Artykuł metodologiczny

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Streszczenie

Organoidy korowe człowieka stały się ważnymi narzędziami do badania rozwoju ludzkiego mózgu, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji ludzkiego mózgu. Badania analizujące funkcję genów poprzez nadekspresję lub nokaut odegrały zasadniczą rolę w modelach zwierzęcych, dostarczając mechanistycznego wglądu w regulację rozwoju kory nowej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ostrego nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 poprzez elektroporację pokrojonych ludzkich organoidów korowych. Krojenie organoidów korowych pomaga w identyfikacji struktur przypominających komory do wstrzyknięcia, a następnie elektroporacji, co czyni go szczególnie dobrze dopasowanym modelem do ostrych manipulacji genetycznych podczas rozwoju kory mózgowej człowieka. Opisujemy projektowanie przewodników RNA i walidację skuteczności celowania in vitro i w organoidach korowych. Elektroporacja organoidów korowych jest wykonywana w środkowych stadiach neurogennych, co umożliwia celowanie w większość głównych klas komórek w rozwijającej się korze nowej, w tym glej promieniowy wierzchołkowy, podstawowe komórki progenitorowe i neurony. Podsumowując, elektroporacja pokrojonych w plastry ludzkich organoidów korowych stanowi potężną technikę badania funkcji genów, regulacji genów i morfologii komórek podczas rozwoju kory mózgowej.

Wprowadzenie

Kora nowa odnosi się do zewnętrznej powłoki półkul mózgowych i jest strukturą unikalną dla ssaków. Kora nowa reprezentuje siedlisko wyższych funkcji poznawczych1,2,3,4,5. Podczas rozwoju nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe dają początek neuronom w procesie zwanym neurogenezą. Badania funkcjonalne badające rozwój ludzkiej kory nowej stanowią podstawę do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw regulacji ludzkich nerwowych komórek macierzystych, patologii neuronalnych i ewolucji ludzkiego mózgu2,6,7.

Historycznie rzecz biorąc, badania nad rozwojem ludzkiego mózgu opierały się na opisowych metodach histologicznych z wykorzystaniem tkanek pośmiertnych, z nowszymi systemami hodowli tkanek swobodnie pływających, umożliwiającymi badania funkcjonalne na tkance ludzkiego płodu8,9. Ponadto wykazano, że tkanka mózgowa ludzkiego płodu ma zdolność do samoorganizacji w długoterminowo rozwijające się organoidy10. Badania nad tkankami płodowymi dostarczyły ważnych informacji na temat rozwoju człowieka11,12, jednak ograniczona dostępność tkanek i względy etyczne ograniczają ich szerokie zastosowanie w mechanistycznych badaniach rozwoju ludzkiego mózgu. W ciągu ostatniej dekady opracowano protokoły, które pozwalają na generowanie trójwymiarowych organoidów nerwowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), w tym ludzkiego indukowanego PSC (hiPSC)13,14.

Organoidy mózgowe wykazują ważne cechy rozwijającego się mózgu, takie jak tworzenie struktur podobnych do komór, polaryzacja apikopodstawna, cytoarchitektura kory mózgowej, międzykinetyczna migracja jądrowa podczas radialnego podziału gleju i migracja neuronów. Co ważne, te nowe modele ludzkich organoidów podsumowują cechy ludzkiego rozwijającego się mózgu, które nie są dobrze modelowane u myszy, w tym ewolucyjnie istotne kluczowe typy progenitorów nerwowych, w szczególności podstawowy glej promieniowy (lub zewnętrzny glej promieniowy)7,14,15. Kilka ograniczeń wczesnych protokołów organoidów mózgowych - takich jak problemy z heterogenicznością organoidów, ograniczone dostarczanie składników odżywczych do wewnętrznego rdzenia i zróżnicowana tożsamość regionalna - zostało rozwiązanych w ostatnich postępach w protokole i można spodziewać się dalszych ulepszeń w nadchodzących latach15,16,17,18,19. Organoidy mózgowe i korowe człowieka szybko stały się kluczowymi modelami do badania rozwoju kory mózgowej człowieka20, zaburzenia neurologiczne21,22,23,24 i ewolucja mózgu25,26,27,28,29, oraz do przeprowadzania badań przesiewowych na dużą skalę30,31,32.

Dla ostrej manipulacji genetycznej, dwie metody były głównie stosowane w zwierzęcych modelach rozwoju kory nowej: dostarczanie wirusa przez infekcję komórek docelowych33 oraz elektroporacja in utero lub in vitro34,35. Wstrzyknięcie DNA - a ostatnio kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP) CRISPR/Cas9 36- do komór bocznych, a następnie elektroporacja, ma tę zaletę, że określone obszary mózgu mogą być celowane w oparciu o orientację elektrod elektroporacyjnych. Elektroporacja polega na krótkich impulsach elektrycznych, które tymczasowo zwiększają przepuszczalność błony komórkowej, umożliwiając wprowadzenie DNA i innych naładowanych cząsteczek do komórek. Elektroporacja in utero została po raz pierwszy przeprowadzona w mouse37, gdzie szybko stała się szeroko stosowaną metodologią w neurobiologii rozwojowej. Metoda ta została następnie zastosowana również do innych gatunków, takich jak rat38,39 i frret40,41,42, gatunek gyrencefaliczny używany do badania ekspansji kory nowej i fałdowania kory mózgowej3,43,44,45.

Elektroporacja stała się również ważną metodą w badaniach organoidów ludzkiego mózgu46. W organoidach mózgowych elektroporacja została zastosowana do wizualizacji morfologii komórek i aksonów neuronalnych14,47, do dostarczania odczynników do knockdownu genów22,48,49, oraz do badania funkcji genów przez nadekspresję50. Metoda ta nie ogranicza się do modeli ludzkich, ale została również zastosowana do modyfikacji genetycznej organoidów mózgowych naczelnych50,51. Ponadto opisano elektroporację organoidów korowych generowanych w bioreaktorze wirującym Spin Ω spinowym52.

W tym protokole opisujemy elektroporację pokrojonych ludzkich organoidów korowych15 do badań funkcji genów w rozwoju kory mózgowej. Organoidy specyficzne dla regionu mózgu zwiększają odtwarzalność i spójność, co ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analizy ilościowej, na przykład w modelowaniu chorób. W protokole organoidów kory ludzkiej z warstwami na plasterki15, podczas różnicowania iPSC stosuje się silne wskazówki dotyczące wzorców w celu uzyskania jednorodnej populacji przodków grzbietowej części przodomózgowia, po czym stosuje się pożywki hodowlane, które promują wzrost tkanek z mniejszą liczbą sygnałów instruktażowych53,54. Wykazano, że krojenie organoidów korowych zmniejsza śmierć komórek wynikającą ze zmniejszonej dostępności składników odżywczych i tlenu w rdzeniu organoidu15. Co więcej, krojenie wspomaga rozwój struktur przypominających komory zawierające obfity podstawowy glej promieniowy, z utrzymującą się neurogenezą prowadzącą do powstania rozszerzonego obszaru przypominającego płytkę korową15. Wielokrotne krojenie w tym protokole sprawia również, że te organoidy korowe są szczególnie odpowiednie do elektroporacji, ponieważ światła komór można łatwo zidentyfikować i nacelować przez wstrzyknięcie. Elektroporacja pokrojonych organoidów korowych została zastosowana do badania regionów regulatorowych genów i ewolucji kory mózgowej26,55.

Podczas procedury elektroporacji, mieszanka iniekcyjna jest dostarczana do światła struktur podobnych do komór. Po zastosowaniu pulsacyjnego pola elektrycznego mieszanina jest pobierana przez glej promieniowy wierzchołkowy, który wyściela komorę. Gdy wierzchołkowy promienisty glej dzieli się i daje początek bardziej zaangażowanym typom komórek4, czynniki elektroporowane są przekazywane do podstawowych komórek progenitorowych i neuronów. Elektroporowane potomstwo jest rozprowadzane w strefie komorowej (VZ) i strefie podkomorowej (SVZ) po 3 dniach i obejmuje większość ściany kory mózgowej, w tym obszar podobny do płytki korowej (CP), 7 dni po elektroporacji w środkowych stadiach neurogennych26,55.

Tutaj opisujemy zakłócenia genów za pośrednictwem CRISPR/Cas956 poprzez elektroporację w pokrojonych ludzkich organoidach korowych26. Ponadto metoda elektroporacji może być również stosowana do nadekspresji genów, wizualizacji morfologii komórek i procesów komórkowych poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, dostarczania bibliotek plazmidów do masowych równoległych testów reporterowych (MPRA), dostarczania narzędzi do edycji epigenomu i znakowania komórek do obrazowania na żywo.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i zatwierdzone przez Komitet Oceny Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Dreźnie (IRB00001473; IORG0001076; numer aprobaty etycznej SR-EK-456092021).

1. Projektowanie przewodników RNA do ostrego nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9

  1. Zaprojektuj parę przewodnikowych RNA (gRNA) celujących w ten sam ekson w odległości idealnie 7-11 pz (unikając wielokrotności 3 pz) między sąsiednimi motywami protospacer (PAM), aby zwiększyć prawdopodobieństwo rozerwania białka za pomocą oprogramowania lub narzędzi online.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby celem były eksony, które kodują domeny funkcjonalne. Alternatywnie można wybrać pierwsze eksony transkryptu (Rysunek 1A). Wybierz RNA przewodnika na podstawie wyniku aktywności (blisko 1)57 i wyniku swoistości (blisko 100 %)58.

2. Hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Aby wygenerować organoidy ludzkiej kory mózgowej i zwalidować funkcję gRNA, użyj linii hiPSC CRTDi004-A59, która pochodzi od zdrowego dawcy.
  2. Hodowla iPSC zgodnie z wcześniejszym opisem60 na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzyą błony podstawowej w pożywce z komórek macierzystych w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ). Indukowane PSC powinny być pasażowane przy 80% zbieganiu przy użyciu enzymu do dysocjacji pojedynczych komórek z suplementacją inhibitora szlaku ROCK (1:1,000) w ciągu pierwszych 24 godzin
    UWAGA: Inne linie iPSC mogą być używane do generowania organoidów i walidacji gRNA.

3. Ekstrakcja genomowego DNA z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

  1. Użyj 2 dołków z 80%-90% zlewającym się hiPSC z 6-dołkowej płytki do ekstrakcji genomowego DNA. Oddziel komórki od płytki za pomocą enzymu, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Zebrać komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi (objętość całkowita), następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 600 x g i usunąć supernatant.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 250 μl buforu do lizy (50 mM TrisHCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 % SDS, 5 mM EDTA w H2O) i 12,5 μl proteinazy K (10 mg/ml zapasu). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C i 250 obr./min.
  3. Wymieszać w 100 μl 5 mM NaCl. Wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 250 μl izopropanolu, kilkakrotnie odwrócić probówki i wirować przez 15 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant, przemyć 500 μl 70 % EtOH (klasa biologii molekularnej), odwrócić probówki i wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Na koniec całkowicie usunąć sklarowany osad, ostrożnie go pipetując i dociskając otwarte probówki reakcyjne do ręczników papierowych.
  7. Pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie rozpuścić go w 100 μl wody wolnej od nukleaz przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrometru. Wyizolowany genomowy DNA jest stabilny w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

4. Weryfikacja rozpoznawania matrycy przez gRNA (in vitro)

UWAGA: Jako pierwsze podejście do walidacji udanego rozpoznania matrycy przez gRNA, wykonaj reakcję Cas9 in vitro, w której dwuniciowe DNA jest rozszczepiane na dwa fragmenty, które można rozróżnić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym40,61,62.

  1. Aby wygenerować matrycę, należy przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z mieszanką wzorcową PCR o wysokiej wierności i starterami 10 μM na genomowym DNA wyizolowanym z hiPSC (sekcja 3) przy użyciu następujących warunków cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, 40 cykli [98 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.
    1. Dostosuj temperaturę wyżarzania zgodnie ze starterami PCR. Upewnij się, że amplikon ma rozmiar od 800 pz do 1,5 kb z asymetryczną lokalizacją miejsc wiązania gRNA.
    2. Rozpuść produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej na 1,5% żelu agarozowym, odetnij odpowiedni prążek z żelu i wyekstrahuj DNA26.
    3. Zmierzyć stężenie DNA w wyekstrahowanym produkcie PCR za pomocą spektrometru.
  2. Złóż funkcjonalne gRNA, łącząc 10 μM CRISPR RNA (crRNA, sekwencja niestandardowa, zapas 100 μM) i 10 μM tracrRNA (zapas 100 μM) w beznukleazowym buforze dupleksowym (całkowita objętość 5 μL). Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT).
  3. Utwórz kompleks rybonukleoproteinowy (RNP), łącząc 10 μM gRNA z kroku 4.2 i 1 μM enzymu Cas9 (ze Streptococcus pyogenes, 62 μM) w PBS przez 15 minut w RT (25 μL objętości całkowitej).
  4. Aby przeprowadzić reakcję trawienia in vitro, zmieszać 1 μM kompleksu RNP (z kroku 4.3) z 0,1 μM matrycą DNA (produkt PCR z kroku 4.1) i 1x buforem reakcyjnym nukleazy Cas9 (zawierającym 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6,5; może być przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C).
    1. Napełnij do końcowej objętości 10 μl wodą wolną od nukleaz.
    2. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Dodać 2 mg/ml proteinazy K i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 56 °C w celu uwolnienia substratu DNA z enzymu Cas9. Przetrawioną mieszaninę reakcyjną przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do czasu końcowej analizy.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie stosunku molowego substratu Cas9-RNP:DNA 10:1 w celu uzyskania najlepszej wydajności łupania. W razie potrzeby rozcieńczyć produkt PCR w wodzie wolnej od nukleaz do wymaganego stężenia. Jako kontrolę ujemną można zabrać ze sobą mieszaninę reakcyjną pozbawioną enzymu gRNA lub Cas9.
  5. Wizualizacja rozszczepionych produktów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym na 2% żelu agarozowym.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby widoczne były dwie prążki o różnych rozmiarach, a prążek matrycy zniknął lub został silnie zmniejszony w celu uzyskania wydajnych gRNA (Rysunek 1B).

5. Weryfikacja funkcji gRNA w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych

UWAGA: Zaleca się przetestowanie skuteczności gRNA celujących w tę samą linię komórkową, z której będą generowane organoidy korowe26. W tym celu kompleksy RNP zawierające odpowiednie gRNA są kotransfekowane plazmidem ekspresyjnym GFP do hiPSC, komórki są hodowane przez 3 dni, a następnie izolowane jest genomowe DNA w celu analizy sekwencjonowania. Do każdego testu gRNA potrzeba około 200 000 komórek. Komórki nie powinny zlewać się w więcej niż 70%-80% i powinny być pasażowane co najmniej dwa razy po rozmrożeniu. Ważne jest, aby wziąć ze sobą kontrolę ujemną (gLACZ)36,63 i stan próbny (roztwór nukleofekcji bez RNP).

  1. Zmień pożywkę hiPSC tak, aby zawierała inhibitor ROCK (1:1,000) na 2 godziny przed eksperymentem, aby zwiększyć żywotność komórek w kapturze do hodowli komórkowej.
  2. Pokryj odpowiednią liczbę dołków płytki 6-dołkowej podstawową matrycą membranową.
  3. Uruchom jednostkę nukleofektora ("jednostka X" dla pasków 16-dołkowych) i wybierz program "Komórki ES, H9" zgodnie z zaprogramowanym programem (impuls CB150). Wybierz odpowiednią liczbę dołków paska.
  4. Przygotuj kompleksy RNP, łącząc 24 μM crRNA i 24 μM tracrRNA w buforze dupleksowym.
    1. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie ostudzić do temperatury pokojowej, jak opisano w kroku 4.2.
    2. W międzyczasie rozcieńczyć enzym Cas9 do 8 μM w PBS.
    3. Połączyć 3 μl gRNA i 3 μl Cas9 i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, aby złożyć RNP.
      UWAGA: Stosunek molowy 3:1 gRNA:Cas9 zapewnia optymalną wydajność rozszczepienia. Aby przetestować gRNA jako parę, przygotuj każdy RNP osobno i połącz 1,5 μl każdego RNP na końcu.
  5. Podczas 15-minutowej inkubacji RNP należy przygotować hiPSC do nukleofekcji pod kapturem hodowli komórkowej.
    1. Zastąp powłokę błony podstawnej 1,5 ml pożywki z komórek macierzystych uzupełnionej inhibitorem ROCK (1:1,000) i 1x penicyliną/streptomycyną na studzienkę.
    2. Przygotować roztwór nukleofekcji jako mieszankę wzorcową na lodzie zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Odłączyć hiPSC od płytki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (jak opisano w sekcji 2) i policzyć komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym w komorze liczącej Neubauera.
    4. Osadzaj 200 000 żywych komórek na parę gRNA przy 600 x g przez 5 minut.
  6. W kapturze do hodowli komórkowej, na lodzie, dodać 3 μl RNP do 20 μl roztworu nukleofekcji plus 0,2 μg/μL plazmidu pCAG-GFP.
  7. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 23 μl końcowej mieszanki nukleofekcji i przenieść je do 1 dołka 16-dołkowego paska nukleofekcji na lodzie.
  8. Gdy wszystkie warunki znajdą się w pasku, umieść go w jednostce nukleofektorowej X na zewnątrz okapu i naciśnij przycisk Start, aby zainicjować nukleofekcję.
  9. Następnie przetransportuj pasek nukleofekcji z powrotem pod kaptur hodowli komórkowej i przenieś komórki nukleofektyczne na przygotowaną płytkę 6-dołkową, wypłukując studzienki paskowe jakimś podłożem z płytki.
  10. Hoduj hiPSC przez 3 dni, zmieniając pożywkę zawierającą 1x penicylina/streptomycyna dziennie. Po 24 godzinach inhibitor ROCK nie jest już potrzebny.
  11. Sprawdź sygnał GFP pod konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym ( Rysunek 1C).
    1. W dniu 3 posortuj i zbierz komórki GFP-dodatnie za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych (FACS).
    2. Przygotować bufor sortujący z 2% FBS w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C. Przygotować 1,5 ml probówek reakcyjnych z 50 μl buforu sortującego zawierającego inhibitor ROCK (1:1 000) do pobierania komórek po FACS na lodzie i 5 ml polistyrenowych probówek okrągłodennych z nakrętkami sitkowymi na lodzie.
    4. Wykonaj zawiesiny jednokomórkowe komórek nukleofektowych.
    5. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi zawierającej inhibitor ROCK (1:1 000) na próbkę i odwirować przy 600 x g przez 5 minut.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu sortującego z inhibitorem ROCK (1:1,000), a następnie dodać 0,4 μl DAPI (2 ng/μL) w celu identyfikacji żywych komórek za pomocą FACS.
    7. Odpipetować roztwór komórkowy przez nasadkę sitka komórkowego schłodzonych probówek okrągłodennych, aby usunąć wszelkie resztki grudek komórek.
      UWAGA: DAPI może z czasem zagrozić żywotności komórek, dlatego najlepiej jest dodać świeżość do każdej próbki przed sortowaniem.
    8. Sortować 10 000 żywych komórek GFP-dodatnich (DAPI-ujemnych) do wcześniej przygotowanych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml z 50 μl buforu sortującego zawierającego inhibitor ROCK (na lodzie).
  12. Po FACS bezpośrednio wyodrębnij genomowe DNA z posortowanych komórek.
    1. Obracać zebrane, posortowane komórki w buforze sortującym o wymiarach 600 x g przez 10 minut.
    2. Usunąć supernatant i zebrać osad komórkowy w 250 μl buforu do lizy plus 12,5 μl proteinazy K na próbkę.
    3. Postępuj zgodnie z opisem w punkcie 3.
    4. Na koniec rozpuść osad DNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz
      5. .
  13. Wykonaj PCR, aby wygenerować matrycę do sekwencjonowania Sangera zgodnie z opisem w kroku 4.1. Jako kontrolę należy użyć DNA z warunku gLACZ i starterów ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania (te same startery, które zastosowano w sekcji 4). Wyodrębnij odpowiednie prążki z elektroforezy w żelu agarozowym, oczyść je w kolumnie i wyślij do sekwencjonowania Sangera.
  14. Dopasuj wyniki sekwencjonowania Sangera przy użyciu parami, globalnego wyrównania.
    UWAGA: Udane celowanie można zidentyfikować po nałożonych sygnałach lub niekompletnych sekwencjach wynikających z losowych insercji/delecji wokół miejsca wiązania gRNA (Rysunek 1D).

6. Generowanie pokrojonych ludzkich organoidów korowych

UWAGA: Ludzkie organoidy korowe (hCO) są generowane zgodnie z metodą plasterkowanych organoidów kory nowej (SNO), jak wcześniej opisano szczegółowo15,60.

  1. Oderwać małe kolonie hiPSC od 1 dołka 6-dołkowej płytki z 1 mg/ml kolagenazy przez inkubację przez 30-40 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. W międzyczasie pokryj nową 6-dołkową płytkę macierzą błony podstawnej.
    1. Zatrzymaj enzym za pomocą 1 ml pożywki z komórek macierzystych i zbierz kolonie końcówką o szerokim otworze w 5 ml pożywki z komórkami macierzystymi w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Wszelkie czynności wspominające o "końcówkach do pipet o szerokim otworze" można również wykonywać z końcówkami przyciętymi do otworu o średnicy co najmniej 2 mm.
    2. Gdy kolonie osiądą na dnie, usuń starą pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką z komórek macierzystych.
    3. Za pomocą końcówki o szerokim otworze rozprowadź kolonie równomiernie na powlekanej płytce 6-dołkowej z 1,5 ml pożywki z komórkami macierzystymi na dołek.
    4. Hoduj hiPSC przez 2-3 dni w standardowych warunkach.
  2. Gdy kolonie hiPSC osiągną średnicę około 1,5 mm, należy ponownie odłączyć wszystkie kolonie za pomocą kolagenazy w ilości 1 mg/ml w inkubacji do 1 godziny w temperaturze 37 °C.
    1. Zatrzymaj enzym za pomocą 6 ml pożywki dla przodomózgowia 115 i zbierz oderwane kolonie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą końcówek o szerokim otworze.
    2. Gdy kolonie się osiądą, usuń starą pożywkę i przemyj 5 ml pożywki do przodomózgowia 1.
    3. Na koniec przenieś kolonie na 6-dołkową płytkę o bardzo niskim nasadce, zawierającą 3 ml pożywki z przodomózgowia po 1 na studzienkę z końcówkami o szerokim otworze i pozwól im uformować ciała zarodkowe (EB). Ten krok wskazuje dzień 0 protokołu organoidów korowych człowieka. Od tego momentu postępuj zgodnie z protokołem published15.
  3. W dniu 7 osadź EB w macierzy błony podstawnej, z około 20 EB na "ciasteczko" i hoduj przez 1 tydzień w pożywce przodomózgowia 2 15. W dniu 14 mechanicznie uwolnij organoidy z matrycy i kontynuuj hodowlę na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim natężeniu w podłożu przodomózgowia 315 na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 120 obr./min.
  4. Od 35 dnia 1% v/v podstawowa macierz błony jest uzupełniana do pożywki.
  5. W 6 tygodniu osadź organoidy w 3% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i pokrój na wibratomie na plastry o grubości 500 μm (Rysunek 2A, B), który wspomaga dostarczanie tlenu i składników odżywczych do organoidów. W razie potrzeby należy powtarzać krojenie organoidów co 4 tygodnie.
  6. Od 70 dnia hodowla organoidów w pożywce przodomózgowia 415.

7. Elektroporacja pokrojonych ludzkich organoidów korowych

UWAGA: Ludzkie organoidy korowe mogą być wstrzykiwane i elektroporowane, gdy tylko widoczne są struktury podobne do komór, mniej więcej od 2 tygodnia. W przypadku organoidów w późniejszym stadium (tydzień 5 i starsze) elektroporacja jest najbardziej wydajna, a żywotność komórek jest najlepsza, gdy procedura jest wykonywana 2 dni po pokrojeniu organoidów26,55. Po pokrojeniu struktury przypominające komory są łatwe do zidentyfikowania, co ułatwia procedurę wstrzykiwania (Rysunek 2C, D). Co więcej, struktury przypominające komory pozostają częściowo otwarte przez pewien czas po pokrojeniu, umożliwiając ucieczkę nadmiaru roztworu do wstrzykiwań, co chroni integralność przylegającego pasa połączeniowego wyściełającego komory. Harmonogram fragmentowania można przesunąć w celu dopasowania do osi czasu eksperymentu. Krojenie należy powtarzać co 3-4 tygodnie w przypadku kultur długotrwałych.

  1. Pociągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego do wstrzykiwań za pomocą ściągacza mikrokapilarnego z następującymi ustawieniami: P 500, ciepło 600, ciągnięcie 30, prędkość 40, czas 1. Przechowuj naczynia włosowate na dużej szalce Petriego, używając taśmy do mocowania.
  2. W dniu elektroporacji należy przygotować świeżo kompleks CRISPRR/Cas9 RNP zgodnie z opisem w kroku 5.4 o końcowym stężeniu 24 μM RNP. Koelektroporacja plazmidu pCAG-GFP o stężeniu 0,1 μg/μL (lub dowolnego innego reportera fluorescencyjnego) wspomaga identyfikację komórek elektroporowanych. Ponadto do końcowej mieszanki iniekcyjnej dodać 0,1% roztwór Fast Green w wodzie, co umożliwia potwierdzenie pomyślnego dostarczenia mieszanki.
    UWAGA: Wykonaj oddzielne mieszanki dla każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania i kontroli gLACZ.
  3. Podgrzej roztwór Tyrode'a (jedno opakowanie soli Tyrode, 1 g NaHCO3, 13 ml 1 M HEPES pH 7,25 w 1 l dH2O) do 37 °C. Pozostałą zawartość roztworu Tyrode'a należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  4. Wybierz hCO z dobrze rozwiniętymi strukturami podobnymi do komór (Rysunek 2E) i odrzuć wszelkie organoidy, które nie wykazują struktur podobnych do komór (Rysunek 2F). Przenieść do 10 organoidów na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór Tyrode'a i utrzymać pozostałe hCOs w inkubatorze.
  5. Napełnij szklaną mikrokapilę 10 μl roztworu do wstrzykiwań za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki i otwórz kapilarę, ściskając cienki koniec pęsetą. Sprawdzić, czy kapilara jest otwarta, uwalniając trochę mieszanki iniekcyjnej do roztworu Tyrode. Wykonywać iniekcje za pomocą mikrowtryskiwacza w trybie ciągłym z kontrolowanym bramkowaniem za pomocą przełącznika nożnego.
  6. Włóż kapilarnę do środka struktur przypominających komory (Rysunek 2C) i wstrzyknij 0,2-0,5 μl mieszanki, naciskając przełącznik nożny.
    UWAGA: Na jeden hCO można wstrzyknąć do 5 komór, przy czym na powtórzenie przypada łącznie 7-8 hCO. Idealnie, komory skierowane na zewnątrz hCO powinny być ukierunkowane, ponieważ są one na ogół najlepiej rozwinięte (Rysunek 2G, H).
  7. Użyj cienkich kleszczy, aby popchnąć organoid w dół, aby ograniczyć ruch. Właściwie nie chwytaj organoidów (Rysunek 2C).
  8. Po wstrzyknięciu użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby przenieść 1-2 organoidy do komory elektroporacyjnej zawierającej roztwór Tyrode'a (Rysunek 2C, D).
  9. Skierować wstrzyknięte organoidy w stronę elektrod tak, aby celować w glej promieniowy wierzchołkowy w obszarach przypominających komory skierowanych na zewnątrz organoidu.
  10. Podłącz do komory elektroporacyjnej tak, aby wstrzyknięta strona organoidu była skierowana w stronę bieguna dodatniego (anody; Rysunek 2D).
  11. Naciśnij przycisk Pulse na elektroporatorze, aby elektroporować pięcioma impulsami 38 V przez 50 ms każdy w odstępach 1 s.
    UWAGA: Ustawienia elektroporacji mogą zależeć od dostępnego elektroporatora i mogą wymagać optymalizacji.
  12. Powtarzaj etapy wstrzykiwania i elektroporacji, aż do przetworzenia żądanej liczby organoidów.
  13. Zebrać elektroporowane organoidy w pożywce w temperaturze pokojowej do momentu, aż wszystkie próbki w tym samym stanie zostaną przetworzone. Upewnij się, że nie znajdują się poza inkubatorem łącznie dłużej niż 30 minut.
  14. Następnie należy umieścić elektroporowane hCOs z powrotem w odpowiedniej pożywce hodowlanej i hodować je bez wstrząsania przez pierwsze 24 godziny
    UWAGA: Po 2-3 dniach sygnał GFP powinien być widoczny w elektroporowanych hCOs pod fluorescencyjnym stereoskopem (Rysunek 2H). Punkt czasowy analizy po elektroporacji powinien być wybrany w zależności od pytania biologicznego, na które należy odpowiedzieć. Po 3-7 dniach komórki GFP-dodatnie znajdują się w klasach VZ, SVZ i CP15,60.

8. Utrwalanie i kriosekcja elektroporowanych organoidów korowych człowieka

  1. Utrwalić elektroporowane organoidy w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w probówce reakcyjnej o pojemności 2 ml.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i rakotwórczy. Wszelkie czynności związane z PFA należy wykonywać pod wyciągiem. Zdecydowanie zaleca się stosowanie rękawic nitrylowych i okularów ochronnych.
  2. Umyć raz w PBS przez 5 minut i przechowywać w sterylnie przefiltrowanej 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C, aż tkanka zostanie całkowicie nasycona sacharozą.
  3. Utrwalone organoidy należy zatopić w pożywce do zatapiania zamrożonej próbki tkanki oraz 15% sacharozy w PBS w blokach na suchym lodzie.
  4. Przygotuj skrawki 20-30 μm w kriostacie i zbierz tkankę na szkiełkach samoprzylepnych26,64.
    UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany, gdy utrwalone organoidy znajdą się w sacharozie (stabilnej w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy) lub w pożywce do zatapiania (zamrożone bloki można przechowywać w hermetycznych workach w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy do lat).

9. Analiza immunohistochemiczna elektroporowanych organoidów korowych człowieka

  1. Do analizy immunohistochemicznej26,64, przeprowadzić pobieranie antygenu w buforze cytrynianowym (10 mM cytrynian sodu, 0,05% polisorbat 20 w dH2O, pH 6,0) przez 1 godzinę w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej.
  2. Umyj raz w PBS przez 5 minut, następnie krótko wysusz szkiełka i zakreśl sekcje pisakiem woskowym.
  3. Gasić przy użyciu 0,1 M glicyny w PBS (pH 7,4) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać ją dwukrotnie PBS przez 5 minut każde.
  4. Przykryć skrawki buforem blokującym (10% surowica końska, 0,1% oktoksynol 9 w PBS) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciała w buforze blokującym i inkubować na skrawkach przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Następnego dnia przemyć trzykrotnie PBS przez 5 minut każdy, inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi i DAPI w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i ponownie przemywać trzy razy PBS przez 5 minut każdy.
  7. Zamontuj szkiełka w podłożu montażowym i zobrazuj pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 3).
    UWAGA: Zaleca się włączenie przeciwciała przeciwko fluoroforowi stosowanemu w mieszance iniekcyjnej w celu identyfikacji komórek docelowych, ponieważ sygnał natywny jest często wygaszony po utrwaleniu. Przeciwciała i barwniki stosowane do barwienia immunofluorescencyjnego, przedstawione w Rysunek 3, są wymienione w Tabeli 1.

10. Weryfikacja nokautu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 na poziomie białka

  1. Aby zweryfikować nokaut na poziomie białka, należy przeprowadzić immunohistochemię białka docelowego na organoidach poddanych elektroporacji (Rysunek 3I).
  2. Zobrazuj zarówno grupę kontrolną gLACZ, jak i docelowe organoidy przy użyciu tych samych ustawień, aby umożliwić porównanie intensywności fluorescencji (Rysunek 3I, J). Zrób to w sposób specyficzny dla strefy, aby porównać wpływ na różne typy komórek rozwijającej się kory nowej. Policz komórki w ImageJ/Fiji (wtyczka Cell Counter) lub poprzez segmentację za pomocą wtyczki StarDist 65.

Wyniki

Ablacja genów za pomocą CRISPR/Cas9 wymaga zaprojektowania gRNA. Zazwyczaj skutecznym podejściem jest celowanie w jeden z pierwszych egzonów genu zainteresowania za pomocą pary gRNA oddalonych od siebie o 7-11 bp (unikając wielokrotności 3 bp) (Rycina 1A). W ramach wstępnego testu wydajność rozpoznawania matrycy przez gRNA można zbadać in vitro, wykorzystując matrycę PCR26,40,62. Skuteczne celowanie i cięcie przez Cas9 są widoczne jako redukcja ilości DNA matrycy oraz pojawienie się produktów cięcia DNA na żelu agarozowym (Rycina 1B). Dalsze testy gRNA można przeprowadzić w linii iPSC wykorzystywanej do generowania organoidów korowych. Wymaga to nukleofekcji iPSC, co można zweryfikować poprzez pomyślną ekspresję fluorescencyjnego reportera (Rycina 1C). Skuteczne celowanie w wybrany locus można potwierdzić za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera, co skutkuje chromatogramem, który nagle się kończy lub nakłada na siebie w obrębie miejsca celowania (Rycina 1D), w wyniku powstania spektrum indeli podczas naprawy pęknięć dwuniciowych poprzez niehomologiczne łączenie końców66. Testy wydajności gRNA in vitro oraz w komórkach iPSC pomagają w wyborze efektywnych par gRNA do ablacji genów w organoidach korowych.

Przed elektroporacją organoidy korowe są przecinane, co ułatwia identyfikację światła komór w celu wstrzyknięcia mieszaniny do elektroporacji (Rycina 2A-C). Następnie wstrzyknięte organoidy przenosi się do komory elektroporacyjnej (Rycina 2D). Do elektroporacji należy używać organoidów korowych z dobrze rozwiniętymi strukturami przypominającymi komory (Rycina 2E), natomiast organoidy korowe pozbawione widocznych struktur należy odrzucić (Rycina 2F). Mieszanina do elektroporacji zawiera barwnik, który umożliwia wizualizację wstrzykniętych komór podczas procedury (Rycina 2G). Po 1-3 dniach hodowli skutecznie ukierunkowane komory są widoczne dzięki natywnemu sygnałowi GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rycina 2H).

W celu przeprowadzenia szczegółowej analizy histologicznej można wykonać immunohistochemię w przypadku przekrojów mrożonych. Idealnym scenariuszem jest obecność wielu celowanych komór wewnątrz elektroporowanego organoidu korowego (Rysunek 3A,B). Najbardziej optymalne elektroporacje celują w struktury przypominające komory w zewnętrznym obszarze organoidu, skierowanym na zewnątrz (Rysunek 3C), ponieważ zazwyczaj są to komory najbardziej rozszerzone. W niektórych przypadkach elektroporacja może prowadzić do nadmiernej śmierci komórek (Rysunek 3D,E), na przykład gdy stężenia plazmidów są zbyt wysokie lub parametry elektroporacji są nieoptymalne. Elektroporacje skierowane w stronę wnętrza organoidu (Rysunek 3F) często obejmują mniej rozszerzone obszary struktur przypominających komory w porównaniu z obszarami zewnętrznymi. W naszym doświadczeniu pomocne jest skoncentrowanie analizy ilościowej na określonych regionach organoidu w celu zmniejszenia zmienności. Czasami elektroporacja może spowodować uszkodzenie powierzchni apikalnej (Rysunek 3G), na przykład gdy objętość wtrysku jest zbyt duża, co prowadzi do pęknięcia komór, lub gdy impulsy elektryczne są zbyt silne, co prowadzi do delaminacji komórek. Wreszcie, gdy celowane są dwie sąsiadujące komory (Rysunek 3H), może stać się trudne określenie granic stref korowych oraz pochodzenia celowanych komórek.

Immunohistochemii można użyć do weryfikacji skutecznego nokautu za pomocą CRISPR/Cas9 na poziomie białka w wybranych komórkach (Rysunek 3I), co zilustrowano tutaj poprzez celowanie w białko PCGF4 kompleksu represyjnego Polycomb 1 (PRC1)67. Intensywność sygnału można analizować w komórkach GFP-dodatnich w warunkach kontrolnych i eksperymentalnych (Rysunek 3J). Alternatywnie, w przypadku braku odpowiedniego przeciwciała, komórki docelowe można wyizolować metodą FACS z organoidów korowych60, a następnie poddać dalszej analizie za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera lub sekwencjonowania nowej generacji (NGS)36. Ponadto redukcję poziomu białka można analizować za pomocą techniki Western blotting.

Edycja genów CRISPR; wydajność gRNA; elektroforeza w żelu; fluorescencja GFP; analiza danych sekwencjonowania.
Rysunek 1: Projektowanie i walidacja gRNA dla ostrego knockoutu genu za pomocą systemu CRISPR/Cas9. (A) Schematyczna ilustracja strategii projektowania gRNA, w której dwa gRNA celują w egzon genu zainteresowania. Czarne strzałki wskazują primery PCR do przygotowania matrycy wykorzystanej do walidacji gRNA. (B) Walidacja wydajności gRNA in vitro. Matryce amplifikowane metodą PCR poddano trawieniu kompleksami RNP. Po skutecznym cięciu w elektroforezie żelowej widoczne są dwa prążki o różnych rozmiarach (lewo), natomiast w przypadku gRNA o niskiej wydajności matryca pozostaje niepocięta (prawo). (C) Obraz w świetle przechodzącym (lewo), fluorescencja GFP (środek) oraz obrazy złożone (prawo) ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSCs) 3 dni po nukleofekcji kompleksem RNP i plazmidem GFP. Paski skali: 350 µm. (D) Walidacja wydajności gRNA w hiPSCs poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera amplifikowanego DNA z komórek GFP-dodatnich. Po skutecznym cięciu dwuniciowego DNA ślady sekwencjonowania wykazują nałożone sygnały rozpoczynające się od miejsca docelowego gRNA (góra, KO1). W przypadku nieudzielnego celowania ślad sekwencji DNA pozostaje niezmieniony (dół, KO2) w porównaniu z kontrolą LACZ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kultura ludzkich organoidów mózgowych: sekcjonowanie, wstrzykiwanie, elektroporacja; schemat eksperymentalny i wyniki.
Rysunek 2: Elektroporacja pociętych ludzkich organoidów korowych. (A) Schematyczna ilustracja przedstawiająca przebieg procesu elektroporacji ludzkich organoidów korowych (hCOs). Najpierw hCOs są cięte na plastry o grubości 500 µm. Dwa dni później mieszanina RNP zawierająca plazmid ekspresyjny GFP oraz Fast Green jest wstrzykiwana do światła struktur przypominających komory, preferencyjnie w zewnętrznym regionie hCOs. Do elektroporacji hCOs są umieszczane w komorze do elektroporacji. Po kilku dniach hodowli w obszarach poddanych elektroporacji można wykryć sygnał GFP. (B) Zdjęcia sekcjonowania hCOs za pomocą wibrotomu. Organoidy są zatapiane w 3% niskotopliwej agarozie w medium w bloku (lewo). Blok jest cięty na plastry o grubości 500 µm (środek). Pocięte organoidy są przenoszone z powrotem do naczynia hodowlanego za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze (prawo). (C) Zdjęcia przedstawiające wstrzykiwanie mieszaniny zawierającej RNP, pCAG-GFP i 0,1% Fast Green do struktur przypominających komory w organoidach. Organoidy są zanurzone w roztworze Tyrode'a, a cienka kapilara szklana jest wprowadzana do światła w centrum struktur przypominających komory (lewo). Do stabilizacji organoidów używa się pęsety (lewo i środek). Celem są komory znajdujące się na zewnątrz organoidów (środek). Wstrzyknięte organoidy są przenoszone do komory do elektroporacji, a później do naczynia hodowlanego, za pomocą końcówek pipety o szerokim otworze (prawo). (D) Zdjęcia komory do elektroporacji, która składa się ze szklanej płytki Petriego i dwóch metalowych ostrzy przyklejonych do szkła. Metalowe ostrza służą jako elektrody i posiadają otwory do przytwierdzenia kabli łączących z elektroporatorem. Strona hCO, w którą wstrzyknięto preparat, widoczna jako zielony cień, powinna być skierowana w stronę anody (biegun dodatni, czerwony kabel) (prawo). (E) Reprezentatywne zdjęcia hCOs wykazujących dobrze rozwinięte struktury przypominające komory. Jaśniejszy pierścień reprezentuje obszar przypominający strefę komorową. Ciemniejsze koło w centrum struktury przypominającej komorę reprezentuje światło i powinno być celem wstrzykiwania. (F) Reprezentatywne zdjęcia hCOs pozbawionych dobrze rozwiniętych struktur przypominających komory, których nie zaleca się włączać do dalszych eksperymentów. (G) Reprezentatywne zdjęcia hCOs po wstrzyknięciu mieszaniny do elektroporacji, w których obszary docelowe są widoczne dzięki Fast Green (pomarańczowe strzałki). (H) Reprezentatywne zdjęcie hCO wykazujące natywny sygnał GFP 24 h po elektroporacji. Paski skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fazy wzorca embrionalnego w mikroskopii DAPI/GFP; analiza śmierci komórek i tworzenia komór.
Rysunek 3: Analiza immunohistochemiczna elektroporowanych przekrojów ludzkich organoidów korowych. (A) Schemat przedstawiający elektroporowany ludzki organoid korowy (hCO) z zielonym sygnałem fluorescencyjnym. (B) Barwienie DAPI (szary) i immunofluorescencja dla GFP (zielony) w krioprzekroju hCO z wieloma elektroporowanymi komorami, 7 dni po elektroporacji. (C-H) Przykładowe obrazy różnych wyników elektroporacji, barwione pod kątem GFP (zielony) i jąder komórkowych (DAPI, szary). (C) Optymalna elektroporacja z nienaruszonymi jądrami (patrz wkładka 1, D), niezakłóconą strukturą przypominającą komorę oraz elektroporowanymi komórkami w obszarze skierowanym na zewnątrz organoidu, który zazwyczaj jest najbardziej rozległy. (E) Przykład hCO wykazujący masową śmierć komórek w obszarze elektroporowanym (patrz również wkładka 2, D), charakteryzująca się małymi, gęstymi od DAPI i zniekształconymi jądrami. (F) Udana elektroporacja skierowana do wnętrza organoidu, co często jest trudniejsze do interpretacji ze względu na obszary przypominające blaszkę korową zlewające się z sąsiednimi komorami. (G) Zakłócone struktury przypominające komory w centrum obszaru elektroporowanego (pomarańczowa strzałka). (H) Przykład hCO zawierającego wiele mniejszych komór, które są częściowo zlane i przez to trudne do ilościowego określenia. (I) Barwienie DAPI (szary) i immunofluorescencja dla GFP (zielony) oraz PCGF4 (magenta) 7 dni po elektroporacji kompleksu RNP celującego w LACZ (gLACZ KO, po lewej) lub PCGF4 (gPCGF4 KO, po prawej) w celu nokautu za pomocą CRISPR/Cas9. Obwiedzione komórki wskazują na zmniejszoną intensywność PCGF4, co świadczy o udanej ablacji genu. Jednolity sygnał widoczny jest w kontroli LACZ (po lewej). (J) Wykres przedstawia ilościową intensywność PCGF4 po immunofluorescencji w komórkach GFP-dodatnich dla kontroli (gLACZ KO) i KO PCGF4 (gPCGF4 KO) w stosunku do mediany ekspresji PCGF4 w warunkach gLACZ. Każda kropka reprezentuje jedną komórkę. Dane z 3-4 organoidów z dwóch różnych partii (szare i czarne) tej samej linii hiPSC. **** p < 0.0001, test Manna-Whitneya. Wszystkie obrazy zostały wykonane za pomocą konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego (B, C) lub mikroskopu fluorescencyjnego (E-I). Obrazy stanowią projekcje maksymalnej intensywności stosów z (z-stacks) o grubości 10-15 µm. Białe przerywane linie wskazują powierzchnię apikalną skierowaną w stronę światła komory oraz powierzchnie zewnętrzne hCO. Pomarańczowe przerywane linie wskazują granicę VZ/SVZ w zlewających się komorach. Paski skali: 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Przeciwciało/BarwnikRozcieńczanie
przeciwciało przeciwko GFP z kurczaka1:2,000
Przeciwciało mysie przeciwko PCGF41:300
Alexa Fluor 488 przeciwkurczakie przeciwciało osle1:1,000
Alexa Fluor 555 przeciwkrólicze przeciwciało osiołkowe1:1,000
DAPIstok 1 mg/ml; 1:1 000

Tabela 1: Lista przeciwciał i barwników oraz ich rozcieńczeń wykorzystanych do barwienia immunofluorescencyjnego.

Dyskusja

Ludzkie organoidy mózgowe i korowe stały się kluczowymi modelami do badania rozwoju ludzkiej kory nowej 7,16,17. W modelowaniu zaburzeń u ludzi izogeniczne linie i organoidy hiPSC stały się złotym standardem68. Ponieważ jednak generowanie nowych linii iPSC jest czasochłonne i kosztowne, szeroko stosuje się ostre manipulacje modelami organoidów korowych do badań funkcji genów.

Elektroporacja organoidów mózgowych i korowych 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 jest łatwa do wdrożenia, a wiele laboratoriów, które tradycyjnie wykorzystywały modele zwierzęce do badań funkcjonalnych, jest wyposażonych w wymagane narzędzia. Do wstrzykiwań in vivo komory boczne są zwykle ukierunkowane 34,36,37,39,40,41,42. Są one modelowane w organoidach korowych przez struktury przypominające komory z centralnym światłem, które można również wstrzyknąć. Elektroporacja organoidów korowych jest ukierunkowana przede wszystkim na końcowe stopy komórek wyściełających komory, zwykle wierzchołkowy promienisty glej69. Skuteczność celowania różni się w zależności od eksperymentu, ale zazwyczaj po 3-7 dniach elektroporacji można uzyskać kilka od 100 do 1000 komórek GFP-dodatnich na organoid. Czas trwania cyklu komórkowego w ludzkich nerwowych komórkach progenitorowych jest mniej więcej dwa razy dłuższy w porównaniu z myszami, gdzie wierzchołkowe promieniste komórki glejowe mają długość cyklu komórkowego 14 godzin, a podstawowe komórki progenitorowe 23 godziny70. Dlatego po 3 dniach głównie wierzchołkowe promieniste komórki glejowe i pośrednie komórki progenitorowe są GFP-dodatnie, podczas gdy komórki GFP-dodatnie są rozmieszczone we wszystkich strefach po 7 dniach. Sygnał GFP można zaobserwować jeszcze kilka miesięcy po elektroporacji, przy czym komórki GFP-dodatnie reprezentują głównie neurony, które są rozproszone po całym organoidzie, co pozwala nam analizować morfologię poszczególnych komórek. Celowanie w neuronalne komórki progenitorowe wyściełające komorę jest możliwe na etapach, w których obszary podobne do komór można zidentyfikować pod mikroskopem jasnego pola. W obecnym protokole15 jest to możliwe od 2 do 12 tygodnia rozwoju organoidów korowych, po czym komory kurczą się i nie są już widoczne. Dla doświadczonego eksperymentatora możliwe jest wstrzyknięcie 50-80 organoidów podczas jednej sesji.

Podczas gdy potomstwo wierzchołkowego gleju promienistego dziedziczy odczynniki do manipulacji genami podczas podziału komórki, bezpośrednie celowanie w dojrzałe komórki, takie jak neurony i astrocyty, nie jest możliwe przy standardowym podejściu do elektroporacji. Zamiast tego metody celowania wirusa zostały zastosowane do komórek postmitotycznych w układzie nerwowym33,71. W szczególności rekombinowane wirusy związane z adenowirusami (AAV) są szeroko stosowane do transferu genów w układzie nerwowym, ponieważ są łatwe do wytworzenia i transdukują końcowo zróżnicowane komórki z wysoką wydajnością71. Co więcej, AAV mogą być ukierunkowane na określone subpopulacje neuronów. Różne podejścia do celowania w wirusy, w tym wykorzystanie adenowirusów, Sendai i lentiwirusów, zostały już zastosowane w organoidach mózgowych i korowych 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Jednym z ograniczeń w protokołach organoidów mózgowych jest rozwój martwiczego rdzenia z powodu ograniczonego zaopatrzenia w tlen i składniki odżywcze. Wdrożono kilka strategii mających na celu poprawę żywotności komórek w centrum organoidów, w tym hodowlę organoidów w wirujących bioreaktorach 14,54, kohodowlę komórek śródbłonka lub podejścia bioinżynieryjne do modelowego unaczynienia75,76, przeszczep organoidów do modeli gryzoni 18,77 i krojenie organoidów15,47. W tym przypadku zastosowaliśmy pokrojony protokół organoidów korowych człowieka, który, jak wykazano, wykazuje zmniejszone niedotlenienie w rdzeniu organoidu i wspomaga ekspansję struktur podobnych do komór i obszaru przypominającego płytkę korową15. Ponadto krojenie organoidów mózgowych jest również korzystne dla obrazowania na żywo gleju promieniowego podstawnego, który znajduje się w strefie podkomorowej, umożliwiając generowanie map decyzyjnych losu komórek72. Podobnie, obrazowanie na żywo wykorzystano do badania pokrojonych organoidów mózgowych hodowanych na granicy powietrzno-cieczowej, co wspiera przeżycie neuronów i wzrost aksonów47. Odkryliśmy, że krojenie ludzkich organoidów korowych sprawia również, że te modele organoidów są szczególnie podatne na elektroporację, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu. Elektroporacja organoidów korowych umożliwia wprowadzenie plazmidów DNA, klasycznie stosowanych do nadekspresji genów, a ostatnio do dostarczania całych bibliotek plazmidów55, oraz narzędzi do edycji genów CRISPR/Cas9 do inaktywacji funkcji genów26.

Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała badanie funkcji genów 56,57,58,63,66. W tym protokole przedstawiliśmy zastosowanie kompleksów rybonukleoproteinowych gRNA / Cas936 do ostrej inaktywacji genów w organoidach korowych człowieka. Wstępną walidację skuteczności gRNA przeprowadzono in vitro, najpierw w probówce, a następnie w iPSC. Odkryliśmy, że te proste testy wstępne pomagają w wyborze obiecujących par gRNA, szczególnie w przypadku braku działających przeciwciał. W miarę jak coraz więcej narzędzi do nokautowania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zostaje scharakteryzowanych, początkowe etapy walidacji mogą zostać pominięte w przyszłości. Podczas gdy sekwencjonowanie nowej generacji docelowych regionów DNA wyizolowanych z iPSC jest bardziej ilościowe i ma wyższą zawartość informacji, okazuje się, że sekwencjonowanie Sangera może często oferować znacznie szybsze wyniki podczas wstępnych badań przesiewowych gRNA. Ostatecznie, walidacja wydajnej edycji CRISPR/Cas9 w organoidach korowych i obniżenie poziomu białek w komórkach będących przedmiotem zainteresowania jest najbardziej ostatecznym dowodem na udaną ablację genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9.

Elektroporacja pokrojonych w plastry organoidów ludzkiej kory mózgowej umożliwia ostrą manipulację genetyczną w badaniach nad zyskiem i utratą funkcji, wizualizacją morfologii komórek i aksonów neuronalnych, dostarczaniem bibliotek plazmidów do podejść przesiewowych i masowych równoległych testów reporterowych, znakowaniem komórek do obrazowania na żywo i dostarczaniem narzędzi do edycji epigenomu. W związku z tym elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka jest potężną metodą, która może ujawnić mechanistyczny wgląd w rozwój kory mózgowej człowieka, zaburzenia neurorozwojowe i ewolucję kory mózgowej.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni obiektom partnerów CRTD i Dresden Concept za wyjątkowe wsparcie, w szczególności K. Neumann i jej zespołowi w Stem Cell Engineering Facility, H. Hartmann i jej zespołowi w Light Microscopy Facility, A. Gompf i jej zespołowi w Flow Cytometry Facility oraz Hartmutowi Wolfowi z warsztatu MPI-CBG za budowę komór elektroporacyjnych. Dziękujemy Joshui Schmidtowi za jego opinie na temat manuskryptu. MA dziękuje za finansowanie z Centrum Terapii Regeneracyjnych Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie, DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) oraz Fundacji Schram.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe PP 15 mL, stożkoweCorning430791
Jednostka rdzeniowa 4D-NucleofectorJednostka Lonza
4D-Nucleofector XRurka okrągłodenna
polistyrenu o pojemności 5 ml z nasadką sitkowąCorningFalcon 352235
6-dołkowa, poddana działaniu nunklonuThermo Fisher140675Do hiPSC kultura
Płytka 6-dołkowa, bardzo niskie nasadkaCorning3471Do hodowli organoidów
A83-01STEMCELL Technologies72022Pożywka z przodomózgowia 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Sprężarka powietrzaAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Przeciwciało drugorzędowe, RRID: AB_2340375; rozcieńczenie 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Przeciwciało drugorzędowe, RRID: AB_162543; rozcieńczenie 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolZintegrowane technologieNiestandardowy projekt (zamów jako 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAZintegrowane technologie DNA10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Zintegrowane technologie DNA1081060100 i mikro; g, ze Streptococcus pyogenes
Amfoterycyna B (Fungizone)Gibco15290018Podłoże przodomózgowia 2, 3 i 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-GFP (kurczak, poliklonalne)Abcamab13970RRID: AB_300798; rozcieńczenie 1:2000
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-PCGF4 (mysie, monoklonalne)Milipore05-637 RRID: AB_309865; rozcieńczenie 1:300
Mikroskop fluorescencyjny ApoTomeKwas askorbinowy
Sigma Aldrich1043003Podłoże Przodomózgowie 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-suplement (+ witamina A)Gibco17504044Podłoże przodomózgowia 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Zestaw bananowych do mikrochwytakówAparatura Harvarda BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (maszyna do PCR)Analytik Jena846-2-070-723
Kapilary, szkło borokrzemianowe z żarnikiem, OD 1,2 mm; średnica wewnętrzna 0,69 mm; 10 cm długościScience ProductsBF120-69-10Należy pociągnąć do określonej grubości
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Podłoże przodomózgowie 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Kolagenaza typu IVGibco17104019
CRTDi004-AStem Cell Engineering Facility w CMCB DD https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-AJednokomórkowa adaptowana linia hiPSC od zdrowego dawcy
DAPIRoche10236276001zapas 1 mg / ml, użyj 1:1000 rozcieńczony dla
IF Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73884Przodomózgowie średnie 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Podłoże przodomózgowie 1, 2 i 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Podłoże przodomózgowia 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Kleszcze, proste, 11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 System elektroporacji fal prostokątnychAparat Harvard BTX45-2052
EtanolSigma Aldrich32205-1L-M
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Płonący / brązowy ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-97Do pobierania mikronaczyń włosowatych
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware wersja 2024.0.5
gLACZKalebic i wsp., 2016; Platt i wsp., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; podkreślone nukleotydy = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Podłoże przodomózgowia 1, 2, 3 i 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1ten artykuł5'-TGAACTTGGACATCACACAAATAGG (odpowiada obrazom KO na rysunku 3I+J)
gPCGF4 KO2ten artykuł5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (odpowiada KO zdjęcia na rysunku 3I+J)
HEPESwykonane w domu1 M zapas
Surowicy dla koni, inaktywowany termicznieGibco26050088
Ludzkie białko rekombinowane GDNFThermo Fisher450-10Podłoże przodomózgowia 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Human/Mysz/Szczur BDNF Rekombinowane białkoThermo Fisher450-02Podłoże przodomózgowia 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Kwas solny (HCl)Sigma Aldrich258148Aby zrobić TrisHCl
ImmEdge (wosk) Piórowektorowe LaboraoryH-4000
Roztwór insuliny ludzkiejSigma Aldrich  I9278Przodomózgowie średnie 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Zamiennik surowicy nokautującejGibco 10828-010Przodomózgowie średnie 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 980Zeiss Agaroza
o niskiej temperaturze topnienia, ultra czysty16520100Thermo Fisherdo osadzania hCOs podczas sekcji wibratomu
Matrigel Matryca membrany podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR), wolna od LDEVCorning354230Do hodowli
organoidówMatrigel Matryca z kwalifikacją hESC, wolna od LDEV354277Corning do hodowli hiPSC
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
Mikrowtryskiwacz PicoPump + przełącznik nożnyWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Końcówki do pipet do mikroładowarek 0,5 do 20 i mikro; LEppendorf5242956003Do napełniania naczyń włosowatych szklanych
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Pożywka z komórek macierzystych
N-2 suplementGibco17502048Podłoże przodomózgowia 2 i 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Komora licząca NeubauerMarka718605
Podłoże neuropodstawoweGibco21103049Podłoże przodomózgowia 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Aminokwasy endogenneGibco 11140050Pożywka Przodomózgowie 1, 2, 3 i 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Beznukleazowy bufor dupleksowyZintegrowane technologie DNA1072570
O. C. T.Tissue-Tek4583Podłoże do zatapiania zamrożonej próbki tkanki
P3 Pierwotna komórka 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldehydFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Forma do osadzania Peel-A-Way TruncatedT12Polysciences Inc.18986-1Do zatapiania hCO do wibratomu i kriosekcji
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) Gibco15140122Podłoże przodomózgowie 1, 2, 3 i 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 oraz dla pożywki dla komórek macierzystych po nukleofekcji
Szalka Petriego 60 mm x 15 mm, bez otworu wentylacyjnego, sterylnaCorningBP50-02
Platynowa komora elektrody na szalkę Petriego, odstęp 5 mmAparat Harvarda BTX45-0504
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)wyprodukowana we własnym zakresie
Proteinaza KSigma AldrichP2308Z albumu Titrachium; 10 mg/ml zapas
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28706
Inhibitor szlaku RHO/ROCK (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Podłoże przodomózgowia 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Cytrynian sodu dwuwodnySigma AldrichW302600-1KG-K
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma AldrichL3771
Sacharoza Prowadnice adhezyjne Sigma AldrichS7903
SuperFrost PlusFisher Scientific10149870
SZX10 z KL 300 LEDOlympusSZX10Lub alternatywny stereoskop
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-X SigmaAldrichT9284a.k.a. Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503Aby zrobić
roztwór błękitu trypanowego TrisHCl, 0,4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021dysocjacja do wytwarzania zawiesin jednokomórkowych
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polisorbat 20
Sól tyrodowaSigma AldrichT2145-10x1l
Wibrujący Mikrotom (wibratom)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 µ L Uniwersalne końcówki filtracyjneCorningTF-1005-WB-R-S
β-MerkaptoetanolGibco 21985-023Przodomózgowie średnie 1, 3 i 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
z DNA

Bibliografia

  1. Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
  2. Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellular basis of human evolution. Nat Rev Genet. 24, 687-711 (2023).
  3. Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Deconstructing cortical folding: Genetic, cellular and mechanical determinants. Nat Rev Neurosci. 20 (3), 161-176 (2019).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141 (11), 2182-2194 (2014).
  5. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  6. Bölicke, N., Albert, M. Polycomb-mediated gene regulation in human brain development and neurodevelopmental disorders. Dev Neurobiol. 82 (4), 345-363 (2022).
  7. Arlotta, P., Pasca, S. P. Cell diversity in the human cerebral cortex: From the embryo to brain organoids. Curr Opin Neurobiol. 56, 194-198 (2019).
  8. Long, K. R., et al. Extracellular matrix components HAPLN1, lumican, and collagen I cause hyaluronic acid-dependent folding of the developing human neocortex. Neuron. 99 (4), 702-719.e6 (2018).
  9. Namba, T., et al. Human-specific arhgap11b acts in mitochondria to expand neocortical progenitors by glutaminolysis. Neuron. 105 (5), 867-881.e9 (2020).
  10. Hendriks, D., et al. Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell. 187 (3), 712-732.e38 (2024).
  11. Voices: The importance of fetal tissue research. Cell Stem Cell. 24 (3), 357-359 (2019).
  12. Temple, S., Goldstein, L. S. B. Why we need fetal tissue research. Science. 363 (6424), 207(2019).
  13. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  14. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  15. Qian, X., et al. Sliced human cortical organoids for modeling distinct cortical layer formation. Cell Stem Cell. 26 (5), 766-781.e9 (2020).
  16. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Dev Biol. 420 (2), 199-209 (2016).
  17. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Andrews, M. G., et al. Lif signaling regulates outer radial glial to interneuron fate during human cortical development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1382-1391.e5 (2023).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Bershteyn, M., et al. Human ipsc-derived cerebral organoids model cellular features of lissencephaly and reveal prolonged mitosis of outer radial glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449.e4 (2017).
  22. Klaus, J., et al. Altered neuronal migratory trajectories in human cerebral organoids derived from individuals with neuronal heterotopia. Nat Med. 25 (4), 561-568 (2019).
  23. Qian, X., et al. Loss of non-motor kinesin KIF26A causes congenital brain malformations via dysregulated neuronal migration and axonal growth as well as apoptosis. Dev Cell. 57 (20), 2381-2396.e13 (2022).
  24. Watanabe, M., et al. Self-organized cerebral organoids with human-specific features predict effective drugs to combat zika virus infection. Cell Rep. 21 (2), 517-532 (2017).
  25. Benito-Kwiecinski, S., et al. An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 184 (8), 2084-2102.e19 (2021).
  26. Cubillos, P., et al. The growth factor epiregulin promotes basal progenitor cell proliferation in the developing neocortex. EMBO J. 43 (8), 1388-1419 (2024).
  27. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  28. Mora-Bermudez, F., et al. Differences and similarities between human and chimpanzee neural progenitors during cerebral cortex development. Elife. 5, e18683(2016).
  29. Pollen, A. A., et al. Establishing cerebral organoids as models of human-specific brain evolution. Cell. 176 (4), 743-756.e17 (2019).
  30. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  31. Fleck, J. S., et al. Resolving organoid brain region identities by mapping single-cell genomic data to reference atlases. Cell Stem Cell. 28 (6), 1177-1180 (2021).
  32. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  33. Janson, C. G., Mcphee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends Neurosci. 24 (12), 706-712 (2001).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev Growth Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
  35. Li, S., Li, Y., Li, H., Yang, C., Lin, J. Use of in vitro electroporation and slice culture for gene function analysis in the mouse embryonic spinal cord. Mech Dev. 158, 103558(2019).
  36. Kalebic, N., et al. CRISPR/cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Rep. 17 (3), 338-348 (2016).
  37. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  38. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of e16 rat embryos. J Vis Exp. 6, e236(2007).
  39. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  40. Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In vivo targeting of neural progenitor cells in ferret neocortex by in utero electroporation. J Vis Exp. (159), e61171(2020).
  41. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Mol Brain. 5, 24(2012).
  42. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biol Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  43. Reillo, I., De Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  44. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, e41241(2018).
  45. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  46. Fischer, J., Heide, M., Huttner, W. B. Genetic modification of brain organoids. Front Cell Neurosci. 13, 558(2019).
  47. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  48. O'neill, A. C., et al. A primate-specific isoform of plekhg6 regulates neurogenesis and neuronal migration. Cell Rep. 25 (10), 2729-2741.e26 (2018).
  49. Buchsbaum, I. Y., et al. Ece2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Rep. 21 (5), e48204(2020).
  50. Fischer, J., et al. Human-specific arhgap11b ensures human-like basal progenitor levels in hominid cerebral organoids. EMBO Rep. 23 (11), e54728(2022).
  51. Tynianskaia, L., Esiyok, N., Huttner, W. B., Heide, M. Targeted microinjection and electroporation of primate cerebral organoids for genetic modification. J Vis Exp. 193, e65176(2023).
  52. Denoth-Lippuner, A., Royall, L. N., Gonzalez-Bohorquez, D., Machado, D., Jessberger, S. Injection and electroporation of plasmid DNA into human cortical organoids. STAR Protoc. 3 (1), 101129(2022).
  53. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 13 (3), 565-580 (2018).
  54. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling zikv exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  55. Noack, F., et al. Joint epigenome profiling reveals cell-type-specific gene regulatory programmes in human cortical organoids. Nat Cell Biol. 25 (12), 1873-1883 (2023).
  56. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with crispr-cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  57. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgrnas for crispr-cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  58. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  59. Völkner, M., et al. Hbegf-tnf induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 13 (1), 6183(2022).
  60. Schütze, T. M., Bölicke, N., Sameith, K., Albert, M. Brain Organoid Research. , Springer US. New York, NY. (2022).
  61. ALT-R CRISPR-cas9 system-in vitro. cleavage of target DNA with RNP complex. , At https://eu.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#resources (2022).
  62. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO J. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  63. Platt, R. J., et al. CRISPR-cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  64. Florio, M., et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).
  65. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell Detection with Star-Convex Polygons. , Springer International Pubs. Cham. (2018).
  66. Wang, J. Y., Doudna, J. A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science. 379 (6629), eadd8643(2023).
  67. Hoffmann, J., et al. Canonical and non-canonical PRC1 differentially contribute to the regulation of neural stem cell fate. bioRxiv. , 2024(2024).
  68. Celotti, M., et al. Protocol to create isogenic disease models from adult stem cell-derived organoids using next-generation crispr tools. STAR Protoc. 5 (3), 103189(2024).
  69. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: Toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  70. Arai, Y., et al. Neural stem and progenitor cells shorten s-phase on commitment to neuron production. Nat Commun. 2, 154(2011).
  71. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu Rev Neurosci. 41, 323-348 (2018).
  72. Coquand, L., et al. A cell fate decision map reveals abundant direct neurogenesis bypassing intermediate progenitors in the human developing neocortex. Nat Cell Biol. 26 (5), 698-709 (2024).
  73. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human brain organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2023).
  74. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  75. Nwokoye, P. N., Abilez, O. J. Bioengineering methods for vascularizing organoids. Cell Rep Methods. 4 (6), 100779(2024).
  76. Cakir, B., Park, I. H. Getting the right cells. Elife. 11, e80373(2022).
  77. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozw j ludzkiego m zgutechnika elektroporacjiknockout genuCRISPR Cas9neuralne kom rki progenitorowekrojenie organoid wimmunohistochemiaapikalna glia radialnastruktury przypominaj ce komory
Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.