Przygotowanie mikropocisków do armatki genowej oraz transfekcja biolistyczna neuronów w kulturze plastrów tkankowych

Podsumowanie

Opisujemy metodę przygotowania złotych mikrocząsteczek (tzw. „bullets”) powlekanych DNA oraz demonstrujemy wykorzystanie tych cząsteczek do biolistycznej transfekcji neuronów w hodowanych plastrach hipokampa.

Streszczenie

Transfekcja biolistyczna jest fizyczną metodą transfekcji komórek poprzez bombardowanie tkanki cząsteczkami powleczonymi DNA, poruszającymi się z dużą prędkością. Przedstawiamy szczegółowy protokół transfekcji biolistycznej skrawków hipokampa szczura, począwszy od wstępnego przygotowania mikrocząsteczek powleczonych DNA, aż po końcowe „ostrzelanie” organotypowych kultur skrawków za pomocą armatki genowej. Transfekcja za pomocą armatki genowej jest wydajnym i prostym sposobem transfekcji neuronów i jest szczególnie użyteczna do fluorescencyjnego znakowania niewielkiej podgrupy komórek w skrawku tkanki. W tym filmie najpierw opisujemy kroki niezbędne do powlekania cząsteczek złota DNA. Następnie demonstrujemy, jak wyłożyć wnętrze plastikowej rurki mikrocząsteczkami złota/DNA oraz jak przeciąć tę rurkę, aby uzyskać plastikowe wkłady do załadowania do armatki genowej. Na koniec przeprowadzamy transfekcję biolistyczną kultur skrawków hipokampa szczura, prezentując obsługę armatki genowej Bio-Rad Helios oraz oferując wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów w celu uzyskania zdrowych i optymalnie transfekowanych skrawków tkanki.

Protokół

PROTOKÓŁ TRANSFEKCJI BIOLISTYCZNEJ

Przygotowanie punktów

„Bulletsy” są stabilne do 6 miesięcy, jednak po 2-3 miesiącach ich wydajność transfekcji może zacząć spadać. „Bulletsy” należy przechowywać w temperaturze 4°C w obecności granulek osuszających. Przed otwarciem fiolek scyntylacyjnych, w których przechowywane są „bulletsy”, należy zawsze odczekać, aż osiągną one temperaturę pokojową.

Przed rozpoczęciem należy przygotować:

• Spermidyna (0,05 M)
• CaCl₂ (1 M)
• EtOH (100% – wysokiej czystości – nieotworzona butelka)
• Autoklawowana H₂O
• DNA do transfekcji
• Poliwinylopirydon (roztwór PVP-20 mg/ml)
• 2 x 15 ml probówki stożkowe (zestaw 2/pocisk)
• Rurka (cięta na 1 x ~30 cali/zestaw pociskowy)
• Fiolki do scyntylacji (1/zestaw pociskowy)
• Granulaty osuszające
• Strzykawka 10 ml z rurką na końcu

Przygotuj wężyki:

1. Osusz ~ 30 calów rurki (około 2 cali wystających poza prawym pierścieniem O-ring) w stacji do rurek za pomocą gazu N₂ (ciśnienie 0,4) przez minimum 20 min.

Wytrącanie DNA na kuleczkach złota:

1. Przygotować DNA do transfekcji w całkowitej objętości 50 μL w probówce do mikrocentryfugi (maksymalnie 50 μg całkowitej ilości DNA)
2. Odważyć 6-8 mg złota i przenieść do probówki do mikrocentryfugi
3. Dodać do złota 100 μL 0,05M spermidyny i poddać sonikacji przez 20 s
4. Dodać 50 μL DNA do mieszaniny złota i spermidyny
5. Wymieszać w wstrząsarce Vortex (ustawienie około 5) przy otwartej zakrętce
6. Dodać kroplami 100 μL 1M CaCl₂
7. Poddać krótkiej sonikacji (< 5 s)
8. Pozostawić do wytrącenia przez 10 min w temperaturze pokojowej
9. Poddać krótkiej sonikacji

Przygotuj roztwór PVP podczas sonikacji:

1. Przygotuj rozcieńczony roztwór PVP w stożkowej probówce 15 ml, przygotowując 3,5 ml rozcieńczonego PVP dla każdego zestawu kuletek (dodaj 7,5 μL roztwoku PVP 20 mg/ml do 3,5 ml 100% EtOH)

Płukanie kulek złota EtOH:

1. Odwirować złote koraliki z maksymalną prędkością przez 10 sec w mikrocentryfudze
2. Odlać supernatant, pozostawiając niewielką ilość cieczy nad złotymi koralikami
3. Przemyć 3X za pomocą 1ml EtOH, w razie potrzeby krótko sonikując po każdym razie

Resuspenduj złoto/DNA w roztworze PVP:

1. Resuspend pellet złota w 200 μL rozcieńczonego roztworu PVP/EtOH (3,5 ml)
2. Wymieszaj pellet złota na wortexie w celu resuspensji (w razie potrzeby krótko poddaj sonikacji)
3. Przenieś 200 μL roztworu złoto/PVP do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL
4. Postępuj w ten sposób, dodając po 200 μL PVP, aż całe złoto zostanie przeniesione do probówki stożkowej 15 mL, a objętość końcowa wyniesie 3,2 mL

Powlekanie rurek:

1. Wyłącz N₂ w stacji z rurkami i wyjmij wysuszone rurki
2. Podłącz wysuszone rurki do strzykawki 10 ml
3. Energicznie wstrząśnij probówką stożkową 15 mL wypełnioną roztworem złoto/PVP
4. Umieść koniec rurki w roztworze złoto/PVP i powoli wciągnij ciecz, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza
5. Pozostaw ok. 2 cali suchego odcinka na obu końcach rurek
6. Trzymając rurkę nadal podłączoną do strzykawki i wypełnioną roztworem złoto/PVP, ostrożnie umieść rurkę z powrotem w stacji
7. Zaznacz końce rurek w miejscu, w którym znajduje się roztwór
8. Pozostaw złoto na 5 min w celu osadzenia przy podłączonej strzykawce
9. Bardzo powoli wciągnij roztwór, przesuwając tłok strzykawki tak, aby osadzone złoto pozostało w probówce (należy upewnić się, że nie nastąpi przepłukanie wsteczne)
10. Odłącz strzykawkę
11. Obróć o 90° i odczekaj 2 sekundy
12. Obróć o 180° i odczekaj kolejne 2 sekundy
13. Obracaj rurką przez 5 sek
14. Włącz N₂ tak, aby manometr wskazywał wartość między 0,4 a 0,5, i obracaj rurki pokryte złotem podczas suszenia przez 5 min.

Przycinanie rurek:

1. Zdejmij dren z przygotowawczej stacji drenów i odetnij końce w wyznaczonych miejscach.
2. Umieść opisaną fiolkę scyntylacyjną pod przecinarką do drenów, aby zbierać odcięte wkłady.
3. Umieść dren w przecinarce i przetnij go czystą żyletką.
4. Włóż pellety osuszające do fiolki scyntylacyjnej.
5. Przechowuj wkłady w temperaturze 4°C.

Filmowanie przekrojów tkanek

Podczas ostrzeliwania hodowanych skrawków tkanek ważne jest zastosowanie relatywnie sterylnej techniki, aby uniknąć kontaminacji. Należy pamiętać, że przy ostrzeliwaniu dwóch różnych konstruktów oba zestawy pocisków można załadować do jednego uchwytu kasetowego, jednak wkładkę lufy oraz ekran należy wymienić pomiędzy konstruktami.

Przed rozpoczęciem należy przygotować:

• Kule DNA (pozostawić fiolkę scyntylacyjną do ogrzania do temperatury pokojowej przed otwarciem)
• Przekroje tkanki
• Gene Gun Helios
• Butla z hellem z podłączonym wężem do gene gun
• Uchwyt wkładu
• Wkładka lufy z zamontowanym plastikowym o-ringiem
• Dyfuzor (zmodyfikowany)
• Sito dyfuzora
• Pinceta

Przygotowanie pistoletu genowego:

1. Za pomocą pęsety umieść plastikowe wkłady powlekane złotem w uchwycie na wkłady.
2. Włóż uchwyt na wkłady do gene gun, przesuwając najpierw blokadę.
3. Zabezpiecz uchwyt na wkłady za pomocą blokady.
4. Pobierz tuleję lufy z zamontowanym pierścieniem O oraz ekranem dyfuzyjnym.
5. Wkręć tuleję lufy do gene gun.

Bombardowanie hodowlanych przekrojów za pomocą armatki genowej:

1. Założyć ochronniki słuchu
2. Podłączyć pistolet genowy do węża połączonego z butlą z Helem
3. Zwiększyć ciśnienie w butli do 180 PSI
4. Wykonać strzał jałowy w powietrze, aby usunąć kurz lub zanieczyszczenia z ekranu dyfuzyjnego. Aby wystrzelić z pistoletu, najpierw należy nacisnąć przycisk blokady bezpieczeństwa i trzymać go do momentu usłyszenia sygnału dźwiękowego, a następnie pociągnąć za spust.
5. Po wykonaniu strzału jałowego wyjąć skrawki z inkubatora
6. Przesunąć pistolet nad pierwszą konstrukcję
7. Wystrzelić, utrzymując ekran dyfuzyjny w odległości około 0,5 - 1 cala od skrawka
8. Przesunąć kasetę pomiędzy dołkami.
9. Po wystrzeleniu do ostatniego dołka umieścić skrawki z powrotem w inkubatorze
10. Zakręcić dopływ gazu i upuścić ciśnienie przed odłączeniem pistoletu od węża z Helem
11. Odkręcić tuleję lufy, a następnie wyjąć kasetę i zużyte ładunki

Czyszczenie uchwytów wkładów i wkładów rurki:

1. Umieścić wkłady, tuleje lufy i ekrany dyfuzyjne w zlewce z wodą z mydłem
2. Wstawić zlewkę do myjki ultradźwiękowej i sonikować przez 20 min
3. Dokładnie wypłukać wodą, aż do usunięcia wszystkich pozostałości mydła
4. Namoczyć w 70% EtOH przez godzinę
5. Położyć na suchym ręczniku papierowym na noc w celu wysuszenia
6. Oczyszczone wkłady, tuleje lufy i ekrany można następnie wykorzystać w kolejnych transfekcjach biolistycznych

Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów w transfekcji biolistycznej

Transfekcja biolistyczna może czasami prowadzić do nieoptymalnych warunków transfekcji.  Może ona skutkować zbyt małą lub zbyt dużą liczbą transfekowanych komórek, zbyt wysokim lub zbyt niskim poziomem ekspresji, bądź może spowodować ogólne pogorszenie stanu zdrowia przekrojów tkankowych. Często niezdrowe przekroje są wynikiem gwałtownego wyrzutu pod ciśnieniem.  Oto kilka wskazówek, jak uzyskać optymalnie transfekowane przekroje tkankowe.

Jeśli przekroje wydają się niezdrowe (lub jeśli zbyt wiele komórki są transfekowane/ skrawek), spróbuj:

• zwiększenie odległości strzału
• zmniejszenie ciśnienia w zbiorniku gazu
• zmniejszenie ilości złota
• wycięcie środkowej części dyfuzora Bio-Rad i zastąpienie jej sitem dyfuzyjnym.

Jeśli przetransfekowano zbyt mało komórek, należy spróbować:

• zmniejszenie dystansu strzału
• zwiększenie ciśnienia w zbiorniku gazu
• zwiększenie ilości złota
• zwiększenie liczby przekrojów tkanki na studzienkę
• należy upewnić się, że o-ring w tulei lufy jest nieuszkodzony.

Jeśli w jednej serii strzałów uzyskasz preparaty z zbyt dużą ORAZ zbyt małą liczbą przetransfekowanych komórek, upewnij się, że:

• pistolet jest trzymany symetrycznie nad dołkiem
• złoto równomiernie pokrywa wnętrze rurki. (Jeśli powstaje linia złota, po osadzeniu się złota należy szybciej odessać nadpływ z rurki i dłużej obracać złoto przed włączeniem azotu. Jeśli natomiast pojawiają się smugi złota, wynika to prawdopodobnie ze zbyt długiej ekspozycji na wilgoć podczas przygotowywania pocisków: należy upewnić się, że używana jest nieotwierana butelka EtOH, rurka jest całkowicie sucha przed powlekaniem, a nakładanie zakrętek i przygotowywanie pocisków odbywa się sprawnie i bezzwłocznie).

Jeśli wydajność transfekcji wydaje się optymalna (liczba przetransfekowanych komórek / plaster), ale poziom ekspresji wydaje się zbyt wysoki lub zbyt niski:

• dostosuj stosunek DNA do złota  (np. jeśli jest zbyt niski, zachowaj ilość złota, ale zwiększ ilość DNA).
• dostosuj czas pomiędzy naświetlaniem a gromadzeniem danych

W przypadku transfekcji podwójnej, jeśli ekspresja jednego z konstruktów jest zbyt niska, należy odpowiednio dostosować stosunek obu konstruktów oraz upewnić się, że oba znajdują się pod kontrolą tego samego promotora, aby zapobiec sytuacji, w której jeden promotor zdominuje drugi.

Dyskusja

Transfekcja biolistyczna jest fizyczną metodą transfekcji komórek poprzez bombardowanie żywej tkanki cząsteczkami złota powleczonymi DNA, poruszającymi się z dużą prędkością. W ogólnym ujęciu, w przypadku transferu genów za pośrednictwem cząsteczek, do transfekcji komórek dochodzi, gdy cząsteczka zatrzymuje się w jądrze komórkowym. Chociaż istnieje wiele różnych metod transfekcji, takich jak mikroiniekcja, lipofekcja, transfekcja fosforanem wapnia, elektroporacja i transfekcja wirusowa, transfekcja biolistyczna może stanowić mniej pracochłonną i wydajną alternatywę dla transfekcji komórek, które nie poddają się łatwo innym metodom. W rzeczywistości technika ta została opracowana początkowo jako metoda transferu genów u roślin, ponieważ obecność ściany komórkowej utrudniała transfekcję przy użyciu istniejących wcześniej metod¹. Podobnie, metoda biolistyczna zyskała popularność w dziedzinie neurobiologii, gdyż neurony postmitotyczne są znane z trudności w transfekcji^2,3. W szczególności jest ona powszechnie uznawana za główną technikę stosowaną w eksperymentach mających na celu ocenę szczegółowej morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonych skrawkach mózgu. Metody opisane w niniejszym materiale stanowią szczegółowe i wyczerpujące wyjaśnienie tego, jak przeprowadzić transfekcję biolistyczną hodowanych skrawków mózgu przy użyciu ręcznego pistoletu genowego (system Helios Gene Gun; Bio-Rad).

Transfekcja biolistyczna stała się preferowaną metodą transfekcji neuronów w kulturach skrawków tkanki, ponieważ pozwala na transfekcję niewielkiej liczby komórek rozproszonych w całym skrawku mózgu. W ten sposób poszczególne neurony mogą być badane w izolacji. Ponieważ technika ta jest szczególnie odpowiednia do transfekcji neuronów w skrawkach mózgu, często stosuje się ją w połączeniu z mikroskopią dwufotonową, gdyż wzbudzanie dwufotonowe umożliwia wizualizację komórek znakowanych fluorescencyjnie głęboko w tkankach rozpraszających światło⁴. Rzeczywiście, przedstawione w tym filmie obrazy pojedynczych neuronów piramidowych przy dużym powiększeniu zostały zarejestrowane przy użyciu specjalnie zbudowanego dwufotonowego skaningowego mikroskopu laserowego. Podsumowując, transfekcja biolistyczna jest wydajnym sposobem transfekcji pojedynczych komórek w kontekście wysokiej gęstości komórek otaczających, a co za tym idzie, okazała się niezwykle użyteczna w fluorescencyjnym znakowaniu pojedynczych neuronów w kulturach skrawków neuronalnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
cząsteczki złota 1.6um (mikronośniki)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1 pinta	Goldshield
Tubing do wkładów		Bio-Rad	1652412
Fiolki scyntylacyjne	20ml, 500/opakowanie	VWR international	66021-668
Granulki osuszające	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Sonikator w kąpieli wodnej	model 50T	VWR international
Uchwyt do wkładów	opakowanie 5 szt.	Bio-Rad	1652426
Wkładka do tuby	opakowanie 5 szt.	Bio-Rad	1652417
Sito dyfuzyjne	opakowanie 5 szt.	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Rozmiar 007, Ilość 100	McMaster-Carr
Sito (siatka)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml w EtOH	Bio-Rad		Dostarczane z tubingiem z firmy Bio-Rad
Stacja do przygotowania tubingów		Bio-Rad	1652418
Obcinarka do tubingów		Bio-Rad	1652422
Działo genowe Helios		Bio-Rad	1652411
Wąż do działa genowego		Bio-Rad		Dostarczany z działem genowym
Spermidyna	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
Chociaż wszystkie produkty wymieniliśmy osobno, bardziej ekonomiczne jest zakupienie zestawu "Helios Gene-Gun System", który zawiera wszystkie powyższe produkty firmy Bio-Rad (nr kat. 165-2431).