Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67548

⸱

21 lutego 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ProMab Biotechnologies

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Streszczenie

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) stała się pionierskim sposobem leczenia raka, osiągając bezprecedensowy sukces w leczeniu niektórych nowotworów hematologicznych, takich jak chłoniaki i białaczki. Jednak w miarę jak coraz więcej pacjentów z rakiem otrzymuje terapie komórkami CAR-T, wtórne nowotwory złośliwe związane z leczeniem są coraz częściej zgłaszane częściowo z powodu nieoczekiwanej insercji transgenu CAR, co budzi poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa. Aby rozwiązać ten problem, opisujemy tutaj niewirusowe, nieintegrujące się podejście do generowania przejściowych komórek CAR-T za pomocą mRNA. Poddaliśmy elektropostacji limfocytów T zmodyfikowanym mRNA kodującym CAR specyficzny dla receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) i wygenerowaliśmy przejściowe komórki CAR-T ukierunkowane na HER2. CAR ulegał efektywnej ekspresji na powierzchni limfocytów T 1 dzień po elektroporacji, wzrastał w 2 dniu i dramatycznie spadał w 5 dniu. Przejściowe komórki CAR-T wykazywały silną cytotoksyczność wobec HER2-dodatnich komórek raka jajnika SKOV-3 i wydzielały wysokie poziomy IFN-Υ. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący opracowywania przejściowych komórek CAR-T na małą skalę bez trwałej integracji transgenu CAR, opisujący szczegółowe procedury przygotowania mRNA CAR, aktywacji i transfekcji limfocytów T, oceny ekspresji CAR oraz analizy in vitro funkcji komórek CAR-T. Metoda ta jest odpowiednia do przejściowego wytwarzania komórek CAR-T zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych.

Wprowadzenie

Rak jest coraz ważniejszym zagrożeniem dla ludzkiego zdrowia, z rocznym szacunkiem 23,6 miliona nowo zdiagnozowanych przypadków i 10 milionami zgonów na całym świecie1. Leczenie chirurgiczne w połączeniu z radioterapią i chemioterapią pozostaje złotym standardem opieki nad różnymi typami zlokalizowanych nowotworów nieinwazyjnych i inwazyjnych2,3,4. Chociaż tradycyjne systematyczne leczenie osiągnęło ogromny sukces w leczeniu nowotworów we wczesnym stadium, jest bardzo toksyczne i ma ograniczony wpływ na nowotwory przerzutowe i hematologiczne5. Pacjenci z tymi nowotworami są poddawani częstym zabiegom i znoszą znaczną toksyczność w nadziei na ustabilizowanie i opóźnienie postępu choroby. Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) pojawiła się ostatnio jako rewolucyjna terapia celowana, która wykazuje silną skuteczność w leczeniu nowotworów hematologicznych komórek B i daje nadzieję tym zdesperowanym pacjentom6.

Komórki CAR-T to zmodyfikowane limfocyty T, które wyrażają CAR na powierzchni komórki, które specyficznie rozpoznają antygeny związane z nowotworem (TAA) i aktywują komórki bez konieczności prezentacji antygenowej z głównych białek kompleksu zgodności tkankowej (MHC)7. Po aktywacji komórki CAR-T wydzielają panel cytokin i lizują komórki nowotworowe niezależnie od MHC, zwiększając w ten sposób niszczenie guzów nawet wtedy, gdy MHC są regulowane w dół lub tracone z powodu immunosupresyjnego mikrośrodowiska guza8,9. CAR składają się z co najmniej trzech odrębnych domen - zewnątrzkomórkowego wariantu fragmentu pojedynczego łańcucha (scFv) zawierającego zmienne regiony przeciwciała specyficznego dla TAA rozpoznającego antygen, domeny transbłonowej, która zakotwicza CAR na powierzchni komórki, oraz domeny wewnątrzkomórkowej, która pośredniczy w rekrutacji białka adaptorowego i dalszej sygnalizacji10. Opierając się na zmianach w domenach wewnątrzkomórkowych, struktury CAR ewoluowały do tej pory przez pięć pokoleń, przy czym pierwsza generacja zawierała tylko domenę aktywacji CD3ζ, a kolejne generacje posiadały jedną lub więcej dodatkowych domen kocymulujących z cząsteczek takich jak 4-1BB i CD2811. Te domeny wewnątrzkomórkowe wpływają na mechanizmy sygnalizacji komórek CAR-T, proliferację, przeżycie i toksyczność, które razem decydują o klinicznej skuteczności przeciwnowotworowej. Sukces kliniczny terapii komórkami CAR-T wynika z komórek CAR-T drugiej generacji, które są specyficznie ukierunkowane na CD19, biomarker o wysokiej ekspresji na komórkach linii B, do leczenia białaczek i chłoniaków z komórek B12,13. Do tej pory Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła sześć terapii komórkowych CAR-T drugiej generacji ukierunkowanych na CD-19 lub antygen dojrzewania komórek B (BCMA) w nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworach hematologicznych, w tym chłoniaku z dużych komórek B, chłoniaka z komórek płaszcza i szpiczaka mnogiego 6. Nowsze generacje komórek CAR-T są obecnie poddawane intensywnym badaniom przedklinicznym i klinicznym14,15.

Kliniczna produkcja komórek CAR-T jest skomplikowanym, kosztownym i czasochłonnym procesem. Obecnie leukocyty używane do przygotowania komórek CAR-T pochodzą od samych pacjentów, aby uniknąć reakcji allogenicznych, chociaż uniwersalne (lub gotowe) komórki CAR-T pochodzące od dawcy są aktywnie rozwijane i oceniane klinicznie16. Po wyizolowaniu leukocytów z krwi obwodowej pacjenta za pomocą leukaferezy, obcy fragment genu kodujący CAR jest wprowadzany do aktywowanych limfocytów T przy użyciu metod wirusowych lub niewirusowych17,18,19. Retrowirusy i lentiwirusy są najczęstszymi wektorami wirusowymi do dostarczania genu CAR, co skutkuje losową i trwałą integracją DNA kodującego CAR z genomem limfocytów T20. Podejścia niewirusowe, w tym nanocząstki mRNA-lipid, systemy transpozonów i edycja genomu CRISPR/Cas9, są mniej powszechne21. Następnie limfocyty T wykazujące ekspresję CAR są namnażane ex vivo na dużą skalę, a następnie zbierane i ponownie podawane pacjentom22,23. Produkcja wektorów wirusowych, które spełniają rygorystyczne standardy Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP), jest bardzo trudna, złożona i kosztowna, co stanowi znaczne obciążenie dla producentów, agencji regulacyjnych i pacjentów, ograniczając w ten sposób jej szerokie zastosowanie kliniczne.

Pomimo ekscytującego sukcesu terapii CAR-T, rosną obawy o jej bezpieczeństwo. Biorąc pod uwagę losowy charakter integracji transgenu CAR z genomem limfocytów T podczas transdukcji wirusa lub transpozonu, może dojść do zakłócenia genów supresorowych nowotworu lub aktywacji onkogenów, co prowadzi do złośliwej transformacji limfocytów T24,25. Od czasu zatwierdzenia przez FDA pierwszego produktu do terapii komórkami CAR-T w 2017 r., badania uzupełniające pokazują, że aż u 15% pacjentów, którzy otrzymują terapię, rozwijają się wtórne pierwotne nowotwory złośliwe (SPM), takie jak chłoniak z komórek T (TCL), niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) i rak skóry26,27,28,29. Uderzające jest to, że transgeny CAR były często wykrywane w niektórych SPM30,31, a niektóre przypadki TCL były bezpośrednio spowodowane nieprawidłową ekspansją komórek CAR-T24,32,33, co wskazuje na bezpośrednią rolę produktów CAR-T w wywoływaniu niektórych SPM. Inne badania zidentyfikowały ponadto inserpozycje transgenu CAR w krytycznych genach, takich jak TET234, JAK135 i PBX236 w komórkach nowotworowych SPM. W świetle gromadzących się dowodów na nowotwory złośliwe komórek T po terapii komórkami CAR-T, FDA stwierdziła niedawno, że ostrzeżenie w ramce podkreślające poważne ryzyko złośliwości komórek T jest wymagane dla wszystkich obecnie zatwierdzonych terapii komórkami CAR-T skierowanych na CD19 i BCMA37. Jednak badania wielkokohortowe obejmujące długoterminowe skutki leczenia CAR-T wskazują na częstość występowania SPM w zakresie od 3,8% do 15% wśród leczonych pacjentów26,27,28,38,39. Częstość występowania nie jest istotnie wyższa niż obserwowana u pacjentów z rakiem krwi poddawanych tradycyjnemu systematycznemu leczeniu40,41, co sugeruje stosunkowo bezpieczny profil terapii komórkami CAR-T. Niemniej jednak istnieje pilna potrzeba opracowania bezpiecznych i skutecznych komórek CAR-T, które zminimalizują ryzyko wystąpienia SPM dzięki bardziej opłacalnym metodom.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla niewirusowego, nieintegrującego podejścia do generowania komórek CAR-T. Celem jest zapewnienie prostego, krok po kroku przewodnika do generowania małych, skutecznych komórek CAR-T z przejściową ekspresją CAR, unikając w ten sposób mutagenezy insercyjnej i minimalizując ryzyko SPM. Pokazujemy, że elektroporacja limfocytów T ze zmodyfikowanym mRNA kodującym CAR specyficzny dla TAA HER2 spowodowała silną i przejściową ekspresję anty-HER2 CAR na powierzchni limfocytów T. Podczas ekspresji CAR limfocyty T silnie zabijały komórki nowotworowe HER2-dodatnie i wydzielały wysoki poziom IFN-Υ. Protokół jest opisany w czterech oddzielnych, ale ciągłych sekcjach, które obejmują przygotowanie mRNA CAR, aktywację i elektroporację limfocytów T, ocenę ekspresji CAR oraz analizę funkcji komórek CAR-T. Takie podejście jest odpowiednie do opracowywania i wytwarzania przejściowych komórek CAR-T zarówno do badań akademickich, jak i klinicznych terapii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użyte tutaj PBMC zostały wcześniej wyizolowane z pełnej krwi z Centrum Krwi Szpitala Stanford, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board (IRB) (13942) przy użyciu gradientu gęstości Ficoll-Paque opisanego wcześniej42. Świadoma zgoda uczestników nie miała zastosowania, ponieważ krew, której użyliśmy do pobrania PBMC, została uzyskana komercyjnie z Centrum Krwi Szpitala Stanforda.

1. Przygotowanie mRNA CAR

  1. Przygotowanie szablonu
    UWAGA: Zarówno zlinearyzowany plazmid, jak i fragment PCR mogą służyć jako matryca do syntezy mRNA CAR in vitro, pod warunkiem, że zawierają odpowiedni promotor 5' SP6 lub T7, region 5' bez translacji (UTR), transgen CAR i 3'UTR z odpowiednim ogonem poli(A). W tym badaniu użyliśmy konstruktu plazmidowego DNA CAR zawierającego promotor SP6, krótki ludzki beta-globinę 5'UTR, transgen CAR i 3'UTR złożony z dwóch tandemowych beta-globiny 3'UTR, po których następuje 112-bp poly(A) tail43. UTR, sekwencja kodująca i ogon poli(A) wpływają na stabilność RNA i wydajność translacji43,44,45. Wykazano, że ogon poli(A) o długości 120 pz zwiększa wydajność białka w hodowli komórkowej w porównaniu z krótszymi ogonami poli(A)43.
    1. Przygotuj CAR skonstruuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta. Wysokiej jakości plazmidowe DNA jest niezbędne do wygenerowania wysokiej wydajności mRNA CAR.
    2. Linearyzuj DNA plazmidu CAR za pomocą enzymu restrykcyjnego BglII. Wybierz enzym restrykcyjny, który tnie za ogonem poli(A), preferencyjnie blisko końca ogona poli(A). Trawić 10 μg (lub 10 000 ng) plazmidu oznaczonego ilościowo za pomocą spektrofotometru w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 10 U enzymu, 10 μl buforu wytrawiającego i wody wolnej od nukleaz przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że enzym restrykcyjny nie przecina transgenu CAR i jego bocznego promotora, UTR i sekwencji ogonowych poli(A). Pełna linearyzacja plazmidu CAR jest niezbędna do efektywnej transkrypcji mRNA CAR.
    3. Dodać 200 μg/ml proteazy K i 0,5% w/v SDS do mieszanki wytrawiającej i inkubować w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
    4. Oczyść zlinearyzowane DNA plazmidu CAR. Dodać równą objętość fenolu: chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v) do reakcji trawienia. Wirować energicznie przez około 15 s. Wirować próbkę w wirówce stołowej z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Przenieś górną warstwę wodną, która zawiera DNA, do nowej probówki do mikrowirówki. Unikaj przenoszenia którejkolwiek ze środkowych i dolnych warstw, które zawierają zanieczyszczenia białkowe i fenolowe. Wykonaj drugą rundę ekstrakcji chloroformem w celu zmniejszenia zanieczyszczeń.
    6. Dodać 1/10 objętości 7,5 M octanu amonu lub 3 M octanu sodu i delikatnie wymieszać. Dodaj 2,5 objętości etanolu, aby wytrącić DNA. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut.
    7. Wirować próbkę z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA. Ostrożnie usunąć supernatant. Dodaj 500 μl 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.
    8. Ponownie wirować próbkę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant. Pozostaw niewielką ilość roztworu w probówce.
    9. Powtarzaj wirowanie przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Ostrożnie usuń pozostały supernatant. Suszyć osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 10 minut w sterylnym kapturze, aż na dnie probówki nie będzie widać roztworu etanolu.
      UWAGA: Unikaj przesuszenia osadu DNA, ponieważ może być trudny do rozpuszczenia.
    10. Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby rozpuścić DNA. Odwirować próbkę na krótko z maksymalną prędkością. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
    11. Przechowywać próbkę na lodzie do natychmiastowego użycia lub w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Załaduj 100 ng oczyszczonego DNA na żel agarozowy i sprawdź rozmiar i integralność. DNA powinno wyglądać jak pojedyncze, wyraźne prążki o oczekiwanej wielkości. Nie należy obserwować żadnych dodatkowych lub rozmazanych pasków.
      UWAGA: Jakość matrycowego DNA ma kluczowe znaczenie dla efektywnej transkrypcji mRNA. Unikaj używania nieczystego, fragmentarycznego i zdegradowanego DNA jako matrycy do transkrypcji mRNA.
  2. Transkrypcja in vitro (IVT)
    1. Zsyntetyzuj mRNA CAR in vitro. Upewnij się, że podczas zabiegów używasz odczynników, probówek i końcówek do pipet wolnych od nukleaz.
    2. Rozmrozić odczynniki wymienione w Tabeli 1 do RT, z wyjątkiem mieszaniny polimerazy SP6 RNA, która powinna być przechowywana w temperaturze -20 °C do czasu użycia. Przygotować reakcję transkrypcji w kolejności przedstawionej w tabeli 1 w RT. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny
      UWAGA: Reakcję można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzebnej ilości mRNA. Reakcja pokazana powyżej zazwyczaj daje co najmniej 100 μg (lub 100 000 ng) zamkniętego mRNA przy użyciu wysokiej jakości matrycy DNA. Dłuższa inkubacja, czyli przez noc, może zwiększyć wydajność mRNA.
    3. Dodać 2 μl DNazy I wolnej od RNaz do reakcji, delikatnie wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu degradacji matrycowego DNA.
    4. Oczyść transkrybowane mRNA CAR za pomocą zestawu do czyszczenia RNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zestawu dotyczącymi oczyszczania. Eluuj mRNA w wodzie wolnej od nukleaz.
      UWAGA: mRNA można również oczyścić za pomocą metody ekstrakcji fenolowo-chloroformowej pokazanej powyżej (krok 1.1.4).
    5. Zmierz stężenie mRNA za pomocą spektrofotometru. Załaduj co najmniej 200 ng mRNA na żel agarozowy i sprawdź jego wielkość i integralność. mRNA powinno pojawić się jako pasmo dominujące o oczekiwanej wielkości, bez żadnych dodatkowych lub rozmazanych prążków. Przechowuj mRNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Aktywacja i elektroporacja limfocytów T

  1. Zawiesić 1 x 106 kriokonserwowanych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w 1 ml pożywki CAR-T (pożywka AIM-V uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną/streptomycyną i 10 ng/ml ludzkiej rekombinowanej IL-2). Aktywuj limfocyty T równą liczbą wstępnie umytych ludzkich kulek T-aktywatora CD3 / CD28 (patrz tabela materiałów). Hodować i namnażać komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% stężeniem CO2 przez kilka dni.
    UWAGA: Ilość PBMC można skalować w górę lub w dół w zależności od ilości limfocytów T wymaganych do kolejnych eksperymentów.
  2. Rozmrozić przygotowane mRNA CAR na lodzie. Dodać 1 ml pożywki CAR-T na studzienkę do dwóch dołków na płytce 12-dołkowej i wyrównać pożywkę, umieszczając płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  3. Przenieś 5 x 10 6 limfocytów T do sterylnej probówki i usuń kulki, kładąc probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie pipetując zawiesinę komórek do nowej probówki.
  4. Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml sterylnego PBS.
  5. Ponownie odwirować probówkę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu neonowego T (patrz tabela materiałów).
  6. Odpipetuj 100 μl komórek do nowej probówki i dodaj 5 μg (lub 5 000 ng) mRNA CAR do komórek46. Uzupełnij bufor neonowy T do całkowitej ilości 125 μl i mieszaj, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Ilość mRNA CAR do transfekcji przez elektroporację może być zwiększona do 8 μg (lub 8,000 ng) na 1 x 106 limfocytów T bez negatywnego wpływu na żywotność komórek, a wyższa ilość mRNA może prowadzić do zwiększonej ekspresji CAR46.
  7. Dodaj 25 μl buforu neonowego T do pozostałych 100 μl komórek. Służy to jako kontrola negatywna.
  8. Elektroporować limfocyty T. Użyj pipety Neon, aby zassać mieszaninę limfocytów T/mRNA CAR lub limfocytów T kontroli ujemnej do końcówki Neon 100 μL i elektroporować ogniwa impulsem 10 ms 1800 V.
  9. Natychmiast po elektroporacji przenieść komórki do zrównoważonej pożywki hodowlanej na 12-dołkowej płytce (przygotowanej w kroku 2.2).
  10. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora i rozprężyć komórki, aż będą gotowe do użycia. Aby zapewnić zdrowy i szybki wzrost limfocytów CAR T, utrzymuj gęstość komórek między 1-3 x 106 komórek/ml ze świeżą pożywką, aż będzie potrzebna.

3. Ocena ekspresji CAR

  1. Wymieszać limfocyty T CAR, delikatnie pipetując w górę i w dół kilka razy w każdym dołku, a następnie przenieść co najmniej 1 x 105 komórek do probówki FACS o pojemności 5 ml.
  2. Dodać 3 ml buforu do płukania na zimno (PBS zawierający 2 mM EDTA i 0,5% w/v BSA) do probówki. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu do przemywania wody. Dodać 2 μl odczynnika do wykrywania CAR allofikocyjaniny (APC) sprzężonego z kozią przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG F(ab')2 (patrz tabela materiałów) i 2 μl barwnika żywotności 7-AAD do zawieszonych komórek.
    UWAGA: CAR może być również wykryty za pomocą odpowiednio oznakowanego antygenu docelowego lub przeciwciała anty-tag, jeśli CAR zawiera znacznik (tj. FLAG). Jeżeli do wykrywania CAR stosuje się nieznakowane przeciwciało, po kroku 3.4 wymagana jest inkubacja z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie.
  4. Wymieszać próbkę, delikatnie potrząsając probówką i inkubować na lodzie przez 30 minut. Podczas inkubacji należy unikać światła. Przemyć komórki 3 ml buforu do przemywania na zimno i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu do przemywania wody. Natychmiast przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego. Upewnij się, że etykieta fluorescencyjna odczynnika do wykrywania i barwnik żywotności są odpowiednio skompensowane przy użyciu odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych.
  6. Oceń wyrażenie CAR przy użyciu następującej strategii bramkowania: Bramka na komórkach przy użyciu wykresu FSC-A vs SSC-A; Bramka na pojedynczych komórkach przy użyciu wykresu FSC-A vs FSC-H; Bramka na żywych komórkach za pomocą barwienia 7-AAD.
  7. Oblicz procent żywych limfocytów T, które zostały wybarwione przeciwciałem anty-ludzkim IgG F(ab')2. Porównaj komórki CAR-T z limfocytami T kontroli negatywnej, które powinny mieć minimalne zabarwienie.

4. Analiza funkcji komórek CAR-T

  1. Analiza cytotoksyczności
    1. Upewnij się, że docelowe komórki nowotworowe wyrażają antygen w konformacji, która może być rozpoznana przez CAR. Aby potwierdzić ekspresję antygenu, przeanalizuj komórki nowotworowe za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciała macierzystego, z którego poprowadzono CAR. Jeśli CAR nie może rozpoznać komórek nowotworowych, komórki CAR-T nie zdołają zabić komórek nowotworowych.
    2. Przygotuj docelowe komórki nowotworowe wykazujące ekspresję antygenu CAR na powierzchni komórki. Trypsynizować przylegające komórki nowotworowe 0,05% roztworem trypsyny-EDTA przez 1 minutę w temperaturze 37 °C i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z odpowiednią pożywką hodowlaną w temperaturze 1−4 x 105 komórek/ml.
      UWAGA: Komórki nowotworowe powinny być dobrze przylegające, aby zapewnić dokładną analizę w kolejnych krokach. Jeśli komórki nowotworowe słabo przylegają, łatwo się odklejają lub rosną w zawiesinie, pokryj dołki płytki użytej w następnym kroku odpowiednim przeciwciałem, polimerem polikationowym lub materiałem biologicznym, takim jak fibronektyna lub kolagen, aby ułatwić przyczepianie komórek.
    3. Przygotuj E-Plate (patrz Tabela materiałów). Zaprojektuj konfigurację eksperymentalną. Dodaj 50 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek nowotworowych do każdej studzienki i umieść E-Plate w przyrządzie do analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) w celu zmierzenia impedancji tła. Zmierz impedancję co 1 minutę na pomiar (lub przemiatanie) dla 3 przemiatań.
      UWAGA: Impedancja tła służy do ustawiania indeksu komórki na zero. Bez pomiaru impedancji tła odwierty nie mogą być ze sobą porównywane, co sprawia, że wyniki są niemożliwe do interpretacji.
    4. Usuń E-Plate z instrumentu RTCA i dodaj 100 μl zawiesiny komórek nowotworowych do każdej studzienki. Dlatego każda studzienka zawiera 1−4 x 104 komórki o całkowitej objętości 150 μl.
      UWAGA: Liczba komórek nowotworowych, które mają zostać wysiane w każdym dołku, powinna zostać określona przed eksperymentem. Zasiej E-Plate zakresem numerów komórek, a następnie monitoruj indeksy komórek przez następne 24−48 godzin. Pożądana liczba komórek utrzymuje stały wzrost indeksu komórkowego przez co najmniej 24 godziny bez plateau. Nadmierne wysiewanie komórek może przyspieszyć wyczerpanie składników odżywczych i zakwaszenie podłoża, co skutkuje wczesnym ustabilizowaniem się indeksu komórkowego. Ponadto dla każdej grupy należy dołączyć odwierty replikowane w celu zidentyfikowania potencjalnych pomiarów wartości odstających.
    5. Równoważyć płytkę E w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Ten krok pozwala komórkom nowotworowym osiąść i przylgnąć do dna studzienek.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do dokładnego pomiaru indeksu komórek. Pominięcie tego kroku zwykle powoduje zmienność między studniami w pomiarach indeksu komórkowego i nierównomierną adhezję komórek nowotworowych w studzienkach, co skutkuje zwiększonym szumem w teście.
    6. Umieść E-Plate z powrotem w przyrządzie RTCA i monitoruj indeksy komórek przez około 24 godziny, z przemiataniem co 5-15 minut.
    7. Następnego dnia należy przygotować zawiesinę komórek CAR-T. Zawiesić komórki CAR-T (komórki efektorowe) od kroku 2.10 w pożywce RPMI 1640 plus 10% FBS do stężenia określonego przez komórkę nowotworową (komórkę docelową) i pożądany stosunek komórek efektorowych do docelowych (E:T). Na przykład, jeśli zawiesina komórek nowotworowych miała gęstość 2 x 105 komórek/ml i pożądany jest stosunek E:T 10:1, wówczas komórki CAR-T powinny być zawieszone na 2 x 106 komórek/ml. Uwzględnij odpowiednie kontrole, takie jak same komórki nowotworowe (bez komórek efektorowych) i kontrolne limfocyty T (limfocyty T elektroporowane bez mRNA lub z kontrolnym mRNA).
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy używać ogniw CAR-T 1-2 dni po elektroporacji, gdy ekspresja CAR na powierzchni jest wysoka. Aby zbadać optymalny stosunek E:T, można przetestować szereg współczynników E:T (na przykład 3:1 do 20:1). O ile częstość CAR-T nie jest bardzo niska, tj. poniżej 10%, stosunek E:T wynoszący 10:1 lub 20:1 jest zwykle wystarczający do osiągnięcia prawie całkowitego zabicia komórek nowotworowych.
    8. Wstrzymaj zapis indeksu komórek i wyjmij E-Plate z instrumentu RTCA.
    9. Lekko przechylić płytkę, ostrożnie usunąć 50 μl pożywki hodowlanej z każdej studzienki, nie dotykając komórek nowotworowych, i dodać 100 μl komórek CAR-T lub kontrolnych limfocytów T do każdej studzienki.
    10. Umieść E-Plate z powrotem w instrumencie RTCA i wznów monitorowanie indeksu komórki przez co najmniej 24 godziny z przemiataniem wykonywanym co 5−15 min.
      UWAGA: Czas monitorowania indeksu komórkowego zależy od tego, jak szybko komórki CAR-T celują w komórki nowotworowe. 24-godzinny okres inkubacji jest zwykle wystarczający, aby komórki CAR-T wywarły maksymalny efekt cytotoksyczny.
    11. Zatrzymaj monitorowanie indeksu komórek, wyjmij E-Plate z instrumentu RTCA i przeanalizuj wynik cytotoksyczności. Oblicz cytotoksyczność jako odsetek komórek nowotworowych, które zostały zabite przez komórki CAR-T. Obliczyć średnią cytotoksyczność limfocytów CAR-T i kontrolnych limfocytów T za pomocą oprogramowania RTCA. Aby ręcznie obliczyć cytotoksyczność, należy użyć wzoru
      Cytotoksyczność = ((Indeks komórkowy komórek nowotworowych) − (Indeks komórkowy komórek nowotworowych plus komórki efektorowe)) / (Indeks komórkowy komórek nowotworowych) × 100%.
  2. Analiza wydzielania cytokin
    1. Aby przeanalizować cytokiny, takie jak IFN-Υ, wydzielane przez komórki CAR-T podczas analizy cytotoksyczności, przenieś supernatant z płytki E na okrągłodenną lub 96-dołkową płytkę w kształcie litery V.
      UWAGA: Jeśli pożądana jest analiza wydzielania cytokin w czasie, wstrzymaj monitorowanie indeksu komórek w kroku 4.1.10, zbierz niewielką porcję supernatantu z każdej studzienki, zwróć E-Plate z powrotem do instrumentu RTCA i wznów monitorowanie.
    2. Odwirować 96-dołkową płytkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieść supernatanty na nową 96-dołkową płytkę, nie naruszając osadów komórkowych.
    3. Zmierz poziom cytokin w supernatantach za pomocą komercyjnych zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta. Supernatanty zwykle wymagają rozcieńczenia przed pomiarem, czasami ponad 100-krotnie, w zależności od analizowanych cytokin.
    4. Analizuj dane, interpolując wartości absorbancji próbki w stosunku do krzywej wzorcowej wygenerowanej z seryjnie rozcieńczanych wzorców. Przygotuj wykresy ze słupkami błędów reprezentującymi średnią ± odchylenie standardowe (SD) za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Aby porównać różnicę między zabiegami, można wykonać test t Studenta. Wartość p mniejsza niż 0,05 jest zwykle uważana za statystycznie istotną.
      UWAGA: Punkty danych, które są wyraźnymi wartościami odstającymi, prawdopodobnie z powodu błędów eksperymentalnych, powinny zostać wyłączone z analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skonstruowaliśmy drugiej generacji CAR skierowany przeciwko HER2, zawierający scFv pochodzący z humanizowanego mysiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) anty-HER2 4D547, region transbłonowy oraz wewnątrzkomórkową domenę kostymulującą 4-1BB, za którą następowała domena aktywacyjna CD3ζ (Rysunek 1A). Sekwencja DNA kodująca CAR zawierała promotor SP6 na końcu 5', aby sterować transkrypcją mRNA CAR in vitro (Rysunek 1B). mRNA CAR mia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy szczegółowe, niewirusowe, nieintegrujące podejście do generowania przejściowych komórek CAR-T i przedstawiamy procedury techniczne do oceny funkcji komórek CAR-T. Takie podejście pozwala uniknąć stosowania konwencjonalnych wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych do stałego i losowego dostarczania transgenu CAR, zamiast tego wykorzystując elektroporację do skutecznego wprowadzania zmodyfikowanego in vitro mRNA CAR do limfocytów T. Metoda ta umożliwia wysokopoziomową, przejściową ekspres...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li i Vita Golubovskaya są pracownikami ProMab Biotechnologies. Lijun Wu jest pracownikiem i udziałowcem ProMab Biotechnologies.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez ProMab Biotechnologies.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Barwnik żywotności 7-AAD Biolegend420404
Cytometr przepływowy ACEA NovocyteAgilentNovoCyte 3000
AIM-V podłożeGibco12055083
APC kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG F(ab')2Jackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
Enzym restrykcyjny BglIINew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, wysoka glukozaGibco11965092
Dynabeads Ludzki aktywator T Koraliki CD3 / CD28Gibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EtanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
Zestaw do syntezy RNA HiScribe SP6 NewEngland BioLabs (NEB)E2070S
Ludzkie białko rekombinowane IL-2Gibco15140122
Markery RNA MillenniumInvitrogenAM7150
Monarch (500 μ g)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfekcja InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfekcja System 100-μ L ZestawInvitrogenMPK10096
Penicylina-Streptomycyna (10000 U/ml)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300120
UltraPure Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Przyrząd do analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA)AgilentRTCA MP
ZymoPURE II Zestaw do przygotowania plazmiduZymo ResearchD4201
Zestaw do oczyszczania RNA

Bibliografia

  1. Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
  2. Jordan, R. M., Oxenberg, J. Breast cancer conservation therapy. , Statpearls. (2024).
  3. Tannock, I. F. Combined modality treatment with radiotherapy and chemotherapy. Radiother Oncol. 16 (2), 83-101 (1989).
  4. Mcree, A. J., Cowherd, S., Wang, A. Z., Goldberg, R. M. Chemoradiation therapy in the management of gastrointestinal malignancies. Future Oncol. 7 (3), 409-426 (2011).
  5. Palumbo, M. O., et al. Systemic cancer therapy: Achievements and challenges that lie ahead. Front Pharmacol. 4, 57(2013).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of car t cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Lim, W. A., June, C. H. The principles of engineering immune cells to treat cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  8. Silveira, C. R. F., et al. Cytokines as an important player in the context of car-t cell therapy for cancer: Their role in tumor immunomodulation, manufacture, and clinical implications. Front Immunol. 13, 947648(2022).
  9. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming car-t cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  10. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  11. Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., Von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. Teaching an old dog new tricks: Next-generation car t cells. Br J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).
  12. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of b-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous t cells genetically engineered to recognize cd19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  13. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  14. Tomasik, J., Jasinski, M., Basak, G. W. Next generations of car-t cells - new therapeutic opportunities in hematology. Front Immunol. 13, 1034707(2022).
  15. Asmamaw Dejenie, T., et al. Current updates on generations, approvals, and clinical trials of car t-cell therapy. Hum Vaccin Immunother. 18 (6), 2114254(2022).
  16. Sun, W., Jiang, Z., Jiang, W., Yang, R. Universal chimeric antigen receptor t cell therapy - the future of cell therapy: A review providing clinical evidence. Cancer Treat Res Commun. 33, 100638(2022).
  17. Wang, X., Riviere, I. Clinical manufacturing of car t cells: Foundation of a promising therapy. Mol Ther Oncolytics. 3, 16015(2016).
  18. Pinto, I. S., Cordeiro, R. A., Faneca, H. Polymer- and lipid-based gene delivery technology for car t cell therapy. J Control Release. 353, 196-215 (2023).
  19. Magnani, C. F., et al. Sleeping beauty-engineered car t cells achieve antileukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 130 (11), 6021-6033 (2020).
  20. Irving, M., Lanitis, E., Migliorini, D., Ivics, Z., Guedan, S. Choosing the right tool for genetic engineering: Clinical lessons from chimeric antigen receptor-t cells. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1044-1058 (2021).
  21. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral car t cells. Front Immunol. 13, 867013(2022).
  22. Song, H. W., et al. Car-t cell expansion platforms yield distinct t cell differentiation states. Cytotherapy. 26 (7), 757-768 (2024).
  23. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Res. 7, F1000 Faculty Rev-517 (2018).
  24. Micklethwaite, K. P., et al. Investigation of product-derived lymphoma following infusion of piggybac-modified cd19 chimeric antigen receptor t cells. Blood. 138 (16), 1391-1405 (2021).
  25. Ghilardi, G., et al. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial car t cell therapy. Nat Med. 30 (4), 984-989 (2024).
  26. Steffin, D. H. M., et al. Long-term follow-up for the development of subsequent malignancies in patients treated with genetically modified iecs. Blood. 140 (1), 16-24 (2022).
  27. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-cd19 chimeric antigen receptor t-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  28. Cordeiro, A., et al. Late events after treatment with cd19-targeted chimeric antigen receptor modified t cells. Biol Blood Marrow Transplant. 26 (1), 26-33 (2020).
  29. Zhao, A., et al. Secondary myeloid neoplasms after cd19 car t therapy in patients with refractory/relapsed b-cell lymphoma: Case series and review of literature. Front Immunol. 13, 1063986(2022).
  30. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor t-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  31. Ruella, M., et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor t cell therapy by transduction of a single leukemic b cell. Nat Med. 24 (10), 1499-1503 (2018).
  32. Bishop, D. C., et al. Development of car t-cell lymphoma in 2 of 10 patients effectively treated with piggybac-modified cd19 car t cells. Blood. 138 (16), 1504-1509 (2021).
  33. Shah, N. N., et al. Clonal expansion of car t cells harboring lentivector integration in the cbl gene following anti-cd22 car t-cell therapy. Blood Adv. 3 (15), 2317-2322 (2019).
  34. Fraietta, J. A., et al. Disruption of tet2 promotes the therapeutic efficacy of cd19-targeted t cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
  35. Heinrich, T., et al. Mature t-cell lymphomagenesis induced by retroviral insertional activation of janus kinase 1. Mol Ther. 21 (6), 1160-1168 (2013).
  36. Harrison, S. J., et al. Car+ t-cell lymphoma post ciltacabtagene autoleucel therapy for relapsed refractory multiple myeloma. Blood. 142 (Supplement 1), 6939-6939 (2023).
  37. FDA Administration. Fda requires boxed warning for t cell malignancies following treatment with bcma-directed or cd19-directed autologous chimeric antigen receptor (car) t cell immunotherapies. , (2024).
  38. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial car t-cell therapy: Analysis of the fda adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  39. Levine, B. L., et al. Unanswered questions following reports of secondary malignancies after car-t cell therapy. Nat Med. 30 (2), 338-341 (2024).
  40. Tward, J. D., Wendland, M. M., Shrieve, D. C., Szabo, A., Gaffney, D. K. The risk of secondary malignancies over 30 years after the treatment of non-hodgkin lymphoma. Cancer. 107 (1), 108-115 (2006).
  41. Kumar, V., et al. Trends in the risk of second primary malignancies among survivors of chronic lymphocytic leukemia. Blood Cancer J. 9 (10), 75(2019).
  42. Holtkamp, S., et al. Modification of antigen-encoding rna increases stability, translational efficacy, and t-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 108 (13), 4009-4017 (2006).
  43. Dvir, S., et al. Deciphering the rules by which 5'-utr sequences affect protein expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (30), E2792-E2801 (2013).
  44. Van Der Velden, A. W., Voorma, H. O., Thomas, A. A. Vector design for optimal protein expression. Biotechniques. 31 (3), passim 572-580 (2001).
  45. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by ficoll-paque density gradient. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2A), 1(2007).
  46. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse t lymphocytes using rna electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  47. Carter, P., et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (10), 4285-4289 (1992).
  48. Hu, L., et al. Her2-cd3-fc bispecific antibody-encoding mrna delivered by lipid nanoparticles suppresses her2-positive tumor growth. Vaccines. 12 (7), 808(2024).
  49. Perales-Puchalt, A., et al. DNA-encoded bispecific t cell engagers and antibodies present long-term antitumor activity. JCI Insight. 4 (8), e126086(2019).
  50. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  51. Kozak, M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mrnas that affect translational efficiency. J Mol Biol. 235 (1), 95-110 (1994).
  52. Wu, Q., et al. Translation affects mrna stability in a codon-dependent manner in human cells. Elife. 8, e45396(2019).
  53. Henderson, J. M., et al. Cap 1 messenger rna synthesis with co-transcriptional cleancap((r)) analog by in vitro transcription. Curr Protoc. 1 (2), e39(2021).
  54. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  55. Gehl, J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177 (4), 437-447 (2003).
  56. Stacey, M., Fox, P., Buescher, S., Kolb, J. Nanosecond pulsed electric field induced cytoskeleton, nuclear membrane and telomere damage adversely impact cell survival. Bioelectrochemistry. 82 (2), 131-134 (2011).
  57. Meaking, W. S., Edgerton, J., Wharton, C. W., Meldrum, R. A. Electroporation-induced damage in mammalian cell DNA. Biochim Biophys Acta. 1264 (3), 357-362 (1995).
  58. Zhang, J., et al. Non-viral, specifically targeted car-t cells achieve high safety and efficacy in b-nhl. Nature. 609 (7926), 369-374 (2022).
  59. Von Auw, N., et al. Comparison of two lab-scale protocols for enhanced mrna-based car-t cell generation and functionality. Sci Rep. 13 (1), 18160(2023).
  60. Gauthier, J., Turtle, C. J. Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after cd19-specific car-t cell therapy. Curr Res Transl Med. 66 (2), 50-52 (2018).
  61. Beatty, G. L., et al. Activity of mesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells against pancreatic carcinoma metastases in a phase 1 trial. Gastroenterology. 155 (1), 29-32 (2018).
  62. Beatty, G. L., et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mrna-engineered t cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2 (2), 112-120 (2014).
  63. Tchou, J., et al. Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (car) t cells in metastatic breast cancer. Cancer Immunol Res. 5 (12), 1152-1161 (2017).
  64. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mrna technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki CAR-Tniewirusowa generacja CARelektroporacja mRNAprzejściowa ekspresja CARterapia celowana w HER2cytometria przepływowasekrecja cytokincytotoksyczność przeciwnowotworowatranskrypcja in vitroanaliza komórkowa w czasie rzeczywistym
Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.