Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Iniekcja dożylna (IV) jest powszechnie uznawana za najbardziej efektywną i powszechnie stosowaną metodę osiągania ogólnoustrojowego dostarczania substancji w modelach badawczych ssaków. Jednak jego zastosowanie u dorosłych danio pręgowanego do dostarczania leków, przeszczepu komórek macierzystych oraz badań regeneracyjnych i nowotworowych było ograniczone ze względu na wyzwania związane z ich małymi rozmiarami ciała i skomplikowanymi naczyniami krwionośnymi. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w przeszłości badano alternatywne techniki iniekcji, takie jak iniekcja dosercowa i zaoczodołowa (RO) do przeszczepu komórek macierzystych u dorosłych ryb danio pręgowanego. Techniki te mają jednak swoje wady, w tym konieczność stosowania skrupulatnych technik iniekcji lub zwiększone ryzyko śmiertelności.
W tym badaniu opracowaliśmy udoskonaloną i zoptymalizowaną procedurę iniekcji dożylnej specjalnie dostosowaną do dorosłych ryb danio pręgowanego, odpowiadając na wyzwania związane z ich unikalną anatomią. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki, przeprowadziliśmy udane iniekcje dożylne całych komórek szpiku nerkowego od ryb Tg(mpo: EGFP) i barwnika FITC-dekstranu do dorosłej ryby Casper. Późniejsza wizualizacja wstrzykniętych komórek i barwników za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego potwierdziła ich pomyślne dostarczenie i wszczepienie w danio pręgowanego. Ponadto wykazaliśmy, że w porównaniu z iniekcjami dosercowymi i RO, wstrzyknięcie dożylne spowodowało poprawę wskaźników przeżycia i skuteczności wszczepienia u leczonego danio pręgowanego. Takie podejście umożliwia precyzyjne dostarczanie i lokalizację substancji i ma ogromny potencjał w zakresie badań przesiewowych leków i substancji chemicznych na dużą skalę z wykorzystaniem dorosłych ryb danio pręgowanego. Ponadto możliwość wizualnego śledzenia wstrzykniętych komórek i barwników zapewnia bezcenny wgląd w ich wszczepianie, migrację i interakcje z tkankami gospodarza, umożliwiając bardziej kompleksową ocenę efektów terapeutycznych i procesów biologicznych w modelach danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Danio rerio) stał się cennym organizmem modelowym w badaniach biomedycznych, głównie ze względu na swoje genetyczne podobieństwo do ludzi, z ponad 70% ludzkich genów mających odpowiedniki danio pręgowanego1,2. To genetyczne podobieństwo, w połączeniu z kompaktowymi rozmiarami danio pręgowanego, szybkim cyklem rozwojowym i zdolnością do rozległych manipulacji genetycznych, sprawia, że jest to potężne narzędzie do badań naukowych. Atrybuty te są szczególnie korzystne w eksperymentach obejmujących przeszczep komórek, dostarczanie leków i śledzenie komórek. Co więcej, przejrzystość optyczna przezroczystych larw i specyficznych mutantów pigmentacyjnych, takich jak danio pręgowany Casper, pozwala na precyzyjną wizualizację przeszczepionych komórek lub substancji, oferując bardziej wydajną i opłacalną alternatywę dla tradycyjnych modeli zwierzęcych.
Danio pręgowany są powszechnie używane do opracowywania modeli przeszczepiania nowotworów oraz do przeprowadzania badań przesiewowych leków na ciężkie choroby, takie jak glejak, czerniak, guzy trzustki i białaczka3,4,5,6,7,8,9,10. Zazwyczaj modele te są inicjowane w stadium larwalnym, aby wykorzystać niedojrzały układ odpornościowy larw i wrodzoną przezroczystość, co upraszcza proces wstrzykiwania i zwiększa wykonalność badań krótkoterminowych. Jednak użycie larw ogranicza czas oceny wszczepienia i interwencji terapeutycznych7,11. Przeniesienie tych protokołów eksperymentalnych na dorosłe ryby-danio pręgowane wiąże się z wyzwaniami, takimi jak bardziej złożone procedury iniekcji, zmniejszona wydajność wszczepienia, wyższa śmiertelność i zwiększona zmienność indywidualnych reakcji. Wyzwania te podkreślają krytyczną potrzebę ulepszenia technik wstrzykiwania i dostarczania substancji, szczególnie w przypadku badań z udziałem dorosłych danio pręgowanego, które wymagają dłuższych okresów obserwacji.
Historycznie, intracardiac12 i zastrzyki retro-orbitalne (RO) class<="xref">13 były podstawowymi metodami dostarczania leków i przeszczepiania komórek u dorosłych ryb danio pręgowanego. Iniekcje dosercowe, które polegają na wstrzykiwaniu substancji bezpośrednio do serca, zapewnia natychmiastowe ogólnoustrojowe krążenie leków, ale wiąże się ze znacznym ryzykiem, w tym potencjalnym uszkodzeniem serca i wysoką śmiertelnością. Z drugiej strony, iniekcja RO, która dostarcza materiał do zatoki żylnej za okiem, również sprzyja szybkiej dystrybucji ogólnoustrojowej, ale może być stresująca dla ryb i wymaga dużej precyzji wykonania14. Wstrzyknięcia dożylne, dobrze znane w ogólnoustrojowym dostarczaniu substancji u myszy i szczurów, mają kluczowe znaczenie dla badań farmakokinetycznych, ocen skuteczności leków i interwencji terapeutycznych w tych modelach15,16,17,18. Ostatnio zastrzyki dożylne zyskały na znaczeniu w badaniach nad danio pręgowanym, szczególnie w badaniach nad wrodzonymi odpowiedziami immunologicznymi19,20 i ostrym uszkodzeniem nerek21 u larw danio pręgowanego. Jednak ich zastosowanie u dorosłych danio pręgowanego pozostaje ograniczone.
W tym badaniu opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy procedurę iniekcji dożylnej dostosowaną specjalnie dla dorosłych danio pręgowanego, co znacznie poprawia przeżywalność, precyzję i efektywność dostarczania. Wizualnie demonstrujemy tę metodę i przedstawiamy szczegółowy protokół przy użyciu tej wyrafinowanej techniki. Z powodzeniem podaliśmy dożylne iniekcje całych komórek szpiku nerkowego (WKM) od ryb Tg(mpo: EGFP) i barwnika FITC-dekstranu dorosłym rybom Casper, z potwierdzeniem dostawy i wszczepienia ocenianym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Nasze odkrycia pokazują, że udoskonalona technika wstrzykiwania dożylnego jest bardziej wydajna i spójna w porównaniu z tradycyjnymi metodami domięśniowymi i RO. Ponieważ wykorzystanie danio pręgowanego w badaniach naukowych stale się rozwija, przyjęcie tej ulepszonej techniki wstrzykiwania dożylnego prawdopodobnie poszerzy naszą wiedzę na temat patogenezy choroby i przyspieszy rozwój nowych podejść terapeutycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych i Badawczych (CULATR) na Uniwersytecie w Hongkongu (HKU).
1. Przygotowanie materiału do iniekcji
- Przygotować zawiesinę komórkową: 0,9x PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep).
- Wysterylizuj strzykawkę Hamilton i dołączoną igłę (34 G, długość 10 mm, pojemność 10 μl, patrz Tabela Materiałów) w świetle UV o długości fali 270-280 nm i naświetlaj przedmioty przez 2 godziny.
- Przygotuj wysterylizowane patyczki kosmetyczne, podkładki piankowe i bibułkę.
- Przygotować mieszaninę znieczulającą, rozcieńczając trikainę wysterylizowaną wodą dla ryb do końcowego stężenia 0,2 mg/ml.
- W przypadku przeszczepienia komórek WKM u ryb Casper, na 2 dni przed przeszczepieniem należy podać subletalną dawkę napromieniania 25 Gy, podzieloną na dwie sesje po 12,5 Gy każda, podaną tego samego dnia z zachowaniem 7-8 godzinnej przerwy między dawkami. W procesie napromieniania należy umieścić 5-10 dorosłych ryb na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej wodę dla ryb i wystawić je na działanie promienia gamma.
UWAGA: Dawkę określono jako subletalną na podstawie analizy przeżycia po wystawieniu ryb Casper na różne poziomy napromieniowania do 35 Gy, monitorowane przez 30 dni (Rysunek 1A). Dokładny czas ekspozycji należy skalibrować zgodnie z ustawieniami naświetlacza. Napromienianie nie jest wymagane w przypadku zabiegów polegających wyłącznie na podawaniu leków. - Użyj laboratoryjnego sterylizatora parowego w autoklawie do sterylizacji wody dla ryb przeznaczonej do przechowywania ryb poddanych działaniu środka (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec infekcjom i zapewnić bezpieczne środowisko rekonwalescencji ryb po wstrzyknięciu.
UWAGA: Proces sterylizacji jest dostosowany do konkretnej używanej jednostki autoklawu i przestrzegamy wytycznych producenta dotyczących autoklawowania płynnych roztworów w celu przygotowania wody dla ryb. - Przygotuj bufor do płukania igieł: kilka probówek z 75% etanolem i ultraczystą wodą w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
- Przygotować bufor do przeszczepu, rozpuszczając FITC-Dekstran (masa cząsteczkowa: 10 000) we wcześniej przygotowanym podłożu zawiesinowym komórek (0,9x PBS z 5% FBS i 1% Pen/Strep). Dostosuj stężenie do 100 μg/mL.
UWAGA: Ten bufor będzie używany do wstrzykiwań, z planowaną objętością 2 μl na rybę.
2. Przygotowanie całego szpiku nerkowego do przeszczepienia
- Poddaj eutanazji niezbędną liczbę ryb Tg(mpo: EGFP), zanurzając je w roztworze trikainy o stężeniu 0,4 mg/ml, upewniając się, że pozostaną w roztworze przez co najmniej 10 minut po ustaniu ruchu wiecznego.
- Rozciąć ryby Tg(mpo: EGFP) w celu wyizolowania i przeniesienia szpiku nerkowego (KM) do pożywki zawiesiny komórkowej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, jak opisano wcześniej22.
- Zdezagregować komórki KM poprzez pipetowanie i filtrowanie zawiesiny przez nylonowe sitko o średnicy 40 μm.
- Odwirować zawiesinę o stężeniu 500 × g przez 8 minut.
- Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 500 μl zawiesiny komórek.
- Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika z podwielokrotnością 10 μl zawiesiny komórek.
- Ponownie odwirować przy 500 × g przez 8 minut.
- Dostosuj stężenie komórek do 150 000 komórek/μl za pomocą buforu do przeszczepu.
3. Procedura iniekcji
- Przed wstrzyknięciem dokładnie umyć strzykawkę Hamilton 3-4x 75% etanolem. Przepłukać strzykawkę 3-4 razy ultraczystą wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości etanolu.
- Podaj znieczulenie danio pręgowanemu, zanurzając go w mieszaninie znieczulającej, aż zostanie w pełni znieczulony, o czym świadczy zmniejszony ruch i utrata reakcji odruchowych. Gdy ryby zostaną uspokojone, ustaw je grzbietową stroną skierowaną do góry i głową skierowaną w lewo (Ryc. 1B). Ostrożnie połóż rybę na czystej, wilgotnej bibułce, która pomoże ustabilizować ją do wstrzyknięcia. Upewnij się, że tkanka jest wystarczająco wilgotna, aby zapobiec wysychaniu ryby, ale nie na tyle mokra, aby spowodować ślizganie się.
- Chwyć mocno strzykawkę Hamiltona i ustaw igłę pod kątem ~45° do naczynia pierwotnego (żyły ogonowej), aby skutecznie ją skierować, jednocześnie minimalizując uszkodzenia otaczających tkanek. W przypadku danio pręgowanego Capser należy dążyć do części naczynia, która jest widoczna przez jego półprzezroczysty korpus, aby zapewnić dokładne umieszczenie igły (Rysunek 1B). W przypadku danio pręgowanego typu dzikiego (Tubingen, TU) z pigmentowaną skórą, należy dążyć do naczyń głównych, które znajdują się wzdłuż osi ciała i za odbytem w obszarze naczyń pierwotnych (Rysunek 1B). Delikatnie i płynnie wprowadzić igłę do wyznaczonego naczynia, powoli wstrzykiwać (2 μl), aby zminimalizować stres, zapewnić optymalne wchłanianie substancji i delikatnie uciskać miejsce wacikiem przez 10 sekund, aby zatamować krwawienie po wstrzyknięciu.
- Obserwuj pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność sygnałów GFP, zapewniając skuteczność wstrzyknięcia. Upewnij się, że komórki lub barwniki pojawiają się jako zielone sygnały w naczyniu (Rysunek 2A).
- Pozwól rybie dojść do siebie w świeżo wysterylizowanej wodzie dla ryb po wstrzyknięciu przez 10 minut, aż do przeniesienia do zbiornika statycznego.
- Wyczyść igłę zgodnie z wcześniejszym opisem między wstrzyknięciami różnych odczynników.
- Aby zapobiec zlepianiu się komórek, należy przesuwać zawiesinę komórek co 10 minut, aby ponownie zawiesić komórki.
- Utrzymuj maksymalnie 15 przesadzonych ryb w 4-litrowym zbiorniku w statycznych warunkach wodnych przez czas trwania zabiegu. Alternatywnie, przesadzone ryby można przechowywać pojedynczo w zbiornikach statycznych o pojemności 1 l. Wyposaż zbiornik w pompę tlenową i wykonuj codzienne podmiany wody, aby zminimalizować ryzyko infekcji.
- Monitorować i oceniać ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej u ryb około 14 dni po przeszczepie, aby ocenić szybkość wszczepienia. Rejestruj dzienną śmiertelność ryb, aby dokładnie obliczyć wskaźniki przeżycia. Wykonaj jednoczynnikową analizę ANOVA do analizy wszczepienia i test Log-rank do analizy przeżycia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ocenić skuteczność i precyzję różnych metod iniekcji u dorosłych ryb Casper, przeprowadzono analizę porównawczą z wykorzystaniem technik wewnątrzsercowej, przez oko (RO) oraz dożylnej (IV) (Rycyna 2A). Wstrzykiwano zmienne ilości komórek WKM z ryb Tg(mpo: EGFP), z których każda była zmieszana z barwnikiem FITC-dekstraną w stężeniach 1 × 105 oraz 3 × 105 komórek. Sukces każdej metody określano poprzez natychmiastową ocenę mikroskopową obecności sygn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu opracowaliśmy protokół wstrzykiwań dożylnych dostosowany do dorosłych danio pręgowanego, aby zwiększyć precyzję i spójność dostarczania komórek lub leków. Kluczowym elementem tej metody jest możliwość lokalizacji i wizualizacji żyły pierwotnej, co jest kluczowe dla dokładnego podawania substancji. Podczas gdy półprzezroczysta odmiana danio pręgowanego Casper jest zalecana w celu uzyskania optymalnej widoczności statku, nasz protokół można dostosować do stosowania z różnymi dorosłymi szczepami danio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Placówce Danio Pręgowanej z Centrum Badań Medycyny Porównawczej (CCMR) na Uniwersytecie w Hongkongu. Dziękujemy Pani Jo Yiu Ling Wong za pomoc zwierzętom. Prace były wspierane przez Tematyczny Program Badawczy (T12-702/20-N), Projekty Funduszu Badań Zdrowotnych i Medycznych nr 08192066 i nr 08193106, Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC)/Radę Grantów Badawczych (RGC) Wspólny Program Badawczy 2021/22 N_HKU745/21, Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2023YFA1800100) oraz Centrum Onkologii i Immunologii w ramach Inicjatywy Health@InnoHK finansowanej przez Komisję ds. Innowacji i Technologii, Rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkong, Chiny (A.Y.H.L.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Autoklawy Sterylizator parowy | HIRAYAMA | Wirówka HRG-140 | |
| 5424 | Eppendorf | ||
| Countess 3 Automatyczny licznik komórek | Thermofisher | ||
| Countess II FL | Invitrogen | ||
| Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina) | Sigma-aldrich | MKCL9483 | |
| Falcon 40 µ m Sitko do komórek | CORNING | Niebieskie, sterylne, pakowane pojedynczo, 50/skrzynka | |
| FBS, kwalifikowane | Gibco | 26140079 | |
| FITC-Dekstran (MW 10000) | MedChemExpress | 60842-46-8 | |
| Igła do iniekcji | Hamilton | HAMI207434 | 34 G, długość 10 mm |
| Mikrostrzykawka | Hamilton | 7635-01 | 10 &mikro; Pojemność L, Model 701 RN |
| Nikon SMZ18 | |||
| PBS pH 7,4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL) | Gibco&handel; | 15070063 | 100x końcówki |
| do pipet | Eppendorf | epTIPS | |
| Eppendorf | 05-403-151 | ||
| Ultraczysta woda destylowana | Invitrogen | 10977015 |
Bibliografia
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 160(2017).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Etchin, J. P. K. J., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
- Khan, N., Mahajan, N. K., Sinha, P., Jayandharan, G. R. An efficient method to generate xenograft tumor models of acute myeloid leukemia and hepatocellular carcinoma in adult zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 75, 48-55 (2019).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- He, B. L., et al. Functions of flt3 in zebrafish hematopoiesis and its relevance to human acute myeloid leukemia. Blood. 123 (16), 2518-2529 (2014).
- Wang, D., et al. Transgenic IDH2(R172K) and IDH2(R140Q) zebrafish models recapitulated features of human acute myeloid leukemia. Oncogene. 42 (16), 1331(2023).
- Fan, R. Y., et al. Zebrafish xenograft model for studying mechanism and treatment of non-small cell lung cancer brain metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 371(2021).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J Vis Exp. (2), e159(2007).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).
- Hilligan, K. L., et al. Intravenous administration of BCG protects mice against lethal SARS-CoV-2 challenge. J Exp Med. 219 (2), e20211862(2022).
- Moreo, E., et al. Intravenous administration of BCG in mice promotes natural killer and T cell-mediated antitumor immunity in the lung. Nat Commun. 14 (1), 6090(2023).
- Wang, Z., et al. Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses. Sci Rep. 14 (1), 7366(2024).
- Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), e59295(2019).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and Intravenous Microinjections in the Larval Zebrafish to Assess Innate Immune Response. Bio Protoc. 11 (7), e3978(2021).
- van Soest, J. J., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunol. 12, 58(2011).
- Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J Vis Exp. (42), e2079(2010).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
