Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Podsumowanie

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Streszczenie

Sekcja tkanek i immunohistochemia są niezbędnymi technikami w badaniach histologicznych i patologicznych chorób siatkówki przy użyciu modeli zwierzęcych. Metody te umożliwiają szczegółowe badania morfologii tkanek i lokalizacji określonych białek w tkance, co dostarcza cennych informacji na temat procesów i mechanizmów chorobowych. Myszy są najczęściej używanym modelem do tego celu. Ponieważ jednak gałki oczne myszy są małe, a siatkówki myszy są niezwykle delikatnymi tkankami, uzyskanie wysokiej jakości przekrojów siatkówki i obrazów barwiących immunologicznie z gałek ocznych myszy jest zazwyczaj trudne. Badanie to opisuje ulepszony protokół kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania immunohistochemii. Istotnym punktem tego protokołu jest pokrycie gałki ocznej warstwą super kleju, który zapobiega deformacji gałek ocznych podczas procesów usuwania rogówki, ekstrakcji soczewki i osadzania. Ten krok zapewnia dobre zachowanie integralności morfologii siatkówki. Protokół ten podkreśla krytyczne względy techniczne i strategie optymalizacyjne w celu konsekwentnego wytwarzania wysokiej jakości skrawków siatkówki i osiągania doskonałych wyników barwienia immunologicznego.

Wprowadzenie

Kriosekcja i immunohistochemia (IHC) są niezbędnymi technikami w badaniach biomedycznych, szczególnie do badania złożonych struktur biologicznych, takich jak siatkówka¹. Te zaawansowane metodologie są integralną częścią zrozumienia skomplikowanego składu komórkowego i organizacji molekularnej siatkówki. Zapewniają one naukowcom możliwość szczegółowego badania funkcjonalności i patologii siatkówki, oferując spostrzeżenia, które mają kluczowe znaczenie dla postępu wiedzy w tej dziedzinie.

Kriosekcja odgrywa istotną rolę w utrzymaniu integralności morfologicznej tkanki siatkówki. Zapewnia, że delikatna struktura siatkówki pozostaje nienaruszona, co pozwala na wykorzystanie skrawków w kolejnych badaniach immunofluorescencyjnych z wysoką dokładnością i wiarygodnością. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak zatapianie parafiny, kriosekcja ma znaczące zalety, ponieważ lepiej zachowuje zarówno morfologię tkanki, jak i antygenowość, dzięki czemu jest szczególnie odpowiednia do barwienia immunohistochemicznego². Technika zamrożonych przekrojów jest szeroko stosowana do badania szeregu złożonych tkanek, a nawet drobnych struktur komórkowych³, umożliwiając precyzyjną analizę ich architektury.

IHC to potężna i wszechstronna technika laboratoryjna, która pozwala na wizualizację lokalizacji określonych białek w tkankach. Technika ta stała się kamieniem węgielnym zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, gdzie jest szeroko stosowana w diagnostyce, monitorowaniu chorób i badaniach biologicznych. Powodzenie eksperymentu IHC zależy w dużej mierze od skrupulatnego przygotowania próbki, ostrożnego obchodzenia się z tkanką i precyzyjnej kontroli warunków barwienia immunologicznego. Niewielkie różnice w protokole mogą mieć duży wpływ na jakość wyników, podkreślając znaczenie standaryzacji i optymalizacji¹.

W połączeniu, kriosekcja i IHC oferują niezrównane korzyści dla badaczy chcących zbadać rozkład przestrzenny, poziomy ekspresji i interakcje komórkowe różnych białek w siatkówce. Metodologie te pozwalają na szczegółowe badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju, funkcji i choroby siatkówki. Takie spostrzeżenia są szczególnie cenne w badaniu zaburzeń siatkówki, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, retinopatii cukrzycowej i barwnikowego zwyrodnienia siatkówki. Wyjaśniając patofizjologię tych schorzeń, kriosekcja i IHC przyczyniają się do identyfikacji potencjalnych biomarkerów i opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Pomimo swojej użyteczności, praca z siatkówkami myszy stanowi wyjątkowe wyzwanie. Myszy są szeroko stosowane jako modele zwierzęce w badaniach okulistycznych ze względu na ich genetyczne podobieństwo do ludzi i dobrze scharakteryzowaną strukturę siatkówki. Jednak uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji jest z natury trudne ze względu na mały rozmiar i delikatny charakter tkanki siatkówki myszy. Badanie to przedstawia szczegółową metodologię kriosekcji i wykonywania IHC na siatkówkach myszy, podkreślając krytyczne względy techniczne i oferując strategie optymalizacyjne w celu sprostania tym wyzwaniom. Udoskonalając te techniki, naukowcy mogą osiągnąć spójne i wysokiej jakości wyniki, posuwając naprzód badania nad biologią i patologią siatkówki.

Protokół

Procedura była zgodna z wytycznymi ustalonymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką na temat wykorzystania zwierząt w badaniach. Zgodę uzyskano od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Szpitala Ludowego Prowincji Syczuan. Do tego protokołu wykorzystano samce myszy C57Bl/6J w wieku od dwóch do trzech miesięcy i o wadze 25-30 g. Pełna lista odczynników i sprzętu wykorzystanego w tym badaniu znajduje się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynnika

1. 1x bufor PBS
   1. Odważyć 8 g NaCl, 1,42 g Na₂HPO₄, 0,42 g KH₂PO₄ i 0,2 g KCl za pomocą wagi. Przenieść je do zlewki i dodać odpowiednią ilość podwójnie destylowanej wody (_ddH2O) w celu rozpuszczenia składników. Wlać roztwór do kolby miarowej o pojemności 1 l i dostosować objętość do 1 l za pomocą ddH₂O.
2. 4% roztwór paraformaldehydu (PFA)
   1. Dodać 0,4 g proszku PFA i 15 μl 1 M NaOH do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml buforu 1x PBS. Umieść probówkę w łaźni wodnej ustawionej na 60 °C, aby całkowicie rozpuścić proszek PFA. Dostosuj końcową objętość do 10 ml za pomocą 1x PBS.
3. Rozwiązanie blokujące IHC
   1. Połącz 1 ml normalnej surowicy osła, 20 μl 20% NaN₃, 200 μl 20% Triton X-100 i 18,78 ml 1x buforu PBS. Dokładnie wymieszaj.
4. 30% roztwór sacharozy
   1. Rozpuścić 15 g sacharozy w 40 ml 1x buforu PBS. Dostosuj objętość do 50 ml za pomocą buforu 1x PBS i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
5. Roztwór przeciwciał drugorzędowych IHC
   1. Rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488 w stosunku 1:300 i DAPI w stosunku 1:2,000 za pomocą przygotowanego buforu blokującego.

2. Kriosekcja gałki ocznej myszy

1. Rozwarstwianie gałek ocznych
   1. Znieczulić 3-miesięczną mysz C57Bl/6 (około 25 g) poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2% tribromoetanolu w dawce 15 μl/g masy ciała. Poświęć mysz za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
   2. Zaznacz górną stronę gałki ocznej niebieskim markerem na twardówce (Ryc. 1A). Usuń gałki oczne za pomocą nożyczek.
   3. Jeśli na powierzchni gałki ocznej znajduje się krew, delikatnie zetrzyj ją niestrzępiącą się chusteczką. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń mięśnie zewnątrzgałkowe przyczepione do gałek ocznych.
2. Utrwalenie
   1. Przenieś wypreparowane gałki oczne do 2-mililitrowej probówki do mikrowirówki z okrągłym dnem zawierającej 1 ml 4% PFA. Unieruchamiaj gałki oczne na 10 minut. Następnie przenieś gałki oczne na odwróconą 3- lub 6-centymetrową szalkę Petriego.
   2. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie (około 1-2 mm) na rogówce za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek okulistycznych. Umieść gałki oczne z powrotem w 4% roztworze PFA na dodatkowe 2 godziny utrwalania na lodzie (Rysunek 1B).
3. Krioprotekcja
   1. Usuń utrwalacz i trzykrotnie przemyj gałki oczne 1x roztworem buforowym PBS. Przenieść gałki oczne do okrągłodennej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml 30% roztworu sacharozy do krioprotekcji w temperaturze 4 °C. Pozwól, aby gałki oczne osiadły na dnie probówki lub pozostaw je na noc.
4. Powlekanie gałki ocznej
   1. Przenieś gałkę oczną na odwróconą szalkę Petriego stroną rogówki skierowaną do góry. Zetrzyj nadmiar roztworu z rogówki za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. Zanurz 2-3 cm odcinek sznurka tenisowego w kleju (złożonym z cyjanoakrylanów) zawartym w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,2 ml, a następnie szybko go usuń.
   2. Pod mikroskopem preparacyjnym przymocuj jeden koniec sznurka tenisowego z resztkami super kleju do środka wilgotnej rogówki. Pozostaw klej do zestalenia się na 10-20 s. Chwyć drugi koniec sznurka tenisowego i zanurz gałkę oczną w probówce mikrowirówkowej o pojemności 200 μl wypełnionej super klejem, upewniając się, że twardówka jest całkowicie zanurzona na około 1 s.
   3. Szybko wyjmij gałkę oczną i zanurz ją w PBS (Rysunek 1C). Klej na powierzchni twardówki natychmiast się zestala.
5. Usunięcie rogówki
   1. Zetrzyj nadmiar PBS na powierzchni zestalonego kleju za pomocą niestrzępiącej się ściereczki. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówkę nożyczkami okulistycznymi, trzymając dołączoną cięciwę tenisową.
6. Osadzanie
   1. Za pomocą kleszczyków ostrożnie wyjmij soczewkę z muszli ocznej. Nadmiar roztworu sacharozy uwięzionego w muszli ocznej należy wchłonąć paskiem niestrzępiącej się chusteczki. Przenieś muszlę oczną do formy do zatapiania wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
   2. Całkowicie napełnij muszlę oczną OCT. Ustaw muszlę oczną tak, aby była skierowana w stronę ściany bocznej formy do zatapiania, upewniając się, że płaszczyzna strzałkowa jest równoległa do dna formy. Użyj niebieskiego znaku na twardówce jako odniesienia. Przenieś formę do zatapiania zawierającą muszlę oczną do zamrażarki o temperaturze -80 °C (Rysunek 1D). Muszla oczna zostanie zamrożona w ciągu pięciu minut.
7. Kriosekcja
   1. Przenieść zamrożoną muszlę oczną do kriostatu ustawionego na -20 °C i pozostawić do wyrównania w komorze przez 30 minut. Pociąć muszlę oczną na grubość 12 μm. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach do późniejszego użycia.

3. Barwienie immunohistochemiczne

1. Pieczenia
   1. Zamrożone kawałki ułożyć na szkiełkach i piec w piekarniku o temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aby zapewnić prawidłowe przyleganie chusteczki do szkiełka.
2. mycie
   1. Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg wokół sekcji na slajdzie. Zanurz szkiełko w słoiku Coplin zawierającym 1x bufor PBS. Umieść słoik Coplin na wolnym wytrząsarce i myj sekcje przez 2 × 10 minut, aby usunąć związek OCT.
3. Blokowanie i przepuszczalność
   1. Umieść szkiełko poziomo w komorze wilgotnościowej. Dodaj roztwór blokujący do zakreślonych odcinków i pozostaw do zablokowania i przepuszczalności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   1. Ostrożnie odessać roztwór blokujący ze szkiełka. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczone w roztworze blokującym, do sekcji. Inkubować skrawki w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez noc, aby zapewnić optymalne wiązanie przeciwciała z antygenem docelowym.
5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
   1. Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełko dwukrotnie 1x PBS przez 2 × 10 minut. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, zmieszane z DAPI i rozcieńczone w roztworze blokującym.
   2. Inkubować skrawki w ciemnej komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby umożliwić wtórne wiązanie przeciwciał i barwienie przeciwstawne za pomocą DAPI.
6. Montażu
   1. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przepłukać szkiełko 1x PBS przez 2 × 10 minut. Użyj chusteczki Kimwiste, aby usunąć pozostały PBS na szkiełku.
   2. Nałóż odpowiednią ilość środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na sekcje i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Zamontowane próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zachować fluorescencję i zapobiec fotowybielaniu.

4. Obrazowanie

1. Pozyskaj sygnały fluorescencyjne z wybarwionych immunologicznie skrawków siatkówki za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Dostosuj ustawienia, aby uzyskać optymalną rozdzielczość i czułość, aby uchwycić wyraźne i wyraźne sygnały fluorescencyjne.
2. Upewnij się, że używane są odpowiednie filtry do wykrywania określonych długości fal fluoroforów użytych w eksperymencie.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, oczy miesięcy myszy typu dzikiego C57Bl/6J utrwalono w 4% PFA. Utrwalone próbki zatopiono w OCT, a następnie wykonano ich kriosekcje. Przekroje poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciała anty-PDE6B oraz barwieniu kontrastowemu DAPI w celu znakowania jąder komórkowych. PDE6B to białko fototransdukcji specyficznie wyrażane w komórkach fotoreceptorów pręcikowych⁴. W porównaniu z tradycyjnymi protokołami, metoda ta znacząco poprawia zarówno morfologię siatków...

Dyskusja

Na jakość skrawków tkanek wpływa szereg czynników, w tym skład roztworu utrwalającego, czas utrwalania i krioprotekcji oraz metody osadzania⁵. Podczas wyłuszczenia gałki ocznej od myszy konieczne jest usunięcie mięśni zewnątrzgałkowych i innej tkanki łącznej przyczepionej do gałki ocznej. Jeśli nie zostaną prawidłowo usunięte, tkanki te mogą spowodować deformację gałki ocznej podczas ekstrakcji z oczodołu, potencjalnie prowadząc do odwarstwienia siatkówki. Podczas procesu stabilizacji należy wykon...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
-80 stopni Celsjusza; C zamrażarka	Haier	DW-86L626
Szkiełka mikroskopu adhezyjnego	CITOTEST	80312-3161
Alexa488-Goat anti-Rabbit	Proteintech	SA00006-2
Mysz C57BL/6J	Jackson Laboratory	664
Mikrotom do kriosekcji	Leica	N/A
Kriostat	LEICA	Nie dotyczy
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Mikroskop preparacyjny	ZEISS	3943030830
Serum dla osła	Solarbio	S9100
Formy do zatapiania	Thermo Fisher Scientific	1841
Nożyczki do precyzyjnego rozwarstwiania	RWD	S13001-10
Kleszcze precyzyjne	RWD	F11020-11
Wodne podłoże montażowe Fluoromount	Inkubator Sigma-Aldrich	F4680
	Shanghai Yuejin	N/A
KCl	Sigma-Aldrich	1049330500
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1048771000
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	FIS-06666
Laserowy mikroskop konfokalny	ZEISS	N/A
Osłona mikroskopu Szkło	CITOTEST	80340-3610
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	1065860500
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	1091371003
Związek OCT	Sakura	4583
Długopis dla dzieci	Sigma-Aldrich	Z672548
PFA	Sigma-Aldrich	441244
Królik anty-PDE6B	Proteintech	22063-1-AP
Wytrząsarka	SCILOGEX	8042210200
Nożyczki sprężynowe	RWD	S11036-08
Sacharoza	BioFroxx	1245GR500
Super klej	Deli	7147S
Sznurek tenisowy (1,24 mm)	Gosen	TS761
Tribromoetanol	Macklin	T831042
Triton X-100	Solarbio	IT9100