Artykuł metodologiczny

Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67544

⸱

8 lipca 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Aby badać regulację przepływu krwi w mózgu in vivo, tradycyjne metody farmakologiczne są inwazyjne, często uszkadzając czaszkę, oponę twardą i opony mózgowo-rdzeniowe. W ramach tej pracy opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę, która łączy wstrzykiwanie intracisternal magna (ICM) pod kontrolą nanoiniektora z laserowym obrazowaniem kontrastowym, zachowując integralność czaszki i opon mózgowo-rdzeniowych.

Streszczenie

Regulacja przepływu krwi w mózgu (CBF) jest kluczowa dla utrzymania funkcji poznawczych, ale jej mechanizmy leżące u podstaw pozostają słabo poznane. Badanie procesów komórkowych i molekularnych związanych z tą regulacją wymaga podejścia farmakologicznego, które umożliwia precyzyjne dostarczanie leków do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), umożliwiając jednocześnie monitorowanie dynamiki przepływu krwi w mózgu w czasie rzeczywistym. W niniejszej pracy przedstawiono metodę badania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo poprzez połączenie iniekcji intracisternal magna (ICM) opartej na nanoiniektorach z laserowym obrazowaniem z kontrastem plamkowym.

Technika iniekcji ICM oparta na nanolitrowym wtryskiwaczu pozwala na precyzyjne dostarczanie leków w dynamicznym zakresie od nL/min do μL/min. W naszych eksperymentach takie podejście znacznie zmniejszyło objętość iniekcji z tradycyjnych 5-10 μl do zaledwie 1,5 μl, utrzymując w ten sposób normalne ciśnienie śródczaszkowe. W połączeniu z laserowym obrazowaniem z kontrastem plamkowym byliśmy w stanie monitorować dynamikę przepływu krwi w mózgu (CBF) w czasie rzeczywistym przed, w trakcie i po wstrzyknięciach ICM.

Korzystając z tej metody, oceniliśmy zmiany CBF w odpowiedzi na wstrzyknięcie ICM trzech różnych leków rozszerzających naczynia krwionośne: (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG), acetylocholiny i adenozyny. Podczas gdy wszystkie trzy leki rozszerzające naczynia krwionośne zwiększały podstawową CBF, miały one wyraźny wpływ na dynamikę CBF. Na przykład wpływ adenozyny był przejściowy, podczas gdy DHPG i acetylocholina powodowały długotrwałe efekty. Dzięki swoim unikalnym zaletom, metoda ta stanowi cenne uzupełnienie zestawu narzędzi do badania regulacji CBF u gryzoni in vivo.

Wprowadzenie

Mózgowy przepływ krwi (CBF) zapewnia ciągły dopływ tlenu i składników odżywczych do mózgu, jednocześnie usuwając odpady metaboliczne, co jest niezbędne do utrzymania prawidłowych funkcji poznawczych1,2. W warunkach homeostatycznych CBF pozostaje względnie stabilny pomimo wahań ciśnienia perfuzji, procesu znanego jako autoregulacja3,4,5. Oprócz autoregulacji, lokalny CBF może być dynamicznie regulowany w odpowiedzi na pobliską aktywność neuronalną, zjawisko określane jako sprzężenie nerwowo-naczyniowe6,7. Zarówno autoregulacja, jak i sprzężenie nerwowo-naczyniowe są regulowane przez grupę komórek - komórki śródbłonka, komórki muralowe, astrocyty, fibroblasty i neurony - wspólnie znane jako komórki elementarne nerwowo-naczyniowe4,7. Jednak mechanizmy komórkowe i molekularne, za pomocą których te różne typy komórek koordynują swoje działania w celu modulowania CBF, są nadal w dużej mierze nieznane.

Metody badania regulacji CBF są zazwyczaj podzielone na modele in vitro i in vivo. Badania in vitro, często z użyciem ostrych wycinków mózgu, są zwykle łączone z technikami elektrofizjologicznymi lub farmakologicznymi w celu zbadania, w jaki sposób neurony i komórki glejowe regulują rozszerzenie lub zwężenie poszczególnych naczyń krwionośnych8,9,10. Podstawowym ograniczeniem modeli in vitro jest to, że nie odtwarzają one warunków in vivo, w szczególności braku fizjologicznego ciśnienia krwi. Modele in vivo do badania regulacji CBF obejmują podejścia od makro do mikroskali. Techniki makroskalowe, takie jak pozytonowa tomografia emisyjna (PET) i funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI), są nieinwazyjne, ale mają niską rozdzielczość przestrzenną i czasową11,12,13,14.

Podstawową metodą mikroskalową do badania CBF in vivo jest obrazowanie dwufotonowe, które zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenno-czasową9,15,16,17,18. Jednak ta technika wymaga usunięcia czaszki i opony twardej, a w połączeniu z manipulacją farmakologiczną staje się jeszcze bardziej inwazyjna, potencjalnie powodując krwotok, uszkadzając tkankę mózgową i zmieniając ciśnienie śródczaszkowe19. Dlatego tak ważne jest, aby dysponować metodą manipulowania i monitorowania CBF in vivo, która spełnia określone kryteria: powinna być nieinwazyjna (zachowująca integralność czaszki, opon mózgowo-rdzeniowych i naczyń krwionośnych), zapewniać wysoką rozdzielczość przestrzenno-czasową i umożliwiać precyzyjną farmakologiczną manipulację CBF. W tym artykule przedstawiamy nową metodę, która łączy w sobie iniekcję intracisternal magna (ICM) opartą na iniektorze nanolitrowym i laserowe obrazowanie kontrastowe plamkowe, spełniając wszystkie te wymagania.

Tradycyjne farmakologiczne podejścia do badania regulacji CBF często polegają na usunięciu czaszki i opon mózgowych, aby odsłonić tkankę mózgową do miejscowego dostarczania leków. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie ICM pozwala uniknąć tego uszkodzenia poprzez podawanie leków bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), umożliwiając im podążanie za naturalnym przepływem płynu mózgowo-rdzeniowego, a tym samym lepsze naśladowanie warunków fizjologicznych. Jednym z wyzwań związanych z wstrzykiwaniem ICM jest to, że zwykle wymaga ono dużych objętości płynu - często 5 μl lub więcej u myszy20. Biorąc pod uwagę, że całkowita objętość płynu mózgowo-rdzeniowego u dorosłych myszy wynosi około 36 μl, wstrzyknięcie 5 μl może zwiększyć ciśnienie śródczaszkowe i zmienić dynamikę CBF. Nasz system nanoiniektorów, który wykorzystuje szklane pipety, dostarcza płyn z precyzyjną kontrolą objętości i prędkości, nie powodując wycieku płynu mózgowo-rdzeniowego w miejscu wstrzyknięcia.

Uretan i alfa-chloraloza są używane w naszym badaniu, ponieważ zapewniają bardziej stabilną fizjologiczną podstawę przepływu krwi w mózgu i zachowują sprzężenie nerwowo-naczyniowe (NVC) lepiej niż powszechnie stosowane alternatywy, takie jak izofluran czy ketamina/ksylazyna (KX). Korzystając z tego systemu, przetestowaliśmy trzy różne leki rozszerzające naczynia krwionośne - (S)-3,5-dihydroksyfenyloglicynę (DHPG), acetylocholinę i adenozynę i potwierdziliśmy, że umożliwia on precyzyjną manipulację i monitorowanie dynamiki CBF in vivo.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Wirginii. Wszystkie eksperymenty były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Do eksperymentów wykorzystano sześć samców myszy C57BL/6 w wieku 10-14 tygodni. Procedury chirurgiczne są opisane w Rysunek 1A.

1. Przygotowanie do operacji

  1. Umieść poduszkę grzewczą na ramie stereotaktycznej i podgrzej ją do 37 °C ~20 min przed zabiegiem. Przygotować świeży uretan (750 mg/kg) i chloralozę (50 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do znieczulenia.
    UWAGA: W celu przygotowania roztworu alfa-chloralozy w PBS podgrzaliśmy roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i wirowaliśmy go co 10-15 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Zarówno roztwory uretanu, jak i alfa-chloralozy przefiltrowano przed użyciem za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
  2. Przed zabiegiem zbierz wszystkie niezbędne narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki, kleszcze, uchwyty do mikroigieł, hemostatyki, waciki, wycieraczki i szwy. Sterylizować narzędzia w autoklawie (121 °C przy 15 psi przez 60 min).
  3. Przygotuj szklane rurki kapilarne (średnica zewnętrzna 1,14 mm, średnica wewnętrzna 0,53 mm, długość 88,9 mm). Użyj ściągacza do szkła, aby utworzyć szklane pipety do wstrzykiwań21. Preferowana rezystancja pipety wynosi około 80 - 100 MΩ. Wysterylizuj i przechowuj szklane pipety w czystym pojemniku.
  4. Przygotować nanoiniektor o odpowiedniej objętości wstrzyknięcia (25 nL - 4,5 μL) i prędkości (6 nL/s - 644 nL/s).
  5. Przygotować następujące roztwory rozszerzające naczynia krwionośne w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF): (S)-3,5-dihydroksyfenyloglicyna (DHPG) w dawce 5 mM, acetylocholina w stężeniu 0,5 mM i adenozyna w stężeniu 10 mM.
  6. Przygotować meloksykam (4,0 mg/kg) w celu złagodzenia bólu podczas zabiegu chirurgicznego. Meloksykam należy podawać myszom podskórnie na około 30 minut przed zabiegiem, aby zapewnić odpowiednią analgezję.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Zważ sześć samców myszy C57BL/6 (w wieku 10-14 tygodni) i znieczulenie ich poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie uretanu (750 mg/kg) i chloralozy (50 mg/kg). Umieść myszy w komorze anestezjologicznej z 1% izofluranem, aby utrzymać znieczulenie. Proces ten trwa około 40 min do 1 godz.
    UWAGA: Izofluran może przyspieszyć indukcję znieczulenia.
  2. Ostrożnie wyjmij myszy z komory anestezjologicznej i oceń głębokość znieczulenia, potwierdzając brak odruchu szczypania palców u stóp. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż krem do depilacji na czubek czaszki i kark, aby usunąć sierść.
  3. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i nakładaj ponownie w razie potrzeby przez cały zabieg. Regularnie monitoruj podczas eksperymentu i w razie potrzeby podawaj dodatkową maść.
  4. Ustaw mysz w pozycji leżącej w ramie stereotaktycznej, zapewniając odpowiednią wentylację powietrzem medycznym o natężeniu przepływu od 1 do 2 l/min. Zabezpiecz mysz za pomocą nauszników, aby zapewnić prawidłowe mocowanie, a następnie delikatnie przechyl głowę w dół, aby utworzyć kąt 120° z ciałem, odsłaniając w ten sposób cisterna magna.
    UWAGA: Izofluran jest stosowany wyłącznie do indukcji znieczulenia, a nie w fazie podtrzymującej.
  5. Zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą co najmniej trzech naprzemiennych aplikacji 70% alkoholu i peelingu chirurgicznego (np. chlorheksydyny lub jodowidonu), aby zapewnić odpowiednią sterylizację skóry.
  6. Zlokalizuj grzebień potyliczny pod mikroskopem chirurgicznym. Podnieś leżącą na niej skórę pęsetą i wykonaj 1 cm nacięcie w linii środkowej. Kontroluj krwawienie za pomocą bawełnianych wacików.
  7. Odsłoń mięśnie szyi i ostrożnie naciąć je i rozdzielić wzdłuż linii środkowej za pomocą kleszczy. Użyj dwóch zakrzywionych kleszczy, po jednym w każdej ręce, aby delikatnie cofnąć mięśnie i odsłonić oponę twardą, która tworzy zewnętrzną granicę cisterna magna.
  8. Dostosuj pozycję głowy, przechylając ją w dół, aby utworzyć kąt 150° z ciałem w celu optymalnego naświetlenia cisterna magna.
  9. Wykonaj nacięcie 5 mm wzdłuż szwu strzałkowego, obejmujące zarówno punkty lambda, jak i bregma. Za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczy delikatnie odciągnij skórę na bok i oczyść powierzchnię czaszki solą fizjologiczną. Upewnij się, że na odsłoniętej czaszce nie pozostały żadne włosy.
  10. Po oczyszczeniu nałóż warstwę żelu ultradźwiękowego o grubości ~1 mm na odsłoniętą czaszkę za pomocą bawełnianych wacików, aby utrzymać wilgoć w okolicy. Ponieważ żel do ultradźwięków może zawierać pęcherzyki powietrza, przed obrazowaniem należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte.
  11. Umieść mysz pod soczewką systemu obrazowania z kontrastem laserowym. Włącz system i towarzyszące mu oprogramowanie. Upewnij się, że mózg myszy jest wyśrodkowany w polu obrazowania, a następnie użyj funkcji automatycznego ustawiania ostrości, aby uzyskać prawidłową ostrość do obrazowania. W razie potrzeby delikatnie usuń wszelkie pozostałe włoski lub pęcherzyki powietrza z pola obrazowania za pomocą pęsety.

3. Konfiguracja nanoiniekcji

  1. Przymocuj pompę do ramienia manipulatora stereotaktycznego i podłącz do sterownika. Włącz sterownik i wybierz pompę docelową. Na panelu sterowania ustaw KIERUNEK na ZAPARZANIE. Ustaw prędkość na 2 μl na minutę, a objętość na 4,5 μl.
    UWAGA: System nanoiniekcji składa się z dwóch głównych elementów: pompy wtryskowej i sterownika. Każdy sterownik może obsługiwać dwie pompy jednocześnie. Do wtrysku ICM używamy tylko jednej pompy.
  2. Po zakończeniu napełniania należy wyjąć z pojemnika jedną szklaną pipetę i napełnić ją bezbarwnym, bezwonnym olejem mineralnym za pomocą elastycznej igły MicroFil o pojemności 34 g lub podobnego rodzaju igły. Upewnij się, że cała szklana pipeta jest wypełniona olejem.
  3. Odkręć tuleję zaciskową pompy, włóż szklaną pipetę, a następnie dokręć tuleję zaciskową. Upewnij się, że wewnątrz szklanej pipety nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Zmień KIERUNEK w panelu sterowania na WYCOFAJ. Ustaw prędkość na 2 μ l/min, a głośność na 4,5 μ L.
  5. Przesuń ramię stereotaktyczne, aby delikatnie wprowadzić pipetę do przygotowanego roztworu i pobrać żądaną objętość.

4. Wstrzykiwanie leków rozszerzających naczynia krwionośne do cisterna magna i monitorowanie CBF

  1. Upewnij się, że pompa jest bezpiecznie przymocowana do ramienia manipulatora stereotaktycznego. Wyreguluj kąt ramienia manipulatora stereotaktycznego na 45° w płaszczyźnie przednio-tylnej.
  2. Za pomocą zakrzywionej pęsety pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie naświetl cisterna magna. Oczyść obszar solą fizjologiczną, aby usunąć krew. Użyj stereotaktycznego mikromanipulatora, aby umieścić szklaną pipetę w pobliżu opony twardej cisterna magna.
  3. Gdy szklana pipeta dotknie opony twardej, delikatnie manewruj nią, aby przeszła do środka cisterna magna, unikając jakiejkolwiek penetracji móżdżku lub rdzenia. Upewnij się, że końcówka szklanej pipety jest włożona na głębokość 1-2 mm przed zwolnieniem pęsety.
    UWAGA: Cyfrowa ramka stereotaktyczna jest niezbędna do monitorowania głębokości penetracji szklanych pipet w cisterna magna.
  4. Zmień KIERUNEK na ZAPARZANIE. Ustaw prędkość wtrysku na 300 nL/min, a objętość na 1,5 μL.
  5. Uruchom oprogramowanie do laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym (LSCI) i dostosuj ostrość, aby uzyskać najwyraźniejszy obraz naczyń krwionośnych. Upewnij się, że w polu widzenia nie ma włosów ani pęcherzyków powietrza.
  6. Ustaw interwał obrazowania na 5 s w panelu sterowania LSCI. Zapisuj podstawowy CBF przez około 10 minut, upewniając się, że linia podstawowa pozostaje stabilna. Jeśli występują wahania linii podstawowej, kontynuuj nagrywanie przez dłuższy czas, aż do osiągnięcia stabilności.
  7. Po 10 minutach stabilnego zapisu linii podstawowej rozpocznij nanoiniekcję i zanotuj czas rozpoczęcia wstrzykiwania w systemie rejestracji LSCI. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy oznaczyć czas zakończenia i kontynuować nagrywanie przez dodatkowe 20 minut lub dłużej. Po zakończeniu eksperymentu perfuzję przezsercową myszy za pomocą PBS i pobrać tkanki mózgowe do analizy histologicznej.

Wyniki

Po zakończeniu operacji mysz unieruchomiliśmy w aparacie stereotaktycznym z odczytem cyfrowym (Rysunek 1A,B). W celu pomiaru przepływu krwi w mózgu (CBF), ostrożnie rozsunęliśmy skórę nad czaszką wzdłuż nacięcia i nałożyliśmy przezroczysty żel ultradźwiękowy, aby utrzymać wilgotność powierzchni czaszki (Rysunek 1C). Aby umożliwić wstrzyknięcie do cysterny wielkiej (ICM), wypreparowaliśmy mięśnie szyi wokół grzebienia potylicznego, odsłaniając cisterna magna. Następnie, za pomocą szklanej pipety pobraliśmy roztwór docelowy i, posługując się mikromanipulatorem, wprowadziliśmy szklaną pipetę przez błony cysterny wielkiej na głębokość 1-2 mm (Rysunek 1D,E). Ramię stereotaktyczne ustawiono pod kątem 45o, aby ułatwić wprowadzenie pipety.

Następnie zbadaliśmy dynamiczne zmiany CBF w odpowiedzi na trzy różne leki rozszerzające naczynia krwionośne: (S)-3,5-dihydroksyfenyloglicynę (DHPG), acetylocholinę oraz adenozynę22,23,24,25. Początkowo zarejestrowaliśmy 10-minutową linię bazową przed wstrzyknięciem 1,5 µL każdego z leków z prędkością 300 nL/min przez 5 min. Po wstrzyknięciu rejestrowaliśmy dane przez kolejne 20 min. Nasze wyniki wykazały, że wszystkie trzy leki zwiększyły CBF, choć z odmienną dynamiką. DHPG wywołała gwałtowny wzrost CBF, po którym nastąpił stopniowy spadek po wstrzyknięciu (Rycina 2A,B). W przeciwieństwie do tego, acetylocholina wywołała stopniowy wzrost CBF przez cały okres rejestracji (Rycina 2C,D). Adenozyna również spowodowała przejściowy wzrost CBF, który powrócił do poziomu bazowego około 15-20 min po wstrzyknięciu (Rycina 2E,F).

Schemat i konfiguracja nanoiniekcji: operacja czaszkowa, szklana pipeta, monitorowanie LSCI, iniekcja do cysterny wielkiej.
Rysunek 1: Podsumowanie procedur chirurgicznych. (A) Główne procedury chirurgiczne krok po kroku dla modelu nanoiniekcji + LSCI. (B) Schematy przedstawiające połączony system nanoiniekcji + LSCI. Nanoiniektor jest stabilnie zamocowany na ramieniu stereotaktycznym, a ramię jest nachylone pod kątem 45o, aby ułatwić penetrację błony atlanto-potylicznej w cysternie wielkiej. (C) Widok z góry na czaszkę myszy w systemie LSCI. Czaszka jest pokryta żelem do ultrasonografii. (D) Widok z tyłu przedstawiający szklaną pipetę penetrującą cysternę wielką. Szklana pipeta została wypełniona błękitem Evansa w celu ułatwienia wizualizacji. W tym eksperymencie należy użyć cyfrowej ramy stereotaktycznej, aby można było precyzyjnie określić dystans penetracji. (E) Schematy przedstawiające położenie końcówki szklanej pipety w cysternie wielkiej. Głowa myszy była nachylona pod kątem 30o, aby ułatwić iniekcję do cysterny wielkiej. Skrót: LCSI = obrazowanie kontrastowe laserowego plamkowania (laser speckle contrast imaging). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zmiana przepływu krwi w mózgu po podaniu DHPG, acetylocholiny i adenozyny; mapy cieplne, wykresy, analiza CBF.
Rycina 2: Zwiększony przepływ krwi w mózgu po nanoiniekcji wazodylatatorów. (A) Reprezentatywne obrazy pokazujące zmiany przepływu krwi w mózgu przed i po iniekcji DHPG. Prędkość krwi jest zakodowana kolorami. Kolor niebieski oznacza niską prędkość, a czerwony wysoką prędkość. (B) Przepływ krwi w czasie rzeczywistym w obszarze zaznaczonym czerwoną linią, która wskazuje okno czasowe dla iniekcji DHPG. (C) Reprezentatywne obrazy pokazujące zmiany przepływu krwi w mózgu przed i po iniekcji ACh. Prędkość krwi jest zakodowana kolorami. Kolor niebieski i czerwony wskazują odpowiednio niską i wysoką prędkość. (D) Przepływ krwi w czasie rzeczywistym w obszarze zaznaczonym czerwoną linią, która wskazuje okno czasowe dla iniekcji ACh. (E) Reprezentatywne obrazy pokazujące zmiany przepływu krwi w mózgu przed i po iniekcji adenozyny. Prędkość krwi jest zakodowana kolorami. Kolor niebieski i czerwony wskazują odpowiednio niską i wysoką prędkość. (F) Przepływ krwi w czasie rzeczywistym w obszarze zaznaczonym czerwoną linią, która wskazuje okno czasowe dla iniekcji adenozyny. Skróty: DHPG = (S)-3,5-dihydroksyfenyloglicyna; ACh = acetylocholina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiamy nowatorską metodę badania regulacji przepływu krwi w mózgu (CBF) in vivo poprzez połączenie precyzyjnej nanoiniekcji cisternal magna z laserowym obrazowaniem z kontrastem plamkowym (LSCI). Takie podejście pozwala na dokładne dostarczanie leku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), umożliwiając jednocześnie monitorowanie CBF w czasie rzeczywistym, ułatwiając ocenę reaktywności naczyniowej mózgu.

Manipulacje farmakologiczne i techniki dostarczania leków mają kluczowe znaczenie dla badania CBF i reaktywności naczyń mózgowych in vivo. Tradycyjne metody stosowania leków, takie jak stosowanie leków rozszerzających lub zwężających, często wymagają usunięcia czaszki, co może uszkodzić opony mózgowo-rdzeniowe, a nawet miąższ mózgu 9,10,18. Te inwazyjne techniki mogą zakłócić mikrośrodowisko mózgu, szczególnie poprzez powodowanie uszkodzeń naczyń krwionośnych i krwotoku, nie odtwarzając w ten sposób rzeczywistych warunków fizjologicznych. Natomiast nasza metoda ma cztery istotne zalety.

Po pierwsze, nasze podejście do stosowania leków jest nieinwazyjne i pozwala zachować warunki fizjologiczne. Po drugie, klasyczne metody iniekcji ICM zazwyczaj opierają się na strzykawkach lub kaniulach, co może prowadzić do wycieku leków lub śladowych ilości i płynu mózgowo-rdzeniowego ze względu na duży rozmiar końcówek. Te tradycyjne metody często wymagają dużych ilości leku lub śladowych ilości - zwykle 5 μl lub więcej, co może zmienić ciśnienie śródczaszkowe. W przeciwieństwie do tego, nasza iniekcja ICM sterowana nanowtryskiwaczem wymaga tylko niewielkiej objętości, wynoszącej zaledwie 1,5 μl lub mniej. Dodatkowo prędkość wtrysku może być precyzyjnie kontrolowana w szerokim zakresie, od 1 nL/s do 100 nL/s. Zazwyczaj używamy prędkości 5 nL/s (300 nL/min), ponieważ szybkość ta nie wpływa na ciśnienie śródczaszkowe. Po trzecie, w przeciwieństwie do wstrzykiwań leków kierowanych pipetą do miąższu mózgu lub perfuzji leku na powierzchnię kory mózgowej, nasze wstrzykiwanie leków oparte na iniekcjach cisternal magna podąża za naturalnym przepływem płynu mózgowo-rdzeniowego, ściśle naśladując warunki fizjologiczne. Wreszcie, ponieważ nasza metoda zachowuje integralność czaszki i opon mózgowych, możemy przeprowadzić pomiary na tej samej grupie myszy w różnych punktach czasowych, co pozwala na porównania podłużne - coś, co jest niewykonalne przy użyciu innych metod stosowania leków. W przypadku badań przeżycia i porównań podłużnych należy przestrzegać ścisłych technik aseptyki, w tym właściwego przygotowania skóry, stosowania sterylnych narzędzi i materiałów oraz zgodności z wytycznymi instytucji w zakresie opieki nad zwierzętami. Na zagojenie się ran należy przewidzieć dwutygodniowy okres rekonwalescencji.

Metoda znieczulenia może znacząco wpłynąć na CBF. Na przykład znieczulenie ketaminowo-ksylazynowe może podnieść CBF o ponad 50% powyżej poziomu wyjściowego, podczas gdy izofluran może podwoić podstawowy poziom CBF. W naszych eksperymentach zdecydowaliśmy się na uretan i chloralozę ze względu na ich minimalny wpływ na układ sercowo-naczyniowy, co pomaga utrzymać fizjologiczny poziom CBF, powszechnie stosowanego w tej dziedzinie26,27. Ponadto pominęliśmy kaniulację dotętniczą, aby wielokrotny pomiar gazometrii krwi był nieinwazyjny, chociaż takie procedury można połączyć z naszą metodą26.

Nasze podejście integruje dwa systemy: system iniekcji ICM oparty na nanoiniekcji28 oraz system obrazowania kontrastowego z laserowym kontrastem plamkowym (LSCI)29. Eksperymentatorzy muszą być przeszkoleni w obu systemach, aby pomyślnie przeprowadzić procedurę. Ponieważ system LSCI zajmuje całą przestrzeń nad głową myszy, przechylenie ramienia o 45o nie tylko ułatwia wstrzykiwanie ICM, ale także zapewnia kompatybilność między tymi dwoma systemami. Ta konfiguracja ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu.

Dla początkujących korzystających z iniekcji ICM pod kontrolą nanoiniektora wymagana jest intensywna praktyka, aby opanować koordynację rozdzielania mięśni za pomocą pęsety w jednej ręce, podczas gdy drugą manewrowanie mikromanipulatorem w celu prowadzenia szklanej pipety. Dobre światło lasera i stereoskop z ramieniem przegubowym są niezbędne do optymalnej wizualizacji podczas zabiegu.

Za pomocą tej metody oceniliśmy, jak klasyczne leki rozszerzające naczynia krwionośne, takie jak DHPG, acetylocholina i adenozyna, wpływają na CBF. Zgodnie z przewidywaniami, wszystkie trzy leki rozszerzające naczynia krwionośne zwiększały CBF; Indukowały one jednak różną dynamikę. DHPG spowodował gwałtowny wzrost CBF, po którym nastąpił powolny rozpad, podczas gdy acetylocholina wywołała stopniowy wzrost. W przeciwieństwie do tego, adenozyna powodowała tylko przejściowy wzrost CBF.

Ta metoda powinna mieć również zastosowanie do modeli szczurów. Jednak biorąc pod uwagę, że grubość czaszki szczura wynosi około 0,5-1 mm, będzie musiała zostać rozrzedzona w celu obrazowania kontrastowego plamek laserowych. Dodatkowo, chociaż obecna metoda może być dostosowana do myszy obudzonych z głową, wymaga intensywnego treningu, aby zminimalizować ruch zwierząt podczas eksperymentów. Użyliśmy ograniczonej liczby myszy, aby zademonstrować naszą metodę; W związku z tym nasze badanie jest statystycznie ograniczone i należy zachować ostrożność przy wyciąganiu szerokich wniosków z naszych ustaleń.

Aby uzyskać spójne i wiarygodne pomiary CBF, ważne jest, aby eksperymentatorzy uznali, że inne parametry fizjologiczne, takie jak temperatura ciała, ciśnienie krwi i poziom CO2 , odgrywają kluczową rolę w kompleksowej ocenie fizjologicznej i powinny być dokładnie rozważone w przyszłych badaniach. Podsumowując, przedstawiamy nową metodę badania regulacji CBF in vivo u myszy. Podejście to jest precyzyjne i minimalnie inwazyjne, dzięki czemu doskonale nadaje się do badania dynamiki CBF wywołanej przez leki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(RS)-3,5-dihydroksyfenyloglicynaTocrisKat. Nr 0342
Chlorek acetylocholinySigmaA6625-25G
AdenozynaSigmaA9251-25G
Wacik nasączony alkoholem 70% Alkohol izopropylowyVitrex Medical A/S520213
AmScope SM-8T Series Ramię przegubowe Zoom Mikroskop stereoAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Przezroczysty żeltransmisyjny do ultradźwiękówAquasonicGelPLI 03-50
Mysz cyfrowa Instrumenty stereotaktyczneStoelting51730D
Alkohol etylowySigma459836-2L
Fiber-Lite DC950Illuminator Dolan-Jenner industriesDC950H
Wymiana szkła 1,14 MMWorld Precision Instruments504949
Chusteczki precyzyjne Kimtech Science Wycieraczki do tkanekKimberly Clark Professional5511
Laserowy obrazownik kontrastowy z plamkamimoorMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 w etui) hospeqBV40815
ELASTYCZNA IGŁA MICROFILWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Olej mineralnySigmaM5904
Poduszka grzewcza pod myszFisher scientific50-195-4000
Balsam do usuwania włosów Nair z masłem kakaowymAmazonASIN ‏ : ‎
NANOLITER 2020 INJECTORWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
Ściągacz do mikropipet P-2000Sutter InstrumentP-2000
Puritan® Waciki, bawełniana głowica, drewniany trzon,Puritan Medical806-WC
Sterylny smar do oczuMedi-Vet11897
UretanSigmaU2500
Klej tkankowy VetbondWorld Precision InstrumentsVETBOND
α-ChloraloseSigma23120
instrumenty B000GCW5CS

Bibliografia

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja do cysterny wielkiejobrazowanie laserowego mrugania (LSI)sprzężenie neuronaczynioweregulacja mikroglialnainiekcja wazodylatatoratest in vivochirurgia stereotaktycznaobrazowanie mózgu gryzoniiniekcja dokisternalna
Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.