Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) stała się pionierskim sposobem leczenia raka, osiągając bezprecedensowy sukces w leczeniu niektórych nowotworów hematologicznych, takich jak chłoniaki i białaczki. Jednak w miarę jak coraz więcej pacjentów z rakiem otrzymuje terapie komórkami CAR-T, wtórne nowotwory złośliwe związane z leczeniem są coraz częściej zgłaszane częściowo z powodu nieoczekiwanej insercji transgenu CAR, co budzi poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa. Aby rozwiązać ten problem, opisujemy tutaj niewirusowe, nieintegrujące się podejście do generowania przejściowych komórek CAR-T za pomocą mRNA. Poddaliśmy elektropostacji limfocytów T zmodyfikowanym mRNA kodującym CAR specyficzny dla receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) i wygenerowaliśmy przejściowe komórki CAR-T ukierunkowane na HER2. CAR ulegał efektywnej ekspresji na powierzchni limfocytów T 1 dzień po elektroporacji, wzrastał w 2 dniu i dramatycznie spadał w 5 dniu. Przejściowe komórki CAR-T wykazywały silną cytotoksyczność wobec HER2-dodatnich komórek raka jajnika SKOV-3 i wydzielały wysokie poziomy IFN-Υ. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący opracowywania przejściowych komórek CAR-T na małą skalę bez trwałej integracji transgenu CAR, opisujący szczegółowe procedury przygotowania mRNA CAR, aktywacji i transfekcji limfocytów T, oceny ekspresji CAR oraz analizy in vitro funkcji komórek CAR-T. Metoda ta jest odpowiednia do przejściowego wytwarzania komórek CAR-T zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych.
Wprowadzenie
Rak jest coraz ważniejszym zagrożeniem dla ludzkiego zdrowia, z rocznym szacunkiem 23,6 miliona nowo zdiagnozowanych przypadków i 10 milionami zgonów na całym świecie1. Leczenie chirurgiczne w połączeniu z radioterapią i chemioterapią pozostaje złotym standardem opieki nad różnymi typami zlokalizowanych nowotworów nieinwazyjnych i inwazyjnych2,3,4. Chociaż tradycyjne systematyczne leczenie osiągnęło ogromny sukces w leczeniu nowotworów we wczesnym stadium, jest bardzo toksyczne i ma ograniczony wpływ na nowotwory przerzutowe i hematologiczne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użyte tutaj PBMC zostały wcześniej wyizolowane z pełnej krwi z Centrum Krwi Szpitala Stanford, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board (IRB) (13942) przy użyciu gradientu gęstości Ficoll-Paque opisanego wcześniej42. Świadoma zgoda uczestników nie miała zastosowania, ponieważ krew, której użyliśmy do pobrania PBMC, została uzyskana komercyjnie z Centrum Krwi Szpitala Stanforda.
1. Przygotowanie mRNA CAR
- Przygotowanie szablonu
UWAGA: Zarówno zlinearyzowany plazmid, jak i fragment PCR mogą służyć jako matryca do syntezy mRNA CAR in vitro, pod warun....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skonstruowaliśmy drugiej generacji CAR skierowany przeciwko HER2, zawierający scFv pochodzący z humanizowanego mysiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) anty-HER2 4D547, region transbłonowy oraz wewnątrzkomórkową domenę kostymulującą 4-1BB, za którą następowała domena aktywacyjna CD3ζ (Rysunek 1A). Sekwencja DNA kodująca CAR zawierała promotor SP6 na końcu 5', aby sterować transkrypcją mRNA CAR in vitro (Rysunek 1B). mRNA CAR mia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu opisujemy szczegółowe, niewirusowe, nieintegrujące podejście do generowania przejściowych komórek CAR-T i przedstawiamy procedury techniczne do oceny funkcji komórek CAR-T. Takie podejście pozwala uniknąć stosowania konwencjonalnych wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych do stałego i losowego dostarczania transgenu CAR, zamiast tego wykorzystując elektroporację do skutecznego wprowadzania zmodyfikowanego in vitro mRNA CAR do limfocytów T. Metoda ta umożliwia wysokopoziomową, przejściową ekspres.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li i Vita Golubovskaya są pracownikami ProMab Biotechnologies. Lijun Wu jest pracownikiem i udziałowcem ProMab Biotechnologies.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez ProMab Biotechnologies.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Barwnik żywotności 7-AAD | Biolegend | 420404 | |
| Cytometr przepływowy ACEA Novocyte | Agilent | NovoCyte 3000 | |
| AIM-V podłoże | Gibco | 12055083 | |
| APC kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG F(ab')2 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-136-097 | |
| Enzym restrykcyjny BglII | New England BioLabs (NEB) | R0144L | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | NEB | S1411S | |
| DMEM, wysoka glukoza | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Ludzki aktywator T Koraliki CD3 / CD28 | Gibco | 11131D | |
| E-Plate 96 | Agilent | 5232376001 | |
| Etanol | Sigma | 459844-4L | |
| FBS | Lonza.com | 14-503F | |
| Zestaw do syntezy RNA HiScribe SP6 New | England BioLabs (NEB) | E2070S | |
| Ludzkie białko rekombinowane IL-2 | Gibco | 15140122 | |
| Markery RNA Millennium | Invitrogen | AM7150 | |
| Monarch (500 μ g) | NEB | T2050L | |
| N1-Methylpseudo-UTP | Trilink | N-1081-10 | |
| Neon Transfekcja Instrument | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon Transfekcja System 100-μ L Zestaw | Invitrogen | MPK10096 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10000 U/ml) | Gibco | 14-503F | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875135 | |
| Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa | Gibco | 25300120 | |
| UltraPure Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593049 | |
| xCELLigence Przyrząd do analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) | Agilent | RTCA MP | |
| ZymoPURE II Zestaw do przygotowania plazmidu | Zymo Research | D4201 |
Bibliografia
- Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
- Jordan, R. M., Oxenberg, J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
