Artykuł metodologiczny

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

DOI:

10.3791/67438

⸱

14 lutego 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki NK to wrodzone komórki odpornościowe, które odgrywają kluczową rolę w obronie organizmu przed nowotworami i infekcjami wirusowymi. Wytwarzanie ludzkiego indukowanego pluripotencjalnego receptora antygenu macierzystego (CAR) pochodzącego z chimerycznego receptora antygenowego (CAR) eksprymującego komórki NK okazało się obiecującą drogą dla "gotowej" immunoterapii nowotworów. W tym przypadku wykorzystaliśmy zoptymalizowany pod kątem komórek NK konstrukt CAR, który obejmuje domenę transbłonową NKG2D, domenę kostymulującą 2B4 i domenę sygnalizacyjną CD3ζ, która, jak wykazano, stymuluje silną aktywność przeciwnowotworową za pośrednictwem komórek NK specyficznych dla antygenu. Zastosowanie iPSC do generowania komórek CAR NK ma kilka zalet, w tym jednorodną ekspresję CAR, skalowalność, odtwarzalność i potencjał do zastosowań klinicznych. Ten szczegółowy protokół krok po kroku od inżynierii komórkowej do różnicowania umożliwia generowanie komórek NK zoptymalizowanych pod kątem komórek NK, pochodzących z iPSC, eksprymujących CAR, zapewniając standaryzowaną i celowaną immunoterapię nowotworów o ulepszonej aktywności przeciwnowotworowej i podkreślając ich potencjał jako obiecującej opcji leczenia różnych nowotworów złośliwych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki NK, rodzaj limfocytów w obrębie wrodzonego układu odpornościowego, odgrywają kluczową rolę we wczesnej obronie przed nowotworami i komórkami zakażonymi wirusem1,2,3. W przeciwieństwie do limfocytów T, komórki NK nie wymagają prezentacji antygenu za pomocą cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Zamiast tego komórki NK mają repertuar receptorów aktywujących i hamujących, które regulują ich aktywność3. Aktywność cytotoksyczna za pośrednictwem komórek NK wykorzystuje różne mechanizmy, w tym uwalnianie perforyny i granzymów, angażowanie receptorów śmierci i wytwarzanie cytokin prozapalnych, takich jak IFN-γ i TNF-α. Ten unikalny sposób działania pozycjonuje komórki NK jako atrakcyjnego kandydata do immunoterapii nowotworów, szczególnie w leczeniu nowotworów litych, w których unikanie odpowiedzi immunologicznej jest istotną przeszkodą1,2,3,4.

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych form raka wątroby na świecie5. Tradycyjne podejścia terapeutyczne, w tym chirurgia, chemioterapia i radioterapia, zazwyczaj zapewniają ograniczone korzyści kliniczne i skutkują wysokimi wskaźnikami nawrotów6,7. Ostatnie postępy w immunoterapii i terapii celowanej znacząco wpłynęły na leczenie HCC8,9. Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak niwolumab i pembrolizumab, wykazały obiecujące wyniki, wzmacniając odpowiedź komórek odpornościowych przeciwko komórkom nowotworowym10,11. Terapie te doprowadziły do poprawy wskaźników przeżycia i lepszej jakości życia niektórych pacjentów. Mogą jednak również powodować działania niepożądane związane z odpornością, co może ograniczać ich stosowanie u niektórych pacjentów12. Terapie celowane, takie jak sorafenib i lenwatynib, w szczególności hamują szlaki promujące wzrost komórek nowotworowych i angiogenezę13. Terapie te mają znaną skuteczność w kontrolowaniu postępu choroby i przedłużaniu przeżycia8,14. Niemniej jednak, oporność na terapie celowane zwykle się rozwija, a skutki uboczne leczenia są powszechne15,16. Wśród obiecujących kierunków w strategiach immunoterapeutycznych nowotworów, pojawienie się limfocytów T CAR z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) zrewolucjonizowało leczenie nowotworów, zwłaszcza w leczeniu nowotworów hematologicznych, takich jak chłoniak i szpiczak mnogi17,18,19.

Komórki NK wykazujące ekspresję CAR, łączące wrodzoną aktywność cytotoksyczną komórek NK z precyzyjnym celowaniem technologii CAR, reprezentują innowacyjne i potencjalnie transformacyjne podejście do guzów litych, takich jak HCC20,21,22,23,24. Komórki zmodyfikowane przez CAR mogą specyficznie rozpoznawać i zabijać komórki nowotworowe wyrażające docelowy antygen, oszczędzając normalne tkanki, zmniejszając w ten sposób ryzyko wystąpienia efektów niepożądanych związanych z konwencjonalnymi terapiami25,26,27. Komórki CAR-NK wytworzone z komórek NK wyizolowanych z krwi obwodowej lub krwi pępowinowej są zwykle wytwarzane przez transdukcję komórek NK za pomocą konstruktów CAR, które składają się z zewnątrzkomórkowej domeny rozpoznawania antygenu, domeny transbłonowej i wewnątrzkomórkowych domen sygnalizacyjnych niezbędnych do aktywacji i proliferacji28,29,30.

Wyzwanie polegające na stworzeniu stabilnej i jednorodnej populacji funkcjonalnie zmodyfikowanych komórek NK do leczenia klinicznego można rozwiązać poprzez zastosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)31,32. Inżynieria ludzkich iPSC z CAR zoptymalizowanymi pod kątem komórek NK zapewnia ulepszony sygnał aktywacji i proliferacji komórek NK oraz zapewnia niewyczerpaną i jednorodną populację komórek NK wykazujących ekspresję CAR jako standaryzowaną, "gotową terapię"20,33. W tym protokole genetyczna modyfikacja iPSC w celu wytworzenia komórek NK pochodzących z iPSC wykazujących ekspresję CAR polega na integracji zoptymalizowanego konstruktu CAR komórki NK, który obejmuje domeny transbłonowe i sygnałowe pochodzące z komórek NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) oraz scFv anty-glipikan-3 (GPC3), jak opisano w naszych poprzednich badaniach23. Genetycznie zmodyfikowane iPSC są następnie różnicowane i namnażane za pomocą opracowanego wcześniej protokołu różnicowania komórek NK34. Te zmodyfikowane komórki NK pochodzące z iPSC wykazujące ekspresję CAR mają zdolność rozpoznawania i eliminowania HCC i innych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję specyficznych antygenów związanych z nowotworem, takich jak Glypican 3 (GPC3), który ulega nadekspresji w HCC i innych nowotworach złośliwych35,36,37,38.

Zastosowanie komórek CAR-NK pochodzących z iPSC do leczenia różnych nowotworów jest bardzo obiecujące30,39,40; wiele z tych komórek CAR-NK pochodzących z iPSC jest obecnie w fazie badań klinicznych41,42,43. Aby ułatwić postęp w tej dziedzinie, protokół ten umożliwia wydajną produkcję zmodyfikowanych komórek CAR-NK pochodzących z iPSC, od inżynierii komórkowej po różnicowanie do dojrzałych komórek NK i ekspansję in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Metoda hodowli ludzkich iPSC bez karmienia

UWAGA: Rozmrozić zamrożone, niezróżnicowane ludzkie iPSC i wyhodować je za pomocą mTeSR 1-plus na wstępnie powlekanych płytkach Matrigel (odtąd nazywanych matrycą membrany podstawnej [BMM]), jak wcześniej opisano23,34. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że iPSC nie są rozróżniane przed i po inżynierii. Świeżo rozmrożone iPSC powinny być hodowane przez około 2-3 pasaże, aby wykazać morfologię pluripotencji zgodną z ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Poniższe instrukcje służą do pasażowania komórek z jednego dołka płytki 6-dołkowej.

  1. Przed pasażowaniem iPSC należy pokryć nową 6-dołkową płytkę 1x BMM (1 ml/dołek) i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny przed użyciem.
  2. Przygotuj 1x rozpuszczony BMM.
    1. Rozmrozić przez noc 5 ml fiolkę z BMM w temperaturze 4 °C.
    2. Szybko porcjuj BMM za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek do wstępnie schłodzonych probówek wirówek.
    3. Przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
    4. Aby przygotować 1x roztwór roboczy BMM, ponownie zawiesić jedną porcję BMM w stosunku 1:100 w zimnym podłożu DMEM/F12. 1x roztwór roboczy BMM może być przechowywany w temperaturze -4 °C przez 2 tygodnie.
    5. Pokryj płytkę wystarczającą objętością, aby pokryć powierzchnię (np. użyć 1 ml na zagłębienie płytki 6-dołkowej).
    6. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny przed użyciem.
  3. Rozmrozić fiolkę z zamrożonymi iPSC (zazwyczaj 1 × 106 komórek/fiolkę) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Stopniowo dodawaj rozmrożone iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR Plus, pozwalając komórkom zaaklimatyzować się, dodając je kropla po kropli, aby zminimalizować szok komórkowy.
  5. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
  6. Odessać supernatant i przemyć komórki raz 5 ml PBS.
  7. Ponownie zawiesić komórki w pożywce mTeSR Plus i ułożyć je płytką o gęstości około 200 000 komórek/3 ml/dołek na wstępnie powlekanej 6-dołkowej płytce BMM.
  8. Przejścia iPSC.
    1. Gdy iPSC osiągną 70-80% konfluencji, odessać pożywkę i przeprowadzić pasażowanie pojedynczych komórek za pomocą TrypLE przez 5 minut w temperaturze 37 °C (1 ml / dołek w płytce 6-dołkowej).
    2. Po 5 minutach dodaj 3 ml 1x PBS, aby zatrzymać reakcję dysocjacji i przemyj komórki raz 3 ml PBS.
    3. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut. Po umyciu ponownie zawiesić jednokomórkowe iPSC w pożywce mTeSR Plus, a następnie umieścić je na wstępnie powlekanej płytce 6-dołkowej BMM.
      UWAGA: Całkowita wymagana objętość pożywki wynosi 3 ml / dołek w płytce 6-dołkowej. Pożywkę należy wymieniać co 2-3 dni, a krok 1.8 należy powtórzyć, gdy komórki zlewają się w 70-80% przez co najmniej 1-2 przejścia przed inżynierią iPSC.
  9. Regularnie sprawdzaj pluripotencję iPSC. Wybarwić iPSC przeciwciałem TRA-1-81 sprzężonym z allofikocyjaniną (APC) i sprzężonym z PE-Cy7 przeciwciałem antygenu embrionalnego 4 (SSEA-4) przez 30 minut na lodzie, a następnie przeanalizować je za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej23,41.
    UWAGA: Komórki iPS użyte w tym eksperymencie są przystosowane do TrypLE. iPSC, które nie były wcześniej pasażowane za pomocą TrypLE, zazwyczaj wymagają 8-10 pasaży, aby w pełni przystosować się do TrypLE, co zapewnia produkcję wysokiej jakości spinowych ciał zarodkowych (EB).

2. Inżynieria ludzkich iPSC do ekspresji anty-GPC3 CAR za pomocą wektora piggyBac

  1. Pokryć nową 6-dołkową płytkę BMM i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę (może to trwać dłużej, dopóki płyn nie wyschnie).
  2. Wstępnie podgrzany mTeSR Plus z 10 μM zwiniętą, cewką zawierającą inhibitor kinazy białkowej (ROCK) (Y-27632) (z 1 mM bulionu przygotowanego w sterylnej wodzie destylowanej) w temperaturze 37 °C.
  3. Włącz system Nucleofection. Wybierz jednostkę X, a następnie wybierz lokalizacje studzienek, które mają zostać transfekowane. Wybierz rozwiązanie P3 i ręcznie wprowadź kod (CA-137).
  4. Zebrać iPSC w 70-80% zbiegu z 1 ml TrypLE i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Sprawdź pod mikroskopem, aby potwierdzić dysocjację.
  5. Pipetować 4-6 razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, następnie zneutralizować 5 ml PBS i osadzać w ilości 300 × g przez 5 minut.
  6. Delikatnie umyj komórki jeszcze raz, aby usunąć wszelkie ślady TrypLE.
  7. Zawiesić w 1 ml mTeSR Plus z Rock-Inhibitorem i policzyć komórki.
  8. Aby utworzyć iPSC anty-GPC3 CAR, użyj 1 × 106 komórek na transfekcję w probówce do mikrowirówki i wiruj z prędkością 300 × g przez 5 minut.
  9. Podczas wirowania połącz transpozonowe DNA z ekspresją CAR z wektorem ekspresyjnym transpozazy super PiggyBac w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml w stosunku 3:1 (np. 3 μg plazmidu zawierającego transpozon na 1 μg plazmidu transpozy).
  10. Włączyć kontrolę pozytywną białka zielonej fluorescencji (GFP) (tabela materiałów) przy użyciu 0,5 μl roztworu o stężeniu 1 mg/ml oraz nietransfekowaną kontrolę ujemną w celu potwierdzenia ekspresji GFP.
  11. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w 20 μl roztworu Nucleofector P3 o temperaturze pokojowej (RT) z suplementem dostarczonym w zestawie do nukleofekcji. Następnie dodaj tę mieszaninę do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej plazmidowe DNA, co daje końcową objętość około 22-25 μl.
    UWAGA: Ponownie zawiesić wszystkie iPSC, które mają być transfekowane w roztworze nukleofektora P3 przed dodaniem plazmidów GPC3 CAR lub plazmidu kontrolnego GFP do komórek.
  12. Przenieść zawiesinę komórka/DNA do 16-dołkowych pasków o pojemności 20 μl. Upewnij się, że próbka zakrywa dno kuwety bez żadnych pęcherzyków.
  13. Delikatnie postukaj w 16-dołkowe paski na blacie, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i osadzić komórki na dnie.
  14. Umieść 16-dołkowe paski zawierające iPSC i mieszankę CAR DNA w systemie Nucleofection, wybierz program CA-137, roztwór P3, a następnie uruchom program. Ten program zakończy się za 1 s i pokaże zielony haczyk.
  15. Dodać 80 μl wstępnie podgrzanego mTeSR Plus z pożywką ROCK-Inhibitor do dołka i ostrożnie przenieść komórki na 6-dołkową płytkę pokrytą BMM (końcowa objętość 1 ml na studzienkę).
  16. Po 4 godzinach krótko sprawdzić komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem ekspresji GFP, aby potwierdzić wskaźnik powodzenia transfekcji.
  17. Badanie przesiewowe iPSC pod kątem ekspresji GFP w celu oceny skuteczności transfekcji 24 godziny po transfekcji przy użyciu cytometrii przepływowej23,41 w celu potwierdzenia wyrażenia GFP.
  18. Inkubować przez 4 dni w temperaturze 37 °C, zmieniając pożywkę w zależności od potrzeb przed przystąpieniem do wyboru leku.
    UWAGA: Każda nukleofekcja wymaga 0,2-2 x 106 iPSC na reakcję. W zależności od liczby reakcji można stosować płytki 24-dołkowe lub 6-dołkowe.

3. Selekcja klonalna i potwierdzenie pluripotencji iPSC GPC3-CAR

  1. Wykonaj serię selekcji zeocyn (1:10 000) na transfekowanych iPSC, aby klonalnie wybrać GPC3-CAR wyrażające iPSC.
  2. Aby potwierdzić skuteczność transfekcji, zmierz ekspresję GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i cytometrii przepływowej23,41.
    UWAGA: Konstrukcja CAR jest dołączona do znacznika FLAG44,45 w celu oceny ekspresji CAR zarówno na etapie iPSC, jak i po różnicowaniu komórek NK.
  3. Utrzymuj transfekowane iPSC CAR pod selekcją leków, dopóki nie osiągną optymalnej ekspresji genu CAR i GFP.
  4. Aby zapewnić jednorodną ekspresję GFP i CAR, należy wydłużyć czas wyboru leku o 2-3 tygodnie.
  5. Przeprowadź sortowanie komórek na podstawie ekspresji GFP lub CAR przy użyciu cytometrii przepływowej, aby uzyskać jednorodną populację klonalnie wybranych iPSCs23.
  6. Zastosowany tutaj konstrukt CAR zawiera znacznik wyboru leku zeocyny. Wybrać transfekowane komórki genu GPC3 CAR, dodając zeocynę (50 μg/ml zeocyny) do pożywki hodowlanej.
  7. Po selekcji zeocyny rozcieńczyć transfekowane iPSC genu GPC3 CAR i umieścić je na 96-dołkowej płytce, aby uzyskać około jednej komórki na dołek. Można to zrobić poprzez seryjne rozcieńczanie lub za pomocą sortera komórek.
    UWAGA: Użyj sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), aby wyizolować pojedyncze transfekowane komórki na podstawie ekspresji markera fluorescencyjnego połączonego z konstruktem CAR.
  8. Pozwól pojedynczym komórkom rozwinąć się w kolonie w 96-dołkowej płytce.
  9. Nakarm komórki świeżą pożywką hodowlaną co 3-4 dni raz i monitoruj studzienki pod kątem wzrostu kolonii.
  10. Przesiewanie kolonii pod kątem wyrażenia CAR. Można to zrobić za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) lub Western blot w celu sprawdzenia obecności konstruktu CAR 23,47.
  11. Alternatywnie, użyj cytometrii przepływowej23,41, aby wykryć powierzchniową ekspresję białka CAR.
    UWAGA: W tym badaniu ekspresję CAR określono ilościowo za pomocą wyrażenia znacznika FLAG przy użyciu cytometrii przepływowej.
  12. Dodatkowo wykonaj kariotypowanie, aby zidentyfikować wszelkie nieprawidłowości chromosomalne.
    UWAGA: Może to być zrobione przez organizacje zewnętrzne, takie jak Wicell (wicell.org) lub Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. Gdy klony CAR-dodatnie zostaną zidentyfikowane bez żadnych nieprawidłowości, należy rozprężyć te klony w większych naczyniach hodowlanych, takich jak płytka 6-dołkowa i kolba T75.
  14. Kriokonserwuj klonalnie ekspandowane iPSC CAR za pomocą pożywki do krioprezerwacji w wielu fiolkach do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Na tym etapie zaleca się następujące punkty: (i) Utrzymuj optymalne warunki hodowli iPSC, aby zapobiec różnicowaniu. (ii) Odczekać 1-4 tygodnie na osiągnięcie jednorodnej populacji ekspresji CAR i GFP w iPSC po wyborze leku. (iii) Kontynuować monitorowanie komórek pod kątem stabilności ekspresji CAR i markerów pluripotencji. (iv) Stosować odpowiednie środki kontroli podczas etapów kontroli bezpieczeństwa i weryfikacji. (v) Po selekcji klonalnej i ekspansji zweryfikuj pluripotencję, oceniając ekspresję TRA-1-81 i SSEA-4 na iPSC wykazujących ekspresję CAR.

4. Generowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych z modyfikowanych iPSC CAR przez tworzenie spinowego ciała zarodkowego (EB)

UWAGA: Do produkcji hematopoetycznych komórek progenitorowych stosuje się protokół spin EB lub hematopoetycznego organoidu23,34. Komórki w EB różnicują się w komórki zrębu, aby wspierać rozwój limfocytów38, eliminując w ten sposób potrzebę komórek zrębowych pochodzących z kseno, takich jak OP923,34,48. Poniżej znajdują się instrukcje dotyczące pobierania komórek z pojedynczego dołka 6-dołkowej płytki w celu utworzenia EB.

  1. Przejście ~ 200 000 komórek / studzienkę 6-dołkowej płytki pokrytej BMM 2 dni przed utworzeniem spinu EB. Upewnij się, że osiąga 70-80% zbieżności w dniu ustawienia spin EBs. Ogólnie rzecz biorąc, 1 dołek z płytki 6-dołkowej wystarcza na dwie płytki spin EB.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną i odłączyć komórki, inkubując z 1 ml wstępnie podgrzanego TrypLE Select w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  3. Ostrożnie rozdzielić agregaty komórkowe na zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 3 ml 1x PBS, aby zatrzymać reakcję dysocjacji, i przemyj komórki raz 3 ml PBS.
  4. Ponownie zawiesić komórki w pożywce mTesR Plus i przefiltrować przez sitko komórkowe o wielkości 70 μM w celu usunięcia agregatów.
  5. Odwiruj komórki, aby usunąć supernatant i ponownie umyj komórki 5 ml PBS. Następnie ponownie zawieś komórki w 1 ml pożywki STEMdiff APEL (pożywka do tworzenia EB).
  6. Policz i rozcieńcz komórki do odpowiedniej gęstości za pomocą pożywki do tworzenia EB zawierającej następujące cytokiny (SCF: 40 ng/ml, BMP4: 20 ng/mL, VEGF: 20 ng/mL) plus 10 μM inhibitor ROCK.
  7. Wysiewać 3000-10000 komórek/studzienkę w 100 μl pożywki (100 000 komórek/ml) na płytkach 96-dołkowych.
    UWAGA: Liczba komórek używanych do tworzenia EB może się różnić w zależności od linii iPSC. Zaleca się testowanie od 3 000 do 10 000 komórek na studzienkę na płytkach 96-dołkowych.
  8. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj zawiesinę komórek do 96-dołkowych płytek o stężeniu 100 μl/basenik.
    UWAGA: W celu lepszego tworzenia ciał zarodkowych (EBs) zaleca się stosowanie 96-dołkowych płytek o bardzo niskim nasadce z okrągłym dnem.
  9. Odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 300 × g przez 5 minut, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 dni.
    UWAGA: Wstępne badania wykazały, że 6 dni wystarczy, aby w tym badaniu powstało >30% komórek CD34 + dla linii CAR iPSC.
  10. Sprawdź jakość EB za pomocą cytometrii przepływowej23,41.
    1. Przygotuj 4 ml podgrzanej 0,25% trypsyny z 0,4% surowicy kurczaka (16 μl na 4 ml trypsyny) w celu dysocjacji EB.
    2. Przenieś 10-30 EBs do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Dodaj roztwór trypsyny/surowicy kurczaka do EB i inkubuj w łaźni wodnej przez 10 minut, wirując co 30 sekund, aby zapewnić całkowitą dysocjację EB.
    4. Odpipetować trypsynizowane EBs. Mieszaj kilka razy w górę i w dół, aby dokładnie oddzielić EBS.
    5. Dodaj 5 ml 1x PBS, aby zatrzymać proces trypsynizacji.
    6. Przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 μm w nowej stożkowej probówce.
    7. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut.
    8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 3-5 ml świeżej pożywki.
    9. Policz komórki, wybarwij typowymi markerami EB, takimi jak CD34, CD31, CD43 i CD45, a następnie przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej23,41 (Rysunek 3).
    10. Dodać zalecaną objętość przeciwciał zgodnie z instrukcjami producenta do każdej probówki zawierającej zdysocjowane pojedyncze komórki EB w 100 μl buforu przepływowego i inkubować na lodzie przez 30 min39,41.
    11. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie buforem przepływowym, dodać żywą/martwą plamę SYTOX i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Zazwyczaj >30% komórek CD34 + uzyskuje się z całkowitej populacji zdysocjowanych ciał embrionalnych Spin w dniu 6 przy użyciu iPSC użytych w tym badaniu, chociaż odsetek ten może się różnić w zależności od źródła iPSC i warunków hodowli.

5. Różnicowanie komórek NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC od Spin EBs

UWAGA: Spin EBs wyrażające GPC3 CAR mogą być przenoszone na płytki 24-dołkowe lub 6-dołkowe pokryte 2% żelatyną lub bez powłoki. W przypadku podłoży bardziej odpowiednie są płytki 6-dołkowe, a 2% powłoka żelatynowa poprawia przyczepność EBs.

  1. Przygotuj 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną, wykonując poniższe czynności.
    1. Przygotować 2% (w/v) roztwór żelatyny, rozpuszczając żelatynę w wodzie o czystości do hodowli tkankowych.
    2. Wysterylizować roztwór w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 30 min.
    3. Pokryj powierzchnię każdego dołka 5-10 μl roztworu żelatyny nacm2 (~ 1 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
    4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny przed użyciem. Po inkubacji odessać pozostały roztwór żelatyny przed przystąpieniem do przenoszenia EB.
  2. Przygotuj pożywkę do różnicowania komórek NK: Dodaj 56,6% DMEM+ GlutaMAX-I, 28,3% F12+ GlutaMAX-I, 15% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB, 1% P/S, 2 mM L-glutaminy, 1 μM β-merkaptoetanolu, 5 ng/ml seleninu sodu, 50 μM etanoloaminy i 20 mg/l kwasu askorbinowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Dodać 3 ml pożywki różnicującej NK zawierającej następujące cytokiny do każdego dołka 6-dołkowych płytek pokrytych żelatyną (IL-3: 5 ng/ml, SCF: 20 ng/ml, IL-7: 20 ng/ml i IL-15: 10 ng/ml).
  4. W dniu 6 przenieś spinowe EB bezpośrednio do przygotowanych, pokrytych żelatyną 6-dołkowych płytek zawierających pożywkę różnicującą NK, wykonując poniższe czynności.
    1. Ostrożnie przenieść EB z płytek 96-dołkowych do 10-centymetrowej płytki, używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu usunięcia większości pożywki.
    2. Dodać 3 ml pożywki różnicującej NK zawierającej powyższe cytokiny do każdego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej żelatyną.
    3. Rozprowadzić 16-20 EBs do każdego dołka płytki 6-dołkowej za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Średnio EB z pojedynczej płytki 96-dołkowej można wykorzystać do wysiewu jednej płytki 6-dołkowej na płytkę różnicującą NK.
  5. Wykonuj zmiany podłoża co 5-7 dni. Po pierwszym tygodniu różnicowania komórek NK należy wykluczyć IL-3 z pożywki.
    UWAGA: Po 14 dniach podłoże należy wymieniać co 3-4 dni.
  6. Kontynuuj zmiany podłoża przez 3-4 tygodnie. Oceń ekspresję markerów komórek NK (CD45+CD56+) za pomocą cytometrii przepływowej24,42 na komórkach zawiesinowych.
  7. Gdy >80% komórek zawiesiny ulega ekspresji CD45 + CD56 +, zbierz komórki, przepuszczając je przez filtr 70 μm, aby usunąć wszelkie grudki.
  8. Wspólna hodowla zebranych komórek NK ze 100 szaro napromieniowanymi aAPCs34,48 i hodowla w pożywce ekspansyjnej NK zawierającej IL-2 (100 ng / ml) i IL-15 (10 ng / ml).

6. Ekspansja komórek NK pochodzących z anty-GPC3 CAR iPSC

UWAGA: Zazwyczaj, wydajność 2-20 × 106 komórek NK można uzyskać z pojedynczej płytki 6-dołkowej, nawet przed ekspansją. Aby ułatwić dalszą ekspansję komórek NK do dalszych zastosowań, sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) są wykorzystywane do generowania komórek NK >1 × 109

.
  1. Wykorzystaj zmodyfikowane komórki K562 eksprymujące 41BBL i związaną z błoną IL-21 (41BBL-mbIL-21)48 jako aAPC, aby indukować ekspansję komórek NK.
  2. Przed wspólną hodowlą aAPC z komórkami NK należy napromienić aAPC za pomocą 100 szarych i zachować je jako zamrożone zapasy.
  3. Zebrać komórki zawiesiny z płytki 6-dołkowej i wyhodować komórki NK w pożywce ekspansywnej NK uzupełnionej 50 U/ml IL-2 i IL-15 (10 ng/ml; dodać na świeżo) o gęstości 5 ×10-5 komórek/ml.
  4. Dodaj rozmrożone, napromieniowane aAPC do komórek NK w stosunku 1:1.
  5. Uzupełniaj pożywkę hodowlaną co 3-4 dni, dodając świeże IL-2 i IL-15 w stężeniu odpowiednio 50 U/ml i 10 ng/ml.
  6. Upewnij się, że komórki NK pochodzące z CAR iPSC utrzymują zdolność do ekspansji przez okres >3 miesięcy, utrzymując zarówno żywotność komórek, jak i aktywność cytolityczną.

7. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC

UWAGA: Charakterystyka komórek NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC obejmuje kompleksową ocenę ich profilu fenotypowego i aktywności funkcjonalnej.

  1. Oceń ekspresję receptorów aktywacji NK, w tym CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL i FasL, na komórkach NK pochodzących z anty-GPC3 CAR iPSC za pomocą cytometrii przepływowej24,42, aby określić aktywność komórek CAR NK i stan dojrzewania (Rysunek 4).
  2. Oceń aktywność funkcjonalną in vitro komórek NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC za pomocą testów kaspazy-3/7 opartych na cytometrii przepływowej, testów uwalniania granulek CD107a, testów uwalniania cytokin IFN-γ i TNF-α przeciwko różnym celom nowotworowym.
  3. W przypadku testu kaspazy3/7 wykonaj poniższe czynności.
    1. Policzyć komórki docelowe i wstępnie wybarwić je barwnikiem fluorescencyjnym do śledzenia komórek o końcowym stężeniu 5 μM w PBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Przepłukać barwione komórki docelowe w kompletnej pożywce hodowlanej przed współhodowlą z komórkami NK pochodzącymi z CAR iPSC w różnych proporcjach efektorowych do docelowych (E:T) w temperaturze 37 °C.
    3. Po 3 godzinach i 30 minutach kohodowli dodać zielony odczynnik do wykrywania kaspazy-3/7 na kolejne 30 minut inkubacji, co daje całkowity czas inkubacji wynoszący 4 godziny.
    4. Dodać 1 μl roztworu do barwienia martwych komórek podczas ostatnich 5 minut barwienia i delikatnie wymieszać.
    5. Przeanalizuj wybarwione komórki za pomocą cytometrii przepływowej23,41(Rysunek 5).
  4. Wdrożenie tego protokołu w celu zapewnienia kompleksowego zrozumienia cech fenotypowych i aktywności funkcjonalnej komórek NK pochodzących z GPC3 CAR iPSC, umożliwiając solidną ocenę ich potencjału terapeutycznego.
    UWAGA: Zwykle potrzeba 4-5 tygodni, aby uzyskać >90% komórek CD45 + CD56 + z warunków różnicowania komórek NK i ekspansji NK opartych na spin EB GPC3 CAR iPSC przy użyciu linii GPC3 CAR iPSC. Niektóre linie komórkowe iPSC mogą wymagać tylko 3 tygodni, a niektóre linie mogą trwać dłużej (około 4-5 tygodni).

8. Elementy rozwiązywania problemów i rozwiązania

UWAGA: Rozwiązywanie problemów z różnicowaniem, ekspansją i testowaniem funkcjonalnym komórek GPC3 CAR NK pochodzących z iPSC przy użyciu metody spin embryoid body (EB) może obejmować kilka kroków. Poniżej znajduje się kilka typowych problemów, które można napotkać, wraz z sugerowanymi rozwiązaniami:

  1. Objawy niespójnego tworzenia EB
    1. Sprawdź, czy EB nie są za małe lub za duże, o nieregularnych kształtach.
  2. Rozwiązanie dla niespójnego tworzenia EB
    1. Dostosuj prędkość wirówki i czas trwania używany do tworzenia EB. Typowa jest prędkość około 200-300 × g przez 5-10 minut.
    2. Upewnij się, że używane są odpowiednie płytki z dnem w kształcie litery U lub szalki hodowlane o bardzo niskim mocowaniu, aby ułatwić tworzenie EB.
    3. Upewnij się, że iPSC są jednorodne i wolne od zróżnicowanych komórek, które mogą wpływać na tworzenie EB.
  3. Objawy słabego różnicowania iPSC do komórek NK
    1. Sprawdź, czy nie ma niskiej ekspresji markerów komórek NK (np. CD56, NKp46).
    2. Sprawdź, czy nie udało się utworzyć EB lub nie uformowano źle uformowanych EB.
  4. Rozwiązanie problemu słabego różnicowania iPSC do komórek NK
    1. Upewnij się, że stężenia podstawowych czynników wzrostu (np. VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF i IL-3) są optymalne do tworzenia EB i różnicowania komórek NK. Dostosuj stężenia na podstawie poprzednich badań23,34,41.
    2. Upewnij się, że początkowa gęstość wysiewu iPSC jest odpowiednia. Zazwyczaj do tworzenia spinu EB zalecana jest gęstość 8000-10 000 komórek/100 μl.
    3. Sprawdzić, czy podłoże różnicujące jest prawidłowo sformułowane, w tym niezbędne suplementy (np. alternatywy bez surowicy lub surowicy, inne cytokiny).
    4. Należy odczekać wystarczająco dużo czasu na wytworzenie się EB, co najmniej 6 dni do 12 dni przed zmianą na pożywkę do różnicowania komórek NK.
  5. Objawy słabej ekspansji komórek NK
    1. Sprawdź, czy wydajność komórek jest ograniczona podczas ekspansji.
    2. Sprawdź, czy ekspandowane komórki NK nie są zmniejszone.
  6. Rozwiązania dla słabej rozszerzalności ogniw NK
    1. Zwiększ stężenie IL-15 i IL-2 w fazie ekspansji. Może to znacznie zwiększyć proliferację komórek NK.
    2. Rozważ użycie komórek zasilających, takich jak napromieniowane aAPC, aby poprawić przeżywalność i ekspansję komórek NK.
    3. Regularnie monitoruj gęstość komórek i pasażuj komórki, zanim osiągną przeludnienie, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu.
  7. Objawy nieoptymalnych wyników testów funkcjonalnych
    1. Sprawdzić, czy nie ma zmniejszonej cytotoksyczności w stosunku do komórek docelowych.
    2. Sprawdź, czy nie ma niskiego poziomu wydzielania cytokin (np. IFN-γ, TNF-α).
  8. Rozwiązania dla nieoptymalnych wyników testów funkcjonalnych
    1. Zoptymalizuj stosunek celu do efektora w testach cytotoksyczności. Zacznij od proporcji 10:1 i dostosuj na podstawie wyników.
    2. Upewnij się, że komórki NK są odpowiednio aktywowane przed testami funkcjonalnymi. Może to obejmować wstępną stymulację cytokinami lub współhodowlę z napromieniowanymi aAPC.
    3. Sprawdź wrażliwość docelowej linii komórkowej na lizę za pośrednictwem komórek NK. Użyj znanych poufnych obiektów docelowych jako kontrolek.
    4. Wydłuż czas trwania testów funkcjonalnych, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na ujawnienie się aktywności komórek NK.
  9. Objawy zmiennych poziomów ekspresji CAR
    1. Sprawdź, czy wyrażenie CAR nie jest niespójne wśród komórek NK.
  10. Rozwiązania dla zmiennych poziomów ekspresji CAR
    1. Należy sprawdzić skuteczność metody transfekcji CAR (np. transdukcja wirusa, elektroporacja). W razie potrzeby dostosuj MOI (mnogość infekcji) lub warunki elektroporacji.
    2. Zaimplementuj odpowiednie znaczniki wyboru, aby wzbogacić komórki CAR+ NK. W razie potrzeby należy stosować selekcję antybiotyków lub sortowanie markerami fluorescencyjnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat różnicowania i ekspansji komórek NK pochodzących z anty-GPC3-CAR iPSC
Schemat ideowy ilustruje różnicowanie in vitro komórek NK zmodyfikowanych anty-GPC3-CAR pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oraz schematyczne przedstawienie wektora piggyBac przenoszącego konstrukt GPC3 CAR. Początkowo niezmodyfikowane iPSC są transfekowane wektorem piggyBac kodującym GPC3 CAR (chimeryczny receptor antygenowy). Po transfekcji te iPSC wykazujące ekspr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia ustandaryzowane i powtarzalne podejście do generowania komórek NK pochodzących z iPSC z ekspresją CAR ze spójnego źródła komórkowego, mające na celu ułatwienie ukierunkowanej "gotowej" immunoterapii nowotworów. Liczne badania przedkliniczne i kliniczne wykazały skuteczność adoptywnej immunoterapii opartej na komórkach NK w leczeniu nowotworów przy jednoczesnej minimalizacji toksyczności, takiej jak choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) lub zespół uwalniania cytokin (CRS)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK jest współzałożycielem i doradcą Shoreline Biosciences i posiada udziały w spółce. DSK doradza również firmom Therabest i RedC Bio, z których tytułu otrzymuje dochody i/lub kapitał własny. Warunki tych ustaleń zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Kaufmana za wsparcie, naukowe spostrzeżenia i dyskusje. Badania te były wspierane przez granty NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (suplement administracyjny) oraz Sanford Stem Cell Institute na UCSD. JT: pisanie i korekta manuskryptu. DSK: zrecenzował i zredagował manuskrypt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
aAPC Dziekan A. Lee lab Pożywka hodowlana N/A
a-MEM Fisher Naukowy Kot#12634
APC anty-DYKDDDDK (znacznik FLAGA)BD Biosciences Kot#637308
APC-anty-ludzki TRA-1-81 ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Nauki biologiczne Nr kat.#302015
APC-CD43 BD BiosciencesKat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesKat# 555485 
APC-GPC3BD Nauki biologiczne Kot#DB100B
APC-NKG2D BD Nauki Biologiczne Kot# 558071 
Odczynnik do wykrywania zielonego CellEvent Caspase-3/7 Rybak termiczny Cat#C10423
CellTrace Zestaw do proliferacji fioletowych komórek Rybak termiczny Kot#C34571Barwnik fluorescencyjny do śledzenia komórek 
Rozwiązanie CryoStor Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlPożywka do kriokonserwacji
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GlutaMAX, pirogronianGibco10569010
Zestaw do wzbogacania ludzkich komórek NK EasySep StemCell Technologies, Inc. Kot#19055
EtanoloaminaSigma AldrichE9508
Surowica bydlęca płodu Fisher Naukowy Kategoria# 10437010
FITC-CD94 BD Nauki Biologiczne Kat#555888
Suplement GlutaMAXGibco35050061
GolgiPlug BD Nauki Biologiczne Kot#555029
GolgiStop BD Nauki Biologiczne Cat#554724
Mieszanka odżywcza F-12 szynki, suplement GlutaMAXGibco31765035
surowica dla koni Fisher Naukowy Kot#16050130
Ludzkie Surowica AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
z ludzkich komórek macierzystych Lonza Kot# VPH-5012
Człowiek: Komórki HePG2 ATCC Kot#HB-8065
Człowiek: komórki HePG2-td-pomidora-luca Dan S. Kaufman labN/A
Człowiek: komórki iPS Dan S. Kaufman lab Nie dotyczy
Człowiek: Ogniwa SNU-449 Kot ATCC# CRL-2234
Człowiek: SNU-449-td-tomato-luc cells Dan S. Kaufman labN/A IncuCyte
Caspase-3/7 Test zielonej apoptozy Essenbioscience Kat#4440
Kwas L-askorbinowySigma AldrichA5960
MP Biomedicals  Surowica ludzka, typ ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR plusStemCell Technologies, Inc. 100-0276
Oprogramowanie NovoExpress ACEA Biosciences 
PE/Cy7 przeciwciało anty-ludzkie SSEA-4 Biolegend330420
PE-CD16 BD Nauki Biologiczne Kot#560995 
PE-CD226BD Nauki biologiczne Kot#559789
PE-CD34 BD BiosciencesKat# 555822 
PE-CD45 BD Nauki Biologiczne Kot# 555483 
PE-CD94 BD Nauki Biologiczne Kot#555888 
PE-cy7-CD56 Kot BioLegend# 318318 
Ligand PE-FAS BD Nauki Biologiczne Kot#564261 
PE-NKp30BD Nauki biologiczneKat# 558407
PE-NKp44 BD Nauki Biologiczne Kot#558563 
PE-NKp46BD Nauki biologiczne Nr kat.#331908
PE-NKp46 BD Nauki Biologiczne Kot#557991 
Obwodowa krwioodporna sierść kożuchowa Bank Krwi w San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/) Nie dotyczy szlaku
PE BD Nauki Biologiczne Kot#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Laboratorium Branden Moriarity N/A
plazmid pMAX-GFPLonza N/AGFP kontrola pozytywna 
Pryzmat 9Graphpad Wersja 9
pSpCas9 GenScriptPX165
Bufor do lizy RBC (10x)BiolegendCat#420301
Rekombinowany ludzki bFGF podstawowy R& D Systems Kot#4114-TC
Rekombinowany człowiek BMP-4 PeproTechCat#120-05
Rekombinowany ludzki ligand FLT-3 PeproTechCat# 300-19
Rekombinowana ludzka IL-15 PeproTechCat# 200-15
Rekombinowana ludzka IL-2 PeproTechCat# 200-02
Rekombinowana ludzka IL-3 PeproTechCat#200-03
Rekombinowany człowiek IL-7 PeproTechCat# 200-07
Rekombinowane ludzkie białko węzłoweR& D Systems Kot#3218-ND-025
Rekombinowany człowiek SCF PeproTechCat# 300-07
Rekombinowany ludzki TGF-β 1PeproTechCat#100-21
Rekombinowany ludzki VEGF PeproTechCat# 100-20
Selenin soduSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies, Inc. 5270EB Podłoże formacyjne
STEMdiff APEL2 Średnie StemCell Technologies, Inc. Cat#05270
Super piggyBac Wektor ekspresji transpozazySBICat#PB210PA-1
SYTOX AADzaawansowany zestaw do barwienia martwych komórekThermoFisher ScientificS10274, S10349Zestaw roztworu do barwienia martwych komórek
i beta;-merkaptoetanolGibco21985023
Zestaw Nucleofector" https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805 RPMI1640 Gibco 11875093

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. J Clin Invest. 132 (6), e143762(2022).
  2. Yu, Y. The function of NK cells in tumor metastasis and NK cell-based immunotherapy. Cancers (Basel). 15 (8), 2323(2023).
  3. Paul, S., Lal, G. The molecular mechanism of natural killer cells function and its importance in cancer immunotherapy. Front Immunol. 8, 1124(2017).
  4. Myers, J. A., Miller, J. S. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 85-100 (2021).
  5. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 7, 6(2021).
  6. Yang, Y., Xiong, L., Li, M., Jiang, P., Wang, J., Li, C. Advances in radiotherapy and immunity in hepatocellular carcinoma. J Transl Med. 21 (1), 526(2023).
  7. Rich, N. E., Yopp, A. C., Singal, A. G. Medical management of hepatocellular carcinoma. J Oncol Pract. 13 (6), 356-364 (2017).
  8. Niu, M., Yi, M., Li, N., Wu, K., Wu, K. Advances of Targeted Therapy for Hepatocellular Carcinoma. Front Oncol. 11, 719896(2021).
  9. Yu, S. J. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma: Recent advances and future targets. Pharmacol Ther. 244, 108387(2023).
  10. Ntellas, P., Chau, I. Updates on systemic therapy for hepatocellular carcinoma. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 44, e430028. 44, e430028(2024).
  11. Liu, T. -H., Shen, Y. -C., Cheng, A. -L. Immune checkpoint inhibitors for hepatocellular carcinoma - A game changer in treatment landscape. J Formos Med Assoc. 121 (8), 1371-1383 (2022).
  12. Sun, Q., Hong, Z., Zhang, C., Wang, L., Han, Z., Ma, D. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 320(2023).
  13. Huang, A., Yang, X. -R., Chung, W. -Y., Dennison, A. R., Zhou, J. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 146(2020).
  14. Girardi, D. M., Pacífico, J. P. M., Guedes de Amorim, F. P. L., Dos Santos Fernandes, G., Teixeira, M. C., Pereira, A. A. L. Immunotherapy and targeted therapy for hepatocellular carcinoma: A literature review and treatment perspectives. Pharmaceuticals (Basel). 14 (1), 28(2020).
  15. Laface, C., et al. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: Old and new opportunities. Cancers (Basel). 14 (16), 4028(2022).
  16. Shyam Sunder, S., Sharma, U. C., Pokharel, S. Adverse effects of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy: pathophysiology, mechanisms and clinical management. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 262(2023).
  17. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  18. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  19. Schuster Stephen, J., et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas. N Engl J Med. 377 (26), 2545-2554 (2017).
  20. Schmidt, D., et al. Engineering CAR-NK cells: how to tune innate killer cells for cancer immunotherapy. Immunother Adv. 2 (1), Itac003(2022).
  21. Zhang, B., et al. Chimeric antigen receptor-based natural killer cell immunotherapy in cancer: from bench to bedside. Cell Death Dis. 15 (1), 50(2024).
  22. Wang, K., et al. Reprogramming natural killer cells for cancer therapy. Mol Ther. 32 (9), 2835-2855 (2024).
  23. Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance antitumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192.e5 (2018).
  24. Liu, E., Marin, D., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  25. Chen, L., Xie, T., Wei, B., Di, D. L. Current progress in CAR-T cell therapy for tumor treatment. Oncol Lett. 24 (4), 358(2022).
  26. Rafiq, S., Hackett, C. S., Brentjens, R. J. Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 17 (3), 147-167 (2020).
  27. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  28. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Ther. 28 (9), 513-527 (2021).
  29. Dagher, O. K., Posey, A. D. Forks in the road for CAR T and CAR NK cell cancer therapies. Nat Immunol. 24 (12), 1994-2007 (2023).
  30. Xie, G., Dong, H., Liang, Y., Ham, J. D., Rizwan, R., Chen, J. CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 59, 102975(2020).
  31. Cichocki, F., van der Stegen, S. J. C., Miller, J. S. Engineered and banked iPSCs for advanced NK- and T-cell immunotherapies. Blood. 141 (8), 846-855 (2023).
  32. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  33. Zhu, H., Kaufman, D. S. Engineered human pluripotent stem cell-derived natural killer cells: the next frontier for cancer immunotherapy. Blood Sci. 1 (1), 4-11 (2019).
  34. Knorr, D. A., et al. Clinical-scale derivation of natural killer cells from human pluripotent stem cells for cancer therapy. Stem Cells Transl Med. 2 (4), 274-283 (2013).
  35. Shimizu, Y., Suzuki, T., Yoshikawa, T., Endo, I., Nakatsura, T. Next-generation cancer immunotherapy targeting Glypican-3. Front Oncol. 9, 248(2019).
  36. Schepers, E. J., Glaser, K., Zwolshen, H. M., Hartman, S. J., Bondoc, A. J. Structural and functional impact of posttranslational modification of Glypican-3 on liver carcinogenesis. Cancer Res. 83 (12), 1933-1940 (2023).
  37. Batra, S. A., et al. Glypican-3-specific CAR T cells coexpressing IL15 and IL21 have superior expansion and antitumor activity against hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol Res. 8 (3), 309-320 (2020).
  38. Gao, W., et al. Immunotoxin targeting glypican-3 regresses liver cancer via dual inhibition of Wnt signalling and protein synthesis. Nat Commun. 6, 6536(2015).
  39. Thangaraj, J. L., Coffey, M., Lopez, E., Kaufman, D. S. Disruption of TGF-β signaling pathway is required to mediate effective killing of hepatocellular carcinoma by human iPSC-derived NK cells. Cell Stem Cell. 31 (9), 1327-1343.e5 (2024).
  40. Maddineni, S., Silberstein, J. L., Sunwoo, J. B. Emerging NK cell therapies for cancer and the promise of next generation engineering of iPSC-derived NK cells. J Immunother Cancer. 10 (5), e004693(2022).
  41. Zhu, H., et al. Metabolic reprograming via deletion of CISH in human iPSC-derived NK cells promotes in vivo persistence and enhances antitumor activity. Cell Stem Cell. 27 (2), 224-237.e6 (2020).
  42. Strati, P., et al. Preliminary results of a phase I trial of FT516, an off-the-shelf natural killer (NK) cell therapy derived from a clonal master induced pluripotent stem cell (iPSC) line expressing high-affinity, non-cleavable CD16 (hnCD16), in patients (pts) with relapsed/refractory (R/R) B-cell lymphoma (BCL). J Clin Oncol. 39, 7541-7541 (2021).
  43. Hong, D., et al. Preliminary results of an ongoing phase I trial of FT500, a first-in-class, off-the-shelf, induced pluripotent stem cell (iPSC) derived natural killer (NK) cell therapy in advanced solid tumors. J Immunother Cancer. 8 (3), A231-A232 (2020).
  44. Zah, E., et al. Systematically optimized BCMA/CS1 bispecific CAR-T cells robustly control heterogeneous multiple myeloma. Nat Commun. 11 (1), 2283(2020).
  45. Ahn, S., et al. Cancer immunotherapy with T cells carrying bispecific receptors that mimic antibodies. Cancer Immunol Res. 7 (5), 773-783 (2019).
  46. Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., Diecke, S. ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR Protoc. 4 (3), 102406(2023).
  47. Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2048, 107-119 (2019).
  48. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), e30264(2012).
  49. Leivas, A., et al. NKG2D-CAR-transduced natural killer cells efficiently target multiple myeloma. Blood Cancer J. 11 (8), 146(2021).
  50. Ramdial, J. L., et al. A phase II clinical trial of "Off-the-Shelf" NK cells with allogeneic stem cell transplantation to decrease disease relapse in patients with high-risk myeloid malignancies. Blood. 140 (Supplement 1), 7484-7485 (2022).
  51. Bachanova, V., et al. Initial clinical activity of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 136, 8(2020).
  52. Bae, W. K., et al. A phase I study of locoregional high-dose autologous natural killer cell therapy with hepatic arterial infusion chemotherapy in patients with locally advanced hepatocellular carcinoma. Front Immunol. 13, 879452(2022).
  53. Marin, D., et al. Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial. Nat Med. 30 (3), 772-784 (2024).
  54. Fehniger, T. A., et al. A phase 1 trial of CNDO-109-activated natural killer cells in patients with high-risk acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 24 (8), 1581-1589 (2018).
  55. Nguyen, R., et al. A phase II clinical trial of adoptive transfer of haploidentical natural killer cells for consolidation therapy of pediatric acute myeloid leukemia. J Immunother Cancer. 7 (1), 81(2019).
  56. Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
  57. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. 382 (6), 545-553 (2020).
  58. Daher, M., Melo Garcia, L., Li, Y., Rezvani, K. CAR-NK cells: the next wave of cellular therapy for cancer. Clin Transl Immunology. 10 (4), e1274(2021).
  59. Lin, X., Sun, Y., Dong, X., Liu, Z., Sugimura, R., Xie, G. IPSC-derived CAR-NK cells for cancer immunotherapy. Biomed Pharmacother. 165, 115123(2023).
  60. Bachanova, V., et al. Safety and efficacy of FT596, a first-in-class, multi-antigen targeted, off-the-shelf, iPSC-derived CD19 CAR NK cell therapy in relapsed/refractory B-cell lymphoma. Blood. 138, 823(2021).
  61. Saetersmoen, M. L., Hammer, Q., Valamehr, B., Kaufman, D. S., Malmberg, K. J. Off-the-shelf cell therapy with induced pluripotent stem cell-derived natural killer cells. Semin Immunopathol. 41 (1), 59-68 (2019).
  62. Gerew, A., et al. Deletion of CISH and TGFβR2 in iPSC-derived NK cells promotes high cytotoxicity and enhances in vivo tumor killing. Blood. 138, 2780(2021).
  63. Goldenson, B. H., Hor, P., Kaufman, D. S. iPSC-derived natural killer cell therapies - Expansion and targeting. Front Immunol. 13, 841107(2022).
  64. Karvouni, M., Vidal-Manrique, M., Lundqvist, A., Alici, E. Engineered NK cells against cancer and their potential applications beyond. Front Immunol. 13, 825979(2022).
  65. Ayuso, J. M., et al. Microphysiological model reveals the promise of memory-like natural killer cell immunotherapy for HIV± cancer. Nat Commun. 14 (1), 6681(2023).
  66. Miller, J. S., et al. Safety and virologic impact of haploidentical NK cells plus interleukin 2 or N-803 in HIV infection. J Infect Dis. 229 (5), 1256-1265 (2024).
  67. Gutiérrez-Hoya, A., Soto-Cruz, I. NK cell regulation in cervical cancer and strategies for immunotherapy. Cells. 10 (11), 3104(2021).
  68. Lisco, A., et al. Treatment of relapsing HPV diseases by restored function of natural killer cells. N Engl J Med. 385 (10), 921-929 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki NK z CARindukowane pluripotencjalne kom rki macierzyster nicowanie kom rek NKimmunoterapia nowotwor wcytometria przep ywowaedycja gen wnieviralna integracja gen wmikro rodowisko guzadelecja punkt w kontrolnych uk adu odporno ciowegotworzenie cia embrionalnych

Powiązane artykuły