Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Kora nowa odnosi się do zewnętrznej powłoki półkul mózgowych i jest strukturą unikalną dla ssaków. Kora nowa reprezentuje siedlisko wyższych funkcji poznawczych^1,2,3,4,5. Podczas rozwoju nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe dają początek neuronom w procesie zwanym neurogenezą. Badania funkcjonalne badające rozwój ludzkiej kory nowej stanowią podstawę do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji ludzkich nerwowych komórek macierzystych, patologii neuronalnych i ewolucji ludzkiego mózgu^2,6,7.

Historycznie rzecz biorąc, badania nad rozwojem ludzkiego mózgu opierały się na opisowych metodach histologicznych z wykorzystaniem tkanek pośmiertnych, z nowszymi systemami hodowli tkanek swobodnie pływających, umożliwiającymi badania funkcjonalne na tkance ludzkiego płodu8^,9. Ponadto wykazano, że tkanka mózgowa ludzkiego płodu ma zdolność do samoorganizacji w długoterminowo rozwijające się organoidy¹⁰. Badania nad tkankami płodowymi dostarczyły ważnych informacji na temat rozwoju człowieka^11,12, jednak ograniczona dostępność tkanek i względy etyczne ograniczają ich szerokie zastosowanie w mechanistycznych badaniach rozwoju ludzkiego mózgu. W ciągu ostatniej dekady opracowano protokoły, które pozwalają na generowanie trójwymiarowych organoidów nerwowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym ludzkiego indukowanego PSC (hiPSC)^13,14.

Organoidy mózgowe wykazują ważne cechy rozwijającego się mózgu, takie jak tworzenie struktur podobnych do komór, polaryzacja apikopodstawna, cytoarchitektura kory mózgowej, międzykinetyczna migracja jądrowa podczas radialnego podziału gleju i migracja neuronów. Co ważne, te nowe modele ludzkich organoidów podsumowują cechy ludzkiego rozwijającego się mózgu, które nie są dobrze modelowane u myszy, w tym ewolucyjnie istotne kluczowe typy progenitorów nerwowych, w szczególności podstawowy glej promieniowy (lub zewnętrzny glej promieniowy)^7,14,15. Kilka ograniczeń wczesnych protokołów organoidów mózgowych - takich jak problemy z heterogenicznością organoidów, ograniczone dostarczanie składników odżywczych do wewnętrznego rdzenia i zróżnicowana tożsamość regionalna - zostało rozwiązanych w ostatnich postępach w protokole i można spodziewać się dalszych ulepszeń w nadchodzących latach^{15,16,17,18,19}. Organoidy mózgowe i korowe człowieka szybko stały się kluczowymi modelami do badania rozwoju kory mózgowej człowieka²⁰, zaburzenia neurologiczne^21,22,23,24 i ewolucja mózgu^{25,26,27,28,29}, oraz do przeprowadzania badań przesiewowych na dużą skalę^30,31,32.

Dla ostrej manipulacji genetycznej, dwie metody były głównie stosowane w zwierzęcych modelach rozwoju kory nowej: dostarczanie wirusa przez infekcję komórek docelowych³³ oraz elektroporacja in utero lub in vitro^34,35. Wstrzyknięcie DNA - a ostatnio kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP) CRISPR/Cas9 ³⁶- do komór bocznych, a następnie elektroporacja, ma tę zaletę, że określone obszary mózgu mogą być celowane w oparciu o orientację elektrod elektroporacyjnych. Elektroporacja polega na krótkich impulsach elektrycznych, które tymczasowo zwiększają przepuszczalność błony komórkowej, umożliwiając wprowadzenie DNA i innych naładowanych cząsteczek do komórek. Elektroporacja in utero została po raz pierwszy przeprowadzona w mouse³⁷, gdzie szybko stała się szeroko stosowaną metodologią w neurobiologii rozwojowej. Metoda ta została następnie zastosowana również do innych gatunków, takich jak rat^38,39 i frret^40,41,42, gatunek gyrencefaliczny używany do badania ekspansji kory nowej i fałdowania kory mózgowej^3,43,44,45.

Elektroporacja stała się również ważną metodą w badaniach organoidów ludzkiego mózgu⁴⁶. W organoidach mózgowych elektroporacja została zastosowana do wizualizacji morfologii komórek i aksonów neuronalnych^14,47, do dostarczania odczynników do knockdownu genów^22,48,49, oraz do badania funkcji genów przez nadekspresję⁵⁰. Metoda ta nie ogranicza się do modeli ludzkich, ale została również zastosowana do modyfikacji genetycznej organoidów mózgowych naczelnych^50,51. Ponadto opisano elektroporację organoidów korowych generowanych w bioreaktorze wirującym Spin Ω spinowym⁵².

W tym protokole opisujemy elektroporację pokrojonych ludzkich organoidów korowych¹⁵ do badań funkcji genów w rozwoju kory mózgowej. Organoidy specyficzne dla regionu mózgu zwiększają odtwarzalność i spójność, co ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analizy ilościowej, na przykład w modelowaniu chorób. W protokole organoidów kory ludzkiej z warstwami na plasterki¹⁵, podczas różnicowania iPSC stosuje się silne wskazówki dotyczące wzorców w celu uzyskania jednorodnej populacji przodków grzbietowej części przodomózgowia, po czym stosuje się pożywki hodowlane, które promują wzrost tkanek z mniejszą liczbą sygnałów instruktażowych^53,54. Wykazano, że krojenie organoidów korowych zmniejsza śmierć komórek wynikającą ze zmniejszonej dostępności składników odżywczych i tlenu w rdzeniu organoidu¹⁵. Co więcej, krojenie wspomaga rozwój struktur przypominających komory zawierające obfity podstawowy glej promieniowy, z utrzymującą się neurogenezą prowadzącą do powstania rozszerzonego obszaru przypominającego płytkę korową¹⁵. Wielokrotne krojenie w tym protokole sprawia również, że te organoidy korowe są szczególnie odpowiednie do elektroporacji, ponieważ światła komór można łatwo zidentyfikować i nacelować przez wstrzyknięcie. Elektroporacja pokrojonych organoidów korowych została zastosowana do badania regionów regulatorowych genów i ewolucji kory mózgowej^26,55.

Podczas procedury elektroporacji, mieszanka iniekcyjna jest dostarczana do światła struktur podobnych do komór. Po zastosowaniu pulsacyjnego pola elektrycznego mieszanina jest pobierana przez glej promieniowy wierzchołkowy, który wyściela komorę. Gdy wierzchołkowy promienisty glej dzieli się i daje początek bardziej zaangażowanym typom komórek⁴, czynniki elektroporowane są przekazywane do podstawowych komórek progenitorowych i neuronów. Elektroporowane potomstwo jest rozprowadzane w strefie komorowej (VZ) i strefie podkomorowej (SVZ) po 3 dniach i obejmuje większość ściany kory mózgowej, w tym obszar podobny do płytki korowej (CP), 7 dni po elektroporacji w środkowych stadiach neurogennych^26,55.

Tutaj opisujemy zakłócenia genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9⁵⁶ poprzez elektroporację w pokrojonych ludzkich organoidach korowych²⁶. Ponadto metoda elektroporacji może być również stosowana do nadekspresji genów, wizualizacji morfologii komórek i procesów komórkowych poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, dostarczania bibliotek plazmidów do masowych równoległych testów reporterowych (MPRA), dostarczania narzędzi do edycji epigenomu i znakowania komórek do obrazowania na żywo.

Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i zatwierdzone przez Komitet Oceny Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Dreźnie (IRB00001473; IORG0001076; numer aprobaty etycznej SR-EK-456092021).

1. Projektowanie przewodników RNA do ostrego nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9

1. Zaprojektuj parę przewodnikowych RNA (gRNA) celujących w ten sam ekson w odległości idealnie 7-11 pz (unikając wielokrotności 3 pz) między sąsiednimi motywami protospacer (PAM), aby zwiększyć prawdopodobieństwo rozerwania białka za pomocą oprogramowania lub narzędzi online.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby celem były eksony, które kodują domeny funkcjonalne. Alternatywnie można wybrać pierwsze eksony transkryptu (Rysunek 1A). Wybierz RNA przewodnika na podstawie wyniku aktywności (blisko 1)⁵⁷ i wyniku swoistości (blisko 100 %)⁵⁸.

2. Hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

1. Aby wygenerować organoidy ludzkiej kory mózgowej i zwalidować funkcję gRNA, użyj linii hiPSC CRTDi004-A⁵⁹, która pochodzi od zdrowego dawcy.
2. Hodowla iPSC zgodnie z wcześniejszym opisem⁶⁰ na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzyą błony podstawowej w pożywce z komórek macierzystych w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO₂ ). Indukowane PSC powinny być pasażowane przy 80% zbieganiu przy użyciu enzymu do dysocjacji pojedynczych komórek z suplementacją inhibitora szlaku ROCK (1:1,000) w ciągu pierwszych 24 godzin
   UWAGA: Inne linie iPSC mogą być używane do generowania organoidów i walidacji gRNA.

3. Ekstrakcja genomowego DNA z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

1. Użyj 2 dołków z 80%-90% zlewającym się hiPSC z 6-dołkowej płytki do ekstrakcji genomowego DNA. Oddziel komórki od płytki za pomocą enzymu, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Zebrać komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi (objętość całkowita), następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 600 x g i usunąć supernatant.
2. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl buforu do lizy (50 mM TrisHCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 % SDS, 5 mM EDTA w H₂O) i 12,5 μl proteinazy K (10 mg/ml zapasu). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C i 250 obr./min.
3. Wymieszać w 100 μl 5 mM NaCl. Wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml.
4. Dodać 250 μl izopropanolu, kilkakrotnie odwrócić probówki i wirować przez 15 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C.
5. Usunąć supernatant, przemyć 500 μl 70 % EtOH (klasa biologii molekularnej), odwrócić probówki i wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C.
6. Na koniec całkowicie usunąć sklarowany osad, ostrożnie go pipetując i dociskając otwarte probówki reakcyjne do ręczników papierowych.
7. Pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie rozpuścić go w 100 μl wody wolnej od nukleaz przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
8. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrometru. Wyizolowany genomowy DNA jest stabilny w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

4. Weryfikacja rozpoznawania matrycy przez gRNA (in vitro)

UWAGA: Jako pierwsze podejście do walidacji udanego rozpoznania matrycy przez gRNA, wykonaj reakcję Cas9 in vitro, w której dwuniciowe DNA jest rozszczepiane na dwa fragmenty, które można rozróżnić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym^40,61,62.

1. Aby wygenerować matrycę, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z mieszanką wzorcową PCR o wysokiej wierności i starterami 10 μM na genomowym DNA wyizolowanym z hiPSC (sekcja 3) przy użyciu następujących warunków cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, 40 cykli [98 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.
   1. Dostosuj temperaturę wyżarzania zgodnie ze starterami PCR. Upewnij się, że amplikon ma rozmiar od 800 pz do 1,5 kb z asymetryczną lokalizacją miejsc wiązania gRNA.
   2. Rozpuść produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej na 1,5% żelu agarozowym, odetnij odpowiedni prążek z żelu i wyekstrahuj DNA²⁶.
   3. Zmierzyć stężenie DNA w wyekstrahowanym produkcie PCR za pomocą spektrometru.
2. Złóż funkcjonalne gRNA, łącząc 10 μM CRISPR RNA (crRNA, sekwencja niestandardowa, zapas 100 μM) i 10 μM tracrRNA (zapas 100 μM) w beznukleazowym buforze dupleksowym (całkowita objętość 5 μL). Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT).
3. Utwórz kompleks rybonukleoproteinowy (RNP), łącząc 10 μM gRNA z kroku 4.2 i 1 μM enzymu Cas9 (ze Streptococcus pyogenes, 62 μM) w PBS przez 15 minut w RT (25 μL objętości całkowitej).
4. Aby przeprowadzić reakcję trawienia in vitro, zmieszać 1 μM kompleksu RNP (z kroku 4.3) z 0,1 μM matrycą DNA (produkt PCR z kroku 4.1) i 1x buforem reakcyjnym nukleazy Cas9 (zawierającym 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl₂, 1 mM EDTA; pH 6,5; może być przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C).
   1. Napełnij do końcowej objętości 10 μl wodą wolną od nukleaz.
   2. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   3. Dodać 2 mg/ml proteinazy K i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 56 °C w celu uwolnienia substratu DNA z enzymu Cas9. Przetrawioną mieszaninę reakcyjną przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do czasu końcowej analizy.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie stosunku molowego substratu Cas9-RNP:DNA 10:1 w celu uzyskania najlepszej wydajności łupania. W razie potrzeby rozcieńczyć produkt PCR w wodzie wolnej od nukleaz do wymaganego stężenia. Jako kontrolę ujemną można zabrać ze sobą mieszaninę reakcyjną pozbawioną enzymu gRNA lub Cas9.
5. Wizualizacja rozszczepionych produktów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym na 2% żelu agarozowym.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby widoczne były dwie prążki o różnych rozmiarach, a prążek matrycy zniknął lub został silnie zmniejszony w celu uzyskania wydajnych gRNA (Rysunek 1B).

5. Weryfikacja funkcji gRNA w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych

UWAGA: Zaleca się przetestowanie skuteczności gRNA celujących w tę samą linię komórkową, z której będą generowane organoidy korowe²⁶. W tym celu kompleksy RNP zawierające odpowiednie gRNA są kotransfekowane plazmidem ekspresyjnym GFP do hiPSC, komórki są hodowane przez 3 dni, a następnie izolowane jest genomowe DNA w celu analizy sekwencjonowania. Do każdego testu gRNA potrzeba około 200 000 komórek. Komórki nie powinny zlewać się w więcej niż 70%-80% i powinny być pasażowane co najmniej dwa razy po rozmrożeniu. Ważne jest, aby wziąć ze sobą kontrolę ujemną (gLACZ)^36,63 i stan próbny (roztwór nukleofekcji bez RNP).

1. Zmień pożywkę hiPSC tak, aby zawierała inhibitor ROCK (1:1,000) na 2 godziny przed eksperymentem, aby zwiększyć żywotność komórek w kapturze do hodowli komórkowej.
2. Pokryj odpowiednią liczbę dołków płytki 6-dołkowej podstawową matrycą membranową.
3. Uruchom jednostkę nukleofektora ("jednostka X" dla pasków 16-dołkowych) i wybierz program "Komórki ES, H9" zgodnie z zaprogramowanym programem (impuls CB150). Wybierz odpowiednią liczbę dołków paska.
4. Przygotuj kompleksy RNP, łącząc 24 μM crRNA i 24 μM tracrRNA w buforze dupleksowym.
   1. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie ostudzić do temperatury pokojowej, jak opisano w kroku 4.2.
   2. W międzyczasie rozcieńczyć enzym Cas9 do 8 μM w PBS.
   3. Połączyć 3 μl gRNA i 3 μl Cas9 i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, aby złożyć RNP.
      UWAGA: Stosunek molowy 3:1 gRNA:Cas9 zapewnia optymalną wydajność rozszczepienia. Aby przetestować gRNA jako parę, przygotuj każdy RNP osobno i połącz 1,5 μl każdego RNP na końcu.
5. Podczas 15-minutowej inkubacji RNP należy przygotować hiPSC do nukleofekcji pod kapturem hodowli komórkowej.
   1. Zastąp powłokę błony podstawnej 1,5 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem ROCK (1:1,000) i 1x penicyliną/streptomycyną na studzienkę.
   2. Przygotować roztwór nukleofekcji jako mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Odłączyć hiPSC od płytki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (jak opisano w sekcji 2) i policzyć komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym w komorze liczącej Neubauera.
   4. Osadzaj 200 000 żywych komórek na parę gRNA przy 600 x g przez 5 minut.
6. W kapturze do hodowli komórkowej, na lodzie, dodać 3 μl RNP do 20 μl roztworu nukleofekcji plus 0,2 μg/μL plazmidu pCAG-GFP.
7. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 23 μl końcowej mieszanki nukleofekcji i przenieść je do 1 dołka 16-dołkowego paska nukleofekcji na lodzie.
8. Gdy wszystkie warunki znajdą się w pasku, umieść go w jednostce nukleofektorowej X na zewnątrz okapu i naciśnij przycisk Start, aby zainicjować nukleofekcję.
9. Następnie przetransportuj pasek nukleofekcji z powrotem pod kaptur hodowli komórkowej i przenieś komórki nukleofektyczne na przygotowaną płytkę 6-dołkową, wypłukując studzienki paskowe jakimś podłożem z płytki.
10. Hoduj hiPSC przez 3 dni, zmieniając pożywkę zawierającą 1x penicylina/streptomycyna dziennie. Po 24 godzinach inhibitor ROCK nie jest już potrzebny.
11. Sprawdź sygnał GFP pod konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym ( Rysunek 1C).
    1. W dniu 3 posortuj i zbierz komórki GFP-dodatnie za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS).
    2. Przygotować bufor sortujący z 2% FBS w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C. Przygotować 1,5 ml probówek reakcyjnych z 50 μl buforu sortującego zawierającego inhibitor ROCK (1:1 000) do pobierania komórek po FACS na lodzie i 5 ml polistyrenowych probówek okrągłodennych z nakrętkami sitkowymi na lodzie.
    4. Wykonaj zawiesiny jednokomórkowe komórek nukleofektowych.
    5. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej inhibitor ROCK (1:1 000) na próbkę i odwirować przy 600 x g przez 5 minut.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu sortującego z inhibitorem ROCK (1:1,000), a następnie dodać 0,4 μl DAPI (2 ng/μL) w celu identyfikacji żywych komórek za pomocą FACS.
    7. Odpipetować roztwór komórkowy przez nasadkę sitka komórkowego schłodzonych probówek okrągłodennych, aby usunąć wszelkie resztki grudek komórek.
       UWAGA: DAPI może z czasem zagrozić żywotności komórek, dlatego najlepiej jest dodać świeżość do każdej próbki przed sortowaniem.
    8. Sortować 10 000 żywych komórek GFP-dodatnich (DAPI-ujemnych) do wcześniej przygotowanych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml z 50 μl buforu sortującego zawierającego inhibitor ROCK (na lodzie).
12. Po FACS bezpośrednio wyodrębnij genomowe DNA z posortowanych komórek.
    1. Obracać zebrane, posortowane komórki w buforze sortującym o wymiarach 600 x g przez 10 minut.
    2. Usunąć supernatant i zebrać osad komórkowy w 250 μl buforu do lizy plus 12,5 μl proteinazy K na próbkę.
    3. Postępuj zgodnie z opisem w punkcie 3.
    4. Na koniec rozpuść osad DNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz
    .
13. Wykonaj PCR, aby wygenerować matrycę do sekwencjonowania Sangera zgodnie z opisem w kroku 4.1. Jako kontrolę należy użyć DNA z warunku gLACZ i starterów ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania (te same startery, które zastosowano w sekcji 4). Wyodrębnij odpowiednie prążki z elektroforezy w żelu agarozowym, oczyść je w kolumnie i wyślij do sekwencjonowania Sangera.
14. Dopasuj wyniki sekwencjonowania Sangera przy użyciu parami, globalnego wyrównania.
    UWAGA: Udane celowanie można zidentyfikować po nałożonych sygnałach lub niekompletnych sekwencjach wynikających z losowych insercji/delecji wokół miejsca wiązania gRNA (Rysunek 1D).

6. Generowanie pokrojonych ludzkich organoidów korowych

UWAGA: Ludzkie organoidy korowe (hCO) są generowane zgodnie z metodą plasterkowanych organoidów kory nowej (SNO), jak wcześniej opisano szczegółowo^15,60.

1. Oderwać małe kolonie hiPSC od 1 dołka 6-dołkowej płytki z 1 mg/ml kolagenazy przez inkubację przez 30-40 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. W międzyczasie pokryj nową 6-dołkową płytkę macierzą błony podstawnej.
   1. Zatrzymaj enzym za pomocą 1 ml pożywki z komórek macierzystych i zbierz kolonie końcówką o szerokim otworze w 5 ml pożywki z komórkami macierzystymi w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Wszelkie czynności wspominające o "końcówkach do pipet o szerokim otworze" można również wykonywać z końcówkami przyciętymi do otworu o średnicy co najmniej 2 mm.
   2. Gdy kolonie osiądą na dnie, usuń starą pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką z komórek macierzystych.
   3. Za pomocą końcówki o szerokim otworze rozprowadź kolonie równomiernie na powlekanej płytce 6-dołkowej z 1,5 ml pożywki z komórkami macierzystymi na dołek.
   4. Hoduj hiPSC przez 2-3 dni w standardowych warunkach.
2. Gdy kolonie hiPSC osiągną średnicę około 1,5 mm, należy ponownie odłączyć wszystkie kolonie za pomocą kolagenazy w ilości 1 mg/ml w inkubacji do 1 godziny w temperaturze 37 °C.
   1. Zatrzymaj enzym za pomocą 6 ml pożywki dla przodomózgowia 1¹⁵ i zbierz oderwane kolonie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą końcówek o szerokim otworze.
   2. Gdy kolonie się osiądą, usuń starą pożywkę i przemyj 5 ml pożywki do przodomózgowia 1.
   3. Na koniec przenieś kolonie na 6-dołkową płytkę o bardzo niskim nasadce, zawierającą 3 ml pożywki z przodomózgowia po 1 na studzienkę z końcówkami o szerokim otworze i pozwól im uformować ciała zarodkowe (EB). Ten krok wskazuje dzień 0 protokołu organoidów korowych człowieka. Od tego momentu postępuj zgodnie z protokołem published¹⁵.
3. W dniu 7 osadź EB w macierzy błony podstawnej, z około 20 EB na "ciasteczko" i hoduj przez 1 tydzień w pożywce przodomózgowia 2 ¹⁵. W dniu 14 mechanicznie uwolnij organoidy z matrycy i kontynuuj hodowlę na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim natężeniu w podłożu przodomózgowia 3¹⁵ na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min.
4. Od 35 dnia 1% v/v podstawowa macierz błony jest uzupełniana do pożywki.
5. W 6 tygodniu osadź organoidy w 3% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i pokrój na wibratomie na plastry o grubości 500 μm (Rysunek 2A, B), który wspomaga dostarczanie tlenu i składników odżywczych do organoidów. W razie potrzeby należy powtarzać krojenie organoidów co 4 tygodnie.
6. Od 70 dnia hodowla organoidów w pożywce przodomózgowia 4¹⁵.

7. Elektroporacja pokrojonych ludzkich organoidów korowych

UWAGA: Ludzkie organoidy korowe mogą być wstrzykiwane i elektroporowane, gdy tylko widoczne są struktury podobne do komór, mniej więcej od 2 tygodnia. W przypadku organoidów w późniejszym stadium (tydzień 5 i starsze) elektroporacja jest najbardziej wydajna, a żywotność komórek jest najlepsza, gdy procedura jest wykonywana 2 dni po pokrojeniu organoidów^26,55. Po pokrojeniu struktury przypominające komory są łatwe do zidentyfikowania, co ułatwia procedurę wstrzykiwania (Rysunek 2C, D). Co więcej, struktury przypominające komory pozostają częściowo otwarte przez pewien czas po pokrojeniu, umożliwiając ucieczkę nadmiaru roztworu do wstrzykiwań, co chroni integralność przylegającego pasa połączeniowego wyściełającego komory. Harmonogram fragmentowania można przesunąć w celu dopasowania do osi czasu eksperymentu. Krojenie należy powtarzać co 3-4 tygodnie w przypadku kultur długotrwałych.

1. Pociągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego do wstrzykiwań za pomocą ściągacza mikrokapilarnego z następującymi ustawieniami: P 500, ciepło 600, ciągnięcie 30, prędkość 40, czas 1. Przechowuj naczynia włosowate na dużej szalce Petriego, używając taśmy do mocowania.
2. W dniu elektroporacji należy przygotować świeżo kompleks CRISPRR/Cas9 RNP zgodnie z opisem w kroku 5.4 o końcowym stężeniu 24 μM RNP. Koelektroporacja plazmidu pCAG-GFP o stężeniu 0,1 μg/μL (lub dowolnego innego reportera fluorescencyjnego) wspomaga identyfikację komórek elektroporowanych. Ponadto do końcowej mieszanki iniekcyjnej dodać 0,1% roztwór Fast Green w wodzie, co umożliwia potwierdzenie pomyślnego dostarczenia mieszanki.
   UWAGA: Wykonaj oddzielne mieszanki dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania i kontroli gLACZ.
3. Podgrzej roztwór Tyrode'a (jedno opakowanie soli Tyrode, 1 g NaHCO₃, 13 ml 1 M HEPES pH 7,25 w 1 l dH₂O) do 37 °C. Pozostałą zawartość roztworu Tyrode'a należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
4. Wybierz hCO z dobrze rozwiniętymi strukturami podobnymi do komór (Rysunek 2E) i odrzuć wszelkie organoidy, które nie wykazują struktur podobnych do komór (Rysunek 2F). Przenieść do 10 organoidów na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór Tyrode'a i utrzymać pozostałe hCOs w inkubatorze.
5. Napełnij szklaną mikrokapilę 10 μl roztworu do wstrzykiwań za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki i otwórz kapilarę, ściskając cienki koniec pęsetą. Sprawdzić, czy kapilara jest otwarta, uwalniając trochę mieszanki iniekcyjnej do roztworu Tyrode. Wykonywać iniekcje za pomocą mikrowtryskiwacza w trybie ciągłym z kontrolowanym bramkowaniem za pomocą przełącznika nożnego.
6. Włóż kapilarnę do środka struktur przypominających komory (Rysunek 2C) i wstrzyknij 0,2-0,5 μl mieszanki, naciskając przełącznik nożny.
   UWAGA: Na jeden hCO można wstrzyknąć do 5 komór, przy czym na powtórzenie przypada łącznie 7-8 hCO. Idealnie, komory skierowane na zewnątrz hCO powinny być ukierunkowane, ponieważ są one na ogół najlepiej rozwinięte (Rysunek 2G, H).
7. Użyj cienkich kleszczy, aby popchnąć organoid w dół, aby ograniczyć ruch. Właściwie nie chwytaj organoidów (Rysunek 2C).
8. Po wstrzyknięciu użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby przenieść 1-2 organoidy do komory elektroporacyjnej zawierającej roztwór Tyrode'a (Rysunek 2C, D).
9. Skierować wstrzyknięte organoidy w stronę elektrod tak, aby celować w glej promieniowy wierzchołkowy w obszarach przypominających komory skierowanych na zewnątrz organoidu.
10. Podłącz do komory elektroporacyjnej tak, aby wstrzyknięta strona organoidu była skierowana w stronę bieguna dodatniego (anody; Rysunek 2D).
11. Naciśnij przycisk Pulse na elektroporatorze, aby elektroporować pięcioma impulsami 38 V przez 50 ms każdy w odstępach 1 s.
    UWAGA: Ustawienia elektroporacji mogą zależeć od dostępnego elektroporatora i mogą wymagać optymalizacji.
12. Powtarzaj etapy wstrzykiwania i elektroporacji, aż do przetworzenia żądanej liczby organoidów.
13. Zebrać elektroporowane organoidy w pożywce w temperaturze pokojowej do momentu, aż wszystkie próbki w tym samym stanie zostaną przetworzone. Upewnij się, że nie znajdują się poza inkubatorem łącznie dłużej niż 30 minut.
14. Następnie należy umieścić elektroporowane hCOs z powrotem w odpowiedniej pożywce hodowlanej i hodować je bez wstrząsania przez pierwsze 24 godziny
    UWAGA: Po 2-3 dniach sygnał GFP powinien być widoczny w elektroporowanych hCOs pod fluorescencyjnym stereoskopem (Rysunek 2H). Punkt czasowy analizy po elektroporacji powinien być wybrany w zależności od pytania biologicznego, na które należy odpowiedzieć. Po 3-7 dniach komórki GFP-dodatnie znajdują się w klasach VZ, SVZ i CP^15,60.

8. Utrwalanie i kriosekcja elektroporowanych organoidów korowych człowieka

1. Utrwalić elektroporowane organoidy w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w probówce reakcyjnej o pojemności 2 ml.
   UWAGA: PFA jest toksyczny i rakotwórczy. Wszelkie czynności związane z PFA należy wykonywać pod wyciągiem. Zdecydowanie zaleca się stosowanie rękawic nitrylowych i okularów ochronnych.
2. Umyć raz w PBS przez 5 minut i przechowywać w sterylnie przefiltrowanej 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C, aż tkanka zostanie całkowicie nasycona sacharozą.
3. Utrwalone organoidy należy zatopić w pożywce do zatapiania zamrożonej próbki tkanki oraz 15% sacharozy w PBS w blokach na suchym lodzie.
4. Przygotuj skrawki 20-30 μm w kriostacie i zbierz tkankę na szkiełkach samoprzylepnych^26,64.
   UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany, gdy utrwalone organoidy znajdą się w sacharozie (stabilnej w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy) lub w pożywce do zatapiania (zamrożone bloki można przechowywać w hermetycznych workach w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy do lat).

9. Analiza immunohistochemiczna elektroporowanych organoidów korowych człowieka

1. Do analizy immunohistochemicznej^26,64, przeprowadzić pobieranie antygenu w buforze cytrynianowym (10 mM cytrynian sodu, 0,05% polisorbat 20 w dH₂O, pH 6,0) przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej.
2. Umyj raz w PBS przez 5 minut, następnie krótko wysusz szkiełka i zakreśl sekcje pisakiem woskowym.
3. Gasić przy użyciu 0,1 M glicyny w PBS (pH 7,4) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać ją dwukrotnie PBS przez 5 minut każde.
4. Przykryć skrawki buforem blokującym (10% surowica końska, 0,1% oktoksynol 9 w PBS) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciała w buforze blokującym i inkubować na skrawkach przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Następnego dnia przemyć trzykrotnie PBS przez 5 minut każdy, inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi i DAPI w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i ponownie przemywać trzy razy PBS przez 5 minut każdy.
7. Zamontuj szkiełka w podłożu montażowym i zobrazuj pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 3).
   UWAGA: Zaleca się włączenie przeciwciała przeciwko fluoroforowi stosowanemu w mieszance iniekcyjnej w celu identyfikacji komórek docelowych, ponieważ sygnał natywny jest często wygaszony po utrwaleniu. Przeciwciała i barwniki stosowane do barwienia immunofluorescencyjnego, przedstawione w Rysunek 3, są wymienione w Tabeli 1.

10. Weryfikacja nokautu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 na poziomie białka

1. Aby zweryfikować nokaut na poziomie białka, należy przeprowadzić immunohistochemię białka docelowego na organoidach poddanych elektroporacji (Rysunek 3I).
2. Zobrazuj zarówno grupę kontrolną gLACZ, jak i docelowe organoidy przy użyciu tych samych ustawień, aby umożliwić porównanie intensywności fluorescencji (Rysunek 3I, J). Zrób to w sposób specyficzny dla strefy, aby porównać wpływ na różne typy komórek rozwijającej się kory nowej. Policz komórki w ImageJ/Fiji (wtyczka Cell Counter) lub poprzez segmentację za pomocą wtyczki StarDist ⁶⁵.

Ablacja genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 wymaga zaprojektowania gRNA. Ogólnie rzecz biorąc, celowanie w jeden z pierwszych eksonów interesującego genu za pomocą pary gRNA oddalonych od siebie o 7-11 pz (unikanie wielokrotności 3 pz) działa dobrze (Figura 1A). W pierwszej kolejności można sprawdzić skuteczność rozpoznawania matryc przez gRNA in vitro przy użyciu szablonu PCR26,40,62. Skuteczne celowanie i cięcie za pośrednictwem Cas9 są widoczne w redukcji matrycowego DNA i pojawieniu się rozszczepionych produktów DNA na żelu agarozowym (Ryc. 1B). Dalsze badania gRNA można przeprowadzić w linii iPSC, która jest używana do generowania organoidów korowych. Wymaga to nukleofekcji iPSC, które można zwizualizować za pomocą udanej ekspresji reporterowej fluorescencji (Rysunek 1C). Skuteczne celowanie w interesujące nas miejsce można zweryfikować za pomocą sekwencjonowania Sangera, w wyniku czego powstaje chromatogram, który nagle kończy się lub nakłada się na miejsce docelowe (Rysunek 1D), wynikający ze spektrum indeli z naprawy pęknięć dwuniciowych przez niehomologiczne łączenie końców66. Przewodnikowe testy wydajności RNA in vitro i w komórkach iPSC pomagają w doborze wydajnych par gRNA do ablacji genów w organoidach korowych.

Przed elektroporacją, organoidy korowe są krojone, co pomaga zidentyfikować światło komory do wstrzyknięcia mieszanki elektroporacyjnej (Rysunek 2A-C). Wstrzyknięte organoidy są następnie przenoszone do komory elektroporacyjnej (Rysunek 2D). Do elektroporacji należy użyć organoidów korowych z dobrze rozwiniętymi strukturami przypominającymi komory (Ryc. 2E), podczas gdy organoidy korowe pozbawione widocznych struktur należy odrzucić (Ryc. 2F). Mieszanka do elektroporacji zawiera barwnik, który umożliwia wizualizację wstrzykiwanych komór podczas zabiegu (Rysunek 2G). Po 1-3 dniach w hodowli, pomyślnie ukierunkowane komory są widoczne za pomocą natywnego sygnału GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 2H).

Dla dogłębnej analizy histologicznej można przeprowadzić immunohistochemię kriosekcji. Idealnie, wiele docelowych komór jest obecnych w elektroporowanym organoidzie korowym (Rysunek 3A, B). Najbardziej optymalne elektroporacje są ukierunkowane na struktury przypominające komory w zewnętrznym obszarze organoidu skierowanym na zewnątrz (Rysunek 3C), ponieważ są to zazwyczaj najbardziej rozbudowane komory. W niektórych przypadkach elektroporacja może prowadzić do nadmiernej śmierci komórki (Rysunek 3D, E), na przykład, gdy stężenia plazmidu są zbyt wysokie lub ustawienia elektroporacji są nieoptymalne. Elektroporacje skierowane do wnętrza organoidu (Ryc. 3F) często obejmują mniej rozszerzone obszary struktur przypominających komory w porównaniu z zewnętrzem. Z naszego doświadczenia wynika, że pomocne jest skoncentrowanie analizy ilościowej na zdefiniowanych regionach organoidu w celu zmniejszenia zmienności. Czasami elektroporacja może spowodować przerwanie powierzchni wierzchołkowej (Rysunek 3G), na przykład, gdy objętość wstrzyknięcia jest zbyt duża, powodując pęknięcie komór lub gdy impulsy elektryczne są zbyt silne, co prowadzi do rozwarstwienia komórek. Wreszcie, gdy celem są dwie sąsiednie komory (Rysunek 3H), przypisanie granic stref korowych i pochodzenia docelowych komórek może być trudne.

Immunohistochemia może być użyta do sprawdzenia udanego nokautu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 na poziomie białka w komórkach będących przedmiotem zainteresowania (Rysunek 3I), czego przykładem jest tutaj celowanie w białko Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) PCGF467. Natężenie sygnału może być analizowane w komórkach GFP-dodatnich w warunkach kontrolnych i eksperymentalnych (Rysunek 3J). Alternatywnie, jeśli nie jest dostępne odpowiednie przeciwciało, docelowe komórki można wyizolować za pomocą FACS z organoidów korowych60 i dalej analizować za pomocą Sanger lub Next Generation Sequencing36. Co więcej, obniżenie poziomu białka może być również analizowane za pomocą Western blot.

Rysunek 1: Przewodnik projektowania i walidacji RNA dla ostrego nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9. (A) Schematyczna ilustracja strategii projektowania przewodnika RNA (gRNA), z dwoma gRNA ukierunkowanymi na ekson interesującego genu. Czarne strzałki wskazują startery PCR do przygotowania matrycy używane do walidacji gRNA. (B) Walidacja skuteczności gRNA in vitro. Matryce amplifikowane PCR trawiono kompleksami RNP. Po udanym rozszczepieniu po elektroforezie żelowej widoczne są dwa pasma o różnych rozmiarach (po lewej), podczas gdy matryca pozostaje nieprzecięta dla gRNA o niskiej wydajności (po prawej). (C) Obraz w jasnym polu (po lewej), fluorescencja GFP (w środku) i połączone obrazy (po prawej) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) 3 dni po nukleofekcji kompleksem RNP i plazmidem GFP. Paski skali: 350 μm. (D) Walidacja wydajności gRNA w hiPSC za pomocą sekwencjonowania Sangera amplifikowanego DNA z komórek GFP-dodatnich. Po udanym rozszczepieniu dwuniciowego DNA, ścieżki sekwencjonowania pokazują nałożone sygnały, zaczynając od miejsca docelowego gRNA (u góry, KO1). W przypadku nieudanego celowania, ślad sekwencji DNA pozostaje niezmieniony (dno, KO2) w porównaniu z kontrolą LACZ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Elektroporacja pokrojonych w plasterki ludzkich organoidów korowych. (A) Schematyczna ilustracja przedstawiająca przebieg procesu elektroporacji ludzkich organoidów korowych (hCOs). Najpierw hCO są krojone na plastry o grubości 500 μm. Dwa dni później mieszanina RNP zawierająca plazmid ekspresji GFP i Fast Green jest wstrzykiwana do lumenów struktur podobnych do komór, preferencyjnie w zewnętrznym regionie hCOs. W celu elektroporacji hCO umieszcza się w komorze elektroporacji. Po kilku dniach hodowli można wykryć sygnał GFP w obszarach poddanych elektroporacji. (B) Obrazy przekroju wibratomu hCO. Organoidy są osadzone w 3% niskotopliwej agarozie w pożywce w bloku (po lewej). Blok jest podzielony na plastry o grubości 500 μm (środek). Pokrojone organoidy przenosi się z powrotem do naczynia hodowlanego za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze (po prawej). (C) Obrazy przedstawiające wstrzyknięcie mieszaniny zawierającej RNP, pCAG-GFP i 0,1% Fast Green do komorowych struktur organoidów. Organoidy zanurza się w roztworze Tyrode'a, a cienka szklana kapilara jest wprowadzana do światła środka struktur przypominających komory (po lewej). Kleszcze służą do stabilizacji organoidów (lewego i środkowego). Komory na zewnątrz organoidów są ukierunkowane (środek). Wstrzyknięte organoidy są przenoszone do komory elektroporacyjnej, a później do naczynia hodowlanego, za pomocą końcówek pipet o szerokim otworze (po prawej). (D) Obrazy komory elektroporacyjnej, która składa się ze szklanej płytki Petriego oraz dwóch metalowych ostrzy przyklejonych do szkła. Metalowe ostrza służą jako elektrody i zawierają otwory do mocowania do podłączenia do elektroporatora. Wstrzyknięta strona hCO, widoczna przez zielony cień, powinna być skierowana w stronę anody (biegun dodatni, czerwony) (po prawej). (E) Reprezentatywne obrazy hCO ukazujące dobrze rozwinięte struktury przypominające komory. Jaśniejszy pierścień reprezentuje obszar przypominający strefę komorową. Ciemniejsze kółko w środku struktury przypominającej komorę reprezentuje światło i powinno być przeznaczone do wstrzyknięcia. (F) Reprezentatywne obrazy hCO pozbawionych dobrze rozwiniętych struktur przypominających komory, których zalecamy nie dołączać do dalszych eksperymentów. (G) Reprezentatywne obrazy hCO po wstrzyknięciu mieszaniny elektroporacyjnej, na których docelowe obszary są widoczne za pomocą szybkiej zieleni (pomarańczowe strzałki). (H) Reprezentatywny obraz hCO pokazujący natywny sygnał GFP 24 godziny po elektroporacji. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza immunohistochemiczna elektroporowanych pokrojonych organoidów korowych człowieka. (A) Schemat przedstawiający elektroporowany ludzki organoid korowy (hCO) z zielonym sygnałem fluorescencyjnym. (B) Barwienie DAPI (szare) i immunofluorescencja dla GFP (zielone) kriosekcji hCO z wieloma elektroporowanymi komorami, 7 dni po elektroporacji. (C-H) Przykładowe obrazy różnych wyników elektroporacji, barwione dla GFP (zielony) i jąder (DAPI, szary). (C) Optymalna elektroporacja z nienaruszonymi jądrami (patrz wstawka 1, D), niezakłóconą strukturą przypominającą komorę i elektroporowanymi komórkami w obszarze skierowanym na zewnątrz organoidu, który jest zwykle najbardziej rozszerzony. (E) Przykład hCO wykazującego masywną śmierć komórki w obszarze elektroporowanym (patrz również wstawka 2, D), charakteryzujący się małymi, gęstymi i zniekształconymi jądrami o dużej gęstości DAPI. (F) Udana elektroporacja skierowana do wnętrza organoidu, która często jest trudniejsza do zinterpretowania ze względu na obszary przypominające płytki korowe łączące się z sąsiednimi komorami. (G) Uszkodzone struktury podobne do komór w centrum obszaru elektroporowanego (pomarańczowa strzałka). (H) Przykład hCO zawierającego wiele mniejszych komór, które są częściowo połączone, a zatem trudne do określenia ilościowego. (I) Barwienie DAPI (szary) i immunofluorescencja dla GFP (zielony) i PCGF4 (magenta) 7 dni po elektroporacji kompleksu RNP ukierunkowanego na LACZ (gLACZ KO, po lewej) lub PCGF4 (gPCGF4 KO, po prawej) w celu wyeliminowania za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Zakreślone komórki podkreślają zmniejszoną intensywność PCGF4, co wskazuje na udaną ablację genu. Jednolity sygnał można zobaczyć w sterowniku LACZ (po lewej). (J) Wykres przedstawia ilościowo określoną intensywność PCGF4 po immunofluorescencji w komórkach GFP-dodatnich dla kontroli (gLACZ KO) i KO PCGF4 (gPCGF4 KO) w stosunku do mediany ekspresji PCGF4 w stanie gLACZ. Każda kropka reprezentuje komórkę. Dane z 3-4 organoidów z dwóch różnych partii (szarej i czarnej) tej samej linii hiPSC. p < 0,0001, test Manna-Whitneya. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego (B, C) lub fluorescencyjnego (E-I). Obrazy reprezentują projekcje o maksymalnej intensywności stosów z o grubości 10-15 μm. Białe przerywane linie wskazują powierzchnię wierzchołkową skierowaną w stronę światła komory i zewnętrzne powierzchnie hCOs. Pomarańczowe przerywane linie wskazują granicę VZ/SVZ w połączonych komorach. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista przeciwciał i barwników oraz ich rozcieńczenie używane do barwienia immunofluorescencyjnego.

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.