Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67463

⸱

20 grudnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Streszczenie

Iniekcja dożylna (IV) jest powszechnie uznawana za najbardziej efektywną i powszechnie stosowaną metodę osiągania ogólnoustrojowego dostarczania substancji w modelach badawczych ssaków. Jednak jego zastosowanie u dorosłych danio pręgowanego do dostarczania leków, przeszczepu komórek macierzystych oraz badań regeneracyjnych i nowotworowych było ograniczone ze względu na wyzwania związane z ich małymi rozmiarami ciała i skomplikowanymi naczyniami krwionośnymi. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w przeszłości badano alternatywne techniki iniekcji, takie jak iniekcja dosercowa i zaoczodołowa (RO) do przeszczepu komórek macierzystych u dorosłych ryb danio pręgowanego. Techniki te mają jednak swoje wady, w tym konieczność stosowania skrupulatnych technik iniekcji lub zwiększone ryzyko śmiertelności.

W tym badaniu opracowaliśmy udoskonaloną i zoptymalizowaną procedurę iniekcji dożylnej specjalnie dostosowaną do dorosłych ryb danio pręgowanego, odpowiadając na wyzwania związane z ich unikalną anatomią. Aby zademonstrować skuteczność tej techniki, przeprowadziliśmy udane iniekcje dożylne całych komórek szpiku nerkowego od ryb Tg(mpo: EGFP) i barwnika FITC-dekstranu do dorosłej ryby Casper. Późniejsza wizualizacja wstrzykniętych komórek i barwników za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego potwierdziła ich pomyślne dostarczenie i wszczepienie w danio pręgowanego. Ponadto wykazaliśmy, że w porównaniu z iniekcjami dosercowymi i RO, wstrzyknięcie dożylne spowodowało poprawę wskaźników przeżycia i skuteczności wszczepienia u leczonego danio pręgowanego. Takie podejście umożliwia precyzyjne dostarczanie i lokalizację substancji i ma ogromny potencjał w zakresie badań przesiewowych leków i substancji chemicznych na dużą skalę z wykorzystaniem dorosłych ryb danio pręgowanego. Ponadto możliwość wizualnego śledzenia wstrzykniętych komórek i barwników zapewnia bezcenny wgląd w ich wszczepianie, migrację i interakcje z tkankami gospodarza, umożliwiając bardziej kompleksową ocenę efektów terapeutycznych i procesów biologicznych w modelach danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Danio rerio) stał się cennym organizmem modelowym w badaniach biomedycznych, głównie ze względu na swoje genetyczne podobieństwo do ludzi, z ponad 70% ludzkich genów mających odpowiedniki danio pręgowanego1,2. To genetyczne podobieństwo, w połączeniu z kompaktowymi rozmiarami danio pręgowanego, szybkim cyklem rozwojowym i zdolnością do rozległych manipulacji genetycznych, sprawia, że jest to potężne narzędzie do badań naukowych. Atrybuty te są szczególnie korzystne w eksperymentach obejmujących przeszczep komórek, dostarczanie leków i śledzenie komórek. Co więcej, przejrzystość optyczna przezroczystych larw i specyficznych mutantów pigmentacyjnych, takich jak danio pręgowany Casper, pozwala na precyzyjną wizualizację przeszczepionych komórek lub substancji, oferując bardziej wydajną i opłacalną alternatywę dla tradycyjnych modeli zwierzęcych.

Danio pręgowany są powszechnie używane do opracowywania modeli przeszczepiania nowotworów oraz do przeprowadzania badań przesiewowych leków na ciężkie choroby, takie jak glejak, czerniak, guzy trzustki i białaczka3,4,5,6,7,8,9,10. Zazwyczaj modele te są inicjowane w stadium larwalnym, aby wykorzystać niedojrzały układ odpornościowy larw i wrodzoną przezroczystość, co upraszcza proces wstrzykiwania i zwiększa wykonalność badań krótkoterminowych. Jednak użycie larw ogranicza czas oceny wszczepienia i interwencji terapeutycznych7,11. Przeniesienie tych protokołów eksperymentalnych na dorosłe ryby-danio pręgowane wiąże się z wyzwaniami, takimi jak bardziej złożone procedury iniekcji, zmniejszona wydajność wszczepienia, wyższa śmiertelność i zwiększona zmienność indywidualnych reakcji. Wyzwania te podkreślają krytyczną potrzebę ulepszenia technik wstrzykiwania i dostarczania substancji, szczególnie w przypadku badań z udziałem dorosłych danio pręgowanego, które wymagają dłuższych okresów obserwacji.

Historycznie, intracardiac12 i zastrzyki retro-orbitalne (RO) class<="xref">13 były podstawowymi metodami dostarczania leków i przeszczepiania komórek u dorosłych ryb danio pręgowanego. Iniekcje dosercowe, które polegają na wstrzykiwaniu substancji bezpośrednio do serca, zapewnia natychmiastowe ogólnoustrojowe krążenie leków, ale wiąże się ze znacznym ryzykiem, w tym potencjalnym uszkodzeniem serca i wysoką śmiertelnością. Z drugiej strony, iniekcja RO, która dostarcza materiał do zatoki żylnej za okiem, również sprzyja szybkiej dystrybucji ogólnoustrojowej, ale może być stresująca dla ryb i wymaga dużej precyzji wykonania14. Wstrzyknięcia dożylne, dobrze znane w ogólnoustrojowym dostarczaniu substancji u myszy i szczurów, mają kluczowe znaczenie dla badań farmakokinetycznych, ocen skuteczności leków i interwencji terapeutycznych w tych modelach15,16,17,18. Ostatnio zastrzyki dożylne zyskały na znaczeniu w badaniach nad danio pręgowanym, szczególnie w badaniach nad wrodzonymi odpowiedziami immunologicznymi19,20 i ostrym uszkodzeniem nerek21 u larw danio pręgowanego. Jednak ich zastosowanie u dorosłych danio pręgowanego pozostaje ograniczone.

W tym badaniu opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy procedurę iniekcji dożylnej dostosowaną specjalnie dla dorosłych danio pręgowanego, co znacznie poprawia przeżywalność, precyzję i efektywność dostarczania. Wizualnie demonstrujemy tę metodę i przedstawiamy szczegółowy protokół przy użyciu tej wyrafinowanej techniki. Z powodzeniem podaliśmy dożylne iniekcje całych komórek szpiku nerkowego (WKM) od ryb Tg(mpo: EGFP) i barwnika FITC-dekstranu dorosłym rybom Casper, z potwierdzeniem dostawy i wszczepienia ocenianym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Nasze odkrycia pokazują, że udoskonalona technika wstrzykiwania dożylnego jest bardziej wydajna i spójna w porównaniu z tradycyjnymi metodami domięśniowymi i RO. Ponieważ wykorzystanie danio pręgowanego w badaniach naukowych stale się rozwija, przyjęcie tej ulepszonej techniki wstrzykiwania dożylnego prawdopodobnie poszerzy naszą wiedzę na temat patogenezy choroby i przyspieszy rozwój nowych podejść terapeutycznych.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych i Badawczych (CULATR) na Uniwersytecie w Hongkongu (HKU).

1. Przygotowanie materiału do iniekcji

  1. Przygotować zawiesinę komórkową: 0,9x PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep).
  2. Wysterylizuj strzykawkę Hamilton i dołączoną igłę (34 G, długość 10 mm, pojemność 10 μl, patrz Tabela Materiałów) w świetle UV o długości fali 270-280 nm i naświetlaj przedmioty przez 2 godziny.
  3. Przygotuj wysterylizowane patyczki kosmetyczne, podkładki piankowe i bibułkę.
  4. Przygotować mieszaninę znieczulającą, rozcieńczając trikainę wysterylizowaną wodą dla ryb do końcowego stężenia 0,2 mg/ml.
  5. W przypadku przeszczepienia komórek WKM u ryb Casper, na 2 dni przed przeszczepieniem należy podać subletalną dawkę napromieniania 25 Gy, podzieloną na dwie sesje po 12,5 Gy każda, podaną tego samego dnia z zachowaniem 7-8 godzinnej przerwy między dawkami. W procesie napromieniania należy umieścić 5-10 dorosłych ryb na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej wodę dla ryb i wystawić je na działanie promienia gamma.
    UWAGA: Dawkę określono jako subletalną na podstawie analizy przeżycia po wystawieniu ryb Casper na różne poziomy napromieniowania do 35 Gy, monitorowane przez 30 dni (Rysunek 1A). Dokładny czas ekspozycji należy skalibrować zgodnie z ustawieniami naświetlacza. Napromienianie nie jest wymagane w przypadku zabiegów polegających wyłącznie na podawaniu leków.
  6. Użyj laboratoryjnego sterylizatora parowego w autoklawie do sterylizacji wody dla ryb przeznaczonej do przechowywania ryb poddanych działaniu środka (patrz Tabela materiałów), aby zapobiec infekcjom i zapewnić bezpieczne środowisko rekonwalescencji ryb po wstrzyknięciu.
    UWAGA: Proces sterylizacji jest dostosowany do konkretnej używanej jednostki autoklawu i przestrzegamy wytycznych producenta dotyczących autoklawowania płynnych roztworów w celu przygotowania wody dla ryb.
  7. Przygotuj bufor do płukania igieł: kilka probówek z 75% etanolem i ultraczystą wodą w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  8. Przygotować bufor do przeszczepu, rozpuszczając FITC-Dekstran (masa cząsteczkowa: 10 000) we wcześniej przygotowanym podłożu zawiesinowym komórek (0,9x PBS z 5% FBS i 1% Pen/Strep). Dostosuj stężenie do 100 μg/mL.
    UWAGA: Ten bufor będzie używany do wstrzykiwań, z planowaną objętością 2 μl na rybę.

2. Przygotowanie całego szpiku nerkowego do przeszczepienia

  1. Poddaj eutanazji niezbędną liczbę ryb Tg(mpo: EGFP), zanurzając je w roztworze trikainy o stężeniu 0,4 mg/ml, upewniając się, że pozostaną w roztworze przez co najmniej 10 minut po ustaniu ruchu wiecznego.
  2. Rozciąć ryby Tg(mpo: EGFP) w celu wyizolowania i przeniesienia szpiku nerkowego (KM) do pożywki zawiesiny komórkowej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, jak opisano wcześniej22.
  3. Zdezagregować komórki KM poprzez pipetowanie i filtrowanie zawiesiny przez nylonowe sitko o średnicy 40 μm.
  4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 500 × g przez 8 minut.
  5. Odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 500 μl zawiesiny komórek.
  6. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika z podwielokrotnością 10 μl zawiesiny komórek.
  7. Ponownie odwirować przy 500 × g przez 8 minut.
  8. Dostosuj stężenie komórek do 150 000 komórek/μl za pomocą buforu do przeszczepu.

3. Procedura iniekcji

  1. Przed wstrzyknięciem dokładnie umyć strzykawkę Hamilton 3-4x 75% etanolem. Przepłukać strzykawkę 3-4 razy ultraczystą wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości etanolu.
  2. Podaj znieczulenie danio pręgowanemu, zanurzając go w mieszaninie znieczulającej, aż zostanie w pełni znieczulony, o czym świadczy zmniejszony ruch i utrata reakcji odruchowych. Gdy ryby zostaną uspokojone, ustaw je grzbietową stroną skierowaną do góry i głową skierowaną w lewo (Ryc. 1B). Ostrożnie połóż rybę na czystej, wilgotnej bibułce, która pomoże ustabilizować ją do wstrzyknięcia. Upewnij się, że tkanka jest wystarczająco wilgotna, aby zapobiec wysychaniu ryby, ale nie na tyle mokra, aby spowodować ślizganie się.
  3. Chwyć mocno strzykawkę Hamiltona i ustaw igłę pod kątem ~45° do naczynia pierwotnego (żyły ogonowej), aby skutecznie ją skierować, jednocześnie minimalizując uszkodzenia otaczających tkanek. W przypadku danio pręgowanego Capser należy dążyć do części naczynia, która jest widoczna przez jego półprzezroczysty korpus, aby zapewnić dokładne umieszczenie igły (Rysunek 1B). W przypadku danio pręgowanego typu dzikiego (Tubingen, TU) z pigmentowaną skórą, należy dążyć do naczyń głównych, które znajdują się wzdłuż osi ciała i za odbytem w obszarze naczyń pierwotnych (Rysunek 1B). Delikatnie i płynnie wprowadzić igłę do wyznaczonego naczynia, powoli wstrzykiwać (2 μl), aby zminimalizować stres, zapewnić optymalne wchłanianie substancji i delikatnie uciskać miejsce wacikiem przez 10 sekund, aby zatamować krwawienie po wstrzyknięciu.
  4. Obserwuj pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność sygnałów GFP, zapewniając skuteczność wstrzyknięcia. Upewnij się, że komórki lub barwniki pojawiają się jako zielone sygnały w naczyniu (Rysunek 2A).
  5. Pozwól rybie dojść do siebie w świeżo wysterylizowanej wodzie dla ryb po wstrzyknięciu przez 10 minut, aż do przeniesienia do zbiornika statycznego.
  6. Wyczyść igłę zgodnie z wcześniejszym opisem między wstrzyknięciami różnych odczynników.
  7. Aby zapobiec zlepianiu się komórek, należy przesuwać zawiesinę komórek co 10 minut, aby ponownie zawiesić komórki.
  8. Utrzymuj maksymalnie 15 przesadzonych ryb w 4-litrowym zbiorniku w statycznych warunkach wodnych przez czas trwania zabiegu. Alternatywnie, przesadzone ryby można przechowywać pojedynczo w zbiornikach statycznych o pojemności 1 l. Wyposaż zbiornik w pompę tlenową i wykonuj codzienne podmiany wody, aby zminimalizować ryzyko infekcji.
  9. Monitorować i oceniać ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej u ryb około 14 dni po przeszczepie, aby ocenić szybkość wszczepienia. Rejestruj dzienną śmiertelność ryb, aby dokładnie obliczyć wskaźniki przeżycia. Wykonaj jednoczynnikową analizę ANOVA do analizy wszczepienia i test Log-rank do analizy przeżycia.

Wyniki

Aby ocenić skuteczność i precyzję różnych metod iniekcji u dorosłych ryb Casper, przeprowadzono analizę porównawczą z wykorzystaniem technik wewnątrzsercowej, przez oko (RO) oraz dożylnej (IV) (Rycyna 2A). Wstrzykiwano zmienne ilości komórek WKM z ryb Tg(mpo: EGFP), z których każda była zmieszana z barwnikiem FITC-dekstraną w stężeniach 1 × 105 oraz 3 × 105 komórek. Sukces każdej metody określano poprzez natychmiastową ocenę mikroskopową obecności sygnału GFP po iniekcji. Wyniki wykazały znaczące różnice w skuteczności dostarczania pomiędzy poszczególnymi metodami. Metoda iniekcji IV wykazała najwyższą skuteczność, gdyż sygnały GFP wykryto u 41 z 43 ryb. W przeciwieństwie do niej, metoda RO wykazała ograniczony sukces, przy czym udane iniekcje zaobserwowano jedynie u 3 z 37 ryb. Metoda wewnątrzsercowa pozwoliła na skuteczne dostarczenie komórek u 11 z 40 ryb (Rycyna 2A). Monitorowano również przeżywalność przeszczepionych ryb. Ryby poddane iniekcjom metodą RO i wewnątrzsercową miały znacznie niższą przeżywalność w porównaniu do ryb poddanych iniekcji dożylnej (Rycyna 2B). Co istotne, liczba wstrzykniętych komórek wpływała na wskaźniki przeżywalności wśród ryb poddanych iniekcji IV, przy czym lepszą przeżywalność odnotowano u biorców otrzymujących 3 × 105 komórek. Wyniki te wskazują na wyższą skuteczność i niezawodność metody iniekcji IV w dostarczaniu komórek i substancji do dorosłych danio-ostrobramkowych.

Wydajność engraftmentu komórek WKM u biorców ryb Casper została dokładnie oceniona poprzez monitorowanie sygnału GFP z przeszczepionych komórek. U ryb, które otrzymały wstrzyknięcia dożylne (IV), sygnały GFP były wykrywalne już w trzeciej dobie po transplantacji (Rycina 2C), co wskazuje na szybki i efektywny proces engraftmentu. W przeciwieństwie do nich, ryby poddane procedurze RO oraz wstrzyknięciom wewnątrzsercowym wykazały opóźnione pojawienie się sygnału GFP, co świadczy o wolniejszym tempie engraftmentu. Do 17. doby po transplantacji przeszczepione komórki w przeważającej mierze repopulowały szpik nerkowy, przy czym najsilniejsze sygnały GFP zaobserwowano u ryb po wstrzyknięciu IV (Rycina 2C). Analiza cytometryczna KM biorców dodatkowo potwierdziła skuteczność metody wstrzykiwania IV. U biorców, którym początkowo wstrzyknięto dożylnie 3 × 105 komórek, około 18% komórek w KM było GFP-dodatnich, co jest proporcją zbliżoną do tej znalezionej w szpiku nerkowym ryb donorów Tg(mpo: EGFP), które nie przeszły transplantacji (Rycina 2D,E). W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie wewnątrzsercowe skutkowało obecnością około 5% komórek GFP-dodatnich, natomiast metoda RO przyniosła jedynie około 2% komórek GFP-dodatnich w szpiku nerkowym biorców. Ponadto stopień engraftmentu korelował dodatnio z liczbą wstrzykniętych komórek, wykazując, że wyższe dawki komórkowe prowadziły do większego engraftmentu. Wyniki te potwierdzają skuteczność techniki wstrzykiwania IV w ułatwianiu engraftmentu komórek i późniejszej repopulacji szpiku nerkowego.

Wykres prawdopodobieństwa przeżycia po napromieniowaniu; schemat metody iniekcji u ryb z wynikami fluorescencji.
Rycina 1: Wyniki przeżywalności po napromieniowaniu i iniekcji dożylnej u dorosłych danio pręgowanych. (A) Ryby Casper poddano napromieniowaniu dawką do 35 Gy i monitorowano przeżywalność przez 30 dni, co potwierdziło, że dawka 25 Gy jest dawką podletalną (n = 10 dla wszystkich grup). (B) Schematy ilustrujące miejsca iniekcji dla ryb Casper oraz TU, wraz z przykładami pomyślnie poddanych iniekcji ryb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Metody iniekcji u rybek zebrafish; wykres przeżywalności; analiza GFP; wyniki transplantacji komórek.
Rysunek 2: Porównanie iniekcji zakulniszowych, wewnątrzsercowych i dożylnych u dorosłych rybek zebrafish. (A) Schematy i reprezentatywne wyniki metod iniekcji RO, wewnątrzsercowej i IV u dorosłych rybek zebrafish. Liczby w prawym dolnym rogu wskazują liczbę ryb z udaną iniekcją lub błędną iniekcją w stosunku do całkowitej liczby prób dla każdej metody; sygnał GFP zweryfikowano pod mikroskopem fluorescencyjnym bezpośrednio po iniekcji. (B) Ogólna przeżywalność biorców po transplantacji różnych liczb komórek szpiku nerkowego dawcy za pomocą różnych metod iniekcji (IV-100K: n = 24; wewnątrzsercowa-100K: n = 10; RO-100K: n = 12; IV-300K: n = 20; wewnątrzsercowa-300K: n = 6; RO-300K: n = 8). (C) Obserwacja wydajności przyjęcia przeszczepu u biorców po transplantacji metodą RO, iniekcji wewnątrzsercowej i IV. (D) Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej dla komórek GFP-dodatnich w KM biorców 17 dni po transplantacji. (E) Procent komórek GFP+ w KM biorców 17 dni po transplantacji, a także w KM ryb dawców Tg(mpo:EGFP) bez napromieniowania (IV-100K: n = 30; wewnątrzsercowa-100K: n = 28; RO-100K: n = 22; IV-300K: n = 22; wewnątrzsercowa-300K: n = 26; RO-300K: n = 18). Dane przedstawiono jako średnia ± s.e.m. Dla D przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). Dla B zastosowano test Log-Rank. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Paski skali = 1 mm (A, C). Skróty: RO = retro-orbital (zakulniszowa); IV = intravenous (dożylna); GFP = green fluorescent protein (zielone białko fluorescencyjne); KM = kidney marrow (szpik nerkowy); SSC-A = side scatter-peak area; FITC-A = fluorescein isothiocyanate-peak area. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym badaniu opracowaliśmy protokół wstrzykiwań dożylnych dostosowany do dorosłych danio pręgowanego, aby zwiększyć precyzję i spójność dostarczania komórek lub leków. Kluczowym elementem tej metody jest możliwość lokalizacji i wizualizacji żyły pierwotnej, co jest kluczowe dla dokładnego podawania substancji. Podczas gdy półprzezroczysta odmiana danio pręgowanego Casper jest zalecana w celu uzyskania optymalnej widoczności statku, nasz protokół można dostosować do stosowania z różnymi dorosłymi szczepami danio pręgowanego, pod warunkiem odpowiednich regulacji widoczności i dokładności. Dobór odpowiedniej grubości igły był niezbędny, aby zminimalizować uszkodzenia naczyń krwionośnych i zapewnić skuteczny transport substancji. Ponadto priorytetowo potraktowano kompleksową opiekę poiniekcyjną, w tym utrzymanie czystej i dobrze natlenionej wody. Praktyki te nie tylko usprawniły proces wstrzykiwania, ale także znacznie poprawiły zdrowie i przeżywalność danio pręgowanego, prowadząc w ten sposób do bardziej wiarygodnych i powtarzalnych wyników eksperymentalnych.

Ponadto przeprowadziliśmy analizę porównawczą technik iniekcji dosercowych, RO i dożylnych u dorosłych danio pręgowanego, wykazując wyraźne zalety metody dożylnej w zwiększaniu przeżywalności i promowaniu wszczepienia komórek. Pomimo ich tradycyjnego stosowania, zastrzyki dosercowe wiążą się z wysoką śmiertelnością13, a precyzja wymagana do skutecznych iniekcji RO jest trudna do konsekwentnego osiągnięcia14. Minimalnie inwazyjny charakter techniki dożylnej znacznie łagodzi stres i urazy fizyczne ryb, prowadząc do znacznej poprawy przeżywalności i wyników wszczepienia po wstrzyknięciu. Ponadto szybka wykrywalność sygnałów GFP w 3 dniu po przeszczepieniu u ryb, którym wstrzyknięto dożylnie, dodatkowo podkreśla skuteczność metody w ułatwianiu skutecznego wszczepiania komórek. W przeciwieństwie do tego, wolniejsze pojawianie się sygnałów GFP u ryb, którym wstrzyknięto dosercowo, i prawie brak sygnałów u ryb, którym wstrzyknięto RO, podkreślają ograniczenia tych alternatywnych metod, sugerując, że podejście dożylne jest bardziej skutecznym podejściem.

Chociaż metoda iniekcji dożylnej oferuje znaczące korzyści, ma potencjalne ograniczenia, takie jak konieczność specjalistycznego sprzętu i szkolenia w celu osiągnięcia wysokiej precyzji. Ponadto, podczas gdy przezierność szczepu Casper ułatwia wizualizację żył, dostosowanie tej metody do mniej przezroczystych szczepów może wymagać dodatkowej widoczności i ulepszeń technologicznych. Ponadto potrzebne są dalsze badania, aby ocenić długoterminowe skutki wstrzyknięć dożylnych i ocenić stabilność przeszczepionych komórek przez dłuższy czas u zebryba, co będzie miało kluczowe znaczenie dla walidacji trwałego sukcesu i bezpieczeństwa tej techniki.

Skuteczność techniki iniekcji dożylnej w dostarczaniu substancji do krwiobiegu i osiąganiu wysokich poziomów wszczepienia u dorosłych danio pręgowanych ma kilka implikacji dla przyszłych badań. Metoda ta umożliwia bardziej efektywne wykorzystanie dorosłych ryb danio pręgowanego w badaniach długoterminowych, eliminując pewne ograniczenia związane z modelami larwalnymi. Niezawodność metody dożylnej zwiększa dokładność modeli do badania złożonych chorób i przeprowadzania badań przesiewowych leków, co może prowadzić do znacznych postępów w strategiach terapeutycznych. Ponadto sukces zastrzyków dożylnych w uzyskaniu solidnego wszczepienia stanowi solidną podstawę do dalszych badań nad manipulacją genetyczną i transplantacją, co jest niezbędne do badania zaburzeń genetycznych i odpowiedzi immunologicznych. Postępy w tym protokole wstrzykiwań dożylnych mogą wnieść znaczący wkład w badania nad danio pręgowanym, udoskonalając narzędzia do badań biomedycznych i przyspieszając postęp w zrozumieniu i leczeniu chorób ludzkich.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Placówce Danio Pręgowanej z Centrum Badań Medycyny Porównawczej (CCMR) na Uniwersytecie w Hongkongu. Dziękujemy Pani Jo Yiu Ling Wong za pomoc zwierzętom. Prace były wspierane przez Tematyczny Program Badawczy (T12-702/20-N), Projekty Funduszu Badań Zdrowotnych i Medycznych nr 08192066 i nr 08193106, Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC)/Radę Grantów Badawczych (RGC) Wspólny Program Badawczy 2021/22 N_HKU745/21, Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2023YFA1800100) oraz Centrum Onkologii i Immunologii w ramach Inicjatywy Health@InnoHK finansowanej przez Komisję ds. Innowacji i Technologii, Rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkong, Chiny (A.Y.H.L.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Autoklawy Sterylizator parowyHIRAYAMA Wirówka HRG-140
5424Eppendorf
Countess 3 Automatyczny licznik komórekThermofisher
Countess II FLInvitrogen
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 µ m Sitko do komórekCORNINGNiebieskie, sterylne, pakowane pojedynczo, 50/skrzynka
FBS, kwalifikowaneGibco26140079
FITC-Dekstran (MW 10000) MedChemExpress60842-46-8
Igła do iniekcjiHamilton HAMI20743434 G, długość 10 mm
MikrostrzykawkaHamilton 7635-01 10 &mikro; Pojemność L, Model 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7,4 (1x)Gibco10010023
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)Gibco&handel;15070063100x końcówki
do pipetEppendorf epTIPS
Eppendorf 05-403-151
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977015
Pipeta jednokanałowa

Bibliografia

  1. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  3. Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 36 (1), 160(2017).
  4. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  5. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  6. Etchin, J. P. K. J., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Khan, N., Mahajan, N. K., Sinha, P., Jayandharan, G. R. An efficient method to generate xenograft tumor models of acute myeloid leukemia and hepatocellular carcinoma in adult zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 75, 48-55 (2019).
  8. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  9. He, B. L., et al. Functions of flt3 in zebrafish hematopoiesis and its relevance to human acute myeloid leukemia. Blood. 123 (16), 2518-2529 (2014).
  10. Wang, D., et al. Transgenic IDH2(R172K) and IDH2(R140Q) zebrafish models recapitulated features of human acute myeloid leukemia. Oncogene. 42 (16), 1331(2023).
  11. Fan, R. Y., et al. Zebrafish xenograft model for studying mechanism and treatment of non-small cell lung cancer brain metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 371(2021).
  12. LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J Vis Exp. (2), e159(2007).
  13. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), e1645(2009).
  14. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660(2017).
  15. Hilligan, K. L., et al. Intravenous administration of BCG protects mice against lethal SARS-CoV-2 challenge. J Exp Med. 219 (2), e20211862(2022).
  16. Moreo, E., et al. Intravenous administration of BCG in mice promotes natural killer and T cell-mediated antitumor immunity in the lung. Nat Commun. 14 (1), 6090(2023).
  17. Wang, Z., et al. Intravenous administration of IL-12 encoding self-replicating RNA-lipid nanoparticle complex leads to safe and effective antitumor responses. Sci Rep. 14 (1), 7366(2024).
  18. Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), e59295(2019).
  19. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and Intravenous Microinjections in the Larval Zebrafish to Assess Innate Immune Response. Bio Protoc. 11 (7), e3978(2021).
  20. van Soest, J. J., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunol. 12, 58(2011).
  21. Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J Vis Exp. (42), e2079(2010).
  22. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki szpiku nerkowegoengrafting kom rekiniekcja zakulnainiekcja wewn trzsercowacytometria przep yewowatransgeniczne danio pr kowaneprzesiewanie lek wmikroskopia fluorescencyjna
Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.