Artykuł metodologiczny

Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

DOI:

10.3791/67575

⸱

31 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oferujemy metodologię immunocytochemii (ICC) krok po kroku do wykrywania anty-MDA5. Podejście to obejmuje utrwalanie komórek, permeabilizację, inkubację przeciwciał oraz techniki obrazowania, które pozwalają na dokładne wykrywanie autoprzeciwciał przeciw MDA5, wspomagając diagnozę szybko postępującej śródmiąższowej choroby płuc u pacjentów z zapaleniem mięśnia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoprzeciwciała przeciw MDA5 są kluczowymi biomarkerami dermatomyositis (DM), amyopatycznego zapalenia dermatomyositis (CADM) oraz polimiozytycznego zapalenia (PM), szczególnie w identyfikacji pacjentów z ryzykiem szybko postępującej śródmiąższowej choroby płuc (RP-ILD). Wczesne wykrycie tych autoprzeciwciał jest niezbędne dla poprawy wyników leczenia pacjentów, ponieważ opóźniona diagnoza często prowadzi do złych rokowań. Obecnie test radioimmunotest jest złotym standardem wykrywania anty-MDA5, jednak jego zastosowanie jest ograniczone przez wysokie koszty, długotrwałe procedury oraz potrzebę specjalistycznej wiedzy. Dodatkowo, test blotowy, szeroko stosowane narzędzie kliniczne, wykazuje wysoki wskaźnik fałszywie pozytywnych przeciwciał przeciwciał MDA5, co może obniżać dokładność diagnostyczną. Aby rozwiązać te ograniczenia, proponujemy nieradioaktywną, wysoce czułą i standaryzowaną metodę testów potwierdzających z wykorzystaniem immunocytochemii (ICC). Protokół ten polega na leczeniu komórek HeLa konstruktem MDA5, permeabilizacji komórek Tritonem X-100 w celu ułatwienia wiązania pierwotnych autoprzeciwciał przeciw MDA5 oraz wykrywaniu przeciwciał związanych z wiązaniem za pomocą enzymatycznych przeciwciał wtórnych (np. peroksydaza chrzanu) za pomocą chromogenu DAB do mikroskopii. ICC oferuje praktyczne, opłacalne i wysokoczułe podejście do wizualizacji autoprzeciwciał anty-MDA5 w strukturach komórkowych. Integrując ICC jako uzupełniającą procedurę potwierdzającą, badanie ma na celu zwiększenie wiarygodności wykrywania anty-MDA5, a tym samym ulepszenie strategii diagnostycznych i prognostycznych dla RP-ILD u pacjentów z DM, APM i PM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Idiopatyczne zapalne miopatie (IIM), powszechnie nazywane zapaleniem mięśnia, to heterogeniczna grupa chorób autoimmunologicznych charakteryzujących się przewlekłym zapaleniem mięśni, zmiennymi przejawami klinicznymi oraz różnorodnymi efektami terapeutycznymi. Typowe objawy to osłabienie mięśni, obniżona wytrzymałość oraz mialgia1. Główne podtypy IIM to polimiozytyczne zapalenie (PM) i dermatomyositis (DM), natomiast klinicznie amyopatyczne dermatomyositis (CADM) wyróżnia się charakterystycznymi wysypkami skórnymi podobnymi do tych obserwowanych u DM, ale z minimalnym lub żadnym zaangażowaniem mięśni. Głównym powikłaniem w PM, DM i CADM jest śródmiąższowa choroba płuc (ILD), która dotyka około 40% pacjentów i wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością2.

Przebieg kliniczny i rokowania ILD w IIM są bardzo zróżnicowane. ILD powiązany z DM i CADM (DM-/CADM-ILD) zwykle jest bardziej oporny na leczenie i ma gorsze rokowanie niż ILD powiązany z PM. Spośród nich ostra lub podostra ILD, która postępuje szybko w ciągu trzech miesięcy3, jest szczególnie ciężka, z pięcioletnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 52%, w porównaniu do 87% dla przewlekłej ILD, która postępuje powoli lub pozostaje stabilna. Szybko postępujące ILD (RP-ILD), będące podtypem ostrego/podostrego ILD, charakteryzuje się szybkim pojawieniem się duszności oraz rozległym uszkodzeniem pęcherzyka płucnego widocznym na obrazowaniu klatki piersiowej. RP-ILD to stan zagrażający życiu o złym rokowaniu, co podkreśla pilną potrzebę wczesnej diagnozy i szybkiej interwencji w celu poprawy wyników leczenia 4,5,6.

Specyficzne dla zapalenia mięśni (MSA) autoprzeciwciała stały się kluczowymi biomarkerami w ILD związanym z zapaleniem mięśnia, przy czym przeciwciała przeciw MDA5 odgrywają szczególnie istotną rolę. Te autoprzeciwciała są często wykrywane u pacjentów z PM-/DM-/CADM-ILD i stanowią ważne wskaźniki prognostyczne dla RP-ILD 7,8,9. MDA5 (gen związany z różnicowaniem czerniaka 5) to cytosolowy receptor rozpoznawania wzorców kodowany przez gen indukowany interferonem, który wykrywa podwójne RNA wirusowe i mitochondrialne, inicjując odpowiedzi immunologiczne pośredniczone interferonem10. Chociaż dokładne mechanizmy patogeniczne pozostają niejasne, uważa się, że autoprzeciwciała anty-MDA5 zakłócają funkcjonowanie MDA5, przyczyniając się tym samym do patogenezy autoimmunologicznej.

Terminowe wykrycie autoprzeciwciał anty-MDA5 jest niezbędne dla wczesnej identyfikacji i leczenia RP-ILD. Tradycyjnie radioaktywna immunoprecipitacja (IP) z użyciem 35ekstraktów komórek K562 znakowanych przez S-metioninę była uznawana za złoty standard wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA511. Jednak ta metoda jest niepraktyczna do rutynowego zastosowania klinicznego ze względu na wysokie koszty, zależność od specjalistycznego sprzętu i wykwalifikowanego personelu, surowe przepisy dotyczące utylizacji odpadów radioaktywnych oraz ograniczoną żywotność odczynników znakowanych radioaktywnie. W praktyce klinicznej testy blot są powszechnie stosowane jako alternatywy; jednak wiążą się one z wysokim wskaźnikiem fałszywie pozytywnych wyników przeciwciał przeciw MDA512,13, co budzi obawy dotyczące dokładności diagnostycznej. W związku z tym pilnie potrzebne jest przeprowadzenie wiarygodnego, nieradioaktywnego testu potwierdzającego, który potwierdzi pozytywne wyniki i poprawi pewność diagnostyczną.

Aby wypełnić tę lukę, proponujemy zastosowanie immunocytochemii (ICC) jako uzupełniającego testu potwierdzającego autoantyciała przeciwciała przeciw MDA5. Podejście to polega na transfekcji komórek HeLa za pomocą konstruktu MDA5, inkubacji komórek osoczem pacjenta oraz wykrywaniu związanych autoprzeciwciał anty-MDA5 przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z enzymami (np. peroksydaza chrzanu) połączonych z chromogenicznym substratem do wizualizacji pod mikroskopem świetlnym. ICC zapewnia nieradioaktywną, wysoce czułą i standaryzowaną platformę do wizualizacji autoprzeciwciał przeciw MDA5 w przedziałach komórkowych. Poprzez integrację ICC z testem blotowym, metoda ta ma na celu zmniejszenie wskaźnika fałszywie pozytywnych wyników, poprawę dokładności diagnostycznej oraz ostatecznie poprawę zarządzania klinicznego i wyników leczenia pacjentów.

Celem tego badania jest ustanowienie solidnego, nieradioaktywnego protokołu wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA5, odpowiadającego na ograniczenia obecnych metod wykrywania oraz oferującego klinicystom praktyczne i wiarygodne narzędzie do wczesnej diagnozy RP-ILD u pacjentów z PM, DM i CADM. W towarzyszącej narracji wideo ten zagrażający życiu kurs jest potocznie opisywany jako "szybka śmierć"; naukowo odpowiada to szybko postępującemu ILD (RP-ILD). Prace te opierają się na istniejących dowodach i mają potencjał do znaczącej poprawy oceny prognosycznej oraz podejmowania decyzji terapeutycznych w praktyce klinicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Utrzymuj komórki HeLa za pomocą Zmodyfikowanego Medium Eagle Dulbecco zawierającego 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i 1% antymikotyku antymikotycznego w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5%CO2 .
  2. Usuwaj komórki co 2-3 dni lub gdy komórki osiągną łączność 90%-100%.
  3. Nasiono 7 × 10 4komórek HeLa w każdej dołku na 24-dołkownicowej płytce (1,9 cm2/dołek) 24 godziny przed transfekcją, aby komórki osiągnęły około 90% zbieżności.
  4. Rozcieńcz 500 ng plazmidu (pENTER-MDA5) oraz 1,5 μL odczynnika transfekcyjnego każdy w 25 μL zredukowanego medium surowicowego.
  5. Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonego odczynnika transfekcyjnego (stosunek 1:1). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 5 minut.
  6. Dodaj mieszankę do komórek zasianych dzień wcześniej i natychmiast mieszaj, aby wymieszać kompleks DNA-lipidowy. Potwierdź, że komórki są łączne w 80%-90%.
  7. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny, a następnie wykonuj ICC.
    UWAGA: Użyliśmy komercyjnie dostępnego wektora (pEnter-MDA5); więcej informacji można znaleźć w Tabeli Materiałów. Skuteczność transfekcji wynosi ~50%.
    Skuteczność transfekcji i ekspresji docelowego białka można określić, transfekując komórki plazmidem ekspresyjnym fluorescencyjnym oraz przeprowadzając western blot w celu wizualizacji ekspresji docelowego białka.

2. Utrwalanie komórek

  1. Po inkubacji przemyj komórki 2 razy PBS, aby usunąć pozostałe nośniki.
    UWAGA: Mycie można wykonać poprzez potrząsanie płytą na wstrząsance orbitalnej.
  2. Utrwal komórki w 4% paradehydu w PBS. Zostaw ogniwa na 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Stosuj odpowiednie zasady postępowania.
  3. Aspiruj odczynnik utrwalający i użyj PBS do przemycia komórek 2 razy.

3. Permeabilizacja komórek

  1. Dodaj odczynnik Triton X-100 (0,3% w PBS) i pozwól komórkom odczekać 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Po 10 minutach wyrzuć detergent.
  3. Dodaj PBS do przeprania komórek raz.

4. Blokowanie komórek

  1. Wykonaj blokowanie z 10% surowicy płodowej bydła w PBS (1x) i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń odczynnik blokujący, a następnie dodaj PBS, aby raz przepłukać komórki.

5. Hybrydyzacja przeciwciał pacjenta

  1. Dodaj rozcieńczone osocze pacjenta do komórek. Przed użyciem pamiętaj, aby rozcieńczyć próbkę pacjenta (rozcieńczenie 1:5 000 w PBS) w PBS.
    UWAGA: Dostosuj rozcieńczenie, aby wzmocnić sygnał lub zmniejszyć tło w razie potrzeby. Aby zapewnić obiektywne wyniki, personel przeprowadzający testy nie miał wiedzy, które próbki należały do pacjentów, a które od zdrowych osób.
  2. Inkubuj próbkę w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin (przez noc).
  3. Po upływie okresu inkubacji pobierz próbkę pacjenta i przemyj komórki 3 razy PBS.

6. Hybrydyzacja przeciwciał wtórnych

  1. Należ na komórki poddać rozcieńczony IgG kozi antyludzki z nadoksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:250 w PBS) i pozostawić komórki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Godzinę później pozbądź się przeciwciał wtórnych.
  3. Przepłucz PBS 3x.

7. Barwienie komórkowe

  1. Po umyciu komórek barw je 300 μL roztworu roboczego DAB.
    UWAGA: Roztwór ten został przygotowany przez zmieszanie koncentratu chromogenu DAB i rozcieńczalnika DAB zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Po 5 minutach barwienia komórek usuń barwnik, opłuknij wodą destylowaną i potrząsaj przez 5 minut.

8. Kontrastkolorowanie komórkowe

  1. Przeciwbarwienie jądra komórkowego rozcieńczoną hematoksyliną.
    UWAGA: Stosujemy hematoksylinę Gill II w 10-krotnym rozcieńczeniu i czekamy 5 minut na proces barwienia.
  2. Po 5 minutach wyrzuć hematoksylinę, a następnie przepłucz ją dezynzistowaną wodą destylowaną przez 2 x 5 minut.

9. Obserwacja

  1. Obserwuj efekty barwienia za pomocą mikroskopu optycznego.
    UWAGA: Prawdziwy pozytywny wynik wykazuje silne brązowe barwienie wewnątrz komórek HeLa ekspresujących MDA5; potwierdza to obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w próbce pacjenta. Wynik negatywny pokazuje komórki HeLa bez brązowego przebarwienia, co wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciw MDA5. Wynik fałszywie pozytywny wykazuje rozległe brązowe przebarwienia we wszystkich komórkach, niezależnie od ekspresji MDA5. To niespecyficzne zabarwienie, występujące w innych chorobach autoimmunologicznych, musi być odróżnione od prawdziwie pozytywnego, aby uniknąć błędnej diagnozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Personel przeprowadzający testy był ślepy na tożsamość próbek, w tym na konkretnych pacjentów, od których je pozyskano, aby zminimalizować potencjalne błędy w procesie oceny. Jednak choć zdrowe próbki kontrolne nie były poddawane oślepianiu, konsekwentnie dawały jasne i jednoznaczne wyniki.

Rysunek 1A pokazuje skuteczną ekspresję MDA5 w komórkach HeLa transfekowanych za pomocą konstrukcji pENTER-MDA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza technika identyfikacji autoprzeciwciał anty-MDA5 oparta na ICC oferuje znaczące przewagi w porównaniu z tradycyjnymi metodami, takimi jak analiza plam linii czy radioimmunoagram. Wcześniej Nombel i in. zgłaszali odpowiednio wartości wrażliwości i swoistości na poziomie 96% i 100%, porównując pośrednią immunofluorescencję (IIF) na komórkach transfekowanych MDA5 z ELISA w kohorcie 23 pacjentów z dermatomiozyozą z anty-MDA5-dodatnim oraz 22 kontrolami anty-MDA5-negatywnymi14. Jednak ten ELISA n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia.

Fragmenty tego rękopisu zostały wygenerowane przy pomocy GPT-4 firmy OpenAI. Autorzy przejrzeli i zredagowali treść, aby zapewnić dokładność i oryginalność.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty Tajwańskiej Narodowej Rady Nauki i Technologii przyznane Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 oraz NSTC 113-2320-B-039-032). Badanie to było również częściowo wspierane przez granty Chińskiego Uniwersytetu Medycznego i szpitala przyznane Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 oraz C1110812016-12).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki z 24 dołkami (1,9 cm²/well)Corning354541
Antymikotyk antybiotykowyGibco15240062
ZlewkiPYREX1000-600
Stożkowe lampy (15 mL)Corning430052
Stożkowe lampy (50 mL)Corning430290
Dejonizowana woda destylowanaNasza destylowana woda destylowana jest produkowana wewnętrznie przy użyciu systemu Milli-Q (Kolumna 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Kolumna 2: Prepak, SN: F1CB11442)
Charakteryzowane surowicę bydła płodowąCytivaSH30396.03
cylindry stopniowane (50 mL)VITLAB64804
Hematoksylin Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco' s Modified Eagle Medium o wysokiej glukozieCytivaSH30243.02
Lipofektamin 2000 reagent transfekcyjnyInvitrogen11668019Odczynnik transfekcyjny
MDA-5 (D74E4) Królik mAbTechnologia sygnalizacji komórkowej5321
Rurki mikrowirówkowe (1,5 mL probówki Eppendorfa)AXYGEN142503
Opti-MEM I substrat surowicyGibco31985070
Orbitalny shaker (opcjonalnie)FIRSTEKS300R
ParaformaldehydSigma-Aldrich4% w 1x PBS
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Peroksydaza AffiniCzyste kozi, antyludzkie IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
Kontroler pipetyThermo Scientific130165
Pipety GILSON
Pipety i końcówki pipetek (10 & mikro; L)QSP104-Q
Pipety i końcówki pipetek (200 & mikro; L)QSPT090-Q
Pipety i końcówki pipetek (1000 & mikro; L)QSP111-Q
Pipety serologiczne (5 mL)SPL91005
Pipety serologiczne (10 mL)SPL91010
Pipety serologiczne (25 mL)SPL91025
Zestaw podłoża SignalStain DABSygnalizacja komórkowa80590,3% w PBS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms. Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).
  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
  5. Go, D. J., et al. Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).
  6. Tsuji, H., et al. Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis. Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).
  7. Hozumi, H., et al. Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Respir Med. 122, 1-8 (2016).
  8. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  9. Koga, T., et al. The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM. Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).
  10. Fuzzi, E., et al. Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside. Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).
  11. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  12. Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity. Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).
  13. Chen, Y. L., Li, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).
  14. Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies. Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).
  15. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  16. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  17. Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza immunocytochemicznar dmi szowa choroba p ucbiomarkery zapalenia sk rno mi niowegopermeabilizacja Tritonem X 100detekcja za pomoc peroksydazy chrzanowejbarwienie chromogenem DABznakowanie przeciwcia ami wt rnymi

Powiązane artykuły