Wykrywanie autoprzeciwciał anty-MDA5 za pomocą komórek HeLa oraz immunocytochemii za pomocą mikroskopii świetlnej

Idiopatyczne zapalne miopatie (IIM), powszechnie nazywane zapaleniem mięśnia, to heterogeniczna grupa chorób autoimmunologicznych charakteryzujących się przewlekłym zapaleniem mięśni, zmiennymi przejawami klinicznymi oraz różnorodnymi efektami terapeutycznymi. Typowe objawy to osłabienie mięśni, obniżona wytrzymałość oraz mialgia¹. Główne podtypy IIM to polimiozytyczne zapalenie (PM) i dermatomyositis (DM), natomiast klinicznie amyopatyczne dermatomyositis (CADM) wyróżnia się charakterystycznymi wysypkami skórnymi podobnymi do tych obserwowanych u DM, ale z minimalnym lub żadnym zaangażowaniem mięśni. Głównym powikłaniem w PM, DM i CADM jest śródmiąższowa choroba płuc (ILD), która dotyka około 40% pacjentów i wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością².

Przebieg kliniczny i rokowania ILD w IIM są bardzo zróżnicowane. ILD powiązany z DM i CADM (DM-/CADM-ILD) zwykle jest bardziej oporny na leczenie i ma gorsze rokowanie niż ILD powiązany z PM. Spośród nich ostra lub podostra ILD, która postępuje szybko w ciągu trzech miesięcy³, jest szczególnie ciężka, z pięcioletnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 52%, w porównaniu do 87% dla przewlekłej ILD, która postępuje powoli lub pozostaje stabilna. Szybko postępujące ILD (RP-ILD), będące podtypem ostrego/podostrego ILD, charakteryzuje się szybkim pojawieniem się duszności oraz rozległym uszkodzeniem pęcherzyka płucnego widocznym na obrazowaniu klatki piersiowej. RP-ILD to stan zagrażający życiu o złym rokowaniu, co podkreśla pilną potrzebę wczesnej diagnozy i szybkiej interwencji w celu poprawy wyników leczenia ^4,5,6.

Specyficzne dla zapalenia mięśni (MSA) autoprzeciwciała stały się kluczowymi biomarkerami w ILD związanym z zapaleniem mięśnia, przy czym przeciwciała przeciw MDA5 odgrywają szczególnie istotną rolę. Te autoprzeciwciała są często wykrywane u pacjentów z PM-/DM-/CADM-ILD i stanowią ważne wskaźniki prognostyczne dla RP-ILD ^7,8,9. MDA5 (gen związany z różnicowaniem czerniaka 5) to cytosolowy receptor rozpoznawania wzorców kodowany przez gen indukowany interferonem, który wykrywa podwójne RNA wirusowe i mitochondrialne, inicjując odpowiedzi immunologiczne pośredniczone interferonem¹⁰. Chociaż dokładne mechanizmy patogeniczne pozostają niejasne, uważa się, że autoprzeciwciała anty-MDA5 zakłócają funkcjonowanie MDA5, przyczyniając się tym samym do patogenezy autoimmunologicznej.

Terminowe wykrycie autoprzeciwciał anty-MDA5 jest niezbędne dla wczesnej identyfikacji i leczenia RP-ILD. Tradycyjnie radioaktywna immunoprecipitacja (IP) z użyciem ³⁵ekstraktów komórek K562 znakowanych przez S-metioninę była uznawana za złoty standard wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA5¹¹. Jednak ta metoda jest niepraktyczna do rutynowego zastosowania klinicznego ze względu na wysokie koszty, zależność od specjalistycznego sprzętu i wykwalifikowanego personelu, surowe przepisy dotyczące utylizacji odpadów radioaktywnych oraz ograniczoną żywotność odczynników znakowanych radioaktywnie. W praktyce klinicznej testy blot są powszechnie stosowane jako alternatywy; jednak wiążą się one z wysokim wskaźnikiem fałszywie pozytywnych wyników przeciwciał przeciw MDA5^12,13, co budzi obawy dotyczące dokładności diagnostycznej. W związku z tym pilnie potrzebne jest przeprowadzenie wiarygodnego, nieradioaktywnego testu potwierdzającego, który potwierdzi pozytywne wyniki i poprawi pewność diagnostyczną.

Aby wypełnić tę lukę, proponujemy zastosowanie immunocytochemii (ICC) jako uzupełniającego testu potwierdzającego autoantyciała przeciwciała przeciw MDA5. Podejście to polega na transfekcji komórek HeLa za pomocą konstruktu MDA5, inkubacji komórek osoczem pacjenta oraz wykrywaniu związanych autoprzeciwciał anty-MDA5 przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z enzymami (np. peroksydaza chrzanu) połączonych z chromogenicznym substratem do wizualizacji pod mikroskopem świetlnym. ICC zapewnia nieradioaktywną, wysoce czułą i standaryzowaną platformę do wizualizacji autoprzeciwciał przeciw MDA5 w przedziałach komórkowych. Poprzez integrację ICC z testem blotowym, metoda ta ma na celu zmniejszenie wskaźnika fałszywie pozytywnych wyników, poprawę dokładności diagnostycznej oraz ostatecznie poprawę zarządzania klinicznego i wyników leczenia pacjentów.

Celem tego badania jest ustanowienie solidnego, nieradioaktywnego protokołu wykrywania autoprzeciwciał anty-MDA5, odpowiadającego na ograniczenia obecnych metod wykrywania oraz oferującego klinicystom praktyczne i wiarygodne narzędzie do wczesnej diagnozy RP-ILD u pacjentów z PM, DM i CADM. W towarzyszącej narracji wideo ten zagrażający życiu kurs jest potocznie opisywany jako "szybka śmierć"; naukowo odpowiada to szybko postępującemu ILD (RP-ILD). Prace te opierają się na istniejących dowodach i mają potencjał do znaczącej poprawy oceny prognosycznej oraz podejmowania decyzji terapeutycznych w praktyce klinicznej.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Utrzymuj komórki HeLa za pomocą Zmodyfikowanego Medium Eagle Dulbecco zawierającego 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i 1% antymikotyku antymikotycznego w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5%_CO2 .
2. Usuwaj komórki co 2-3 dni lub gdy komórki osiągną łączność 90%-100%.
3. Nasiono 7 × 10 4^{komórek HeLa} w każdej dołku na 24-dołkownicowej płytce (1,9 cm²/dołek) 24 godziny przed transfekcją, aby komórki osiągnęły około 90% zbieżności.
4. Rozcieńcz 500 ng plazmidu (pENTER-MDA5) oraz 1,5 μL odczynnika transfekcyjnego każdy w 25 μL zredukowanego medium surowicowego.
5. Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonego odczynnika transfekcyjnego (stosunek 1:1). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 5 minut.
6. Dodaj mieszankę do komórek zasianych dzień wcześniej i natychmiast mieszaj, aby wymieszać kompleks DNA-lipidowy. Potwierdź, że komórki są łączne w 80%-90%.
7. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5% CO₂ przez 24 godziny, a następnie wykonuj ICC.
   UWAGA: Użyliśmy komercyjnie dostępnego wektora (pEnter-MDA5); więcej informacji można znaleźć w Tabeli Materiałów. Skuteczność transfekcji wynosi ~50%.
   Skuteczność transfekcji i ekspresji docelowego białka można określić, transfekując komórki plazmidem ekspresyjnym fluorescencyjnym oraz przeprowadzając western blot w celu wizualizacji ekspresji docelowego białka.

2. Utrwalanie komórek

1. Po inkubacji przemyj komórki 2 razy PBS, aby usunąć pozostałe nośniki.
   UWAGA: Mycie można wykonać poprzez potrząsanie płytą na wstrząsance orbitalnej.
2. Utrwal komórki w 4% paradehydu w PBS. Zostaw ogniwa na 15 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Stosuj odpowiednie zasady postępowania.
3. Aspiruj odczynnik utrwalający i użyj PBS do przemycia komórek 2 razy.

3. Permeabilizacja komórek

1. Dodaj odczynnik Triton X-100 (0,3% w PBS) i pozwól komórkom odczekać 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Po 10 minutach wyrzuć detergent.
3. Dodaj PBS do przeprania komórek raz.

4. Blokowanie komórek

1. Wykonaj blokowanie z 10% surowicy płodowej bydła w PBS (1x) i inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Usuń odczynnik blokujący, a następnie dodaj PBS, aby raz przepłukać komórki.

5. Hybrydyzacja przeciwciał pacjenta

1. Dodaj rozcieńczone osocze pacjenta do komórek. Przed użyciem pamiętaj, aby rozcieńczyć próbkę pacjenta (rozcieńczenie 1:5 000 w PBS) w PBS.
   UWAGA: Dostosuj rozcieńczenie, aby wzmocnić sygnał lub zmniejszyć tło w razie potrzeby. Aby zapewnić obiektywne wyniki, personel przeprowadzający testy nie miał wiedzy, które próbki należały do pacjentów, a które od zdrowych osób.
2. Inkubuj próbkę w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin (przez noc).
3. Po upływie okresu inkubacji pobierz próbkę pacjenta i przemyj komórki 3 razy PBS.

6. Hybrydyzacja przeciwciał wtórnych

1. Należ na komórki poddać rozcieńczony IgG kozi antyludzki z nadoksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:250 w PBS) i pozostawić komórki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Godzinę później pozbądź się przeciwciał wtórnych.
3. Przepłucz PBS 3x.

7. Barwienie komórkowe

1. Po umyciu komórek barw je 300 μL roztworu roboczego DAB.
   UWAGA: Roztwór ten został przygotowany przez zmieszanie koncentratu chromogenu DAB i rozcieńczalnika DAB zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Po 5 minutach barwienia komórek usuń barwnik, opłuknij wodą destylowaną i potrząsaj przez 5 minut.

8. Kontrastkolorowanie komórkowe

1. Przeciwbarwienie jądra komórkowego rozcieńczoną hematoksyliną.
   UWAGA: Stosujemy hematoksylinę Gill II w 10-krotnym rozcieńczeniu i czekamy 5 minut na proces barwienia.
2. Po 5 minutach wyrzuć hematoksylinę, a następnie przepłucz ją dezynzistowaną wodą destylowaną przez 2 x 5 minut.

9. Obserwacja

1. Obserwuj efekty barwienia za pomocą mikroskopu optycznego.
   UWAGA: Prawdziwy pozytywny wynik wykazuje silne brązowe barwienie wewnątrz komórek HeLa ekspresujących MDA5; potwierdza to obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w próbce pacjenta. Wynik negatywny pokazuje komórki HeLa bez brązowego przebarwienia, co wskazuje na brak autoprzeciwciał przeciw MDA5. Wynik fałszywie pozytywny wykazuje rozległe brązowe przebarwienia we wszystkich komórkach, niezależnie od ekspresji MDA5. To niespecyficzne zabarwienie, występujące w innych chorobach autoimmunologicznych, musi być odróżnione od prawdziwie pozytywnego, aby uniknąć błędnej diagnozy.

Personel przeprowadzający testy był ślepy na tożsamość próbek, w tym na konkretnych pacjentów, od których je pozyskano, aby zminimalizować potencjalne błędy w procesie oceny. Jednak choć zdrowe próbki kontrolne nie były poddawane oślepianiu, konsekwentnie dawały jasne i jednoznaczne wyniki.

Rysunek 1A pokazuje skuteczną ekspresję MDA5 w komórkach HeLa transfekowanych za pomocą konstrukcji pENTER-MDA5. Aby zweryfikować skuteczność transfekcji, ICC wykonano przy użyciu komercyjnego przeciwciała anty-MDA5. Silne brązowe barwienia cytoplazmatyczne zaobserwowano w około 50% transfekowanych komórek, co wskazuje na silną ekspresję białka MDA5. Natomiast komórki nietransfekowane w identycznych warunkach nie wykazały barwienia cytoplazmatycznego, co potwierdza specyficzność przeciwciała oraz brak endogennej ekspresji MDA5.

Zgodnie z protokołem ICC, reprezentatywne próbki pacjentów z anty-MDA5, potwierdzone radioznakowaną immunoprecipitacją, wykazały wyraźne brązowe barwienia cytoplazmatyczne w komórkach HeLa ekspresujących MDA5, podczas gdy komórki nietransfekowane pozostały niezabarwione (Rysunek 1B). Ten wzór barwienia wskazuje na obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w osoczu pacjenta i jest zgodny z ustalonym standardem wykrywania przy użyciu 35ekstraktów komórek K562 znakowanych S-metioniną.

Charakterystyka pacjentów została podsumowana w Tabeli UzupełniającejS1, która przedstawia diagnozy kliniczne, status przeciwciał przeciwciał anty-MDA5 oraz klasyfikację w trzech grupach: anty-MDA5-dodatnie, fałszywie pozytywne oraz zdrową kontrolę. Oprócz statusu przeciwciał, Tabela Uzupełniająca S1 podsumowuje również demografię pacjentów, w tym wiek, płeć oraz diagnozę podstawową dla każdej kohorty. Reaktywność przeciwciał była oceniana częściowo ilościowo jako słaba (1+), umiarkowana (2+) lub silna (3+) w zależności od intensywności pasma, co odzwierciedlało rosnące poziomy przeciwciał. Zapewnia to kontekst kliniczny do interpretacji wyników ICC, jednocześnie zachowując główny priorytet metodologiczny niniejszego badania. Kohorta badawcza obejmowała 10 pacjentów z potwierdzonymi przeciwciałami przeciwciałami anty-MDA5 (grupa dodatnia), pięciu pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, którzy uzyskali fałszywie pozytywne wyniki dzięki komercyjnym testom blot (grupa fałszywie pozytywna), oraz 10 zdrowych osób (zdrowa grupa kontrolna). Każda próbka była testowana wraz z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi oraz weryfikowana niezależnie za pomocą radioznakowanej immunoprecipitacji. Dla próbek o wyraźnych i jednoznacznych wynikach barwienia uznano za wystarczający jeden przebieg ICC. W przypadkach, gdy barwienie było niejednoznaczne lub na granicy, przeprowadzono dalsze badania, w tym seryjne rozcieńczenia i powtarzające testy ICC, aby zapewnić dokładną interpretację. Takie podejście zapewniło zarówno rzetelność metodologiczną, jak i efektywność zasobów w weryfikacji wydajności metody wykrywania opartej na ICC.

Fałszywie pozytywne wyniki przedstawiono na Rysunku 2. W tych próbkach wykorzystano osocze pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi innymi niż idiopatyczne miopatie zapalne (IIM). W przeciwieństwie do Rysunku 1, brązowe barwienie cytoplazmatyczne było szeroko obserwowane we wszystkich komórkach, niezależnie od statusu ekspresji MDA5. Ten wzór barwienia wskazuje na niespecyficzne wiązanie i podkreśla ryzyko fałszywie pozytywnych wyników w próbkach pacjentów z innymi chorobami autoimmunologicznymi. Wyniki negatywne przedstawiono na Rysunku 3, gdzie badano osocze zdrowych osób. Praktycznie nie zaobserwowano brązowego barwienia cytoplazmatycznego ani w komórkach HeLa transfekowanych, ani nietransfekowanych, co wskazuje na brak autoprzeciwciał anty-MDA5 w tych próbkach.

Rysunek 1: Walidacja ekspresji MDA5 i wykrywanie autoprzeciwciał przeciw MDA5 za pomocą ICC. (A) Komórki HeLa transfekowane plazmidem ekspresyjnym MDA5 zostały zabarwione komercyjnym przeciwciałem anty-MDA5. Zaobserwowano silne brązowe barwienia cytoplazmatyczne, co wskazuje na silną ekspresję białka MDA5. Natomiast komórki nietransfekowane w identycznych warunkach nie wykazywały barwienia, co potwierdza zarówno specyficzność przeciwciał, jak i brak endogennej ekspresji MDA5. (B) Komórki HeLa transfekowane MDA5 były inkubowane w osocze u pacjentów, u których potwierdzono dodatnie anty-MDA5 dzięki radiomarkerowanej immunoprecipitacji. Zaobserwowano wyraźne cytoplazmatyczne brązowe przebarwienia, co wykazało obecność autoprzeciwciał anty-MDA5 w próbce pacjenta. Pręty skalowe = 50 μm. Skrót: ICC = immunocytochemia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Wykrywanie fałszywie pozytywnych sygnałów za pomocą osocza u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi innymi niż IIM. Szeroko zaobserwowano brązowe barwienia cytoplazmatyczne zarówno w komórkach transfekowanych, jak i nietransfekowanych, co sugeruje niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Wyniki te ilustrują potencjał do wykrywania fałszywie dodatnich wyników w testach line blot przy użyciu osocza u pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi niezwiązanymi z pacjentami z anty-MDA5-dodatnim IIM. Pręty skalowe = 50 μm. Skrót: IIM = idiopatyczne miopatie zapalne. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Negatywne barwienia występują w osocze u zdrowych osób kontrolnych. Komórki HeLa transekowane MDA5 i inkubowane osoczem od zdrowych osób wykazały niewielkie lub żadne brązowe barwienia cytoplazmatyczne. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela uzupełniająca S1: Cechy pacjenta. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia.

Fragmenty tego rękopisu zostały wygenerowane przy pomocy GPT-4 firmy OpenAI. Autorzy przejrzeli i zredagowali treść, aby zapewnić dokładność i oryginalność.