Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67431

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Department of Medicine, University of Toronto, 4Department of Medical Biophysics, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wytwarzanie mikropęcherzyków lipidowych i kompatybilną metodę radioznakowania mikropęcherzyków w jednym garnku z nieoczyszczającą >95% skutecznością znakowania, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków. Metoda ta jest skuteczna w przypadku różnych preparatów mikropęcherzyków lipidowych i może być dostosowana do generowania mikropęcherzyków radioaktywnych i/lub fluorescencyjnych.

Streszczenie

Mikropęcherzyki to wypełnione lipidami, wypełnione gazem cząsteczki, które przekształciły się z ultradźwiękowych środków kontrastowych do rewolucyjnych platform terapii raka. W połączeniu z terapeutycznymi skoncentrowanymi ultradźwiękami (FUS) mogą bezpiecznie i miejscowo pokonywać bariery fizjologiczne (np. barierę krew-mózg), dostarczać leki na niedostępne w inny sposób nowotwory (np. glejaka i raka trzustki) oraz leczyć choroby neurodegeneracyjne. Arsenał terapeutyczny microbubble-FUS rozwija się w nowych kierunkach, w tym w synergicznej radioterapii skojarzonej, obrazowaniu multimodalnym oraz kompleksowym ładowaniu i dostarczaniu leków z otoczek mikropęcherzykowych.

Oznaczanie mikropęcherzyków za pomocą radioznaczników jest kluczem do ustanowienia tych rozszerzonych możliwości teranostycznych. Jednak istniejące strategie znakowania radioaktywnego mikropęcherzyków opierają się na metodologiach oczyszczania, o których wiadomo, że zaburzają właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków, wykorzystują krótkożyciowe izotopy promieniotwórcze i nie zawsze zapewniają stabilną chelatację. Łącznie stwarza to niejasności co do dokładności obrazowania radiologicznego mikropęcherzyków i skuteczności dostarczania radioizotopów guza.

Ten protokół opisuje nową, jednogarnkową, nieoczyszczającą metodologię znakowania mikropęcherzyków, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków, osiągając jednocześnie >95% skuteczności chelatacji radioizotopów. Jest wszechstronny i może być z powodzeniem stosowany w niestandardowych i komercyjnych preparatach mikropęcherzykowych o różnej długości łańcucha lipidowego acylowego, ładunku i składzie chelatora/sondy (porfiryna, DTPA, DiI). Może być stosowany adaptacyjnie podczas zmielonego wytwarzania mikropęcherzyków oraz do gotowych preparatów mikropęcherzykowych z modułową możliwością dostosowania właściwości fluorescencyjnych i multimodalnych fluorescencji/radioaktywnych. W związku z tym ta elastyczna metoda umożliwia produkcję dostosowanych, identyfikowalnych (radio, fluorescencyjnych lub radio/fluorescencyjnych aktywnych) multimodalnych mikropęcherzyków, które są przydatne w rozwoju mechanistycznych, obrazowych i terapeutycznych zastosowań mikropęcherzyków-FUS.

Wprowadzenie

Mikropęcherzyki to supramolekularne środki teranostyczne o rozmiarach mikrometrycznych, posiadające rdzeń gazowy stabilizowany przez otoczkę białkową, polimerową lub, w większości przypadków, lipidową (Rycina 1A). Po wstrzyknięciu do krwiobiegu mikropęcherzyki utrzymują granice faz gaz-ciecz, które są wykrywalne za pomocą ultradźwięków przez kilka minut przed rozpuszczeniem ich rdzeni gazowych1,2. W konsekwencji pierwszym zastosowaniem klinicznym mikropęcherzyków było wykorzystanie ich jako środków kontrastowych w obrazowaniu ultradźwiękowym w czasie rzeczywistym3. Wynalezienie terapeutycznego ultradźwiękowego skupiania wiązki (FUS) rozszerzyło możliwości kliniczne mikropęcherzyków. Pod wpływem niskoczęstotliwościowego FUS mikropęcherzyki oscylują i generują ukierunkowane, regulowane siły mechaniczne, prowadzące od przejściowej permeabilizacji naczyń po ogniskową ablację tkanki4,5. W rezultacie w ciągu ostatnich 20 lat badano zastosowanie metody mikropęcherzyki-FUS w otwieraniu bariery krew-mózg (BBB), dostarczaniu leków i sond obrazujących do guzów (np. raka trzustki, mózgu i przerzutowego raka wątroby), terapii chorób neurodegeneracyjnych oraz ablacji nowotworów6,7,8,9,10,11.

Arsenał teranostyczny mikropęcherzyków wciąż rozwija się w nowych i ekscytujących kierunkach. Konwencjonalne zastosowania dostarczania substancji za pomocą mikropęcherzyków i ukierunkowanego ultradźwiękowego skupienia (FUS) opierają się na jednoczesnym podawaniu ładunku terapeutycznego lub obrazującego wraz z komercyjnymi mikropęcherzykami. Rośnie zainteresowanie zwiększaniem możliwości dostarczania za pomocą mikropęcherzyków-FUS poprzez zrozumienie oddziaływań między powłoką mikropęcherzyka a organizmem, badanie niestandardowych, niekomercyjnych formulacji mikropęcherzyków oraz tworzenie zintegrowanych mikropęcherzyków teranostycznych z ładunkiem osadzonym bezpośrednio na powłoce12,13,14. W rzeczywistości około 40% badań nad dostarczaniem leków za pomocą lipidowych mikropęcherzyków wykorzystuje takie mikropęcherzyki z ładunkiem w powłoce15. Poza obrazowaniem i dostarczaniem leków, metoda mikropęcherzyków-FUS wykazuje również potencjał w usprawnianiu radioterapii nowotworów16 oraz aktywowaniu przeciwnowotworowych efektów łagodnych zazwyczaj czynników osadzonych w powłoce poprzez terapię sonodynamiczną17,18.

Te konwencjonalne i rozszerzone kierunki zastosowań mikropęcherzyków w onkologii mogą zostać bardziej strategicznie rozwinięte poprzez znakowanie powłok mikropęcherzyków znacznikami radioaktywnymi. W obszarze wielofunkcyjnych mikropęcherzyków z ładunkiem, takie radioznakowanie 1) ułatwia złotym standardem prowadzoną ilościową ocenę biodystrybucji tych załadowanych powłok mikropęcherzyków w obszarach docelowych i poza nimi, 2) pozwala wyznaczyć farmakokinetyczne zależności struktura-aktywność, które pomagają w optymalnym doborze składu mikropęcherzyków w celu maksymalizacji dostarczania do celu oraz 3) kieruje strategicznym i odpowiednim planowaniem aplikacji oraz leczenia pod kontrolą obrazową (np. rodzaje tkanek docelowych, dozymetria, dobór leków w celu ograniczenia problemów z bezpieczeństwem poza obszarem docelowym, użyteczność w porównaniu z konwencjonalnymi paradygmatami współleczenia) wielofunkcyjnych systemów z ładunkiem15,19. Na etapie przedklinicznym takie zrozumienie losów powłoki mikropęcherzyka może również wyjaśnić szersze mechanizmy działania układu mikropęcherzyki-FUS. Na przykład wykazano, że transfer lipidów z powłok mikropęcherzyków do komórek docelowych wpływa na sonoporację indukowaną przez FUS12,20. Zrozumienie i optymalizacja takiego transferu może zatem wspomóc przedkliniczne i kliniczne terapie z wykorzystaniem mikropęcherzyków i FUS, w których zaangażowana jest sonoporacja (transfekcja in vitro, dostarczanie leków, ablacja guzów, radiodyfuzyjna sensytyzacja oraz terapia sonodynamiczna20,21,22,23,24,25). Możliwości podwójnego obrazowania ultradźwiękowego i radiologicznego umożliwiłyby również otwieranie naczyń za pomocą FUS i monitorowanie leczenia (np. kinetykę otwierania BBB) przy użyciu jednego środka, zamiast konwencjonalnych projektów opartych na dwóch różnych środkach26. W podobnym duchu, radioznakowanie lipidowych mikropęcherzyków mogłoby służyć jako wielofunkcyjna, jednoskładnikowa alternatywa mikropęcherzyki-FUS/radioterapia dla platform współdostarczania mikropęcherzyków-FUS i radiofarmaceutyków27.

Kruchość mikropęcherzyków stanowi istotne wyzwanie w procesie takiego znakowania. Wszystkie istniejące strategie znakowania radioaktywnego są ograniczone przez metodologie oczyszczania, o których wiadomo, że zaburzają stabilność i rozmiar mikropęcherzyków, podczas gdy niektóre z nich charakteryzują się również nieefektywnym i niestabilnym znakowaniem radioaktywnym28,29,30,31,32. Wymogi dotyczące oczyszczania prowadzą również do wydłużenia protokołów. W połączeniu z zastosowaniem krótkożyciowych izotopów promieniotwórczych (np. 18F t1/2 1,8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,32 68Ga t1/2 1 h31), powoduje to nieefektywność związaną z rozpadem izotopów i ogranicza ramy czasowe obrazowania radioizotopowego oraz planowania leczenia. Łącznie ograniczenia te stwarzają ryzyko pozyskania skróconych i niereprezentatywnych obrazów radioizotopowych, niedokładnych danych farmakokinetycznych oraz nieefektywnego dostarczania radioizotopów do guza.

W niniejszym raporcie ograniczenia te zostały przezwyciężone dzięki wykorzystaniu silnych i stabilnych właściwości chelatujących metale porfiryn. Porfiryny są organicznymi, heterocyklicznymi makrocząsteczkami o silnie sprzężonym pierścieniu płaskim i centralnym miejscu koordynacyjnym, które może pomieścić różne metale. Obejmuje to radioizotopy o dłuższym okresie półtrwania, takie jak miedź-64 (t1/2 12,7 h), radiofarmaceutyk umożliwiający obrazowanie w pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) oraz pomiary γ33. Po sprzężeniu z lipidowym szkieletem porfiryny mogą być łatwo włączone w struktury supramolekularne, a następnie szybko znakowane miedzią-64 z wysoką wydajnością chelatowania i stabilnością w surowicy, przy jednoczesnym zachowaniu właściwości wyjściowych nieznakowanych cząsteczek33,34. Ponadto porfiryny wykazują aktywność fluorescencyjną z modułowym samogaszeniem w nanocząsteczkach i mikrocząsteczkach, które zostaje przywrócone po rozpadzie cząsteczek; stanowi to komplementarną metodę odczytu względem PET i pomiarów γ, co ułatwia analizę losów otoczki zarówno w skali masowej, jak i mikroskopowej (Rysunek 1A)15.

Wykorzystując porfirynę lipidową jako chelatorem, właściwości te zostały użyte do opracowania nowej, jednopułkowej (one-pot) metody znakowania radiologicznego mikropęcherzyków, która nie wymaga oczyszczania (Rysunek 1B,C) i pozwala pokonać ograniczenia związane z istniejącymi metodami znakowania radiologicznego mikropęcherzyków. Protokół ten pozwala osiągnąć wydajność chelatacji miedzi-64 >95%, nie wymaga oczyszczania po znakowaniu i zachowuje fizykochemiczne właściwości mikropęcherzyków. Może on zostać łatwo zintegrowany z procesem wytwarzania lipidowych mikropęcherzyków od podstaw przed ich aktywacją (Rysunek 1B). Metoda ta jest wszechstronna i może być z powodzeniem stosowana w przypadku niestandardowych i komercyjnych formulacji mikropęcherzyków o różnej długości łańcucha acylowego lipidów (C16 do C22), ładunku (neutralnym i anionowym) oraz składach porfirynowo-lipidowych (1 mol%, 10 mol%, 30 mol%), co pozwala na otrzymanie mikropęcherzyków o aktywności radiologicznej i fluorescencyjnej. Możliwości adaptacji wykraczają również poza porfiryny. Protokół jednopułkowy może zostać zmodyfikowany w celu wykorzystania alternatywnych, dostępnych komercyjnie chelatorów (np. lipidowego pięciooctanodietylenotriaminy (DTPA)) i fluoroforów (np. DiI). Można go również zmodyfikować, aby znakować gotowe formulacje mikropęcherzyków poprzez metodę „spikingu”. W związku z tym metoda ta umożliwia produkcję dostosowanych, śledzalnych (aktywnych radiologicznie, fluorescencyjnie lub dwuparametrycznie – radiologicznie i fluorescencyjnie) mikropęcherzyków, przydatnych w rozwoju mechanistycznych, obrazowych i terapeutycznych zastosowań mikropęcherzyków w połączeniu z FUS. Poniższy protokół opisuje wytwarzanie lipidowych mikropęcherzyków, zastosowanie jednopułkowego protokołu znakowania radiologicznego, niezbędną charakterystykę znakowania radiologicznego i właściwości fizykochemicznych oraz potencjalne modyfikacje.

Schemat tworzenia mikropęcherzyków porfiryna-lipid; proces fluorescencji, ultradźwięków i znakowania radiacyjnego.
Rysunek 1: Protokół wytwarzania i znakowania radiacyjnego mikropęcherzyków. (A) Porfiryna-lipid, w formie pyrofeoforbidu-a-lipidu, służy w tym protokole jako wielomodalny chelator. Jako monomer chelatowany miedzią-64 (i), posiada zdolność do obrazowania PET i wizualizacji. Jego fluorescencja jest wygaszona w formie cząsteczkowej (mikropęcherzyki (ii) oraz ich nanopochodne po rozpuszczeniu (iii)) i zostaje przywrócona po zniszczeniu cząsteczek (iv). (B) Opisany w niniejszym raporcie protokół hydratacji/aktywacji filmu lipidowego w celu generowania mikropęcherzyków lipidowych od podstaw oraz (C) integracja znakowania radiacyjnego metodą „one-pot” pomiędzy formowaniem zawiesiny lipidowej a aktywacją mikropęcherzyków. Rysunek opracowano za zgodą autorów Rajora et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotowanie buforu octanu amonu (0,1 M, pH 5,5)
    1. Używając wagi analitycznej, odważ 770,8 mg octanu amonu na papierze wagowym. Przenieś odważoną ilość do czystego szklanego zlewka o pojemności 250 mL.
    2. Do zlewka dodaj 90 mL wody dwukrotnie destylowanej (ddH2O), odmierzonej za pomocą pipety graduowanej. Dodaj mieszadło magnetyczne i ustaw zlewkę na mieszalniku magnetycznym, aby rozpuścić octan amonu. Mieszaj z prędkością tworzącą lekki wir, ale bez rozbryzgiwania roztworu.
    3. Zkalibruj pH-metr zgodnie z instrukcją urządzenia, używając wzorców o pH 4 i 7. Po kalibracji zanurz sondę pH w buforze octanu amonu.
    4. Dodaj do roztworu 104 µL kwasu octowego, wymieszaj do rozpuszczenia i zmierz pH.
      UWAGA: Na tym etapie pH powinno być bliskie 5,5.
    5. Dostosuj pH buforu, dodając 10 N wodorotlenek sodu (lub kwas solny, jeśli bufor stanie się zbyt zasadowy) w przyrostach 5-10 µL za pomocą mikropipety. Mieszaj, mierz pH i powtarzaj w razie potrzeby. Zanotuj objętość dodanej zasady/kwasu.
    6. Dodaj odpowiednią objętość ddH2O, aby uzyskać łącznie 100 mL buforu.
      UWAGA: Na przykład, jeśli podczas regulacji pH zużyto 45 µL 10 N wodorotlenku sodu, do zlewki należałoby dodać 9,851 mL ddH2O (100 mL [objętość docelowa] - 90 mL [krok 1.1.2] - 0,104 mL [krok 1.1.4] - 0,045 mL [krok 1.1.5] = 9,851 mL).
    7. Wymieszaj bufor dokładnie po raz ostatni przed przelaniem go do szczelnego pojemnika do przechowywania.
    8. Oczyść pH-metr zgodnie z instrukcją urządzenia.
      OSTROŻNIE: Stężony wodny wodorotlenek sodu i kwas solny mogą powodować reakcje skórne i należy z nimi pracować w rękawicach.
  2. Przygotowanie buforu do hydratacji (PGG)
    1. Naciągnij fosforanowy bufor solny (PBS) do strzykawki i załóż na jej koniec filtr strzykawkowy z polietersulfonu o wielkości porów 0,2 µm. Przefiltruj PBS do czystej plastikowej, zakręcanej probówki wirówkowej.
      UWAGA: Można stosować filtry strzykawkowe 0,2 µm wykonane z innych materiałów membranowych (na przykład z polifluorku winylidenu), o ile membrana jest kompatybilna z PBS i octanem amonu.
    2. Połącz przefiltrowany PBS, glikol propylenowy i glicerol za pomocą mikropipety w stosunku objętościowym 8:1:1, aby przygotować bufor do hydratacji (zwany również PGG). Podczas dodawania glikolu propylenowego i glicerolu, naciągnij i usuń wszelkie pozostałe krople glikolu propylenowego lub glicerolu z powierzchni końcówki pipety przed powolnym dozowaniem odczynnika do PBS. W PBS pojawi się przejrzysta, nitkowata, lepka mętność.
      UWAGA: Zaleca się użycie mikropipety p1000, aby najpierw dodać PBS do probówki wirówkowej, a następnie glikol propylenowy i glicerol, ponieważ dwa ostatnie odczynniki są lepkie. Powinny być one powoli naciągane mikropipetą do momentu, aż ruch cieczy w końcówce pipety ustanie, tak aby podczas wyjmowania końcówki z odczynnika nie został zassany powietrze. Idealnie byłoby używać końcówek mikropipet z oznaczeniami objętościowymi, aby dobrać objętości odczynników zgodne z tymi oznaczeniami (na przykład przygotowując 1 mL lub 5 mL PGG i używając odpowiednio oznaczenia 0,1 mL lub 0,5 mL na końcówce mikropipety, aby zweryfikować całkowite zassanie glikolu propylenowego i glicerolu). Podczas wycierania powierzchni końcówki mikropipety nie wycieraj otworu końcówki, a jedynie jej boki.
    3. Wypompowuj i zaciągaj roztwór końcówką pipety, aż odczynniki zostaną homogenicznie rozpuszczone. Uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do roztworu.
    4. Aby zapewnić całkowite wymieszanie buforu do hydratacji, zakręć probówkę wirówkową i powoli obracaj nią w górę i w dół. Nie używaj wirówki typu vortex.
    5. Wiruj probówkę z prędkością poniżej 1000 x g przez 20-30 s (temperatura minimalna 4 °C, maksymalna RT), aby usunąć niewidoczne pęcherzyki powietrza.
  3. Przygotowanie buforu do hydratacji/radiomarkowania (AA-PGG)
    1. Przefiltruj przez filtr strzykawkowy bufor octanu amonu 0,1 M, pH 5,5 (z kroku 1.1) oraz PBS do osobnych probówek zgodnie z krokiem 1.2.1.
    2. Połącz przefiltrowany bufor octanu amonu, przefiltrowany PBS, glikol propylenowy i glicerol za pomocą mikropipety p1000 w probówce wirówkowej w stosunku objętościowym 5:3:1:1 (bufor octanu amonu: PBS: glikol propylenowy: glicerol) w wymienionej kolejności. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi aspiracji, mieszania i wirowania z kroków 1.2.2-1.2.5, aby przygotować AA-PGG.
  4. Eluent do błyskawicznej chromatografii cienkowarstwowej (iTLC)
    1. Odważ do 0,1 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i przenieś do zakręcanej fiolki. Rozpuść w ddH2O w taki sposób, aby uzyskać 2% (w/v) roztwór EDTA (na przykład dla 50 mg EDTA dodaj 2,5 mL ddH2O).
    2. Połącz 2% (w/v) roztwór EDTA z buforem octanu amonu z kroku 1.1 w stosunku objętościowym 9:1 (90% roztworu EDTA, 10% buforu octanu amonu). Zakręć i przechowuj otrzymany eluent iTLC.

2. Tworzenie filmów lipidowych

UWAGA: Niniejsza procedura opisuje tworzenie filmu lipidowego o składzie naśladującym komercyjny mikropęcherzyk, Definity®, w którym lipid porfirynowy zastępuje lipid gospodarza i stanowi 30 mol% całkowitej zawartości lipidów. Protokół znakowania radioizotopowego można jednak zastosować do różnych formulacji lipidowych (łańcuchy o długości C16, C18, C22, ładunek neutralny lub anionowy, zróżnicowane molowe proporcje lipidów porfirynowych). Dołączono arkusz uzupełniający (Supplementary File 1), który zawiera obliczenia, składy, masy i objętości roztworów stokowych dla opisanych oraz innych formulacji. Wszystkie lipidy są dostępne komercyjnie z wyjątkiem lipidu porfirynowego, pyrofioforbidu-a-lipid (pyro-lipid), którego synteza została szczegółowo opisana wcześniej35,36.

  1. Korzystając z Supplementary File 1, należy określić całkowitą masę każdego lipidu w zależności od liczby wymaganych filmów.
  2. Odważyć pustą szklaną fiolkę 0,5 dram na wadze analitycznej.
    UWAGA: Kurz utrudnia prawidłowe tworzenie się mikropęcherzyków. Dlatego, jeśli fiolka była przechowywana bez zakrętki, należy przedmuchać ją sprężonym powietrzem w celu usunięcia kurzu i cząsteczek stałych.
  3. Odważyć 1,2-dipalmitoylo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) na papierze do ważenia.
    UWAGA: Odważona masa powinna wynikać z kroku 2.1, powiększona o dodatkowe 0,5-1 mg, aby zrekompensować ewentualne straty podczas manipulacji próbką w kolejnych etapach.
  4. Przenieść DPPC do odważonej szklanej fiolki i ponownie ją zważyć, aby określić masę lipidu w fiolce. Proces ten umożliwia łatwiejszy transfer lipidu do szklanej fiolki, zmniejsza straty/rozsypanie proszku lipidowego i pozwala na dokładniejszy pomiar masy lipidu.
  5. Powtórzyć kroki od 2.2 do 2.4 dla pozostałych lipidów: 1,2-dipalmitoylo-sn-glicero-3-fosfoetanolaminy-N-[metoksy(polyglikol)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoylo-sn-glicero-3-fosforanu (DPPA) oraz pyro-lipidu C16.
    UWAGA: Jeśli pyro-lipid nie jest dostępny w formie proszku do ważenia, lecz jako film lub alikwot o nieznanej ilości, można go rozpuścić w chloroformie w celu przygotowania roztworu zapasowego, którego stężenie można obliczyć za pomocą pomiarów absorbancji UV-Vis w metanolu, stosując prawo Beer-Lamberta, zgodnie z wcześniejszym opisem35.
  6. Przygotować następujące rozpuszczalniki organiczne i roztwory w szklanych probówkach, używając mikropipet lub szklanych strzykawek: 1) chloroform, 2) chloroform:metanol w stosunku 9:1 v/v oraz 3) chloroform:metanol:ddH2O w stosunku 65:35:8. W przypadku ostatniego roztworu, składniki należy odpipetować i wymieszać w następującej kolejności: ddH2O, metanol, a następnie chloroform.
    OSTROŻNIE: Metanol i chloroform stanowią zagrożenie dla zdrowia, są łatwopalne i lotne. Należy stosować ochronę oczu, rękawice oraz fartuch laboratoryjny i pracować pod wyciągiem (dygestorium).
  7. Użyć Supplementary File 1 do obliczenia objętości rozpuszczalnika/roztworu organicznego potrzebnego do przygotowania roztworów zapasowych lipidów i wybrać szklane strzykawki o odpowiednich objętościach.
    UWAGA: Objętość ta powinna zapewnić stężenia zapasowe odpowiadające objętościom alikwotów 15-100 µL na film, które można łatwo odmierzyć za pomocą szklanych strzykawek mikrolitrowych 25-100 µL.
  8. Przepłukać szklane strzykawki trzykrotnie chloroformem. Przesuwać tłok w przód i w tył, aby osuszyć strzykawkę.
  9. Odmierzyć i dodać rozpuszczalniki/roztwory organiczne za pomocą czystej szklanej strzykawki do poszczególnych fiolek z lipidami zgodnie z obliczeniami w arkuszu z kroku 2.7 w celu przygotowania roztworów zapasowych lipidów. Rozpuścić pyro-lipid w chloroformie (chyba że został już rozpuszczony zgodnie z uwagą w kroku 2.5), DPPC i DPPE-mPEG w mieszaninie chloroform:metanol 9:1 v/v, a DPPA w mieszaninie chloroform:metanol:ddH2O 65:35:8. W przypadku użycia tej samej szklanej strzykawki do wszystkich dodatków, należy ją przepłukać i osuszyć pomiędzy każdym lipidem.
    UWAGA: Jeśli wybrana formulacja nie zawiera DPPA ani jego wariantu o długości łańcucha C18, to pyro-lipid, gospodarczy lipid PC i lipid PEG można rozpuścić w chloroformie.
  10. Zakręcić fiolki i wymieszać w wortexie.
  11. Dodać obliczone objętości roztworów zapasowych lipidów do nowej szklanej fiolki 0,5 dram (fiolka do filmu) za pomocą szklanej strzykawki mikrolitrowej. W przypadku pierwszego roztworu lipidowego, należy wprowadzić końcówkę igły do dolnej części środka fiolki i powoli wcisnąć tłok, aby uniknąć rozpryśnięcia roztworu na ścianki fiolki. Przy kolejnych dodatkach należy umieścić końcówkę igły bezpośrednio nad poziomem cieczy i dotknąć ścianki fiolki, aby usunąć ostatnie krople w sposób, który nie naraża igły na kontakt z cieczą poniżej.
    UWAGA: W przypadku wystąpienia zanieczyszczeń należy przepłukać i osuszyć szklaną strzykawkę pomiędzy dodatkami lipidów. Przy przygotowywaniu wielu filmów, należy zakręcać zarówno fiolki z filmem, jak i zapasowe pomiędzy dodatkami, aby zminimalizować odparowanie rozpuszczalnika.
  12. Delikatnie zakręcić fiolką ręcznie w pozycji pionowej, aby wymieszać zawartość. Unikać rozpryskiwania roztworu na ścianki fiolki.
  13. Zdjąć zakrętkę (zachować ją) i wprowadzić linię z azotem do przestrzeni nad cieczą w fiolce. Dostosować przepływ azotu tak, aby wywołać lekkie, widoczne zaburzenie powierzchni cieczy, ale bez tworzenia lejka lub rozpryskiwania.
  14. Wortexować fiolkę natychmiast po wprowadzeniu linii z azotem. Zacząć od niskiej prędkości, wystarczającej do utworzenia lejka, w którym rozpuszczalnik nie podnosi się wyżej niż 1 cm od dna fiolki. Unikać rozpryskiwania rozpuszczalnika. W miarę odparowywania rozpuszczalnika, powoli i bez przerwy zwiększać prędkość wortexowania, utrzymując wysokość rozpuszczalnika, aż cała ciecz odparuje. Wynikiem będzie cienki film pokrywający dolną jedną trzecią fiolki.
  15. Umieścić fiolkę w eksykatorze z podłączeniem do pompy próżniowej i kontynuować suszenie filmu w próżni przez 8-72 h. Przykryć fiolkę (z wyjątkiem otworu) lub eksykator folią aluminiową.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. Kolejne kroki można wykonać po wysuszeniu filmu, lub filmy można przechowywać pod argonem, uszczelnione Parafilmem, w zamrażarce -20 °C do 1 miesiąca, a dłużej, jeśli są przechowywane w stanie suchym.

3. Hydratacja filmu lipidowego

UWAGA: Jeśli mikropęcherzyki są wykorzystywane in vitro lub in vivo, w krokach od 3.3 do 5.4 należy stosować sterylne końcówki do mikropipet, probówki, strzykawki i igły, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Wyjąć film z próżni lub, jeśli był przechowywany w zamrażarce, pozwolić mu ogrzać się do RT.
  2. Napełnić zlewkę o pojemności 250 mL wodą i podgrzać wodę do 70-80 °C.
  3. Podgrzać sonikator w łaźni wodnej do 69 °C.
  4. Za pomocą mikropipety nanieść 1 mL AA-PGG (krok 1.3) po ściankach fiolki z filmem lipidowym, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Podczas wytwarzania niechelatowanych mikropęcherzyków kontrolnych lub mikropęcherzyków wyłącznie fluorescencyjnych, należy użyć PGG (krok 1.2) zamiast AA-PGG.
  5. częściowo zakryć otwór fiolki zakrętką, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na włożenie linii z perfluoropropanem (PFP). Przepływać PFP do przestrzeni nad cieczą w fiolce przez 20 s, tak aby ciecz była widocznie poruszana, ale nie rozpryskiwała się. Nie kierować przepływu PFP bezpośrednio do zawiesiny. Zakręcić fiolkę.
    UWAGA: Jeśli przepływ jest odpowiednio silny i trwa wystarczająco długo, fiolka zacznie stawać się zimna w dotyku.
  6. Zanurzyć dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 70-80 °C na 1 min. Następnie sonikować przez co najmniej 30 s w sonikatorze w łaźni o temperaturze 69 °C lub do momentu jednorodnego rozproszenia filmu lipidowego w AA-PGG. Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza lub przedwczesnej aktywacji tworzenia mikropęcherzyków (przedwczesna aktywacja objawia się jako mleczne/zmętniałe obszary w zawiesinie lipidowej). W razie potrzeby przetrzeć powierzchnię fiolki, aby lepiej ocenić, czy pozostały niezawieszone lipidy.
    UWAGA: Jeśli film lipidowy nie ulegnie hydratacji w ciągu 1 min sonikacji, należy ponownie podgrzać go w łaźni 70-80 °C i ponownie sonikować.
  7. Gdy film lipidowy zostanie jednorodnie zawieszony, podgrzać go po raz ostatni przez 1 min i sonikować przez dodatkowe 30 s.
  8. Przetrzeć fiolkę i pozwolić jej pasywnie ochłodzić się do RT (~5-10 min).
  9. Ponownie wypełnić przestrzeń nad cieczą w fiolce PFP zgodnie z krokiem 3.5, zakręcić i uszczelnić krawędzie zakrętki Parafilmem.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać i wznowić nie później niż po 8 h.

4. Radiomarkowanie

UWAGA: W przypadku kontroli niechelatowanej lub mikropęcherzyków wyłącznie fluorescencyjnych należy przejść bezpośrednio do sekcji 5 protokołu.

UWAGA: Kroki 4.4-4.6 niniejszego protokołu należy przeprowadzić w laboratorium radiologicznym, chyba że wskazano inaczej. 64CuCl2 stanowi zagrożenie radiologiczne z ryzykiem toksyczności wieloukładowej w wyniku kontaktu ze skórą, inhalacji lub spożycia. W miarę możliwości należy z nim pracować w dygestorium, używając pośrednio pęset z gumowymi końcówkami. Podczas pracy należy nosić ochronny fartuch laboratoryjny, osobisty dozymetr pierścieniowy i odznakowy oraz podwójne rękawiczki. Należy zapewnić, aby 64CuCl2 był obsługiwany za osłoną ołowianą o grubości 2 cali. W razie potrzeby transportować go w pojemniku z osłoną ołowianą. Pojemniki na odpady należy osłonić, a po zakończeniu prac przeprowadzić badanie operacyjne pod kątem skażenia.

  1. Przygotuj 60 °C kąpiel wodna w zlewce szklanej lub dużym naczyniu krystalizacyjnym zawierającym mieszadło magnetyczne. Należy użyć grzejarki z mieszadłem z kontrolą temperatury, wyposażonej w sondę termiczną zanurzoną w wodzie, ustawiając prędkość mieszania tak, aby powstał słaby, lecz widoczny wir.
  2. Przenieś szczelnie zamkniętą fiolkę zawierającą 64CuCl2 w 0,1 N HCl do kalibratora dawek za pomocą pęsety z gumowymi końcówkami.
    UWAGA: Podczas zamawiania 64CuCl2, poproś o rozpuszczenie w 5-20 µL 0,1 N HCl. Mniejsza objętość jest kluczowa dla zachowania wydajności mikropęcherzyków.
  3. Zanotuj aktywność miedzi-64 zmierzoną na kalibratorze dawców oraz godzinę pomiaru. Wyjmij fiolkę za pomocą pęsety i umieść ją w osłonie ołowianej.
  4. Podziel wartość odnotowanej aktywności przez podaną objętość dla 64CuCl2 aby uzyskać aktywność w MBq·mL-1 wartość
  5. Zdejmij nakrętkę z zawiesiny lipidowej z kroku 3.9 i zabezpiecz ją w uchwycie na probówki.
  6. Zdejmij zakrętkę z 64CuCl2 fiolkę i zabezpieczyć ją za pomocą pęsety.
  7. Odmierz mikrodozownikiem objętość 64CuCl2 roztwór odpowiadający aktywności od 40 do 250 MBq i przenieść go do zawiesiny lipidowej. Należy upewnić się, że końcówka pipety jest zanurzona w zawiesinie. Należy wprowadzić końcówkę i kilkukrotnie pipetować w górę i w dół, aby całkowicie przenieść 64CuCl2.
    UWAGA: Ilość 64CuCl2 dodana ilość będzie zależeć od zamierzonego zastosowania znakowanych promieniotwórczo mikropęcherzyków oraz czułości kalibratora dawki. W przypadku podłużnych badań PET oraz pobierania krwi (do 48 h po wstrzyknięciu) in vivo w przypadku myszy zaleca się podanie odpowiednio minimum 220 MBq i 50 MBq.
  8. Zakręć obie probówki z zawiesiną lipidową i 64CuCl2 probówki
  9. Używając płaskich pęset z gumowymi końcówkami, należy ręcznie przemieszać zawiesinę lipidów promieniotwórczych, wykonując co najmniej 5 ruchów góra-dół, aby delikatnie wymieszać 64CuCl2 przez zawiesinę. Należy unikać wstrząsania lub upuszczania probówki oraz unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
  10. Trzymając fiolkę w pozycji pionowej, delikatnie stuknij w jej zakrętkę, utrzymując zawiesinę w stabilizacji. Pomoże to spłynąć cieczy uwięzionej w zakrętce na dno fiolki. Ostrożnie odkręć częściowo zakrętkę i wprowadź linię z PFP wyposażoną w igłę 18 G. Wypełnij przestrzeń nad cieczą w fiolce gazem PFP przez 20 s, zgodnie z krokiem 3.5. Zakręć fiolkę i uszczelnij ją Parafilmem.
  11. Zmierz aktywność fiolki za pomocą kalibratora dawkującego i zanotuj godzinę pomiaru.
    UWAGA: Jeśli do fiolki nie przeniesiono odpowiedniej aktywności, należy powtórzyć kroki 4.5–4.11, dodając odpowiednią dodatkową objętość 64CuCl2.
  12. Umieść fiolkę w piankowym uchwycie i dociśnij ją tak, aby dolna połowa fiolki była wystawiona na działanie ciepła. Umieść uchwyt w mieszalce 60 °C umieścić w łaźni wodnej i podgrzewać przez 1 h.
  13. Podczas gdy trwa reakcja chelatacji, należy przygotować płytki do iTLC. Po założeniu nowej pary rękawiczek wyciąć z szklanego papieru chromatograficznego z włókna szklanego paski o wymiarach 1 cm x 8 cm. Paski należy podgrzać w 80 °C suszarka szklana.
    UWAGA: Ten etap można przeprowadzić w laboratorium bez materiałów radioaktywnych.
  14. Po 1 h należy wyjąć fiolkę z kroku 4.12 z cieplarki i wytrzeć jej krawędzie chusteczką.
  15. Ręcznie obracaj fiolkę w górę i w dół za pomocą pęsety z gumowymi końcówkami, aby skroplona na ściankach fiolki wilgoć powróciła do zawiesiny lipidowej.
  16. Trzymając fiolkę w pozycji pionowej, opukaj nakrętkę, stabilizując jednocześnie probówkę. Usuń Parafilm i przetrzyj obszar wokół nakrętki, aby usunąć pozostałości wody z kąpieli.
  17. Ostrożnie odkręć zakrętkę fiolki i pobierz 1-2 µL zawiesiny lipidowej. Nanieś zawiesinę w odległości 1 cm od dolnej krawędzi w osi środkowej paska iTLC, a następnie ponownie zakręć fiolkę. Pozostaw naniesioną próbkę do wyschnięcia.
    UWAGA: W celu uzyskania pewności, w obrębie każdej mieszaniny reakcyjnej należy nanieść i rozwinąć co najmniej 2 próbki iTLC na każdą zawiesinę lipidów znakowanych izotopowo.
  18. Mikropipeta 200 µL eluenta do iTLC (przygotowanego w kroku 1.4) do dna probówki o pojemności 10 ml. Probówkę należy umieścić w pojemniku ołowianym. Do probówki należy włożyć naniesioną próbkę i pozwolić paskowi rozwijać się do momentu, aż czoło eluentu znajdzie się około 1 cm od górnej krawędzi paska.
  19. Usuń rozwinięte paski iTLC za pomocą pęsety. Trzymając pasek pionowo, przetnij go na trzy części nad plastikowymi probówkami o okrągłym dnie o pojemności 5 ml, kompatybilnymi z licznikiem gamma oraz nakrętkami typu push-cap, tak aby każda trzecia część paska wpadła bezpośrednio do oddzielnej probówki. Włóż nakrętki push-cap do trzech probówek.
  20. Zmierz aktywność miedzi-64 w probówkach zawierających paski oraz w pustej, zakapslowanej probce kontrolnej za pomocą licznika gamma i zapisz odpowiadające im wartości zliczeń na minutę (cpm). Od pozostałych odczytów odejmij aktywność probówki kontrolnej, aby skorygować wynik o promieniowanie tła.
    UWAGA: Poprawione odczyty dla dolnej jednej trzeciej paska (fragment 1) dotyczą miedzi-64 chelatowanej do cząstek zawiesiny lipidowej. Sekcja środkowa (fragment 2) zawiera smugę wolnej miedzi-64 i 64Chelaty miedzi-pirokatu-lipidów w formie niesupramolekularnej. Górna sekcja (fragment 3) zawiera przeważnie wolną miedź-64.
  21. Oblicz czystość radiochemiczną za pomocą równania 1.
    Wzór na procentową czystość, równania; obliczanie skorygowanego CPM w analizie eksperymentalnej.     (Równanie 1)
    UWAGA: jeśli wartość cpm dla próbki 1 wydaje się nienaturalnie niska (np. jest niższa lub równa wartościom dla próbek 2 lub 3) lub jeśli jakiekolwiek odczyty przekraczają próg nieliniowości/nasycenia licznika gamma, należy pobrać mniejszą objętość lub rozcieńczoną alikwot (1-2 µL) zawiesiny znakowanej radioaktywnie do iTLC.
  22. Należy upewnić się, że czystość radiochemiczna uzyskana z obu pasków iTLC na każdą zawiesinę lipidową wynosi ≥ 94%, aby kontynuować procedurę. W przeciwnym razie należy kontynuować ogrzewanie zawiesiny lipidowej w temperaturze 60 °C a proces chelatacji należy monitorować w odstępach 30-minutowych za pomocą iTLC.
  23. Odkręć zakrętkę z fiolki z zawiesiną lipidów znakowanych promieniotwórczo i użyj mikropipety 8.89 µL dodaj 1 N NaOH do zawiesiny, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie przenieść zasadę i zneutralizować zawiesinę. Zamknij fiolkę, obróć ją ręcznie za pomocą pęsety w celu odwrócenia i przywrócenia do pierwotnej pozycji, a następnie delikatnie stuknij w zakrętkę fiolki.
  24. Napełnij przestrzeń nad próbką PFP zgodnie z krokiem 4.10, załóż korek i zabezpiecz Parafilmem.

5. Aktywacja i izolacja mikropęcherzyków

  1. Aktywuj zawiesinę lipidową za pomocą mechanicznego wstrząsarki do fiolek przez 45 s przy 4530 rpm, aby uzyskać mleczną zawiesinę mikropęcherzyków. Pozostaw fiolkę do pasywnego ochłodzenia do RT przez około 10 min. Powstała mleczna zawiesina z czasem rozdzieli się na dwie warstwy.
    UWAGA: Zawartość fiolki po aktywacji powinna mieć mleczny wygląd. Przejrzystsza zawiesina po aktywacji świadczy o niepowodzeniu procesu, którego przyczyny zostaną omówione w późniejszych sekcjach.
  2. Po osiągnięciu RT delikatnie odwróć fiolkę, aby ponownie zawiesić mikropęcherzyki. Postaw fiolkę na płaskiej powierzchni i odczekaj 2 min przed zlaniem, aby uzyskać pożądaną populację mikropęcherzyków w następujący sposób:
    1. Wyposaż plastikową strzykawkę 1 mL w igłę 18 G i odpowietrz strzykawkę/igłę, zasysając i wypuszczając powietrze. Po upływie 2 min szybko odkręć korek fiolki, zrywając uszczelnienie z Parafilmu jednym ruchem.
    2. Pobierz 400-550 µL z dna fiolki (docelowa populacja mikropęcherzyków), unikając zasysania górnej pianistej warstwy zawierającej większe, niepożądane populacje mikropęcherzyków.
      UWAGA: W razie potrzeby przechyl fiolkę na bok, aby zebrać końcowe objętości do strzykawki i uniknąć aspiracji warstwy pianistej/lżejszej.
  3. Ostrożnie przetrzyj krawędzie igły, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia pianiste, i przenieś wyizolowaną zawiesinę mikropęcherzyków do probówki do mikrocentryfugi. Delikatnie zakryj (nie zatrzaskuj gwałtownie korka). Jest to końcowa zawiesina robocza znakowanych izotopowo mikropęcherzyków.
  4. Zmierz aktywność końcowego produktu mikropęcherzyków na kalibratorze dawki i zanotuj czas. Podziel tę wartość przez objętość zawiesiny zlanej w kroku 5.2, aby uzyskać wartość MBq·mL-1 niezbędną do obliczenia objętości wstrzyknięcia w zależności od interesującej aplikacji.
    UWAGA: Znakowane izotopowo mikropęcherzyki są teraz gotowe do użycia. Sekcję 6 można wykonać do 24 h później. Informacje na temat tego, jak można wstrzykiwać i śledzić te znakowane izotopowo mikropęcherzyki in vivo za pomocą multimodalnego obrazowania (ultradźwiękowego, PET, fluorescencyjnego), znajdują się w pracy Rajora et al.15.

6. Walidacja wydajności znakowania radioizotopowego

  1. Resuspender zawiesinę mikropęcherzyków poprzez delikatne pipetowanie lub odwracanie fiolki.
    UWAGA: Nigdy nie należy mieszać gotowego produktu z mikropęcherzykami w wstrząsarce wiroksowej (vortex). Wirowanie w taki sposób destabilizuje zawiesiny mikropęcherzyków.
  2. Przenieść 10-200 µL radioznaczonej zawiesiny do jednostki filtra wirowego o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 30 000 i pojemności 0,5 mL. W przypadku objętości <200 µL, dodać ddH2O do jednostki filtra, aby uzyskać całkowitą objętość 200 µL. Umieścić jednostkę filtra w kompatybilnej probówce do mikrocentryfugi i zakręcić.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie testu radioznakowania przed i oddzielnie od jakiegokolwiek zastosowania radioznaczonych mikropęcherzyków in vitro lub in vivo, aby upewnić się, że protokół został prawidłowo wykonany. W takim przypadku w tym kroku można zastosować większą objętość (np. 200 µL). Gdy protokół zostanie następnie wykorzystany w sesji terapeutycznej, należy najpierw przygotować objętości terapeutyczne/iniekcje, a następnie przeprowadzić sekcję 6 z pozostałej radioznaczonej zawiesiny mikropęcherzyków tak szybko, jak to możliwe.
  3. Wirować przez 10 min przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: mikrocentryfuga powinna być otoczona osłoną ołowianą.
  4. Odciąć nożyczkami połączenie między probówką do mikrocentryfugi a jej zakrętką.
    1. Umieścić zakrętkę w 20 mL fiolce scyntylacyjnej z oznaczeniem „caps” (zakrętki). Przenieść jednostkę filtra do nowej probówki do mikrocentryfugi (probówka 2).
    2. Umieścić pierwszą probówkę do mikrocentryfugi z infranatantem w 20 mL fiolce scyntylacyjnej z oznaczeniem „tube 1” (probówka 1). Dodać 200 µL ddH2O do jednostki filtra w probówce 2.
  5. Wirować jednostkę filtra w probówce 2 przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Powtórzyć kroki 6.4 i 6.5. Dodać zakrętkę z probówki 2 do fiolki scyntylacyjnej „caps”, w której znajduje się zakrętka z probówki 1. Umieścić probówkę 2 w nowej 20 mL fiolce scyntylacyjnej.
  7. Odciąć zakrętkę trzeciej probówki do mikrocentryfugi i umieścić ją w fiolce „caps” zgodnie z krokiem 6.4. Przenieść jednostkę filtra do nowej 20 mL fiolki scyntylacyjnej z oznaczeniem „unit” (jednostka), upewniając się, że infranatant pozostaje w probówce 3 i nie zostaje przeniesiony do fiolki „unit”. Jeśli na krawędziach jednostki filtra widoczne są krople, należy zwrócić ją do probówki 3, zakręcić i wirować przez 10 s. Umieścić probówkę 3 w nowej 20 mL szklanej fiolce scyntylacyjnej.
  8. Zakręcić 5 fiolek scyntylacyjnych (probówka 1, probówka 2, probówka 3, zakrętki i jednostka). Przygotować jedną pustą i zakręconą 20 mL fiolkę scyntylacyjną jako kontrolę ślepą.
  9. Zmierzyć aktywność miedzi-64 w sześciu fiolkach scyntylacyjnych za pomocą licznika γ. Odjąć aktywność fiolki ślepej od aktywności pozostałych fiolek. Obliczyć wydajność radioznakowania/chelatacji, korzystając z Równania 2.
    Wzór na obliczanie wydajności, równanie dla procentowej wydajności, stosowane w analizie ilościowej.    (Równanie 2)
    UWAGA: Jeśli wartość cpm dla jednostki jest nienaturalnie niska (np. niższa lub równa wartościom dla probówek) lub jeśli jakiekolwiek odczyty przekraczają próg nieliniowości/nasycenia licznika γ, przechowywać fiolki scyntylacyjne w pojemnikach ołowianych do 4 dni, aby pozwolić na rozpad aktywności do momentu, aż wartości spadną poniżej progu, a następnie ponownie wykonać pomiar.

7. Charakterystyka fizykochemiczna mikropęcherzyków

UWAGA: Jeśli laboratorium nie dysponuje sprzętem przeznaczonym do przetwarzania próbek radioaktywnych, charakterystyka fizykochemiczna mikropęcherzyków musi zostać przeprowadzona z wykorzystaniem niepromieniotwórczych, „zimnych” próbek z chelatem miedzi. Takie „zimne” znakowanie ułatwia ocenę wydajności otrzymywania mikropęcherzyków, co jest kluczowe dla określenia dawki mikropęcherzyków stosowanej w zamierzonym zastosowaniu. Ponadto pozwala to na porównanie z kontrolnymi mikropęcherzykami niechelatowanymi, aby upewnić się, że proces znakowania radioaktywnego nie zaburza właściwości mikropęcherzyków. To „zimne” znakowanie oraz powiązana z nim charakterystyka fizykochemiczna powinny zostać wykonane przed zastosowaniem mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie i mogą służyć jako informacja zwrotna, jeśli wymagane są modyfikacje procesu znakowania (patrz sekcja Dyskusja).

  1. „Zimne” znakowanie mikropęcherzyków miedzią
    1. Wykorzystując objętość roztworu 64CuCl2 dodaną do zawiesiny lipidowej w kroku 4.7, procent moli porfiryny w składzie błon lipidowych oraz aktywność właściwą podaną w karcie produktu 64CuCl2, oblicz przybliżony molowy stosunek metalu do porfiryny osiągnięty podczas radioznakowania. Przykładowe obliczenia znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.
    2. Postępuj zgodnie z sekcjami 1-3 niniejszego protokołu.
    3. Przygotuj roztwór CuCl2 o stężeniu 0,1 mg·mL-1 w 0,1 N HCl.
    4. Za pomocą mikropipety dodaj odpowiednią objętość tego roztworu CuCl2 do zawiesiny lipidowej, obliczoną w kroku 7.1.1, i zamknij fiolkę.
    5. Obracaj fiolką, aby wymieszać CuCl2 z zawiesiną lipidową, wypełnij przestrzeń nad próbką PFP, uszczelnij i podgrzej zgodnie z krokami 4.9, 4.10 i 4.12. Do obsługi fiolek nie są wymagane pęsety gumowe.
    6. Po 1 h wyjmij fiolkę z urządzenia grzewczego i wytrzyj zewnętrzną stronę do sucha. Pozostaw fiolkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT).
    7. Zneutralizuj zawiesinę lipidową, wymieszaj, wypełnij przestrzeń nad próbką PFP i uszczelnij zgodnie z krokami 4.23 i 4.24.
    8. Aktywuj zawiesinę mikropęcherzyków i zlej nadmiar cieczy, aby uzyskać produkt roboczy zgodnie z krokami 5.1-5.3.
  2. Pomiar wielkości mikropęcherzyków
    UWAGA: Pomiar wielkości mikropęcherzyków należy przeprowadzić natychmiast po aktywacji. W przypadku oceny stabilności zawiesiny roboczej należy powtórzyć przygotowanie próbek i pomiary w odstępach 30 min. Zazwyczaj okno czasowe 1-2 h jest reprezentatywne dla czasu, w którym zawiesina robocza mikropęcherzyków byłaby używana lub podawana po aktywacji. Celem pomiarów stabilności jest upewnienie się, że wielkość i wydajność mikropęcherzyków są utrzymane w tym czasie, tak aby wszystkie podane dawki z roztworu roboczego zawierały podobne populacje mikropęcherzyków.
    1. Włącz licznik Coulter (CC) i ustaw następujące parametry za pomocą narzędzia Edit SOP: apertura 30 µm, zakres wielkości 0,6-18 µm, prąd apertury 400-600 µA, wzmocnienie przedwzmacniacza 4-8, 400 przedziałów (bins), płukanie przed i po każdym pomiarze, analiza wolumetryczna, objętość próbki 5 µL.
    2. Przefiltruj elektrolit CC przez jednostkę filtracji próżniowej 0,2 µm. Napełnij pojemnik na elektrolit oraz osobny pojemnik do przygotowania próbek.
    3. Pomiar tła: Napełnij jednorazową kuwetę 10 mL 10 mL przefiltrowanego elektrolitu i wykonaj pomiar bazowy. Upewnij się, że liczba zliczeń jest poniżej 400. W przeciwnym razie przepłucz instrument.
    4. Pomiar próbki
      1. Dodaj 10 mL przefiltrowanego elektrolitu do nowej kuwety. Resuspenduj zawiesinę mikropęcherzyków poprzez ręczne odwracanie fiolki. Pobierz mikropipetą 5 µL z dolnej części środka fiolki. Wytrzyj krawędzie końcówki pipety (z wyjątkiem otworu) i zanurz próbkę bezpośrednio w przygotowanym elektrolicie.
      2. Wysysaj i wypuszczaj ciecz z pipety, aby całkowicie przenieść zawiesinę. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie zamieszać elektrolit, aż „smugi” zawiesiny mikropęcherzyków zostaną rozproszone.
    5. Zmierz próbkę na CC (dwa pomiary na analityt).
      UWAGA: Objętość próbki 5 µL jest zazwyczaj odpowiednia dla próbek o stężeniu mikropęcherzyków od 1 do 5 x 109 mikropęcherzyków·mL-1. Objętość ta może wymagać korekty w zależności od konfiguracji instrumentu CC oraz w przypadku, gdy wydajność mikropęcherzyków w próbce wykracza poza powyższy zakres.
  3. Obrazowanie konfokalne
    UWAGA: Obrazowanie konfokalne należy przeprowadzić natychmiast po pomiarze wielkości mikropęcherzyków i w czasie zachowania ich stabilności, zgodnie z uwagą w kroku 7.2.
    1. Resuspenduj zawiesinę mikropęcherzyków i przenieś 1-5 µL na środek szklanego preparatu do mikroskopu. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkę na kropli zawiesiny mikropęcherzyków, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza. Zawiesina rozprzestrzeni się pod szkiełkiem nakrywką.
    2. Wykonaj obrazowanie mikropęcherzyków przy powiększeniu 60x z użyciem obiektywu imersyjnego olejowego. Uzyskaj obrazy w polu jasnym oraz przy wzbudzaniu 633 nm/emisji 640-765 nm. Nałóż obraz fluorescencyjny na obraz w polu jasnym.
      UWAGA: Sygnał fluorescencji powinien pokrywać się z powłoką wszystkich widocznych cząstek, gdy sonda jest homogenicznie wbudowana w powłokę mikropęcherzyka.
  4. Spektrofluorometria
    UWAGA: Pomiary spektrofluorometryczne można przeprowadzić w ciągu 24 h od aktywacji mikropęcherzyków.
    1. Przygotuj 1% Triton X-100 zgodnie z wcześniejszym opisem35.
    2. Włącz spektrofluorometr na 15-30 min przed pierwszym pomiarem.
    3. Zmierz widma fluorescencji 1% Triton X-100 przy wzbudzaniu 410 nm i zakresie emisji 600-800 nm w kuwecie kwarcowej. Wybierz opcję normalizacji sygnału względem sygnału detektora referencyjnego (często określaną jako S1/R1).
      UWAGA: Triton X-100 łatwo pieni się podczas pipetowania. Dlatego podczas przenoszenia do kuwety dociskaj tłok pipety tylko do pierwszego ogranicznika.
    4. Płucz kuwetę metanolem i osusz sprężonym powietrzem pomiędzy próbkami.
    5. Przenieś 6 mL 1% Triton X-100 do probówki wirówkowej 15 mL. Resuspenduj zawiesinę mikropęcherzyków i pobierz 1 µL za pomocą mikropipety. Wytrzyj krawędzie końcówki pipety z wyjątkiem otworu i przenieś próbkę do przygotowanego 1% Triton X-100, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie przenieść zawiesinę. Zamieszaj roztwór w wstrząsaczu Vortex i przenieś go do kuwety kwarcowej.
      UWAGA: Dostosuj stosunek próbki do 1% Triton X-100 w zależności od czułości instrumentu i progu nasycenia nieliniowego.
    6. Zmierz tę próbkę, stosując parametry z kroku 7.4.3. Pomiary te odpowiadają cząstkom „rozbitym”.
    7. Powtórz kroki 7.4.3-7.4.6, używając PBS. Pomiary te odpowiadają cząstkom „nienaruszonym”.
    8. Skoryguj tło widm próbek rozbitych i nienaruszonych, używając odpowiednio pomiarów dla 1% Triton X-100 i PBS.
    9. Oblicz wydajność wygaszania (QE) za pomocą Równania 3, wykorzystując zintegrowany skorygowany sygnał fluorescencji próbki nienaruszonej w PBS (FPBS) i w 1% Triton X-100 (FTx):
      Schemat formuły wydajności kwantowej, QE=(1-(stosunek całek))×100%, obliczenie absorpcji optycznej.    (Równanie 3)
  5. Spektroskopia UV-Vis
    UWAGA: Pomiary spektroskopowe można przeprowadzać do 72 h po aktywacji mikropęcherzyków.
    1. Poddaj alikwot zawiesiny mikropęcherzyków w probówce do mikrowirowania sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej (RT), aż zawiesina stanie się przezroczysta. Redukuje to efekty rozpraszania podczas spektroskopii.
    2. Włącz spektrofotometr na 10 min przed pierwszym pomiarem. Wybierz interwał skanowania 0,25 nm i zakres akwizycji 200-800 nm. Włącz odejmowanie tła.
    3. Do pomiarów użyj kwarcowej kuwety o drodze optycznej 1 cm. Płucz kuwetę metanolem pomiędzy pomiarami i osusz sprężonym powietrzem.
    4. Wykonaj pomiar bazowy dla metanolu.
    5. Zamieszaj w wstrząsaczu Vortex sonikowaną, przezroczystą zawiesinę mikropęcherzyków i przenieś 10-50 µL do probówki do mikrowirowania zawierającej 200-1000 µL metanolu. Upewnij się, że objętość metanolu została zmierzona i dodana do probówki za pomocą czystej szklanej strzykawki mikrolitrowej. Zamieszaj roztwór w wstrząsaczu Vortex, aby uzyskać próbkę „rozbitą”.
      UWAGA: Rozcieńczenie próbki będzie zależeć od wydajności ładowania porfiryny i procentowego składu molowego. Rozcieńczenie 20-krotne jest odpowiednie dla składu mikropęcherzyków z 30 mol% piro-lipidów.
    6. Zarejestruj widmo UV-Vis.
    7. Powtórz kroki od 7.5.4 do 7.5.6, używając PBS zamiast metanolu.
      UWAGA: Do pomiaru objętości PBS można użyć mikropipety zamiast szklanej strzykawki mikrolitrowej.

8. Modyfikacje protokołu

  1. Alternatywny chelator
    1. Przygotować filmy lipidowe zgodnie z sekcją 2, zastępując pyro-lipid alternatywnym lipidowo-sprzężonym chelatorem miedzi (na przykład 1,2-dipalmitoylo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminą-N-dietylenotriaminopentooctową (sól amonowa), zwanym dalej DTPA-lipidem). Użyć Supplementary File 1 do obliczenia wymaganej masy i objętości roztworów stokowych.
      UWAGA: Prawdopodobnie konieczne będzie przetestowanie różnych składów molowych alternatywnego chelatora w celu określenia górnej granicy, powyżej której nie można generować stabilnych mikropęcherzyków o wysokiej wydajności.
    2. Postępować zgodnie z sekcjami od 3 do 6 w celu wygenerowania i scharakteryzowania radiomarkowanych mikropęcherzyków.
    3. Postępować zgodnie z krokami od 7.1 do 7.3 w celu scharakteryzowania „zimnych” mikropęcherzyków z chelatowaną miedzią. Do oceny morfologii cząstek wymagane jest jedynie obrazowanie za pomocą konfokalnej mikroskopii w świetle białym. Jeśli alternatywny chelator jest fluorescencyjny, należy przeprowadzić mikroskopię konfokalną z zastosowaniem odpowiednich długości fal wzbudzenia i emisji, dodatkowo do kroków 7.4 i 7.5.
  2. Alternatywny fluorofor
    1. Przygotować filmy lipidowe zgodnie z sekcją 2, zastępując pyro-lipid alternatywnym lipidowo-sprzężonym lub interkalującym fluoroforem (np. DiI). Użyć Supplementary File 1 do obliczenia wymaganej masy i objętości roztworów stokowych.
      UWAGA: Prawdopodobnie konieczne będzie przetestowanie różnych składów molowych alternatywnego fluoroforu w celu określenia górnej granicy, powyżej której nie można generować stabilnych mikropęcherzyków o wysokiej wydajności.
    2. Postępować zgodnie z sekcją 3, stosując PGG zamiast AA-PGG.
    3. Wykonać kroki od 5.1 do 5.3 oraz kroki od 7.2 do 7.5.
  3. Metoda „spikingu”: znakowanie gotowych zawiesin lipidowych mikropęcherzyków
    1. Przygotować film z porfiryno-lipidem zgodnie z sekcją 2, stosując wyłącznie pyro-lipid bez innych składników lipidowych. Ilości pyro-lipidu znajdują się w Supplementary File 1.
    2. Nawodnić film z pyro-lipidem zgodnie z sekcją 3, stosując 100-200 µL AA-PGG (lub PGG, jeśli radiomarkowanie nie jest wymagane) zamiast 1 mL buforu nawadniającego.
    3. Przenieść całą zawiesinę pyro-lipidu do gotowej zawiesiny lipidowych mikropęcherzyków.
    4. Wypełnić przestrzeń nad cieczą PFP, podgrzać, poddać zawiesinę sonikacji i zamknąć pod PFP zgodnie z krokami od 3.4 do 3.9. Monitorować dyspersję zawiesiny pyro-lipidu w gotowej zawiesinie lipidowych mikropęcherzyków i przeprowadzać cykle grzania/sonikacji aż do całkowitego rozproszenia.
      UWAGA: W przypadku użycia komercyjnej fiolki z mikropęcherzykami zamkniętej septem, zawiesinę pyro-lipidu można wprowadzić do fiolki za pomocą strzykawki z igłą bez konieczności ponownego wypełniania przestrzeni nad cieczą PFP.
    5. Przeprowadzić radiomarkowanie (patrz krok 8.3.5.1 poniżej), aktywację, izolację (patrz UWAGA poniżej) oraz powiązaną charakterystykę zgodnie z sekcjami od 4 do 7.
      1. Alternatywnym podejściem jest najpierw radiomarkowanie nawodnionej zawiesiny pyro-lipidu, monitorowanie czystości radiochemicznej >94%, neutralizacja 1 N NaOH (zmodyfikować objętość zgodnie z objętością AA-PGG użytego do nawodnienia filmu z pyro-lipidem), a następnie wprowadzenie radiomarkowanej zawiesiny pyro-lipidu do gotowej zawiesiny lipidowych mikropęcherzyków zgodnie z krokiem 8.3.3.
        UWAGA: Tę zmodyfikowaną metodę należy stosować wyłącznie do generowania fluorescencyjnych lub multimodalnych radiomarkowanych mikropęcherzyków, jeśli po niej następuje proces izolacji usuwający submikronowe pęcherzyki wielowarstwowe powstałe podczas nawadniania lipidów, które nie zostały włączone do mikropęcherzyków. Szczegóły znajdują się w sekcji Dyskusja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kluczowymi mierzalnymi wynikami podczas wytwarzania znakowanych radiologicznie mikropęcherzyków są czystość radiochemiczna oraz wydajność znakowania radiologicznego. W niniejszym protokole do ich charakterystyki wykorzystano odpowiednio iTLC oraz zwalidowaną procedurę odwirowywania. Rycina 2A pokazuje, że osiągnięto średnią czystość radiochemiczną i wydajność na poziomie ≥95% we wszystkich komercyjnych formulacjach naśladujących mikropęcherzyki, w których lipid gospodarza zastąpiono pirolipi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół znakowania radiochemicznego mikropęcherzyków lipidowych osiąga czystość radiochemiczną >95%, skuteczność chelatacji >95% i zachowanie właściwości fizykochemicznych mikropęcherzyków bez konieczności oczyszczania po znakowaniu. Osiągnięcia te reprezentują postępy, które wcześniej nie zostały osiągnięte dla istniejących protokołów etykietowania. Brak etapów oczyszczania pozwala na szybsze wykorzystanie izotopów promieniotwórczych (w tym przypadku miedzi-64), a co za tym idzie, zmniejszenie nieefektywnych str...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Deborah Scollard i Teesha Komal (program University Health Network Spatio-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response (STTARR), Toronto, Ontario) za ich usługi techniczne i wskazówki. Dziękujemy również Markowi Zhengowi i dr Alexowi Dhaliwalowi za ich pomoc techniczną podczas mikroskopii konfokalnej oraz Zakładowi Zaawansowanej Mikroskopii Optycznej (Toronto, Ontario) za dostarczenie odpowiedniego sprzętu. Wymieniamy nasze źródła finansowania: Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Instytut Badawczy Terry'ego Foxa, Kanadyjska Rada ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych, Kanadyjska Fundacja na rzecz Innowacji, Fundacja Księżniczki Małgorzaty na rzecz Raka, Kanadyjski Program Katedr Badawczych, Centrum McLaughlin, Program Stypendialny Vanier, Program Stypendialny dla Absolwentów Ontario, Kanadyjski Rak Prostaty oraz Fundacja Charytatywna Peterborough K. M. Hunter.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
64CuCl2Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of RadiologyN/AZamówienie w małej objętości (< 10 &mikro; L) rozpuszczony w 0,1 N HCl
Kwas octowy Dowolna firma≥ 95% czystości
Folia aluminiowaDowolna firma
Octan amonuDowolna firmaCzystość: ≥ 98%
Równowaga - analitycznaDowolna firmaMożliwość pomiaru do 0,1 mg
Sonikator do kąpieliDowolna firmaMoże być podgrzany do 69 oC
Otwór CC - 30 mikronówBeckman CoulterA36391Zakres średnic cząstek: 0,6-18 um
Elektrolit CCBeckman Coulter8546719Rozcieńczalnik Isoton II
CC OprogramowanieBeckman CoulterMultisizer 4e
Wirówki filtrujące (0,5 ml 30 000 MWCO) z kompatybilnymi probówkami do mikrowirówekMiliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0,5 ml
Probówki wirówkowe - 15 ml z nakrętkamiDowolna firma
ChloroformDowolna firmaCzystość: ≥ 99,8% 
Licznik redlicBeckman CoulterB43905Multisizer 4e Licznik redlic
Szkiełka nakrywkoweVWR48393081VWR Micro cover glass
CuCl2Dowolna firmaUpewnij się, że nie utlenione
CuCl2
Kuweta - kwarty, długość ścieżki 1 cmDowolna firma
Kuwety - 10 ml tworzywa sztucznego do pomiarów CCBeckman CoulterA35471Coulter Counter Accuvette
ST ddH2ODowolna firmaMożna uzyskać za pomocą ultraczystego systemu oczyszczania wody
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanina)Dowolna firmaForma proszku
Kalibrator dawkiDowolna firmaPotrafi odczytać miedź-64
DPPA (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosforan (sól sodowa))Avanti Polar Lipids830855PForma proszku
DPPC (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina)Avanti Polar Lipids850355PForma proszku
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (sól amonowa)))Avanti Polar Lipids880200PPostać proszku
DTPA-lipid (kwas 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-dietytylenotriaminopentaoctowy (sól amonowa))Avanti Polar Lipids790106PProszek w postaci
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Dowolna firma
Licznik gammaDowolna firmaPotrafi odczytać miedź-64
Nasadki do zliczania rurek zliczających gammaGlobe Scientific22-171-665Kołnierzowe zaślepki do probówek 12 mm
Probówki liczące gammaSarstedt55.15795 mL, 75 x 12 mm, PS
Zlewka szklana - 250 mLDowolna firmaWytrzymuje temperatury do 100 oC
Piec do suszenia szkłaDowolna firmaMoże być podgrzewany do 80 oC
Szklane strzykawki mikrolitrowe - 25, 50, 100, 1000 &mikro; LDowolna firmaKompatybilny z rozpuszczalnikami organicznymi
Szklane fiolki scyntylacyjne - 20 mlVWR66022-081VWR® Fiolki scyntylacyjne, ze szkła borokrzemianowego, z nakrętkami, z wkładką z folii celulozowej
Fiolki szklane - 0,5 dramVWR66011-020VWR Fiolka 1/2 dram, z czarną fenolową nakrętką i wkładką z masy celulozowej pokrytej poliwinylem
GlycerolSigma AldrichG7757-1LCzystość:  ≥ 99.0% 
Pipeta z podziałką/pistoletDowolna firma
PłytaWyposażona w sondę temperatury do automatycznej kontroli temperatury
Kwas solny - 0,1 NDowolna firma
Płytki iTLCAgilentA120B12  Bibuła chromatograficzna iTLC-SA
Tkanki laboratoryjneDowolna firma
Media Jednostka filtracji próżniowejDowolna firma0,22 mikrona wielkość porów, membrana PES, pojemność lejka 500 ml
MetanolDowolna firmaCzystość:  ≥ 99,8%, klasa HPLC, spełnia specyfikacje ACS
Probówki do mikrowirówek niesterylne - 1,5 mlDowolna firma
Probówki do mikrowirówek sterylne - 1,5 mlDowolna firma
Mikropipety - p1000, p200, p20, p10Dowolna firmaUpewnij się, że są skalibrowane
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe Wstępnie oczyszczone
igły - 18 GSterylny
ParafilmDowolna firma
PBSSigma AldrichD8537-500MLDPBS, modyfikowany, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
PFPFluoroMedAPF-N40HPCzystość:  ≥ 99,8%
Linia PFPDowolna firmaWąż plastikowy o średnicy 1/4 cala o długości około 50 cm
Regulator PFPSwagelokSS-1RF4 i SS-4HC-1-4
pH-metrDowolna firma
Wzorce pH 4 i 7Dowolna firma
Końcówki do pipet do p1000, p200, p10 - niesterylneDowolna firma
Końcówki do pipet do p1000, p200, p10 - sterylneDowolna firma
Strzykawka plastikowa - 1 mlDowolna firmaSterylne
GlikolpropylenowyBioShopPRO888.500Czystość:  ≥ 99,5%
PirolipidN/AWyprodukowano we własnym zakresie
Kleszcze z gumową końcówkąDowolna firmaZalecana mieszanka krawędzi z cienką końcówką i płaskimi/kwadratowymi
NożyczkiDowolna firma
Wodorotlenek sodu - 1 NDowolna firma
Wodorotlenek sodu - 10 NDowolna firma
SpektrofluorometrDowolna firmaZdolny do wzbudzenia 410 nm i emisji 600-850 nm
Oprogramowanie do spektrofluorometriiSpektrometr HoribaFluorEssence
Dowolna firma
Strzykawka - 1 mlDowolna firmaJednorazowe, plastikowe, sterylne
Filtry strzykawkowe - wielkość porów 0,2 mikronaDowolna FirmaMateriał membrany: PES lub inny kompatybilny z octanem amonu/kwasem octowym i PBS
Probówka - 10 ml
Triton X-100Dowolna firma
Eksykator próżniowy / próżniaDowolna firma
VialmixLantheus Obrazowanie medyczne515030-0508Określany w protokole jako mechaniczna wytrząsarka do fiolek
Waga papierDowolna firmaAby uniknąć utraty produktu, zaleca się cięcie papieru o wymiarach 3x3 cm
gorąca/mieszająca

Bibliografia

  1. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Mol Imaging Biol. 14 (1), 40-46 (2012).
  2. Kong, W. T., Wang, W. P., Huang, B. J., Ding, H., Mao, F. Value of wash-in and wash-out time in the diagnosis between hepatocellular carcinoma and other hepatic nodules with similar vascular pattern on contrast-enhanced ultrasound. J Gastroenterol Hepatol. 29 (3), 576-580 (2014).
  3. Wilson, S. R., Burns, P. N. Microbubble-enhanced us in body imaging: What role. Radiology. 257 (1), 24-39 (2010).
  4. Hynynen, K., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. Noninvasive mr imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier bbb in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  5. He, W., et al. Enhanced ablation of high intensity focused ultrasound with microbubbles: An experimental study on rabbit hepatic vx2 tumors. Cardiovasc Intervent Radiol. 34 (5), 1050-1057 (2011).
  6. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in alzheimer's disease using mr-guided focused ultrasound. Nat Commun. 9 (1), 2336(2018).
  7. Burke, C. W., Klibanov, A. L., Sheehan, J. P., Price, R. J. Inhibition of glioma growth by microbubble activation in a subcutaneous model using low duty cycle ultrasound without significant heating. J Neurosurg. 114 (6), 1654-1661 (2011).
  8. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. J Control Release. 243, 172-181 (2016).
  9. Haram, M., Hansen, R., Bouget, D., Myhre, O. F., Davies, C. L., Hofsli, E. Treatment of liver metastases with focused ultrasound and microbubbles in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy. Ultrasound Med Biol. 49 (9), 2081-2088 (2023).
  10. Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 9 (1), 321(2019).
  11. Karakatsani, M. E., et al. Focused ultrasound mitigates pathology and improves spatial memory in alzheimer's mice and patients. Theranostics. 13 (12), 4102-4120 (2023).
  12. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the role of lipid transfer in microbubble-mediated drug delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  13. Wang, S., Samiotaki, G., Olumolade, O., Feshitan, J. A., Konofagou, E. E. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  14. Huynh, E., Rajora, M. A., Zheng, G. Multimodal micro, nano, and size conversion ultrasound agents for imaging and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8 (6), 796-813 (2016).
  15. Rajora, M. A., et al. Quantitative pharmacokinetics reveal impact of lipid composition on microbubble and nanoprogeny shell fate. Adv Sci. 11 (4), 2304453(2024).
  16. Leong, K. X., Sharma, D., Czarnota, G. J. Focused ultrasound and ultrasound stimulated microbubbles in radiotherapy enhancement for cancer treatment. Technol Cancer Res Treat. 22, 1-9 (2023).
  17. Li, Y., et al. Ultrasound-triggered release of sinoporphyrin sodium from liposome-microbubble complexes and its enhanced sonodynamic toxicity in breast cancer. Nano Research. 11, 1038-1056 (2017).
  18. Nomikou, N., Fowley, C., Byrne, N. M., Mccaughan, B., Mchale, A. P., Callan, J. F. Microbubble-sonosensitiser conjugates as therapeutics in sonodynamic therapy. Chem Commun. 48 (67), 8332-8334 (2012).
  19. Chakravarty, R., Hong, H., Cai, W. Positron emission tomography image-guided drug delivery: Current status and future perspectives. Mol Pharm. 11 (11), 3777-3797 (2014).
  20. Delalande, A., Leduc, C., Midoux, P., Postema, M., Pichon, C. Efficient gene delivery by sonoporation is associated with microbubble entry into cells and the clathrin-dependent endocytosis pathway. Ultrasound Med Biol. 41 (7), 1913-1926 (2015).
  21. Sheikov, N., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med Biol. 30 (7), 979-989 (2004).
  22. Conway, G. E., Paranjape, A. N., Chen, X., Villanueva, F. S. Development of an in vitro model to study mechanisms of ultrasound-targeted microbubble cavitation-mediated blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 50 (3), 425-433 (2024).
  23. Hu, S., Zhang, X., Unger, M., Patties, I., Melzer, A., Landgraf, L. Focused ultrasound-induced cavitation sensitizes cancer cells to radiation therapy and hyperthermia. Cells. 9 (12), 2595(2020).
  24. Zhao, C., et al. Synergistically augmenting cancer immunotherapy by physical manipulation of pyroptosis induction. Phenomics. , (2024).
  25. Tachibana, K., Uchida, T., Ogawa, K., Yamashita, N., Tamura, K. Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet. 353 (9162), 1409(1999).
  26. Arif, W. M., et al. Focused ultrasound for opening blood-brain barrier and drug delivery monitored with positron emission tomography. J Control Release. 324, 303-316 (2020).
  27. Da Ros, V., et al. PVA-microbubbles as a radioembolization platform: Formulation and the in vitro proof of concept. Pharmaceutics. 15 (1), 217(2023).
  28. Tartis, M. S., et al. Dynamic micropet imaging of ultrasound contrast agents and lipid delivery. J Control Release. 131 (3), 160-166 (2008).
  29. Willmann, J. K., et al. Targeted microbubbles for imaging tumor angiogenesis: Assessment of whole-body biodistribution with dynamic micro-pet in mice. Radiology. 249 (1), 212-219 (2008).
  30. Ingram, N., et al. Ultrasound-triggered therapeutic microbubbles enhance the efficacy of cytotoxic drugs by increasing circulation and tumor drug accumulation and limiting bioavailability and toxicity in normal tissues. Theranostics. 10 (24), 10973-10992 (2020).
  31. Hernández-Gil, J., et al. Development of 68ga-labelled ultrasound microbubbles for whole-body pet imaging. Chem Sci. 10 (215), 5603-5615 (2019).
  32. Warram, J. M., et al. Biodistribution of p-selectin targeted microbubbles. J Drug Target. 22 (5), 387-394 (2014).
  33. Liu, T. W., Macdonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically copper-64-labeled organic nanoparticles as radiotracers. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (52), 13128-13131 (2012).
  34. Rajora, M. A., et al. Tailored theranostic apolipoprotein e3 porphyrin-lipid nanoparticles target glioblastoma. Chem Sci. 8 (8), 5371-5384 (2017).
  35. Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets. J Vis Exp. 176, e62665(2021).
  36. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  37. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjug Chem. 25 (4), 796-801 (2014).
  38. Mcmahon, D., Hynynen, K. Acute inflammatory response following increased blood-brain barrier permeability induced by focused ultrasound is dependent on microbubble dose. Theranostics. 7 (16), 3989-4000 (2017).
  39. Bismuth, M., Katz, S., Rosenblatt, H., Twito, M., Aronovich, R., Ilovitsh, T. Acoustically detonated microbubbles coupled with low frequency insonation: Multiparameter evaluation of low energy mechanical ablation. Bioconjug Chem. 33 (6), 1069-1079 (2022).
  40. Kutscher, H. L., et al. Threshold size for optimal passive pulmonary targeting and retention of rigid microparticles in rats. J Control Release. 143 (1), 31-37 (2010).
  41. You, Y., et al. Porphyrin-grafted lipid microbubbles for the enhanced efficacy of photodynamic therapy in prostate cancer through ultrasound-controlled in situ accumulation. Theranostics. 8 (6), 1665-1677 (2018).
  42. Chen, X., Qin, B., Whitehurst, D., Helfield, B., Lavery, L., Villanueva, F. S. Sonodynamic therapy using protoporphyrin ix encapsulated microbubbles inhibits tumor growth. 2017 IEEE International Ultrasonics Symposium. , Washington, DC. 1-4 (2017).
  43. Cheng, M. H. Y., et al. Targeted theranostic 111in/lu-nanotexaphyrin for spect imaging and photodynamic therapy. Mol Pharm. 19 (6), 1803-1813 (2022).
  44. Cheng, M. H. Y., Cevallos, A., Rajora, M. A., Zheng, G. Fast, facile, base-free microwave-assisted metallation of bacteriochlorophylls and corresponding high yield synthesis of tookad. J Porphyrins Phthalocyanines. 25 (07n08), 703-713 (2021).
  45. Macdonald, T. D., Liu, T. W., Zheng, G. An MRI-sensitive, non-photobleachable porphysome photothermal agent. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (27), 6956-6959 (2014).
  46. Shao, S., et al. Functionalization of cobalt porphyrin-phospholipid bilayers with his-tagged ligands and antigens. Nat Chem. 7 (5), 438-446 (2015).
  47. Teh, J. H., et al. A kit-based aluminium-[(18)f]fluoride approach to radiolabelled microbubbles. Chem Commun (Camb). 57 (88), 11677-11680 (2021).
  48. Rajora, M. A. Supramolecular Structure-Enabled Delivery of Porphyrin to Glioblastomas Beyond the Blood-Brain Barrier [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2024).
  49. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  50. Dhaliwal, A. Utilizing Porphyrin to Improve Ultrasound-Activated Supramolecular Agent Design for Solid Tumor Delivery [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2023).
  51. Kilroy, J. P., Klibanov, A. L., Wamhoff, B. R., Bowles, D. K., Hossack, J. A. Localized in vivo model drug delivery with intravascular ultrasound and microbubbles. Ultrasound Med Biol. 40 (10), 2458-2467 (2014).
  52. Dhaliwal, A., et al. Deep learning for automatic organ and tumor segmentation in nanomedicine pharmacokinetics. Theranostics. 14 (3), 973-987 (2024).
  53. Shakya, G., Cattaneo, M., Guerriero, G., Prasanna, A., Fiorini, S., Supponen, O. Ultrasound-responsive microbubbles and nanodroplets: A pathway to targeted drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 206, 115178(2024).
  54. Honari, A., Merillat, D. A., Bellary, A., Ghaderi, M., Sirsi, S. R. Improving release of liposome-encapsulated drugs with focused ultrasound and vaporizable droplet-liposome nanoclusters. Pharmaceutics. 13 (5), 609(2021).
  55. Barmin, R. A., et al. Polymeric materials for ultrasound imaging and therapy. Chem Sci. 14 (43), 11941-11954 (2023).
  56. Chen, Y., Liang, Y., Jiang, P., Li, F., Yu, B., Yan, F. Lipid/PLGA hybrid microbubbles as a versatile platform for noninvasive image-guided targeted drug delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (45), 41842-41852 (2019).
  57. Barmin, R. A., et al. Engineering the acoustic response and drug loading capacity of pbca-based polymeric microbubbles with surfactants. Mol Pharm. 19 (9), 3256-3266 (2022).
  58. Barrefelt, A. A., et al. Multimodality imaging using SPECT/CT and MRI and ligand functionalized 99mTc-labeled magnetic microbubbles. EJNMMI Res. 3 (1), 12(2013).
  59. Song, R., Hu, D., Chung, H. Y., Sheng, Z., Yao, S. Lipid-polymer bilaminar oxygen nanobubbles for enhanced photodynamic therapy of cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (43), 36805-36813 (2018).
  60. Böhmer, M. R., Chlon, C. H. T., Raju, B. I., Chin, C. T., Shevchenko, T., Klibanov, A. L. Focused ultrasound and microbubbles for enhanced extravasation. J Control Release. 148 (1), 18-24 (2010).
  61. Zhang, S., et al. Compare ultrasound-mediated heating and cavitation between flowing polymer- and lipid-shelled microbubbles during focused ultrasound exposures. J Acoust Soc Am. 131 (6), 4845-4855 (2012).
  62. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  63. Krasnovskaya, O. O., et al. Recent advances in (64)cu/(67)cu-based radiopharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (11), 9154(2023).
  64. Navarro-Becerra, J. A., Borden, M. A. Targeted microbubbles for drug, gene, and cell delivery in therapy and immunotherapy. Pharmaceutics. 15 (6), 1625(2023).
  65. Fan, C. -H., et al. Antiangiogenic-targeting drug-loaded microbubbles combined with focused ultrasound for glioma treatment. Biomaterials. 34 (8), 2142-2155 (2013).
  66. Luo, T., et al. Ultrasound-mediated destruction of oxygen and paclitaxel loaded dual-targeting microbubbles for intraperitoneal treatment of ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 391, 1-11 (2017).
  67. Fix, S. M., et al. Oxygen microbubbles improve radiotherapy tumor control in a rat fibrosarcoma model - a preliminary study. PLoS One. 13 (4), e0195667(2018).
  68. Eisenbrey, J. R., et al. Sensitization of hypoxic tumors to radiation therapy using ultrasound-sensitive oxygen microbubbles. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (1), 88-96 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wytwarzanie mikropęcherzykówznakowanie mikropęcherzykówfluorescencyjne mikropęcherzykiradioaktywne mikropęcherzykiskupione ultradźwiękichelatowanie radioizotopówobrazowanie multimodalnelipidowe mikropęcherzykilicznik gammafiltracja wirowa
Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.