Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

DOI:

10.3791/67431

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Department of Medicine, University of Toronto, 4Department of Medical Biophysics, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wytwarzanie mikropęcherzyków lipidowych i kompatybilną metodę radioznakowania mikropęcherzyków w jednym garnku z nieoczyszczającą >95% skutecznością znakowania, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków. Metoda ta jest skuteczna w przypadku różnych preparatów mikropęcherzyków lipidowych i może być dostosowana do generowania mikropęcherzyków radioaktywnych i/lub fluorescencyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki to wypełnione lipidami, wypełnione gazem cząsteczki, które przekształciły się z ultradźwiękowych środków kontrastowych do rewolucyjnych platform terapii raka. W połączeniu z terapeutycznymi skoncentrowanymi ultradźwiękami (FUS) mogą bezpiecznie i miejscowo pokonywać bariery fizjologiczne (np. barierę krew-mózg), dostarczać leki na niedostępne w inny sposób nowotwory (np. glejaka i raka trzustki) oraz leczyć choroby neurodegeneracyjne. Arsenał terapeutyczny microbubble-FUS rozwija się w nowych kierunkach, w tym w synergicznej radioterapii skojarzonej, obrazowaniu multimodalnym oraz kompleksowym ładowaniu i dostarczaniu leków z otoczek mikropęcherzykowych.

Oznaczanie mikropęcherzyków za pomocą radioznaczników jest kluczem do ustanowienia tych rozszerzonych możliwości teranostycznych. Jednak istniejące strategie znakowania radioaktywnego mikropęcherzyków opierają się na metodologiach oczyszczania, o których wiadomo, że zaburzają właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków, wykorzystują krótkożyciowe izotopy promieniotwórcze i nie zawsze zapewniają stabilną chelatację. Łącznie stwarza to niejasności co do dokładności obrazowania radiologicznego mikropęcherzyków i skuteczności dostarczania radioizotopów guza.

Ten protokół opisuje nową, jednogarnkową, nieoczyszczającą metodologię znakowania mikropęcherzyków, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków, osiągając jednocześnie >95% skuteczności chelatacji radioizotopów. Jest wszechstronny i może być z powodzeniem stosowany w niestandardowych i komercyjnych preparatach mikropęcherzykowych o różnej długości łańcucha lipidowego acylowego, ładunku i składzie chelatora/sondy (porfiryna, DTPA, DiI). Może być stosowany adaptacyjnie podczas zmielonego wytwarzania mikropęcherzyków oraz do gotowych preparatów mikropęcherzykowych z modułową możliwością dostosowania właściwości fluorescencyjnych i multimodalnych fluorescencji/radioaktywnych. W związku z tym ta elastyczna metoda umożliwia produkcję dostosowanych, identyfikowalnych (radio, fluorescencyjnych lub radio/fluorescencyjnych aktywnych) multimodalnych mikropęcherzyków, które są przydatne w rozwoju mechanistycznych, obrazowych i terapeutycznych zastosowań mikropęcherzyków-FUS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki to mikronowe supramolekularne środki teranostyczne z rdzeniem gazowym stabilizowanym przez białko, polimer lub, w większości przypadków, otoczkę lipidową (Rysunek 1A). Po wstrzyknięciu do krwiobiegu mikropęcherzyki utrzymują granicę faz gaz/ciecz, która jest wykrywalna za pomocą ultradźwięków przez kilka minut przed rozpuszczeniem ich rdzeni gazowych1,2. W związku z tym pierwszym klinicznym zastosowaniem mikropęcherzyków było zastosowanie mikropęcherzyków jako środków kontrastowych do obrazowania ultrasonograficznego w czasie rzeczywistym3. Wynalezienie terapeutycznych skoncentrowanych ultradźwięków (FUS) rozszerzyło możliwości kliniczne mikropęcherzyków. Po stymulacji przez FUS o niskiej częstotliwości, mikropęcherzyki oscylują i generują ukierunkowane, przestrajalne siły mechaniczne, od przejściowej przepuszczalności naczyń do ogniskowej ablacji tkanki4,5. W rezultacie, w ciągu ostatnich 20 lat, mikropęcherzyki-FUS zostały zbadane pod kątem otwarcia bariery krew-mózg (BBB), guza (np. raka trzustki, mózgu i wątroby z przerzutami), dostarczania leków i sond obrazowych, terapii chorób neurodegeneracyjnych i ablacji raka6,7,8,9,10,11.

Teranostyczny arsenał mikropęcherzyków wciąż rozwija się w nowych i ekscytujących kierunkach. Konwencjonalne zastosowania dostarczania mikropęcherzyków-FUS polegają na jednoczesnym podawaniu ładunku terapeutycznego lub obrazowego wraz z komercyjnymi mikropęcherzykami. Rośnie zainteresowanie zwiększeniem możliwości dostarczania mikropęcherzyków FUS poprzez zrozumienie interakcji mikropęcherzyków i biologicznych, badanie niestandardowych niekomercyjnych preparatów mikropęcherzyków oraz generowanie mikropęcherzyków teranotycznych typu "wszystko w jednym" z ładunkiem załadowanym bezpośrednio na powłokę mikropęcherzykową12,13,14. W rzeczywistości około 40% badań nad dostarczaniem leków z mikropęcherzykami lipidowymi wykorzystuje takie mikropęcherzyki wypełnione powłoką15. Poza obrazowaniem i dostarczaniem leków, microbubble-FUS okazał się również obiecujący w ulepszaniu radioterapii nowotworów16 oraz aktywacji działania przeciwnowotworowego skądinąd łagodnych środków obciążonych powłoką poprzez terapię sonodynamiczną17,18.

Te konwencjonalne i rozszerzone kierunki w zastosowaniach raka mikropęcherzyków mogą być bardziej strategicznie zaawansowane poprzez oznaczanie mikropęcherzyków radioaktywnych znaczników. W dziedzinie mikropęcherzyków typu "wszystko w jednym" załadowanych ładunkiem, takie znakowanie radioaktywne 1) ułatwia złote, ilościową ocenę biodystrybucji tych naładowanych mikropęcherzyków w miejscu i poza celem, 2) wyprowadza farmakokinetyczne zależności między strukturą a aktywnością, które informują o optymalnym doborze kompozycji mikropęcherzyków w celu maksymalizacji dostarczania do celu, oraz 3) kieruje strategicznym i odpowiednim planowaniem aplikacji i leczenia pod kątem obrazu (np. rodzaje docelowych tkanek, Dozymetria, dobór leków w celu złagodzenia obaw związanych z bezpieczeństwem poza celem, użyteczność w porównaniu z konwencjonalnymi paradygmatami współleczenia) systemów typu "wszystko w jednym" załadowanych ładunkiem15,19. Na etapie przedklinicznym takie zrozumienie losu skorupek mikropęcherzyków może również rzucić światło na szersze mechanizmy działania mikropęcherzyków-FUS. Na przykład wykazano, że transfer lipidów z otoczek mikropęcherzyków do komórek docelowych wpływa na sonoporację z włączoną funkcją FUS12,20. Zrozumienie i optymalizacja takiego transferu może zatem dostarczyć informacji na temat przedklinicznych i klinicznych terapii mikropęcherzyków FUS, w które zaangażowana jest sonoporacja (transfekcja in vitro, dostarczanie leków, ablacja guza, uwrażliwienie na promieniowanie i terapia sonodynamiczna20,21,22,23,24,25). Podwójne urządzenia do ultrasonografii i radioobrazowania umożliwiłyby również monitorowanie otwarcia naczynia FUS i leczenia (np. kinetykę otwarcia BBB) za pomocą jednego środka, a nie konwencjonalnych konstrukcji z podwójnym środkiem26. W tym samym duchu, znakowanie radioaktywne mikropęcherzykami lipidów może służyć jako uniwersalna alternatywa dla mikropęcherzyków-FUS/radioterapii typu "wszystko w jednym" dla platform do wspólnego dostarczania mikropęcherzyków-FUS + radiofarmaceutyków27.

Kruchość mikropęcherzyków jest nietrywialnym wyzwaniem dla takiego etykietowania. Wszystkie istniejące strategie znakowania radioaktywnego są ograniczone metodologiami oczyszczania, o których wiadomo, że zaburzają stabilność i rozmiar mikropęcherzyków, podczas gdy niektóre charakteryzują się również nieskutecznym i niestabilnym radioznakowaniem28,29,30,31,32. Wymagania dotyczące oczyszczania prowadzą również do dłuższych protokołów. W połączeniu z użyciem krótkożyciowych izotopów promieniotwórczych (np. 18F t1/2 1.8 h,28,29 99mTc t1/2 6 h,32 68Gat 1/2 1 h31), tworzy to nieefektywność związaną z rozpadem radioizotopów i ogranicza ramy czasowe planowania radioobrazowania i leczenia. Łącznie ograniczenia te grożą uzyskaniem skróconego i niereprezentatywnego obrazowania radiologicznego, niedokładnymi danymi farmakokinetycznym i nieefektywnym dostarczaniem radioizotopów guza.

W tym raporcie, te ograniczenia zostały przezwyciężone poprzez wykorzystanie silnych i stabilnych zdolności chelatacji metali porfiryny. Porfiryny to organiczne, heterocykliczne makrocząsteczki z wysoce sprzężonym płaskim pierścieniem i centralnym miejscem koordynacji, które może pomieścić różne metale. Obejmuje to radioizotopy o dłuższym okresie życia, takie jak miedź-64 (t1/2 12,7 h), radiofarmaceutyk z pozytonową tomografią emisyjną (PET) oraz γ-counting wykonalności33. Po sprzężeniu ze szkieletem lipidowym, porfiryny mogą być łatwo włączane do struktur supramolekularnych, a następnie znakowane miedzią-64 z szybkością, wysoką wydajnością chelatacji i stabilnością surowicy, przy zachowaniu właściwości macierzystych nieznakowanych cząstek33,34. Ponadto porfiryny są fluorescencyjnie aktywne z modułowym samogasnieniem w nano i mikrocząstkach, które jest przywracane po rozbiciu cząstek; uzupełniający odczyt do PET i zliczania γ, który ułatwia zarówno masową, jak i mikroskopową analizę losu skorupy (Rysunek 1A)15.

Używając lipidu porfirynowego jako chelatora, właściwości te zostały wykorzystane do stworzenia nowej, jednogarnkowej, nieoczyszczającej metodologii radioznakowania mikropęcherzykami (Rysunek 1B,C), która pokonuje ograniczenia związane z istniejącymi metodami radioznakowania mikropęcherzyków. Protokół ten osiąga >95% skuteczność chelatacji miedzi-64, nie wymaga oczyszczania po znakowaniu i zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków. Można go łatwo zintegrować z "podstawowym" wytwarzaniem mikropęcherzyków lipidów przed ich aktywacją (Rysunek 1B). Jest wszechstronny i może być z powodzeniem stosowany w niestandardowych i komercyjnych preparatach mikropęcherzykowych o różnej długości łańcucha acylowo-lipidowego (C16 do C22), ładunku (neutralnym i anionowym) oraz składzie porfirynowo-lipidowym (1 mol., 10 mol., 30 mol.), generując mikropęcherzyki o aktywności radiowej i fluorescencyjnej. Jego zdolności adaptacyjne mogą również wykraczać poza porfirynę. Protokół jednogarnkowy można zmodyfikować w celu wykorzystania alternatywnych dostępnych na rynku chelatorów (np. pentaoctanu dietylenotriaminy (DTPA)-lipidu) i fluoroforów (np. DiI). Można go również zmodyfikować, aby oznaczać gotowe preparaty mikropęcherzykowe za pomocą podejścia "dopingowego". W związku z tym metoda ta umożliwia wytwarzanie dostosowanych, identyfikowalnych (radio, fluorescencyjnych lub podwójnie radio/fluorescencyjnych aktywnych) mikropęcherzyków, przydatnych do rozwoju mechanistycznych, obrazowych i terapeutycznych zastosowań mikropęcherzyków-FUS. Poniższy protokół przedstawia wytwarzanie mikropęcherzyków lipidowych, zastosowanie protokołu znakowania radioaktywnego w jednym garnku, wymagane znakowanie radioaktywne i charakterystykę właściwości fizykochemicznych oraz potencjalne modyfikacje.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Protokół wytwarzania mikropęcherzyków i znakowania radioaktywnego. (A) Lipid porfirynowy, w postaci pirofeoforbidu-a-lipidu, służy jako multimodalny chelator w tym protokole. Jako monomer chelatowany do miedzi-64 (i), ma właściwości PET i obrazowania. Jego fluorescencja jest wygaszana w postaci cząstek (mikropęcherzyki (ii) i ich nanopotomstwo po rozpuszczeniu (iii)) i niegaszona przez rozerwanie cząstek (iv). (B) Protokół hydratacji/aktywacji filmu lipidowego opisany w niniejszym raporcie w celu wytworzenia mikropęcherzyków lipidowych od podstaw oraz (C) integracja znakowania radioaktywnego w jednym garnku między tworzeniem zawiesiny lipidowej a aktywacją mikropęcherzyków. Ten rysunek został zaadaptowany za zgodą Rajora et al.15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować bufor octanu amonu (0,1 M, pH 5,5)
    1. Za pomocą wagi analitycznej odważyć 770,8 mg octanu amonu na bibułce. Przenieść zważoną ilość do czystej szklanej zlewki o pojemności 250 ml.
    2. Dodać 90 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O), odmierzonej pipetą miarową, do zlewki. Dodać mieszadło i umieścić zlewkę na magnetycznej płytce mieszającej, aby rozpuścić octan amonu. Mieszać z prędkością, która tworzy lekki wir, ale bez rozpryskiwania roztworu.
    3. Skalibruj pH-metr zgodnie z instrukcją urządzenia, używając wzorców pH 4 i 7. Po kalibracji włóż sondę pH do buforu octanu amonu.
    4. Dodać 104 μl kwasu octowego do roztworu, wymieszać do rozpuszczenia i zmierzyć pH,
      UWAGA: W tym momencie pH powinno być bliskie 5,5.
    5. Dostosuj pH buforu, dodając 10 N wodorotlenku sodu (lub kwasu solnego, jeśli bufor staje się zbyt zasadowy) w odstępach co 5-10 μl za pomocą mikropipety. Wymieszaj, zmierz pH i powtórz w razie potrzeby. Zanotuj objętość dodanej zasady/kwasu.
    6. Dodaj wystarczającą objętość ddH2O, aby utworzyć w sumie 100 ml buforu.
      UWAGA: Na przykład, jeśli podczas regulacji pH użyto 45 μl 10 N wodorotlenku sodu, do zlewki dodanoby 9,851 ml ddH2O (100 ml [objętość docelowa] - 90 ml [krok 1.1.2] - 0,104 ml [krok 1.1.4] - 0,045 ml [krok 1.1.5] = 9,851 ml).
    7. Bufor dokładnie wymieszać po raz ostatni przed przeniesieniem go do pojemnika do przechowywania z pokrywą.
    8. Wyczyść pH-metr zgodnie z instrukcją przyrządu.
      UWAGA: Stężony wodny roztwór wodorotlenku sodu i kwasu solnego może powodować reakcje skórne i należy się z nimi obchodzić w rękawiczkach.
  2. Przygotowanie buforu hydracyjnego (PGG)
    1. Odessać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do strzykawki i wyposażyć koniec w filtr strzykawkowy z polieterosulfonu o wielkości porów 0,2 μm. Przefiltruj PBS do czystej plastikowej probówki wirówkowej z pokrywką.
      UWAGA: Filtry strzykawkowe z porami 0,2 μm z alternatywnych materiałów membranowych (na przykład polifluorku winylidenu) mogą być stosowane, o ile membrana jest kompatybilna z PBS i octanem amonu.
    2. Połącz przefiltrowany PBS, glikol propylenowy i glicerol za pomocą mikropipety w stosunku objętościowym 8:1:1, aby uzyskać bufor hydratacyjny (określany również jako PGG). Podczas dodawania glikolu propylenowego i glicerolu należy odessać i zetrzeć wszelkie pozostałe kropelki glikolu propylenowego lub glicerolu z powierzchni końcówki pipety, a następnie powoli pipetować odczynnik do PBS. W PBS.
      zaobserwowane będzie wyraźne zmętnienie lepkie przypominające strunę. UWAGA: Zaleca się użycie mikropipety p1000, aby najpierw dodać PBS do probówki wirówkowej, a następnie glikol propylenowy i glicerol, ponieważ te dwa ostatnie odczynniki są lepkie. W związku z tym należy je powoli zasysać za pomocą mikropipety, aż do momentu, gdy ruch płynu w końcówce pipety przestanie być widoczny i tak, aby po wyjęciu końcówki pipety z odczynnika nie było pobierane powietrze. Końcówki do mikropipet z oznaczeniami wolumetrycznymi powinny być najlepiej używane do wybierania objętości odczynników, które są zgodne z takimi oznaczeniami (na przykład wykonanie 1 ml lub 5 ml PGG i odpowiednio użycie oznaczenia 0,1 ml lub 0,5 ml na końcówce mikropipety w celu wizualizacji całkowitego zasysania glikolu propylenowego i glicerolu). Podczas wycierania powierzchni końcówki mikropipety, Nie wycierać otworu końcówki, tylko po bokach.
    3. Pipetować w górę i w dół, zanurzając końcówkę pipety w roztworze, aż odczynniki zostaną jednorodnie rozpuszczone. Należy uważać, aby nie wprowadzić do roztworu żadnych pęcherzyków powietrza.
    4. Aby dodatkowo zapewnić kompletną mieszaninę buforu hydratacyjnego, zakryj probówkę wirówkową i powoli obracaj w górę iw dół. Nie wirować.
    5. Wiruj rurkę przy mniej niż 1000 x g przez 20-30 s (minimalna temperatura 4 °C, maksymalna RT), aby usunąć niewidoczne pęcherzyki powietrza.
  3. Przygotować bufor do nawadniania/znakowania radioaktywnego (AA-PGG)
    1. Filtr strzykawkowy 0,1 M, bufor octanu amonu o pH 5,5 (od kroku 1.1) i PBS do oddzielnych probówek zgodnie z krokiem 1.2.1.
    2. Połączyć przefiltrowany bufor octanu amonu, przefiltrowany PBS, glikol propylenowy i glicerol za pomocą mikropipety p1000 do probówki wirówkowej w buforze octanu amonu w proporcji 5:3:1:1: PBS: glikol propylenowy: stosunek objętościowy glicerolu w podanej kolejności. Postępuj zgodnie z instrukcjami zasysania, mieszania i wirowania zgodnie z krokami 1.2.2-1.2.5, aby uzyskać AA-PGG.
  4. Eluent metodą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej (iTLC)
    1. Odważyć do 0,1 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i przenieść do fiolki z nakrętką. Rozpuścić w ddH2O tak, aby uzyskać 2% w/v roztwór EDTA (na przykład dla 50 mg EDTA dodać 2,5 ml ddH2O).
    2. Połączyć 2% w/v roztwór EDTA z buforem octanu amonu z kroku 1.1 w stosunku 9:1 v/v (90% roztwór EDTA, 10% bufor octanu amonu). Pokryć pokrywką i przechowywać powstały eluent iTLC.

2. Tworzenie się filmów lipidowych

UWAGA: Ta procedura opisuje tworzenie filmu lipidowego z kompozycjami naśladującymi komercyjną mikropęcherzyk, Definity®, z porfiryną-lipidem zastępującym lipid gospodarza i stanowiącym 30% mol% całkowitego lipidu. Jednak protokół znakowania radioaktywnego może być stosowany do różnych preparatów lipidowych (długości łańcuchów C16, C18, C22, ładunek obojętny lub anionowy, różny skład molowy porfiryny i lipidów). W załączeniu znajduje się Uzupełniający Arkusz Kalkulacyjny (Plik Uzupełniający 1), który zawiera obliczenia, składy, masy i objętości zapasów dla opisanych i innych preparatów. Wszystkie lipidy są dostępne na rynku, z wyjątkiem lipidu porfirynowego, pirofeoforbidu-a-lipidu (pyro-lipidu), którego synteza została wcześniej szczegółowo opisana35,36.

  1. Korzystając z pliku uzupełniającego 1, określ całkowitą masę potrzebną dla każdego lipidu na podstawie wymaganej liczby warstw.
  2. Zważyć pustą szklaną fiolkę o pojemności 0,5 dram na wadze analitycznej.
    UWAGA: Pył przeszkadza w pomyślnym tworzeniu się mikropęcherzyków. W związku z tym należy wdmuchnąć sprężone powietrze do fiolki, aby usunąć wszelkie kurze/cząstki stałe, jeśli są przechowywane bez pokrywy.
  3. Zważyć 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DPPC) na papierze wagowym.
    UWAGA: Zważoną masę należy uzyskać z kroku 2.1 plus dodatkowe 0,5-1 mg, aby uwzględnić wszelkie ubytki podczas obchodzenia się z próbką w późniejszych etapach.
  4. Przenieść DPPC do zważonej szklanej fiolki i ponownie zważyć w celu określenia masy lipidów w fiolce. Proces ten pozwala na łatwiejszy transfer lipidów do szklanej fiolki, zmniejszenie utraty/rozlania proszku lipidowego oraz dokładniejszy pomiar masy lipidowej.
  5. Powtórzyć kroki od 2.2 do 2.4 z pozostałymi lipidami: 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminą-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (DPPE-mPEG), 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosforan (DPPA) i C16 pirolipid.
    UWAGA: Jeśli pirolipid nie jest dostępny w postaci proszku do ważenia, ale raczej w postaci filmu lub podwielokrotności o nieznanej ilości, można go rozpuścić w chloroformie, tworząc podstawę, której stężenie można obliczyć za pomocą pomiarów absorbancji UV-Vis w metanolu przy użyciu prawa Beera-Lamberta, jak opisano wcześniej35.
  6. Za pomocą mikropipet lub szklanych strzykawek przygotować następujące rozpuszczalniki organiczne i roztwory w szklanych probówkach: 1) chloroform, 2) chloroform 9:1 v/v: metanol i 3) 65:35:8 chloroform:metanol:ddH2O. Na koniec odpipetuj składniki i wymieszaj je w następującej kolejności: ddH2O, metanol, następnie chloroform.
    UWAGA: Metanol i chloroform stanowią zagrożenie dla zdrowia, są łatwopalne i lotne. Nosić okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny oraz używać okapu wyciągowego.
  7. Użyj pliku uzupełniającego 1, aby obliczyć objętość rozpuszczalnika/roztworu organicznego potrzebnego do wytworzenia zapasów lipidowych i wybierz szklane strzykawki o odpowiednich objętościach.
    UWAGA: Ta objętość powinna dawać stężenia podstawowe odpowiadające 15-100 μl podwielokrotnych objętości na folię, które można łatwo zmierzyć za pomocą szklanych strzykawek mikrolitrowych o pojemności 25-100 μl.
  8. Przepłukać szklane strzykawki trzykrotnie chloroformem. Pompować tłok w przód i w tył, aby wysuszyć strzykawkę.
  9. Odmierzyć i dodać rozpuszczalnik/roztwory organiczne za pomocą oczyszczonej szklanej strzykawki do poszczególnych fiolek z lipidami zgodnie z obliczeniami w arkuszu kalkulacyjnym w kroku 2.7, aby utworzyć zapas lipidów. Rozpuścić pirolipid w chloroformie (chyba że został już rozpuszczony zgodnie z uwagą dotyczącą kroku 2.5), DPPC i DPPE-mPEG w chloroformie 9:1 v/v: metanol i DPPA w chloroformie 65:35:8 chloroform:metanol:ddH2O. Jeśli używasz tej samej szklanej strzykawki do wszystkich dodatków, spłucz i wysusz między poszczególnymi lipidami.
    UWAGA: Jeśli wybrany preparat nie zawiera DPPA lub jego wariantu długości łańcucha C18, wówczas pirolipid, lipid PC gospodarza i lipid PEG można rozpuścić w chloroformie.
  10. Zakręć fiolki i zawiruj.
  11. Dodać obliczone objętości podstawowych roztworów lipidowych do nowej szklanej fiolki o pojemności 0,5 dram (fiolki z folią) za pomocą szklanej strzykawki o pojemności mikrolitrów. W celu pobrania pierwszego zapasu lipidów należy wprowadzić końcówkę igły w dolną środkową część fiolki i powoli zanurzać, aby uniknąć rozpryskiwania się ścianek fiolki. W celu kolejnego dodania należy umieścić końcówkę igły bezpośrednio nad poziomem płynu i dotknąć boku fiolki, aby usunąć ostatnie krople w taki sposób, aby igła nie była narażona na działanie płynu znajdującego się poniżej.
    UWAGA: Wypłucz i osusz szklaną strzykawkę między dodatkami lipidów, gdy dojdzie do zanieczyszczenia. W przypadku tworzenia wielu folii, należy zakryć zarówno fiolki z folią, jak i zapasami między dodatkami, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalnika.
  12. Delikatnie obracać fiolkę ręcznie w pozycji pionowej, aby wymieszać zawartość. Należy unikać rozpryskiwania roztworu na ściankach fiolki.
  13. Odkręcić nakrętkę (przechowywać nakrętkę) i wprowadzić przewód azotowy do przestrzeni nad roztworem fiolki. Dostosuj przepływ azotu, aby spowodować lekkie widoczne zakłócenia na powierzchni cieczy, ale bez lejków lub rozprysków.
  14. Odwirować fiolkę natychmiast po włożeniu przewodu azotowego. Rozpocząć od małej prędkości wystarczającej do utworzenia lejka z rozpuszczalnikiem wznoszącym się nie wyżej niż 1 cm od dna fiolki. Unikaj rozpryskiwania rozpuszczalnika. Gdy rozpuszczalnik odparowuje, zwiększaj prędkość wiru powoli i bez przerwy, utrzymując wysokość rozpuszczalnika, aż cała ciecz odparuje. Rezultatem będzie cienka warstwa pokryta w dolnej jednej trzeciej fiolki.
  15. Umieścić fiolkę w eksykatorze wyposażonym w próżnię i kontynuować suszenie filmu w próżni przez 8-72 godzin. Przykryj fiolkę (z wyjątkiem otworu) lub eksykator folią aluminiową.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Kolejne kroki można wykonać po wysuszeniu folii lub folie można przechowywać w atmosferze argonu, uszczelnione Parafilmem, w zamrażarce w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca i dłużej, jeśli są przechowywane w stanie suchym.

3. Nawilżenie filmu lipidowego

UWAGA: Jeśli mikropęcherzyki są używane in vitro lub in vivo, użyj sterylnych końcówek do mikropipet, probówek, strzykawek i igieł w krokach od 3.3 do 5.4, chyba że określono inaczej.

  1. Wyjmij folię z odkurzacza lub, jeśli jest przechowywana w zamrażarce, pozwól jej ogrzać się do temperatury pokojowej.
  2. Napełnij zlewkę o pojemności 250 ml wodą i podgrzej ją do temperatury 70-80 °C.
  3. Podgrzej sonikator łaźni wodnej do temperatury 69 °C.
  4. Mikropipetę 1 ml AA-PGG (krok 1.3) przesunąć wzdłuż krawędzi fiolki z filmem lipidowym, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
    UWAGA: Podczas wytwarzania niechelatowanych mikropęcherzyków kontrolnych lub fluorescencyjnych należy użyć PGG (krok 1.2) zamiast AA-PGG.
  5. Częściowo zakryć otwór fiolki nakrętką, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na wprowadzenie przewodu perfluoropropanu (PFP). Wlać PFP do przestrzeni nad fiolką na 20 s nad płynem, tak aby płyn był widocznie zakłócony, ale nie rozpryskiwał się. Nie należy wlewać PFP bezpośrednio do zawiesiny. Zakręć fiolkę.
    UWAGA: Jeśli przepływ jest odpowiedni pod względem siły i czasu, fiolka zacznie stygnąć w dotyku.
  6. Zanurzyć dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 70-80 °C na 1 minutę. Następnie sonikować przez co najmniej 30 s w sonikatorze kąpielowym o temperaturze 69 °C lub do momentu, gdy film lipidowy rozproszy się jednorodnie w AA-PGG. Należy unikać tworzenia pęcherzyków lub przedwczesnej aktywacji tworzenia się mikropęcherzyków (przedwczesna aktywacja objawi się mlecznymi/mętnymi obszarami w zawiesinie lipidów). W razie potrzeby należy wytrzeć powierzchnię fiolki, aby lepiej rozpoznać, czy pozostały jakiekolwiek niezawieszone lipidy.
    UWAGA: Jeśli film lipidowy nie uwodni się w ciągu 1 minuty od sonikacji, ponownie podgrzej w łaźni o temperaturze 70-80 °C i ponownie sonikat.
  7. Gdy film lipidowy zostanie jednorodnie zawieszony, podgrzej po raz ostatni przez 1 minutę i sonikuj przez dodatkowe 30 sekund.
  8. Wytrzeć fiolkę i pozostawić do pasywnego ostygnięcia do temperatury (~5-10 min).
  9. Uzupełnij przestrzeń nad fiolką PFP zgodnie z krokiem 3.5, nakręć nakrętkę i uszczelnij krawędzie nakrętki Parafilm.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu i wznowić go nie później niż po 8 godzinach.

4. Radioznakowanie

UWAGA: Dla niechelatowanej kontroli lub mikropęcherzyków tylko fluorescencyjnych, przejdź do sekcji 5 protokołu.

UWAGA: Wykonaj kroki 4.4-4.6 tego protokołu w laboratorium radioaktywnym, chyba że określono inaczej. Rozdział 64CuCl2 stanowi zagrożenie radiologiczne stwarzające ryzyko toksyczności wieloukładowej poprzez narażenie na działanie skóry, wdychanie lub spożycie. Jeśli to możliwe, należy obchodzić się z nim w dygestoriach pośrednio za pomocą kleszczy z gumową końcówką. Podczas obsługi należy nosić ochronny fartuch laboratoryjny, osobisty pierścionek i dozymetr z odznaką oraz podwójną rękawicę. Upewnij się, że 64CuCl2 jest obsługiwany przez 2-calową osłonę ołowiu. W razie potrzeby przetransportuj go w pojemniku z ołowianą osłoną. Osłoń pojemniki na odpady i przeprowadź badanie operacyjne pod kątem zanieczyszczenia po użyciu.

  1. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 60 °C w szklanej zlewce lub dużym naczyniu krystalizującym zawierającym mieszadło magnetyczne. Użyj płyty do podgrzewania/mieszania o kontrolowanej temperaturze, wyposażonej w sondę termiczną włożoną do wody, ustawioną na mieszanie z szybkością, która daje słaby, ale widoczny lejek.
  2. Przenieść szczelnie zapieczętowaną fiolkę zawierającą 64CuCl2 w 0,1 N HCl do kalibratora dawki za pomocą kleszczyków z gumową końcówką.
    UWAGA: Zamawiając 64CuCl2, należy poprosić o rozpuszczenie go w 5-20 μl 0,1 N HCl. Mniejsza objętość ma kluczowe znaczenie dla zachowania wydajności mikropęcherzyków.
  3. Zwróć uwagę na aktywność miedzi-64 zmierzoną na kalibratorze dawki i czas. Wyjąć fiolkę za pomocą kleszczy i umieścić ją w ołowianym pojemniku.
  4. Podzielić aktywność odnotowaną przez objętość zgłoszoną dla 64CuCl2, aby uzyskać wartość MBq·mL-1.
  5. Odkorkować zawiesinę lipidową z kroku 3.9 i umieścić ją w uchwycie na fiolkę.
  6. Odkręcić fiolkę 64CuCl2 i zabezpieczyć ją kleszkami.
  7. Mikropipetą objętość 64CuCl2 roztworu odpowiadającą 40-250 MBq aktywności i przenieść do zawiesiny lipidowej. Upewnij się, że końcówka pipety jest zanurzona w zawiesinie. Zanurz, a następnie pipetować w górę i w dół, aby całkowicie przenieść 64CuCl2,
    UWAGA: Ilość dodanych 64CuCl2 będzie zależeć od zamierzonego zastosowania mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie oraz czułości kalibratora dawki. W przypadku podłużnego (do 48 godzin po wstrzyknięciu) PET i pobierania krwi in vivo u myszy zaleca się co najmniej 220 MBq i 50 MBq.
  8. Zakryj zarówno zawiesinę lipidów, jak i 64fiolki CuCl2.
  9. Używając płaskich kleszczyków z gumową końcówką, ręcznie obróć radioaktywną zawiesinę lipidową w górę iw dół co najmniej 5 razy, aby delikatnie wymieszać 64CuCl2 przez zawiesinę. Należy unikać potrząsania lub upuszczania fiolki oraz tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  10. Kierując się prawą stroną do góry, delikatnie przesunąć nakrętkę fiolki, utrzymując zawiesinę w stabilnym położeniu. Pomoże to wszelkim płynom uwięzionym w nasadce przedostać się na dno fiolki. Ostrożnie częściowo odkręcić fiolkę i wprowadzić 18 G linię PFP wyposażoną w igłę. Napełnić przestrzeń nad fiolką PFP przez 20 sekund, jak opisano w kroku 3.5. Zakryć fiolkę i zapieczętować folią Parafilm.
  11. Zmierzyć aktywność fiolki na kalibratorze dawki i zanotować czas.
    UWAGA: Jeśli do fiolki nie została przeniesiona odpowiednia aktywność, powtórzyć kroki 4.5-4.11, dodając odpowiednią dodatkową objętość 64CuCl2.
  12. Umieścić fiolkę w piankowym uchwycie na fiolkę i przepchnąć przez nią tak, aby dolna połowa fiolki była wystawiona na działanie ciepła. Umieścić uchwyt w mieszającej łaźni wodnej o temperaturze 60 °C i podgrzewać przez 1 godzinę.
  13. Podczas gdy następuje reakcja chelatacji, przygotuj płytki iTLC. Zakładając świeże rękawice, pokrój bibułę chromatograficzną z mikrofibry szklanej na paski o wymiarach 1 cm x 8 cm. Podgrzej paski w piecu do suszenia szkła o temperaturze 80 °C.
    UWAGA: Ten krok można wykonać w laboratorium nieradioaktywnym.
  14. Po upływie 1 godziny zdjąć fiolkę z kroku 4.12 z ognia i przetrzeć brzegi chusteczką.
  15. Obracać fiolkę ręcznie w górę i w dół za pomocą kleszczyków z gumową końcówką, aby ponownie skondensować kondensację na ściankach fiolki do zawiesiny lipidowej.
  16. Trzymając fiolkę w pozycji pionowej, przesunąć nakrętkę, jednocześnie stabilizując probówkę. Usuń Parafilm i przetrzyj wokół nakrętki, aby usunąć uwięzioną wodę do kąpieli.
  17. Ostrożnie odkręcić fiolkę i odessać 1-2 μl zawiesiny lipidowej. Umieścić zawiesinę w odległości 1 cm od dolnej środkowej części paska iTLC i ponownie nakręcić fiolkę. Pozostaw miejsce do wyschnięcia.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby na mieszaninę reakcyjną wykryto co najmniej 2 iTLC i dla pewności opracowano je dla uzyskania pewności w postaci znakowanej radioizotopem zawiesiny lipidowej.
  18. Mikropipetę 200 μl eluentu iTLC (przygotowanego w kroku 1.4) na dno probówki o pojemności 10 ml. Umieść probówkę w ołowianym pojemniku. Dodaj nakrapiany iTLC do probówki i pozwól, aby pasek się rozwinął, aż eluent znajdzie się około 1 cm od górnej krawędzi paska.
  19. Usuń rozwinięte paski iTLC za pomocą kleszczy. Trzymaj pasek pionowo i pokrój na trzy części na okrągłych probówkach o pojemności 5 ml kompatybilnych z γ blatem i nasadką typu push, tak aby każda trzecia część paska wpadała bezpośrednio w pojedynczą trzecią. Włóż zaślepki do trzech probówek.
  20. Zmierz probówki zawierające pasek i pustą/zaślepioną probówkę kontrolną na liczniku γ pod kątem aktywności miedzi-64 i zapisz związane z tym zliczenia na minutę (cpm). Odejmij aktywność rurki kontrolnej od innych odczytów, aby skorygować aktywność tła.
    UWAGA: Skorygowane odczyty dla dolnej jednej trzeciej paska (element 1) są związane z cząstkami miedzi-64 schelatowanymi do zawiesiny lipidowej. Środkowa część (część 2) zawiera pasmo wolnych chelatów miedzi-64 i 64Cu-pirolipidowych w formie niesupramolekularnej. Górna część (część 3) zawiera głównie wolną miedź-64.
  21. Obliczać czystość radiochemiczną za pomocą równania 1.
    figure-protocol-1 (Równanie 1)
    UWAGA: jeśli cpm dla części 1 wydaje się nieracjonalnie niska (na przykład niższa lub równoważna częściom 2 lub 3) lub jeśli jakiekolwiek odczyty są powyżej progu nieliniowego/nasycenia licznika γ, należy zwrócić uwagę na mniejszą objętość lub rozcieńczoną podwielokrotność (1-2 μl) znakowanej radioizotopem zawiesiny dla iTLC.
  22. Upewnij się, że czystość radiochemiczna uzyskana z obu pasków iTLC na zawiesinę lipidową wynosi ≥ 94%, aby można było kontynuować. Jeśli nie, kontynuuj podgrzewanie zawiesiny lipidowej w temperaturze 60 °C i monitoruj chelatację w odstępach 30-minutowych za pomocą iTLC.
  23. Odkręcić fiolkę z zawiesiną lipidową znakowaną radioizotopem i mikropipetę 8,89 μl 1 N NaOH do zawiesiny, pipetując w górę i w dół, aby całkowicie przenieść bazę i zneutralizować zawiesinę. Zakręć fiolkę, obróć ręcznie kleszczami, aby odwrócić/cofnąć, a następnie delikatnie postukać w nasadkę fiolki.
  24. Wypełnij przestrzeń nad głową PFP zgodnie z krokiem 4.10, zakryj i uszczelnij Parafilmem.

5. Aktywacja i izolacja mikropęcherzyków

  1. Aktywuj zawiesinę lipidową za pomocą mechanicznej wytrząsarki do fiolek przez 45 s przy 4530 obr./min, aby wytworzyć mleczną zawiesinę mikropęcherzyków. Pozostawić fiolkę do pasywnego ostygnięcia do temperatury rynkowej przez około 10 minut. Powstała mleczna zawiesina z czasem rozpadnie się na dwie warstwy.
    UWAGA: Zawartość fiolki powinna wyglądać na mleczną po aktywacji. Wyraźniejsze zawieszenie po aktywacji wskazuje na nieudaną aktywację, do której przyczynienie się zostanie omówione w dalszych sekcjach.
  2. Po osiągnięciu RT delikatnie odwrócić/odwrócić fiolkę, aby ponownie zawiesić zawiesinę mikropęcherzyków. Umieść fiolkę na płaskiej powierzchni i odczekaj 2 minuty przed dekantacją, aby uzyskać pożądaną populację mikropęcherzyków w następujący sposób:
    1. Wyposażyć plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml w igłę 18 G i odpowietrzyć strzykawkę/igłę, zasysając i wdmuchując powietrze. Po upływie 2 minut szybko odkręć fiolkę, zrywając plombę Parafilm jednym ruchem.
    2. Pobrać 400-550 μl z dna fiolki (docelowa populacja mikropęcherzyków), unikając zasysania górnej warstwy pianki w przypadku większych niepożądanych populacji mikropęcherzyków.
      UWAGA: W razie potrzeby przechylić fiolkę na bok, aby zebrać końcowe objętości do strzykawki, aby uniknąć zasysania warstwy spienionej/lżejszej.
  3. Ostrożnie wytrzeć krawędzie igły, aby usunąć wszelkie pieniste zanieczyszczenia i przenieść wyizolowaną zawiesinę mikropęcherzyków do probówki do mikrowirówki. Delikatnie nasadkę (nie otwieraj jej gwałtownie ani nie zamykaj). Jest to końcowa zawiesina robocza mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie.
  4. Zmierzyć aktywność końcowego produktu z mikropęcherzykami na kalibratorze dawki i zanotować czas. Podzielić tę wartość przez objętość zawiesiny zdekantowanej w kroku 5.2, aby uzyskać wartość MBq·mL-1 w celu obliczenia objętości iniekcji w zależności od interesującego zastosowania.
    UWAGA: Mikropęcherzyki znakowane radioaktywnie są teraz gotowe do użycia. Sekcja 6 może być wykonana do 24 godzin później. Aby uzyskać informacje na temat tego, w jaki sposób te znakowane radioaktywnie mikropęcherzyki mogą być wstrzykiwane i śledzone in vivo za pomocą obrazowania multimodalnego (ultradźwięki, PET, fluorescencja), patrz Rajora et al.15.

6. Walidacja skuteczności znakowania radioaktywnego

  1. Zawiesić zawiesinę mikropęcherzyków poprzez delikatne pipetowanie lub odwrócenie fiolki.
    UWAGA: Nigdy nie wiruj produktu działającego z mikropęcherzykami. Wirowanie destabilizuje zawiesiny mikropęcherzyków.
  2. Dodać 10-200 μl znakowanej radioizotopem zawiesiny do 0,5 ml 30 000 masy cząsteczkowej (MWCO) wirówki filtrującej. W przypadku stosowania objętości <200 μl, dodać ddH2O do jednostki filtrującej, aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl. Umieść jednostkę filtrującą w kompatybilnej probówce do mikrowirówki i nasadce.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie testu znakowania promieniotwórczego przed i oddzielnie od jakiegokolwiek zastosowania mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie in vitro lub in vivo, aby zapewnić pomyślne wypełnienie protokołu. W takim przypadku na tym etapie można użyć większej objętości (np. 200 μl). Gdy protokół jest następnie stosowany podczas sesji terapeutycznej, należy najpierw przygotować objętości leczenia/zastrzyki, a następnie jak najwcześniej przeprowadzić sekcję 6 z pozostałą zawiesiną mikropęcherzyków znakowaną radioaktywnie.
  3. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g przy RT.
    UWAGA: mikrowirówka powinna być otoczona ołowianą osłoną.
  4. Przetnij nożyczkami połączenie między rurką mikrowirówki a jej nasadką.
    1. Umieścić nakrętkę w 20 ml fiolce scyntylacyjnej oznaczonej jako "nakrętki". Przenieść jednostkę filtrującą do nowej probówki do mikrowirówki (probówka 2).
    2. Umieścić pierwszą probówkę do mikrowirówki z infranatantem w 20 ml fiolce scyntylacyjnej oznaczonej "probówka 1". Dodać 200 μl ddH2O do jednostki filtrującej w probówce 2.
  5. Odwirować jednostkę filtrującą w probówce 2 przy 12 000 x g przy temperaturze pokojowej.
  6. Powtórz kroki 6.4 i 6.5. Dodać nasadkę z probówki 2 do fiolki scyntylacyjnej "caps", w której znajduje się nasadka z probówki 1. Umieścić probówkę 2 w nowej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
  7. Odciąć nakrętkę trzeciej probówki do mikrowirówki i umieścić w fiolce z "nakrętkami" zgodnie z krokiem 6.4. Przenieść jednostkę filtrującą do nowej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml oznaczonej jako "jednostka", upewniając się, że infranatant pozostaje w probówce 3 i nie jest przenoszony do fiolki "jednostkowej". Jeśli na krawędziach jednostki filtrującej widoczne są krople, włóż ją z powrotem do rurki 3, nakręć i wiruj w dół przez 10 sekund. Umieścić probówkę 3 w nowej szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml.
  8. Zakręć 5 fiolek scyntylacyjnych (probówka 1, probówka 2, probówka 3, kapsle i jednostka). Przygotować jedną pustą i zakrytą 20 ml fiolkę scyntylacyjną jako ślepą próbę.
  9. Zmierz sześć fiolek scyntylacyjnych na liczniku γ pod kątem aktywności miedzi-64. Odjąć aktywność ślepej próby fiolki od aktywności innych fiolek. Obliczyć skuteczność znakowania radioizotopowego/chelatacji za pomocą równania 2.
    figure-protocol-2 (Równanie 2)
    UWAGA: Jeśli jednostka cpm jest nadmiernie niska (np., niższa lub równoważna z probówkami) lub jeśli jakiekolwiek odczyty są powyżej progu nieliniowego/nasycenia licznika γ, należy przechowywać fiolki scyntylacyjne w ołowianych pojemnikach do 4 dni, aby umożliwić spadek aktywności, aż wartości spadną poniżej progu i ponownie zmierzyć.

7. Charakterystyka fizykochemiczna mikropęcherzyków

UWAGA: O ile laboratorium nie posiada wyznaczonego sprzętu do przetwarzania próbek radioaktywnych, charakterystyka fizykochemiczna mikropęcherzyków musi być przeprowadzona przy użyciu nieradioaktywnych, "zimnych" próbek chelatowanych miedzią. To "zimne" etykietowanie ułatwia ocenę wydajności mikropęcherzyków, co ma zasadnicze znaczenie dla oceny dawki mikropęcherzyków stosowanych do zamierzonego zastosowania. Dodatkowo pozwala na porównanie z kontrolnymi nieschelatowanymi mikropęcherzykami, aby zapewnić, że proces znakowania radioaktywnego nie zaburza właściwości mikropęcherzyków. To "zimne" znakowanie i związana z nim charakterystyka fizykochemiczna powinny mieć miejsce przed zastosowaniem mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie i mogą być wykorzystane jako informacja zwrotna, jeśli wymagane są modyfikacje znakowania radioaktywnego (patrz Dyskusja).

  1. "Zimne" etykietowanie mikropęcherzykami miedzi
    1. Korzystając z objętości roztworu 64CuCl2 dodanego do zawiesiny lipidowej w kroku 4.7, % składu molowego porfiryny w warstwach lipidowych i aktywności właściwej stwierdzonej na karcie produktu 64CuCl2, należy obliczyć przybliżony stosunek molowy metal/porfiryna uzyskany podczas znakowania radioizotopowego. Przykładowe obliczenia można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.
    2. Postępuj zgodnie z sekcjami 1-3 aktualnego protokołu.
    3. Przygotować roztwór 0,1 mg·mL-1 CuCl2 w 0,1 N HCl.
    4. Wprowadzić do mikropipety odpowiednią objętość roztworu CuCl2 do zawiesiny lipidowej, obliczonej zgodnie z krokiem 7.1.1, a następnie zakryć fiolkę.
    5. Obrócić fiolkę, aby wymieszać CuCl2 z zawiesiną lipidową, wypełnić przestrzeń nad głową PFP, uszczelnić i podgrzać zgodnie z krokami 4.9, 4.10 i 4.12. Gumowe kleszczyki nie są potrzebne do przenoszenia fiolek.
    6. Po 1 godzinie zdjąć fiolkę z ognia i wytrzeć ją do wyschnięcia. Pozostawić fiolkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    7. Zneutralizować zawiesinę lipidową, wymieszać, wypełnić przestrzeń PFP i uszczelnić zgodnie z krokami 4.23 i 4.24.
    8. Aktywować zawiesinę mikropęcherzyków i zdekantować w celu uzyskania działającego produktu zgodnie z krokami 5.1-5.3.
  2. Rozmiary mikropęcherzyków
    UWAGA: Wymiarowanie mikropęcherzyków należy przeprowadzić natychmiast po aktywacji. W przypadku oceny stabilności zawiesiny roboczej należy powtórzyć przygotowanie próbki i pomiary w odstępach 30-minutowych. Zazwyczaj okno 1-2 godzin jest reprezentatywne dla ram czasowych, w których zawiesina robocza mikropęcherzyków byłaby używana/podawana po aktywacji. Celem pomiarów stabilności jest zapewnienie utrzymania wielkości i wydajności mikropęcherzyków w tym przedziale czasowym, tak aby wszystkie zabiegi podawane z roztworu roboczego zawierały podobne populacje mikropęcherzyków.
    1. Włącz licznik redlic (CC) i ustaw następujące parametry za pomocą narzędzia Edytuj SOP: apertura 30 μm, zakres wielkości 0,6-18 μm, prąd apertury 400-600 μA, wzmocnienie przedwzmacniacza 4-8, 400 pojemników, płukanie przed i po każdym przebiegu, analiza objętościowa, objętość próbki 5 μl.
    2. Przefiltruj elektrolit CC przez jednostkę filtracji próżniowej 0,2 μm. Napełnij pojemnik na elektrolit i oddzielny pojemnik do przygotowania próbki.
    3. Pomiar tła: Napełnij jednorazową kuwetę o pojemności 10 ml filtrowanym elektrolitem o pojemności 10 ml i przeprowadź pomiar podstawowy. Upewnij się, że liczba jest mniejsza niż 400. Jeśli nie, przepłucz instrument.
    4. Pomiar próbki
      1. Dodaj 10 ml przefiltrowanego elektrolitu do nowej kuwety. Ponownie zawiesić mikropęcherzyki, ręcznie odwracając/odwracając. Mikropipeta 5 μl od dolnej środkowej części fiolki. Wytrzyj krawędzie końcówki pipety (z wyjątkiem otworu) i zanurz próbkę bezpośrednio w przygotowanym elektrolicie.
      2. Pipetować w górę i w dół, aby całkowicie przenieść zawiesinę. Za pomocą końcówki pipety delikatnie zamieszaj elektrolit, aż "kosmyki" zawiesiny mikropęcherzyków zostaną rozproszone.
    5. Zmierzyć próbkę na CC (dwie serie na analit).
      UWAGA: Objętość próbki mikropęcherzyków 5 μl jest zwykle odpowiednia dla próbek zawierających 1-5 x 109 mikropęcherzyków · mL-1. Ta objętość próbki może wymagać dostosowania w zależności od konkretnej konfiguracji przyrządu CC i jeśli wydajność mikropęcherzyków próbki wykracza poza powyższy zakres.
  3. Obrazowanie konfokalne
    UWAGA: Obrazowanie konfokalne należy przeprowadzić natychmiast po doborze wielkości mikropęcherzyków i w ramach czasowych zachowanej stabilności mikropęcherzyków, zgodnie z uwagą w kroku 7.2.
    1. Zawiesić zawiesinę mikropęcherzyków i przenieść 1-5 μl na środek szklanego szkiełka mikroskopowego. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na kropelkę zawiesiny mikropęcherzyków, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza. Zawiesina rozprowadzi się pod szkiełkiem nakrywkowym.
    2. Zobrazuj mikropęcherzyki w 60-krotnym powiększeniu za pomocą obiektywu zanurzeniowego w olejku. Uzyskuj obrazy w jasnym polu i poniżej 633 nm wzbudzenia/emisji 640-765 nm. Nałóż na siebie obrazy jasnego pola i fluorescencji.
      UWAGA: Sygnał fluorescencyjny powinien nakładać się na powłokę wszystkich widocznych cząstek, gdy sonda jest jednorodnie wbudowana w powłokę mikropęcherzyków.
  4. Spektrofluorometria
    UWAGA: Pomiary spektrofluorometryczne można przeprowadzić w ciągu 24 godzin od aktywacji mikropęcherzyków.
    1. Przygotuj 1% Triton X-100 zgodnie z wcześniejszym opisem35.
    2. Włącz spektrofluorometr 15-30 minut przed pierwszym pomiarem.
    3. Zmierz widma fluorescencji 1% Triton X-100 przy użyciu wzbudzenia 410 nm i zakresu emisji 600-800 nm w kuwecie kwarcowej. Wybierz opcję normalizacji sygnału przez sygnał detektora odniesienia (często określany jako S1/R1).
      UWAGA: Triton X-100 łatwo bąbelkuje podczas pipetowania. W związku z tym podczas przenoszenia do kuwety zanurzaj tylko do pierwszego ogranicznika mikropipety.
    4. Przepłukać kuwetę metanolem i osuszyć powietrzem pod ciśnieniem pomiędzy próbkami.
    5. Przenieś 6 ml 1% Triton X-100 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zawiesić zawiesinę mikropęcherzyków i odessać 1 μl za pomocą mikropipety. Wytrzyj krawędzie końcówki pipety z wyjątkiem otworu i przenieś próbkę do przygotowanego 1% Triton X-100, pipetując w górę i w dół, aby zakończyć przenoszenie. Zwiruj roztwór i przenieś go do kuwety kwarcowej.
      UWAGA: Dostosuj stosunek próbki: 1% Triton X-100 zgodnie z czułością instrumentu i nieliniowym progiem nasycenia.
    6. Zmierz tę próbkę, używając parametrów podanych w kroku 7.4.3. Pomiar ten odpowiada cząstkom "rozerwanym".
    7. Powtórz kroki 7.4.3-7.4.6 przy użyciu PBS. Pomiar ten odpowiada cząstkom "nienaruszonym".
    8. Skoryguj linię bazową zakłóconych i nienaruszonych widm próbki, używając odpowiednio 1% pomiarów Triton X-100 i PBS.
    9. Obliczyć wydajność hartowania (QE) za pomocą równania 3 przy użyciu zintegrowanego sygnału fluorescencji skorygowanego o linię bazową nienaruszonej próbki w PBS (FPBS) i w 1% Triton X-100 (FTx):
      figure-protocol-3 (Równanie 3)
  5. Spektroskopia UV-VIS
    UWAGA: Pomiary spektroskopowe można przeprowadzić do 72 godzin po aktywacji mikropęcherzyków.
    1. Sonikować podwielokrotność zawiesiny mikropęcherzyków w probówce do mikrowirówek za pomocą sonografu kąpielowego w temperaturze pokojowej, aż zawiesina stanie się przezroczysta. Zmniejsza to efekty rozpraszania podczas spektroskopii.
    2. Włącz spektrofotometr 10 minut przed pierwszym pomiarem. Wybierz interwał skanowania 0,25 nm i zakres akwizycji 200-800 nm. Włącz odejmowanie linii bazowej.
    3. Do pomiarów użyj kuwety kwarcowej o długości 1 cm. Przepłucz kuwetę metanolem między pomiarami i osusz powietrzem pod ciśnieniem.
    4. Uzyskać podstawowy pomiar metanolu.
    5. Zmieszać sonikowaną, przezroczystą zawiesinę mikropęcherzyków i przenieść 10-50 μl do probówki mikrowirówki zawierającej 200-1000 μl metanolu. Upewnij się, że objętość metanolu została odmierzona i dodana do probówki za pomocą czystej szklanej strzykawki o pojemności mikrolitrów. Odwirować roztwór, aby uzyskać "zakłóconą" próbkę.
      UWAGA: Rozcieńczenie próbki będzie zależało od skuteczności ładowania porfiryną i składu molowego. Rozcieńczenie 20x jest odpowiednie dla kompozycji mikropęcherzyków pirolipidowych o stężeniu 30% mol.
    6. Zbieraj widmo UV-Vis.
    7. Powtórz kroki od 7.5.4 do 7.5.6, używając PBS zamiast metanolu.
      UWAGA: Do pomiaru objętości PBS można użyć mikropipety zamiast szklanej strzykawki mikrolitrowej.

8. Modyfikacje protokołu

  1. Alternatywny chelator
    1. Przygotować warstwy lipidowe zgodnie z sekcją 2, zastępując pirolipid alternatywnym chelatorem miedzi sprzężonym z lipidami (na przykład kwas 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-dietylenotriaminopentaoctowy (sól amonowa), określany dalej jako DTPA-lipid). Użyj pliku uzupełniającego 1, aby obliczyć wymaganą masę i objętości zapasów.
      UWAGA: Testowanie różnych składów molowych alternatywnego chelatora jest prawdopodobnie konieczne w celu określenia górnej granicy, powyżej której nie można wytworzyć stabilnych mikropęcherzyków o wysokiej wydajności.
    2. Postępuj zgodnie z sekcjami od 3 do 6, aby wygenerować i scharakteryzować mikropęcherzyki znakowane radioaktywnie.
    3. Wykonaj kroki od 7.1 do 7.3, aby scharakteryzować "zimne" mikropęcherzyki chelatowane miedzią. Do oceny morfologii cząstek wymagana jest tylko akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej w jasnym polu. Jeśli alternatywnym chelatorem jest fluorescencyjny, oprócz kroków 7.4 i 7.5 należy przeprowadzić mikroskopię konfokalną z powiązanymi długościami fal wzbudzenia i emisji.
  2. Alternatywny fluorofor
    1. Przygotować filmy lipidowe zgodnie z sekcją 2, zastępując pirolipid alternatywnym fluoroforem sprzężonym z lipidami lub interkalującym (np. DiI). Użyj pliku uzupełniającego 1, aby obliczyć wymaganą masę i objętości zapasów.
      UWAGA: Testowanie różnych składów molowych alternatywnego fluoroforu jest prawdopodobnie konieczne w celu określenia górnej granicy, powyżej której nie można wytworzyć stabilnych mikropęcherzyków o wysokiej wydajności.
    2. Postępuj zgodnie z sekcją 3, używając PGG zamiast AA-PGG.
    3. Wykonaj kroki od 5.1 do 5.3 i od 7.2 do 7.5.
  3. Podejście "Spiking": Znakowanie wstępnie uformowanych zawiesin lipidowych z mikropęcherzykami
    1. Wytworzyć film porfirynowo-lipidowy zgodnie z sekcją 2, używając wyłącznie pirolipidów bez innych składników lipidowych. Patrz plik uzupełniający 1 w celu uzyskania informacji na temat ilości pirolipidów.
    2. Uwodnić film pirolipidowy zgodnie z sekcją 3, używając 100-200 μl AA-PGG (lub PGG, jeśli znakowanie radioaktywne nie jest wymagane) zamiast 1 ml buforu hydratacyjnego.
    3. Przenieść całą zawiesinę pirolipidową do wcześniej przygotowanej zawiesiny lipidowej z mikropęcherzykami.
    4. Wypełnić przestrzeń nad roztworem PFP, podgrzać i poddać sonifikacji zawiesinę i uszczelnić pod PFP zgodnie z krokami od 3.4 do 3.9. Monitorować dyspersję zawiesiny pirolipidowej do gotowej zawiesiny mikropęcherzyków lipidowych i przeprowadzać cykle cieplne/sonikacyjne aż do całkowitego rozproszenia.
      UWAGA: W przypadku korzystania z komercyjnej fiolki z mikropęcherzykami z uszczelnioną przegrodą, zawiesinę pirolipidową można wprowadzić do fiolki za pomocą strzykawki/igły bez ponownego napełniania przestrzeni nad fiolką PFP.
    5. Przeprowadzić znakowanie radioaktywne (patrz krok 8.3.5.1 poniżej), aktywację, izolację (patrz UWAGA poniżej) i związaną z tym charakterystykę zgodnie z sekcjami od 4 do 7.
      1. Alternatywnym podejściem jest najpierw znakowanie radioizotopem uwodnionej zawiesiny pirolipidowej, monitorowanie czystości radiochemicznej >94%, neutralizacja 1 N NaOH (modyfikacja objętości zgodnie z objętością AA-PGG użytą do uwodnienia filmu pirolipidowego), a następnie wprowadzenie znakowanej radioaktywnie zawiesiny pirolipidowej do wcześniej przygotowanej zawiesiny lipidowej z mikropęcherzykami zgodnie z krokiem 8.3.3.
        UWAGA: To zmodyfikowane podejście powinno być stosowane do generowania fluorescencyjnych lub multimodalnych mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie tylko wtedy, gdy następuje po nim proces izolacji, który usuwa submikronowe pęcherzyki wielopłytkowe powstałe podczas hydratacji lipidów, ale nie włączone do mikropęcherzyków. Zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowymi wymiernymi wynikami podczas wytwarzania mikropęcherzyków znakowanych radioaktywnie są czystość radiochemiczna i skuteczność znakowania radioaktywnego. Protokół ten wykorzystuje odpowiednio iTLC i zwalidowaną procedurę odśrodkową do scharakteryzowania każdego z nich. Rysunek 2A pokazuje, że średnia czystość radiochemiczna i skuteczność na poziomie ≥95% została osiągnięta w komercyjnych preparatach naśladujących mikropęcherzyki, w których lipid gospodarza został zastąpiony pirolipidem o skład...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół znakowania radiochemicznego mikropęcherzyków lipidowych osiąga czystość radiochemiczną >95%, skuteczność chelatacji >95% i zachowanie właściwości fizykochemicznych mikropęcherzyków bez konieczności oczyszczania po znakowaniu. Osiągnięcia te reprezentują postępy, które wcześniej nie zostały osiągnięte dla istniejących protokołów etykietowania. Brak etapów oczyszczania pozwala na szybsze wykorzystanie izotopów promieniotwórczych (w tym przypadku miedzi-64), a co za tym idzie, zmniejszenie nieefektywnych str...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Deborah Scollard i Teesha Komal (program University Health Network Spatio-Temporal Targeting and Amplification of Radiation Response (STTARR), Toronto, Ontario) za ich usługi techniczne i wskazówki. Dziękujemy również Markowi Zhengowi i dr Alexowi Dhaliwalowi za ich pomoc techniczną podczas mikroskopii konfokalnej oraz Zakładowi Zaawansowanej Mikroskopii Optycznej (Toronto, Ontario) za dostarczenie odpowiedniego sprzętu. Wymieniamy nasze źródła finansowania: Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Instytut Badawczy Terry'ego Foxa, Kanadyjska Rada ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych, Kanadyjska Fundacja na rzecz Innowacji, Fundacja Księżniczki Małgorzaty na rzecz Raka, Kanadyjski Program Katedr Badawczych, Centrum McLaughlin, Program Stypendialny Vanier, Program Stypendialny dla Absolwentów Ontario, Kanadyjski Rak Prostaty oraz Fundacja Charytatywna Peterborough K. M. Hunter.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
64CuCl2Washington University School of Medicine, Mallinckrodt Institute of RadiologyN/AZamówienie w małej objętości (< 10 &mikro; L) rozpuszczony w 0,1 N HCl
Kwas octowy Dowolna firma≥ 95% czystości
Folia aluminiowaDowolna firma
Octan amonuDowolna firmaCzystość: ≥ 98%
Równowaga - analitycznaDowolna firmaMożliwość pomiaru do 0,1 mg
Sonikator do kąpieliDowolna firmaMoże być podgrzany do 69 oC
Otwór CC - 30 mikronówBeckman CoulterA36391Zakres średnic cząstek: 0,6-18 um
Elektrolit CCBeckman Coulter8546719Rozcieńczalnik Isoton II
CC OprogramowanieBeckman CoulterMultisizer 4e
Wirówki filtrujące (0,5 ml 30 000 MWCO) z kompatybilnymi probówkami do mikrowirówekMiliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0,5 ml
Probówki wirówkowe - 15 ml z nakrętkamiDowolna firma
ChloroformDowolna firmaCzystość: ≥ 99,8% 
Licznik redlicBeckman CoulterB43905Multisizer 4e Licznik redlic
Szkiełka nakrywkoweVWR48393081VWR Micro cover glass
CuCl2Dowolna firmaUpewnij się, że nie utlenione
CuCl2
Kuweta - kwarty, długość ścieżki 1 cmDowolna firma
Kuwety - 10 ml tworzywa sztucznego do pomiarów CCBeckman CoulterA35471Coulter Counter Accuvette
ST ddH2ODowolna firmaMożna uzyskać za pomocą ultraczystego systemu oczyszczania wody
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanina)Dowolna firmaForma proszku
Kalibrator dawkiDowolna firmaPotrafi odczytać miedź-64
DPPA (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosforan (sól sodowa))Avanti Polar Lipids830855PForma proszku
DPPC (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina)Avanti Polar Lipids850355PForma proszku
DPPE-MPEG (1,2-dipalmitoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (sól amonowa)))Avanti Polar Lipids880200PPostać proszku
DTPA-lipid (kwas 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-dietytylenotriaminopentaoctowy (sól amonowa))Avanti Polar Lipids790106PProszek w postaci
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Dowolna firma
Licznik gammaDowolna firmaPotrafi odczytać miedź-64
Nasadki do zliczania rurek zliczających gammaGlobe Scientific22-171-665Kołnierzowe zaślepki do probówek 12 mm
Probówki liczące gammaSarstedt55.15795 mL, 75 x 12 mm, PS
Zlewka szklana - 250 mLDowolna firmaWytrzymuje temperatury do 100 oC
Piec do suszenia szkłaDowolna firmaMoże być podgrzewany do 80 oC
Szklane strzykawki mikrolitrowe - 25, 50, 100, 1000 &mikro; LDowolna firmaKompatybilny z rozpuszczalnikami organicznymi
Szklane fiolki scyntylacyjne - 20 mlVWR66022-081VWR® Fiolki scyntylacyjne, ze szkła borokrzemianowego, z nakrętkami, z wkładką z folii celulozowej
Fiolki szklane - 0,5 dramVWR66011-020VWR Fiolka 1/2 dram, z czarną fenolową nakrętką i wkładką z masy celulozowej pokrytej poliwinylem
GlycerolSigma AldrichG7757-1LCzystość:  ≥ 99.0% 
Pipeta z podziałką/pistoletDowolna firma
PłytaWyposażona w sondę temperatury do automatycznej kontroli temperatury
Kwas solny - 0,1 NDowolna firma
Płytki iTLCAgilentA120B12  Bibuła chromatograficzna iTLC-SA
Tkanki laboratoryjneDowolna firma
Media Jednostka filtracji próżniowejDowolna firma0,22 mikrona wielkość porów, membrana PES, pojemność lejka 500 ml
MetanolDowolna firmaCzystość:  ≥ 99,8%, klasa HPLC, spełnia specyfikacje ACS
Probówki do mikrowirówek niesterylne - 1,5 mlDowolna firma
Probówki do mikrowirówek sterylne - 1,5 mlDowolna firma
Mikropipety - p1000, p200, p20, p10Dowolna firmaUpewnij się, że są skalibrowane
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-550-15Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe Wstępnie oczyszczone
igły - 18 GSterylny
ParafilmDowolna firma
PBSSigma AldrichD8537-500MLDPBS, modyfikowany, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
PFPFluoroMedAPF-N40HPCzystość:  ≥ 99,8%
Linia PFPDowolna firmaWąż plastikowy o średnicy 1/4 cala o długości około 50 cm
Regulator PFPSwagelokSS-1RF4 i SS-4HC-1-4
pH-metrDowolna firma
Wzorce pH 4 i 7Dowolna firma
Końcówki do pipet do p1000, p200, p10 - niesterylneDowolna firma
Końcówki do pipet do p1000, p200, p10 - sterylneDowolna firma
Strzykawka plastikowa - 1 mlDowolna firmaSterylne
GlikolpropylenowyBioShopPRO888.500Czystość:  ≥ 99,5%
PirolipidN/AWyprodukowano we własnym zakresie
Kleszcze z gumową końcówkąDowolna firmaZalecana mieszanka krawędzi z cienką końcówką i płaskimi/kwadratowymi
NożyczkiDowolna firma
Wodorotlenek sodu - 1 NDowolna firma
Wodorotlenek sodu - 10 NDowolna firma
SpektrofluorometrDowolna firmaZdolny do wzbudzenia 410 nm i emisji 600-850 nm
Oprogramowanie do spektrofluorometriiSpektrometr HoribaFluorEssence
Dowolna firma
Strzykawka - 1 mlDowolna firmaJednorazowe, plastikowe, sterylne
Filtry strzykawkowe - wielkość porów 0,2 mikronaDowolna FirmaMateriał membrany: PES lub inny kompatybilny z octanem amonu/kwasem octowym i PBS
Probówka - 10 ml
Triton X-100Dowolna firma
Eksykator próżniowy / próżniaDowolna firma
VialmixLantheus Obrazowanie medyczne515030-0508Określany w protokole jako mechaniczna wytrząsarka do fiolek
Waga papierDowolna firmaAby uniknąć utraty produktu, zaleca się cięcie papieru o wymiarach 3x3 cm
gorąca/mieszająca

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Mol Imaging Biol. 14 (1), 40-46 (2012).
  2. Kong, W. T., Wang, W. P., Huang, B. J., Ding, H., Mao, F. Value of wash-in and wash-out time in the diagnosis between hepatocellular carcinoma and other hepatic nodules with similar vascular pattern on contrast-enhanced ultrasound. J Gastroenterol Hepatol. 29 (3), 576-580 (2014).
  3. Wilson, S. R., Burns, P. N. Microbubble-enhanced us in body imaging: What role. Radiology. 257 (1), 24-39 (2010).
  4. Hynynen, K., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. Noninvasive mr imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier bbb in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  5. He, W., et al. Enhanced ablation of high intensity focused ultrasound with microbubbles: An experimental study on rabbit hepatic vx2 tumors. Cardiovasc Intervent Radiol. 34 (5), 1050-1057 (2011).
  6. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in alzheimer's disease using mr-guided focused ultrasound. Nat Commun. 9 (1), 2336(2018).
  7. Burke, C. W., Klibanov, A. L., Sheehan, J. P., Price, R. J. Inhibition of glioma growth by microbubble activation in a subcutaneous model using low duty cycle ultrasound without significant heating. J Neurosurg. 114 (6), 1654-1661 (2011).
  8. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. J Control Release. 243, 172-181 (2016).
  9. Haram, M., Hansen, R., Bouget, D., Myhre, O. F., Davies, C. L., Hofsli, E. Treatment of liver metastases with focused ultrasound and microbubbles in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy. Ultrasound Med Biol. 49 (9), 2081-2088 (2023).
  10. Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 9 (1), 321(2019).
  11. Karakatsani, M. E., et al. Focused ultrasound mitigates pathology and improves spatial memory in alzheimer's mice and patients. Theranostics. 13 (12), 4102-4120 (2023).
  12. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the role of lipid transfer in microbubble-mediated drug delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  13. Wang, S., Samiotaki, G., Olumolade, O., Feshitan, J. A., Konofagou, E. E. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  14. Huynh, E., Rajora, M. A., Zheng, G. Multimodal micro, nano, and size conversion ultrasound agents for imaging and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8 (6), 796-813 (2016).
  15. Rajora, M. A., et al. Quantitative pharmacokinetics reveal impact of lipid composition on microbubble and nanoprogeny shell fate. Adv Sci. 11 (4), 2304453(2024).
  16. Leong, K. X., Sharma, D., Czarnota, G. J. Focused ultrasound and ultrasound stimulated microbubbles in radiotherapy enhancement for cancer treatment. Technol Cancer Res Treat. 22, 1-9 (2023).
  17. Li, Y., et al. Ultrasound-triggered release of sinoporphyrin sodium from liposome-microbubble complexes and its enhanced sonodynamic toxicity in breast cancer. Nano Research. 11, 1038-1056 (2017).
  18. Nomikou, N., Fowley, C., Byrne, N. M., Mccaughan, B., Mchale, A. P., Callan, J. F. Microbubble-sonosensitiser conjugates as therapeutics in sonodynamic therapy. Chem Commun. 48 (67), 8332-8334 (2012).
  19. Chakravarty, R., Hong, H., Cai, W. Positron emission tomography image-guided drug delivery: Current status and future perspectives. Mol Pharm. 11 (11), 3777-3797 (2014).
  20. Delalande, A., Leduc, C., Midoux, P., Postema, M., Pichon, C. Efficient gene delivery by sonoporation is associated with microbubble entry into cells and the clathrin-dependent endocytosis pathway. Ultrasound Med Biol. 41 (7), 1913-1926 (2015).
  21. Sheikov, N., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med Biol. 30 (7), 979-989 (2004).
  22. Conway, G. E., Paranjape, A. N., Chen, X., Villanueva, F. S. Development of an in vitro model to study mechanisms of ultrasound-targeted microbubble cavitation-mediated blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 50 (3), 425-433 (2024).
  23. Hu, S., Zhang, X., Unger, M., Patties, I., Melzer, A., Landgraf, L. Focused ultrasound-induced cavitation sensitizes cancer cells to radiation therapy and hyperthermia. Cells. 9 (12), 2595(2020).
  24. Zhao, C., et al. Synergistically augmenting cancer immunotherapy by physical manipulation of pyroptosis induction. Phenomics. , (2024).
  25. Tachibana, K., Uchida, T., Ogawa, K., Yamashita, N., Tamura, K. Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet. 353 (9162), 1409(1999).
  26. Arif, W. M., et al. Focused ultrasound for opening blood-brain barrier and drug delivery monitored with positron emission tomography. J Control Release. 324, 303-316 (2020).
  27. Da Ros, V., et al. PVA-microbubbles as a radioembolization platform: Formulation and the in vitro proof of concept. Pharmaceutics. 15 (1), 217(2023).
  28. Tartis, M. S., et al. Dynamic micropet imaging of ultrasound contrast agents and lipid delivery. J Control Release. 131 (3), 160-166 (2008).
  29. Willmann, J. K., et al. Targeted microbubbles for imaging tumor angiogenesis: Assessment of whole-body biodistribution with dynamic micro-pet in mice. Radiology. 249 (1), 212-219 (2008).
  30. Ingram, N., et al. Ultrasound-triggered therapeutic microbubbles enhance the efficacy of cytotoxic drugs by increasing circulation and tumor drug accumulation and limiting bioavailability and toxicity in normal tissues. Theranostics. 10 (24), 10973-10992 (2020).
  31. Hernández-Gil, J., et al. Development of 68ga-labelled ultrasound microbubbles for whole-body pet imaging. Chem Sci. 10 (215), 5603-5615 (2019).
  32. Warram, J. M., et al. Biodistribution of p-selectin targeted microbubbles. J Drug Target. 22 (5), 387-394 (2014).
  33. Liu, T. W., Macdonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically copper-64-labeled organic nanoparticles as radiotracers. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (52), 13128-13131 (2012).
  34. Rajora, M. A., et al. Tailored theranostic apolipoprotein e3 porphyrin-lipid nanoparticles target glioblastoma. Chem Sci. 8 (8), 5371-5384 (2017).
  35. Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets. J Vis Exp. 176, e62665(2021).
  36. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  37. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjug Chem. 25 (4), 796-801 (2014).
  38. Mcmahon, D., Hynynen, K. Acute inflammatory response following increased blood-brain barrier permeability induced by focused ultrasound is dependent on microbubble dose. Theranostics. 7 (16), 3989-4000 (2017).
  39. Bismuth, M., Katz, S., Rosenblatt, H., Twito, M., Aronovich, R., Ilovitsh, T. Acoustically detonated microbubbles coupled with low frequency insonation: Multiparameter evaluation of low energy mechanical ablation. Bioconjug Chem. 33 (6), 1069-1079 (2022).
  40. Kutscher, H. L., et al. Threshold size for optimal passive pulmonary targeting and retention of rigid microparticles in rats. J Control Release. 143 (1), 31-37 (2010).
  41. You, Y., et al. Porphyrin-grafted lipid microbubbles for the enhanced efficacy of photodynamic therapy in prostate cancer through ultrasound-controlled in situ accumulation. Theranostics. 8 (6), 1665-1677 (2018).
  42. Chen, X., Qin, B., Whitehurst, D., Helfield, B., Lavery, L., Villanueva, F. S. Sonodynamic therapy using protoporphyrin ix encapsulated microbubbles inhibits tumor growth. 2017 IEEE International Ultrasonics Symposium. , Washington, DC. 1-4 (2017).
  43. Cheng, M. H. Y., et al. Targeted theranostic 111in/lu-nanotexaphyrin for spect imaging and photodynamic therapy. Mol Pharm. 19 (6), 1803-1813 (2022).
  44. Cheng, M. H. Y., Cevallos, A., Rajora, M. A., Zheng, G. Fast, facile, base-free microwave-assisted metallation of bacteriochlorophylls and corresponding high yield synthesis of tookad. J Porphyrins Phthalocyanines. 25 (07n08), 703-713 (2021).
  45. Macdonald, T. D., Liu, T. W., Zheng, G. An MRI-sensitive, non-photobleachable porphysome photothermal agent. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (27), 6956-6959 (2014).
  46. Shao, S., et al. Functionalization of cobalt porphyrin-phospholipid bilayers with his-tagged ligands and antigens. Nat Chem. 7 (5), 438-446 (2015).
  47. Teh, J. H., et al. A kit-based aluminium-[(18)f]fluoride approach to radiolabelled microbubbles. Chem Commun (Camb). 57 (88), 11677-11680 (2021).
  48. Rajora, M. A. Supramolecular Structure-Enabled Delivery of Porphyrin to Glioblastomas Beyond the Blood-Brain Barrier [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2024).
  49. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  50. Dhaliwal, A. Utilizing Porphyrin to Improve Ultrasound-Activated Supramolecular Agent Design for Solid Tumor Delivery [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2023).
  51. Kilroy, J. P., Klibanov, A. L., Wamhoff, B. R., Bowles, D. K., Hossack, J. A. Localized in vivo model drug delivery with intravascular ultrasound and microbubbles. Ultrasound Med Biol. 40 (10), 2458-2467 (2014).
  52. Dhaliwal, A., et al. Deep learning for automatic organ and tumor segmentation in nanomedicine pharmacokinetics. Theranostics. 14 (3), 973-987 (2024).
  53. Shakya, G., Cattaneo, M., Guerriero, G., Prasanna, A., Fiorini, S., Supponen, O. Ultrasound-responsive microbubbles and nanodroplets: A pathway to targeted drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 206, 115178(2024).
  54. Honari, A., Merillat, D. A., Bellary, A., Ghaderi, M., Sirsi, S. R. Improving release of liposome-encapsulated drugs with focused ultrasound and vaporizable droplet-liposome nanoclusters. Pharmaceutics. 13 (5), 609(2021).
  55. Barmin, R. A., et al. Polymeric materials for ultrasound imaging and therapy. Chem Sci. 14 (43), 11941-11954 (2023).
  56. Chen, Y., Liang, Y., Jiang, P., Li, F., Yu, B., Yan, F. Lipid/PLGA hybrid microbubbles as a versatile platform for noninvasive image-guided targeted drug delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (45), 41842-41852 (2019).
  57. Barmin, R. A., et al. Engineering the acoustic response and drug loading capacity of pbca-based polymeric microbubbles with surfactants. Mol Pharm. 19 (9), 3256-3266 (2022).
  58. Barrefelt, A. A., et al. Multimodality imaging using SPECT/CT and MRI and ligand functionalized 99mTc-labeled magnetic microbubbles. EJNMMI Res. 3 (1), 12(2013).
  59. Song, R., Hu, D., Chung, H. Y., Sheng, Z., Yao, S. Lipid-polymer bilaminar oxygen nanobubbles for enhanced photodynamic therapy of cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (43), 36805-36813 (2018).
  60. Böhmer, M. R., Chlon, C. H. T., Raju, B. I., Chin, C. T., Shevchenko, T., Klibanov, A. L. Focused ultrasound and microbubbles for enhanced extravasation. J Control Release. 148 (1), 18-24 (2010).
  61. Zhang, S., et al. Compare ultrasound-mediated heating and cavitation between flowing polymer- and lipid-shelled microbubbles during focused ultrasound exposures. J Acoust Soc Am. 131 (6), 4845-4855 (2012).
  62. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  63. Krasnovskaya, O. O., et al. Recent advances in (64)cu/(67)cu-based radiopharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (11), 9154(2023).
  64. Navarro-Becerra, J. A., Borden, M. A. Targeted microbubbles for drug, gene, and cell delivery in therapy and immunotherapy. Pharmaceutics. 15 (6), 1625(2023).
  65. Fan, C. -H., et al. Antiangiogenic-targeting drug-loaded microbubbles combined with focused ultrasound for glioma treatment. Biomaterials. 34 (8), 2142-2155 (2013).
  66. Luo, T., et al. Ultrasound-mediated destruction of oxygen and paclitaxel loaded dual-targeting microbubbles for intraperitoneal treatment of ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 391, 1-11 (2017).
  67. Fix, S. M., et al. Oxygen microbubbles improve radiotherapy tumor control in a rat fibrosarcoma model - a preliminary study. PLoS One. 13 (4), e0195667(2018).
  68. Eisenbrey, J. R., et al. Sensitization of hypoxic tumors to radiation therapy using ultrasound-sensitive oxygen microbubbles. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (1), 88-96 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microbubble FabricationMicrobubble LabelingFluorescent MicrobubblesRadioactive MicrobubblesFocused UltrasoundRadioisotope ChelationMultimodal ImagingLipid MicrobubblesGamma CounterCentrifuge Filtration

Powiązane artykuły