% komórek wykazujących ekspresję CAR. Wydłużyło to jednak czas produkcji do ~1 tygodnia. Jeśli pożądane są krótsze czasy produkcji, transpozon DNA może być dostarczony jako miniokrąg, co może zwiększyć wydajność transfekcji i może wyeliminować potrzebę etapu wzbogacania19. Niemniej jednak czas produkcji nie może zostać skrócony do <1 tygodnia, aby umożliwić regenerację i proliferację komórek.

Biorąc pod uwagę ostry charakter inwazyjnej aspergilozy, korzystne byłyby "gotowe" terapie komórkowe. Wyzwania i koszty związane z izolacją komórek od pacjentów i ekspansją komórek pierwotnych zwiększyły popularność NK-92 jako wygodnej linii komórkowej do produkcji komórek CAR-NK20. Komórki NK-92 są na ogół wytrzymałe i szybko się namnażają w obecności IL-2, co ułatwia osiągnięcie dużej ilości komórek w stosunkowo krótkim czasie. W świetle tych zalet opracowaliśmy protokół inżynierii genetycznej komórek NK-92, wykazując, że możliwa jest bezpieczna transfekcja i przygotowanie produktów komórkowych CAR-NK o wysokiej czystości. Chociaż protokół ten można dostosować do przygotowania pierwotnych komórek CAR-NK, należy rozważyć kilka modyfikacji. Obejmują one optymalizację liczby i intensywności impulsów, ilości użytego DNA oraz ustalenie odpowiedniego protokołu ekspansji. Wszelkie modyfikacje protokołu wymagałyby dokładnego zbadania w celu zapewnienia skuteczności. Niemniej jednak nasz protokół zapewnia podstawowy szablon, który może zostać zaadaptowany do pierwotnych komórek NK w przyszłych eksperymentach.

Podsumowując, ten innowacyjny protokół transfekcji do produkcji stabilnych komórek Af-CAR-NK jest wydajną i powtarzalną metodą, która może być stosowana do zwalczania innych chorób. Ponadto może być stosowany jako opłacalna metoda badań przesiewowych w kierunku nowych CAR ukierunkowanych na różne antygeny.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H.: Wynalazca w zgłoszeniach patentowych i udzielonych patentach związanych z technologią CAR, częściowo licencjonowanych dla przemysłu. Współzałożyciel i właściciel udziałów T-CURX GmbH, Würzburg. Honorowi mówcy: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Wsparcie badawcze: BMS. M. B. donosi o wsparciu dla podróży ze strony firmy farmaceutycznej "Eli Lilly and company", która nie jest związana z tym badaniem. Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie i wsparcie dla projektu zostały zapewnione przez Wilhelm Sander Stiftung, projekt 2020.017.1 dla M.H. i J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Centrum Badań Współpracujących/Transregio 124 Grzyby chorobotwórcze i ich ludzki gospodarz: Sieci interakcji-FungiNet; projekt A8 do M.H. i H.E.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki stożkowe 15 MLGreiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERYLNE
50 ML probówki stożkoweGreiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERYLNA
6- i 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCorning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474Płytki wielodołkowe poddane TC, płaskie dna, Poddane obróbce w celu optymalnego przylegania komórek, Sterylizowane promieniowaniem gamma, Niepirogenny
7-AAD (7-aminoaktynomycyna D)BD Biosciences559925łatwy w użyciu barwnik kwasu nukleinowego do wykluczania komórek niezdolnych do życia w testach cytometrii przepływowej
Alexa Fluor 647 anty-ludzkie przeciwciało EGFRBiolegend352918Clone AY13
Mikrokulki antybiotyny UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure MicroBeads sprzężone z monoklonalną mysią antybiotyną przeciwciała
Aspergillus fumigatusATCC46645
Końcówki filtrów biosfery (20 i 100 μ L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537  Modyfikowany, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych, endotoksyna, testowany
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γBiolegend430104
Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)Sigma-AldrichE7889do biologii molekularnej, 0,5  M w H2O, DNaza, RNaza, NICKaza i proteaza, brak wykrywania, 0,2 i mu; m filtrowany.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003
FACS Roztwór do płukaniaBD Bioscience340346
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych, inaktywowana termicznie przed użyciem
Gibco, MEM α, nukleozydyThermofisher Scientific22571020 Czerwień fenolowa, rybonukleozydy, dezoksyrybonukleozydy, wodorowęglan sodu
Surowica końskaThermo Fisher Scientific16050122Sterylnie filtrowane, inaktywowane termicznie przed użyciem
Ludzka IL-2 IS, klasa badawczaMiltenyi Biotec130-097-742Klasa badawcza. ED50 jest ≤ 0,3 ng/ml, co odpowiada aktywności ≥ 3 i razy; 106 j.m./mg.
JonomycynaSigma-AldrichI0634-1MGz Streptomyces conglobatus, stosowana jako kontrola pozytywna wydzielania cytokin 
L-GlutaminaSigma-AldrichW368401Do hodowli komórkowych
MACS LS KolumnaMiltenyi Biotec130-042-401  Kolumny i tłoki, sterylnie pakowane
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Bufor do zaparowania R, Bufor elektrolityczny E2, 100 μ L Neon Tips, Neonowe rurki do elektroporacji
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGstosowany jako kontrola pozytywna wydzielania cytokin 
Polistyrenowa probówka okrągłodenna, 5 mlBD BioscienceS-452400używana do cytometrii przepływowej
Probówka reakcyjna, 1,5 mlGreiner Bio-One7,26,90,001PP, przezroczysta, z dołączoną nakrętką, z wtryskiwaną podziałką. Sterylizowane przed użyciem. 
RPMI 1640 Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  Czerwień fenolowa, HEPES, sterylnie filtrowany
TipOne 1000 μ L XL Końcówka filtra stopniowegoStarLabS1122-1730
Sprzęt
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 Inkubator C60 Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX Tecan
NanoQuant Infinite M200 Pro
NeonPipety Invitrogen
 Separator Eppendorf
Quadro MACS Miltenyi Biotec
denne Myjka do mikropłytek System transfekcji Tecan

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki CAR NKkom rki NK 92magnetyczna aktywacyjna segregacja kom rekAspergillus fumigatusniewirusowy transfer gen wsekrecja interferonu gammaanaliza cytometrycznatest ELISA

Powiązane artykuły