Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

DOI:

10.3791/67550

⸱

24 stycznia 2025

 , 
1REQUIMTE/LAQV, Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Sciences, University of Porto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrost liczby zakażeń wielolekoopornych i brak nowych klas antybiotyków spowodowały ponowne zainteresowanie alternatywnymi terapiami, takimi jak fotodynamiczna inaktywacja bakterii (aPDI). Proces ten polega na podaniu fotouczulacza (PS) aktywowanego przez odpowiednie źródło światła widzialnego, powodującego zaostrzenie poziomu reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają kluczowe biomolekuły komórkowe, ostatecznie powodując śmierć komórek bakteryjnych. Kluczowe znaczenie ma stworzenie ustandaryzowanych, łatwych w użyciu i powtarzalnych testów wstępnych w celu oceny i porównania skuteczności fototoksyczności indukowanej światłem potencjalnych fotouczulaczy. Badanie to wprowadza prostą i skuteczną technikę in vitro do oceny aktywności fotodynamicznej wobec komórek bakterii planktonowych. Dzięki zastosowaniu 96-dołkowej mikropłytki wraz z dużym panelem LED, system ułatwia systematyczną ocenę różnych związków. Taka konfiguracja pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe potencjalnych fotouczulaczy w kontrolowanym i spójnym środowisku, upraszczając proces identyfikacji obiecujących kandydatów do dalszego rozwoju. Ta elastyczna platforma stanowi ważny krok w kierunku rozwoju innowacyjnych terapii fotodynamicznych do zwalczania zakażeń opornych na antybiotyki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia fotodynamiczna (PDT) to minimalnie inwazyjne podejście terapeutyczne, które w ostatnich latach przyniosło obiecujące wyniki, szczególnie w dermatologicznym leczeniu klinicznym1. Jednym ze szczególnie interesujących obszarów zastosowania tej metody terapeutycznej jest leczenie infekcji mikrobiologicznych, proces znany jako przeciwdrobnoustrojowa inaktywacja fotodynamiczna (aPDI)2. Chociaż początkowo pomijano, głównie ze względu na niezwykłą skuteczność antybiotyków, w ostatnich latach ponownie zainteresowano się eradykacją bakterii wyzwalaną światłem, napędzaną pojawieniem się wielolekowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) oraz potrzebą znalezienia alternatywnych i skutecznych strategii rozwiązania tego problemu zdrowia publicznego3,4. Znaczące wyniki można osiągnąć w ciągu kilku sekund lub minut, z precyzją przestrzenną i czasową oferowaną odpowiednio przez specjalne naświetlanie obszaru zainteresowania i funkcji włączania/wyłączania procedury.

Mechanizm stojący za zasadą fotodynamiki opiera się na połączeniu światłoczułych cząsteczek (fotosensybilizator), tlenu cząsteczkowego i zewnętrznego źródła światła. Chociaż te trzy składniki są nieszkodliwe, po połączeniu mogą stać się śmiertelne dla komórek docelowych z powodu fotoaktywacji fotouczulacza. Reakcje wywołane światłem skutkują masowym generowaniem reaktywnych form tlenu (ROS), co ostatecznie powoduje poważne i nieodwracalne uszkodzenia kluczowych składników komórkowych, prowadząc do śmierci komórki5,6. Ponadto połączenie aPDI z innymi konwencjonalnymi terapiami przeciwdrobnoustrojowymi wykazało obiecujące wyniki terapeutyczne, w tym wyższą skuteczność leczenia, skrócony czas leczenia i niższe dawki leków7.

Ponadto, miejscowe podawanie fotosensybilizatorów (PS) w PDT pozwala na celowane leczenie z minimalnym uszkodzeniem otaczających tkanek i niskimi efektami ogólnoustrojowymi, co czyni go cenioną opcją leczenia powierzchownych infekcji skóry8. Wygoda leczenia miejscowego i powierzchowny charakter wielu infekcji i zmian skórnych sprawiają, że jest to atrakcyjny cel dla PDT. Badania potwierdziły skuteczność aPDI w leczeniu zakażeń oparzeniami, zakażeniami ran chirurgicznych, owrzodzeniami i innymi powierzchownymi dolegliwościami, takimi jak trądzik i liszajec9,10,11.

Liczne cząsteczki, zarówno naturalne, jak i syntetyczne, zostały przetestowane i zaproponowane do aPDI. Jednak stosowanie zmiennych i często nieokreślonych parametrów w protokołach eksperymentalnych utrudnia porównywanie wyników, co wpływa na przejrzystość wyników naukowych. Opracowanie prostych i powtarzalnych testów może ułatwić szybkie badania przesiewowe wielu związków, przyspieszając identyfikację obiecujących kandydatów. Proste, powtarzalne i ekonomiczne protokoły są szczególnie cenne w testach na wczesnym etapie, ponieważ umożliwiają porównywanie wyników w różnych ośrodkach badawczych. Wydajne procesy przesiewowe ułatwiają również badanie szerszego zakresu cząsteczek, co może prowadzić do odkrycia i wyboru nowych fotosensybilizatorów do dalszych testów w bardziej zaawansowanych, złożonych i kosztownych metodologiach.

Ten protokół przedstawia prostą metodę oceny fototoksyczności potencjalnych fotosensybilizatorów na bakterie za pomocą panelu LED o natężeniu światła 25 mW/cm2. Użyto reprezentatywnego szczepu bakteryjnego S. aureus i wybrano kanał światła białego, oferujący pełne pokrycie widma widzialnego. Procedura obejmowała 30-minutowy okres preinkubacji, po którym nastąpiła 15-minutowa ekspozycja na światło (22,5 J/cm2). Chociaż wyniki opierają się na tych konkretnych warunkach eksperymentalnych, można je dostosować do indywidualnych protokołów. Konieczne jest jasne zdefiniowanie tych ustawień i uwzględnienie ich w opisie procedury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny opis protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie kultury bakteryjnej

  1. Hoduj bakterie S. aureus (ATCC 29213) na agarze Muellera-Hintona (MH) z kultur podstawowych. Inkubować płytki MH w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przed badaniem w celu uzyskania świeżych kultur.
  2. Zaszczepić bakterie: Zebrać 2-3 świeże kolonie z płytki agarowej i rozcieńczyć w 6 ml wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4, sterylnie przefiltrowanej.
  3. Wirować (1200 obr./min) inokulum 3-4 razy, aby zapewnić prawidłową homogenizację próbki. Pobrać 3 ml do jednorazowej kuwety.
  4. Zmierz OD600 i dostosuj go do 0,1 (około 1 x 108 CFU/ml) za pomocą PBS.
    UWAGA: Dokładna konwersja OD do CFU może się różnić w zależności od szczepu S. aureus. Można ustalić standardową krzywą wzrostu dla konkretnego szczepu i warunków eksperymentu laboratoryjnego, z którym pracujemy.

2. Przygotowanie fotouczulacza

  1. Roztwór podstawowy: Przygotować roztwór podstawowy fotouczulacza będącego przedmiotem zainteresowania związku (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji Wyniki) w odpowiednim rozpuszczalniku (np. DMSO lub PBS; Rysunek 2).
  2. Roztwór roboczy: Rozcieńczyć roztwór podstawowy w PBS. Zastosowanie pożywek hodowlanych PBS zamiast pożywek bakteryjnych zapewnia, że składniki pożywki nie zakłócają absorpcji światła podczas eksperymentów aPDI.
  3. Wirować próbkę, aby zapewnić pełną homogenizację. W razie potrzeby użyj kąpieli ultradźwiękowej, aby zagwarantować całkowite rozpuszczenie i uzyskać klarowny roztwór (w takim przypadku dokładnie kontrolować. W przypadku związków hydrofobowych może być wymagane dostosowanie układu rozpuszczalnika (np. dodanie % DMSO lub etanolu). Upewnij się, że wpływ rozpuszczalnika na żywotność komórek jest zawsze sprawdzany.
    UWAGA: Warunki sonikacji będą się różnić w zależności od rodzaju związku, stężenia i rozpuszczalnika systemowego; Krótsze czasy (np. 5 min) mogą być wystarczające w przypadku związków łatwo rozpuszczalnych, podczas gdy dłuższe czasy (20-30 min) mogą być wymagane w przypadku związków wysoce hydrofobowych.

3. Ustawienie płyty

  1. Przygotuj dwie oddzielne płytki 96-dołkowe: jedną do poddania ekspozycji na światło, a drugą do przechowywania w ciemności (kontrola ciemności).
  2. W każdej z płytek wymieszać 100 μl roztworu fotouczulacza ze 100 μl zawiesiny bakteryjnej. Pipetę w górę i w dół 5-10 razy.
  3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez określony czas (w tym badaniu zastosowano okres 30 minut), aby umożliwić fotosensybilizatorowi interakcję z komórkami bakteryjnymi.

4. Napromieniowanie

  1. Wyjmij płytki z inkubatora i wystaw jedną z nich na działanie światła emitowanego przez panel LED (urządzenie użyte w tym eksperymencie składało się z prostokątnego projektora LED o mocy 50W; Stopień ochrony IP65; napięcie wejściowe: AC 85-265 V), chroniąc drugi przed ekspozycją na światło.
  2. Umieść jedną z płytek nad panelem LED. Aby zapewnić precyzyjną regulację płytki poprzez kilka powtórzeń protokołu, należy zaznaczyć krawędzie płytki 96-dołkowej bezpośrednio na powierzchni diody LED.
  3. Naświetlić płytkę przez odpowiedni czas naświetlania (w tym badaniu zastosowano okres 15 minut).
    UWAGA: Upewnij się, że dawka światła jest wystarczająca do aktywacji fotouczulacza bez uszczerbku dla żywotności komórek. Z tego powodu należy uwzględnić kontrolę światła (bakterie wystawione na działanie światła przy braku fotouczulacza).

5. Po napromieniowaniu i pobieranie próbek z płytki agarowej

  1. Użyć innej płytki 96-dołkowej do przygotowania seryjnych rozcieńczeń próbek (studzienek kontrolnych, nienapromieniowanych i napromieniowanych).
  2. Dodać 180 μl PBS/basenik w zależności od liczby próbek. Aby prawidłowo zdefiniować układ, należy wziąć pod uwagę, że do szeregowego rozcieńczania jednej próbki potrzebny jest rząd 6 studzienek (rozcieńczenie 10-krotne, od 10−1 do 10−6).
  3. Podwielokrotność 20 μl z każdej studzienki (z napromienionej i nienapromienionej płytki 96-dołkowej) do pierwszej kolumny płytki uprzednio wypełnionej PBS.
  4. Za pomocą mikropipety wielokanałowej wykonaj proste rozcieńczenie seryjne od studzienka 1 do 6 (10-1 do 10-6). UWAGA: Homogenizacja próbki ma w tym momencie kluczowe znaczenie dla zapewnienia jednolitej i spójnej mieszaniny. Na każdym etapie rozcieńczania pipetować w górę i w dół 5-10 razy.
  5. Podzielić płytkę agarową na sześć równych części, z których każda odpowiada jednemu z rozcieńczeń (patrz Rysunek 3).
  6. Podwielokrotność 10 μl z każdej studzienki na odpowiednią sekcję na powierzchni płytki agarowej (dla każdej próbki należy uwzględnić co najmniej 3 kontrpróby). Unikaj umieszczania podwielokrotności zbyt blisko siebie. Delikatnie przetransportować płytki agarowe do inkubatora i odczekać 18-20 godz.
    UWAGA: Należy wziąć pod uwagę, że morfologia CFU różni się znacznie w zależności od gatunku bakterii. Na przykład, podczas gdy kolonie S. aureus są stosunkowo łatwe do policzenia, P. aeruginosa ma tendencję do tworzenia bardziej rozproszonych kolonii. Biorąc to pod uwagę, można dostosować liczbę powtórzeń.

6. Określanie żywotności komórek (liczenie jednostek tworzących kolonie)

  1. Wyjąć płytki agarowe z inkubatora i wybrać obszary odpowiednie do zliczania komórek.
    UWAGA: Unikaj liczenia w sekcjach z licznymi, nakładającymi się i niedobrze zdefiniowanymi koloniami.
  2. W każdej sekcji należy policzyć liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) i określić średnią z 3 powtórzeń
  3. Przeliczyć liczbę zliczonych jtk na jtk/ml, mnożąc średnie zliczanie przez współczynnik rozcieńczenia i dzieląc przez objętość kultury posiewanej w ml.

7. Analiza danych

  1. Przekonwertuj dane jtk/ml na skalę logarytmiczną i przedstaw żywotność komórkową w logarytmie10|jtk/ml| w funkcji badanego stężenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amino-based flavylium compounds (Rysunek 2): 7-dietyloamino-4′-dimetyloaminoflavylium (7NEt24′NMe2), 7-dietyloamino-2-(dimetyloaminostyryl)-1-benzopiryl (7NEt2st4′NMe2), 7-dietyloamino-4′-aminoflavyl(7NEt24′NH2) i 7-dietyloamino-4′-hydroksyflavylium (7NEt24′OH), których światło reaguje natura została wcześniej omówiona12,13, inkubowano z S. aureus przez 30 mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż protokół ten służy jako platforma testowa na początkowym etapie, ważne jest, aby rozważyć bardziej miarodajne warunki testowania w leczeniu infekcji bakteryjnych w bardziej zaawansowanej fazie badania. Oceniając skuteczność aPDI, należy przeprowadzić eksperymenty na organizacjach bakteryjnych typu biofilm, a nie na bakteriach planktonowych. Wiele przypadków klinicznych dotyczy mikroorganizmów zorganizowanych w tej bardziej odpornej konformacji, takich jak rany przewlekłe, mukowiscydoza i wszczepione wyroby medycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez projekt FCT FERMEN. TO - FERmented foods do walki z syNdromem metabbolicznym. Zintegrowane podejście dynamiczne in vitro (2023.00164.RESTART). Prace te były wspierane przez Associate Laboratory for Green Chemistry - LAQV (LA/P/0008/2020 https://doi.org/10.54499/LA/P/0008/2020; UIDP/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDP/50006/2020; UIDB/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDB/50006/2020), które fundusze krajowe finansują z FCT/MCTES. P.C. dziękuje za grant doktorski z FCT (SFRH/BD/150661/2020). Iva Fernandes potwierdza kontrakt na adiunkt (https://doi.org/10.54499/CEECINST/00064/2021/CP2812/CT0004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spektrofotometr Cary 60 UV-VisAgilentG6860A
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD8418
Kuwety jednorazowe PMMABRAND GMBH + CO KG759030
Eppendorfs (500 mL)Probówki Fisher Scientific15625367
Falcon (15 mL)Probówki Corning430791
Falcon ( 50 mL)Panel LED Corning430291
IP65 50W
Micropippete (100 uL)Transferpette S705874
Micropippete (1000 uL)Transferpette S705880
Mueller Hinton agar OxoidCM0405
Wielokanałowa pipeta 12-kanałowaTransferpette S
Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytkiThermo Scientific260844
Phospate Buforowane tabletki soli fizjologicznej pH 7,4Panreac ApplichemA9177
Pipety serologiczne (10 ml)Pipety170356N
(5 ml)Thermo Scientific170366N
Naczynie do hodowli tkankowychTPP Techno Plastic Products AG93150
serologiczne Thermo Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  2. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: A bright new technique to kill resistant microbes. Curr Opin Microbiol. 33 (6), 67-73 (2016).
  3. Aroso, R. T., Oliveira, S. M., Almeida, A., Carvalho, C. M. B. Photodynamic disinfection and its role in controlling infectious diseases. Photochem Photobiol Sci. 20 (11), 1497-1545 (2021).
  4. Rapacka-Zdończyk, A., Woźniak, A., Podbielska, H., Kasprzycka, A. Factors determining the susceptibility of bacteria to antibacterial photodynamic inactivation. Front Med. 8, 733501(2021).
  5. Dolmans, D. E. J. G. J., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  6. Lima, E., Reis, L. V., Silva, A. L. C., Carvalho, M. T. Photodynamic therapy: From the basics to the current progress of N-heterocyclic-bearing dyes as effective photosensitizers. Molecules. 28 (13), 5103(2023).
  7. Pérez-Laguna, V., Pérez-Artiaga, L., Royo-Díaz, D., Gilaberte, Y. A combination of photodynamic therapy and antimicrobial compounds to treat skin and mucosal infections: A systematic review. Photochem Photobiol Sci. 18 (5), 1020-1029 (2019).
  8. Babilas, P., Karrer, S., Szeimies, R. M. Photodynamic therapy in dermatology: state-of-the-art. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 26 (3), 118-132 (2010).
  9. Pérez-Laguna, V., Pérez-Artiaga, L., Gilaberte, Y. Photodynamic therapy combined with antibiotics or antifungals against microorganisms that cause skin and soft tissue infections: a planktonic and biofilm approach to overcome resistances. Pharmaceutics. 14 (6), 1-16 (2021).
  10. Almenara-Blasco, M., López-Roca, A., Pérez-Sanchez, A., Valiente, R. Antimicrobial photodynamic therapy for dermatological infections: current insights and future prospects. Front Photobiol. 2, 773502(2024).
  11. de Oliveira, A. B., Reis, C., Soares, M. T., Batista, S. L. Photodynamic therapy for treating infected skin wounds: a systematic review and meta-analysis from randomized clinical trials. Photodiagnosis Photodyn Ther. 40 (5), 103-118 (2022).
  12. Correia, P., Oliveira, S. R., Batista, A. L. Light-activated amino-substituted dyes as dual-action antibacterial agents: bio-efficacy and AFM evaluation. Dyes Pigm. 224, 111975(2024).
  13. Oliveira, H., Santos, A. R., Costa, L. M. Photoactivated cell-killing amino-based flavylium compounds. Sci Rep. 11 (1), 22005(2021).
  14. Sharma, S., Singh, V., Kaur, S., Mehta, A. Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment. Microorganisms. 11 (6), 1614(2023).
  15. Barolet, D., Christiaens, F., Misery, L. Light-emitting diodes (LEDs) in dermatology. Semin Cutan Med Surg. 27 (3), 227-238 (2009).
  16. Algorri, J. F., López-Higuera, J. M., Rodríguez-Cobo, L., Cobo, A. Advanced light source technologies for photodynamic therapy of skin cancer lesions. Pharmaceutics. 15 (7), 2075(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

LED Light PanelPhotosensitizer ScreeningBacterial Cell DeathFlavylium CompoundsStaphylococcus Aureus96 Well MicroplateReactive Oxygen SpeciesColony CountingSerial Dilution

Powiązane artykuły