Artykuł metodologiczny

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

DOI:

10.3791/67643

⸱

7 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Radiobiology, Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2Comprehensive Cancer Center Erlangen-EMN, 3Bayerischerisches Zentrum für Krebsforschung, 4Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytotoksyczne limfocyty T odgrywają kluczową rolę w eliminacji komórek nowotworowych i dlatego są intensywnie badane w immunologii nowotworów. Częstość i aktywność cytotoksycznych limfocytów T w obrębie guzów i ich mikrośrodowiska guza (TME) są obecnie dobrze znanymi biomarkerami prognostycznymi i predykcyjnymi dla wielu typów nowotworów. Jednak dobrze wiadomo, że różne metody leczenia nowotworów, w tym radioterapia, chemioterapia, immunoterapia i terapia celowana, modulują nie tylko immunogenność guza, ale także sam układ odpornościowy. W związku z tym interakcja między komórkami nowotworowymi a limfocytami T wymaga bardziej intensywnych badań w różnych kontekstach terapeutycznych, aby w pełni zrozumieć złożoną rolę limfocytów T podczas terapii nowotworów. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano protokół do analizy aktywności i zdolności proliferacyjnej ludzkich cytotoksycznych (CD8+) limfocytów T w kohodowli ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. W szczególności limfocyty T CD8 + od zdrowych dawców są barwione nietoksycznym markerem proliferacji estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) i stymulowane za pomocą płytek pokrytych CD3 / CD28. Następnie limfocyty T są hodowane wspólnie z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi. Jako odczyt, proliferacja limfocytów T jest określana ilościowo poprzez pomiar rozkładu sygnału CFSE i ocenę ekspresji markerów aktywacji powierzchniowej za pomocą cytometrii przepływowej. Można to dodatkowo uzupełnić poprzez ilościowe określenie uwalniania cytokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Metoda ta ułatwia ocenę wywołanych leczeniem zmian w interakcji między komórkami nowotworowymi a limfocytami T, stanowiąc podstawę do bardziej szczegółowych analiz metod leczenia nowotworów i ich immunogenności w warunkach ex vivo u ludzi. Dodatkowo przyczynia się do zmniejszenia liczby przedklinicznych analiz in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie staje się coraz bardziej oczywiste, że wzrost i postęp nowotworów są silnie zależne od skutecznej manipulacji i tłumienia układu odpornościowego gospodarza. Przekształcone komórki pojawiają się każdego dnia, nawet w zdrowym organizmie. Jednak powstawanie makroskopowych guzów jest raczej rzadkim zjawiskiem, ponieważ powstające przekształcone komórki są usuwane z organizmu z dużą wydajnością. Do usuwania komórek nowotworowych wkraczają różne typy komórek odpornościowych, takie jak cytotoksyczne limfocyty T, limfocyty T NK (NK), komórki NK lub makrofagi1,2,3. Niemniej jednak czasami mogą pojawić się przekształcone klony komórek, które przetrwają w stanie równowagi z układem odpornościowym gospodarza, który charakteryzuje się różnymi strategiami immunosupresyjnymi klonu komórek nowotworowych4. W końcu niektóre przekształcone komórki nabywają dalsze funkcje, które umożliwiają komórkom nowotworowym aktywne tłumienie odpowiedzi immunologicznej, co w konsekwencji prowadzi do wyrostka guza. Ta immunosupresja jest pośredniczona przez liczne mechanizmy, które obejmują ekspresję ligandów immunosupresyjnych na komórkach nowotworowych lub aktywną rekrutację lub pobudzanie immunoregulacyjnych lub immunosupresyjnych populacji komórek odpornościowych. Ta tak zwana koncepcja edycji immunologicznej pokazuje kluczową rolę modulacji immunologicznej podczas tworzenia i wzrostu nowotworu5.

Nie jest więc zaskakujące, że układ odpornościowy jest obecnie głównym celem nie tylko w terapii raka, ale także jako czynnik predykcyjny i prognostyczny w wielu jednostkach nowotworowych i warunkach terapeutycznych. W ciągu ostatnich lat inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI) okazały się obiecującymi opcjami terapeutycznymi w różnych jednostkach raka litego, takich jak rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) lub niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) w celu modulacji mikrośrodowiska guza (TME) w kierunku bardziej efektywnej przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej i zmniejszonej immunosupresji komórek nowotworowych6. Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych mają na celu zwiększenie zabijania komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T poprzez celowanie w cząsteczki immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak cząsteczki białka programowanej śmierci 1 (PD-1) i jego oś liganda 1 (PD1 / PD-L1). Fakt ten podkreśla kluczową rolę limfocytów T w odporności przeciwnowotworowej. Na przykład w HNSCC ICI zostały z powodzeniem zatwierdzone jako terapia pierwszego rzutu w nawrotach i przerzutach HNSCC7. W związku z tym obecność cytotoksycznych limfocytów T w TME, a także ekspresja PD1 i PD-L1 na komórkach nowotworowych i limfocytach T, mogą służyć jako biomarkery predykcyjne w HNSCC8,9,10.

Mimo że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w immunologii nowotworów i terapii nowotworów, wiele otwartych pytań dotyczących ich interakcji z nowotworem nadal wymaga rozwiązania. Obecnie dobrze wiadomo, że odpowiedź immunologiczna guza jest procesem dynamicznym i że immunogenność nowotworów może się zmieniać w trakcie trwania choroby i leczenia. Różne metody leczenia, takie jak chemioterapia (CT), radioterapia (RT) lub terapia celowana (TT), są szczególnie znane z modulowania fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych. RT może napędzać regulację w górę cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego w tkance nowotworowej i zmieniać częstotliwość komórek naciekających nowotwór11,12. Z drugiej strony TT może również popierać korzystne zmiany w obrębie guza i TME poprzez bezpośrednią modulację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej13,14,15,16. Jednak modulacje te są trudne do zbadania u pacjentów, ponieważ wymagałoby to powtarzalnego badania tkanki nowotworowej w trakcie leczenia. W związku z tym potrzebne są rozstrzygające eksperymentalne systemy modelowe do badania dynamicznego fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych i limfocytów T oraz, co ważniejsze, ich interakcji.

Stąd, w celu analizy aktywności komórek T i interakcji komórek nowotworowych i limfocytów T, potrzebny jest kompleksowy test kohodowli ex vivo, który jest łatwy do wdrożenia w każdym laboratorium w oparciu o proste prace hodowlane i powszechnie stosowane analizy cytometrii przepływowej. Na podstawie istniejącego i dostępnego piśmiennictwa nie opublikowano dotychczas łatwego w użyciu i powszechnie stosowanego protokołu dotyczącego kohodowli limfocytów T i komórek nowotworowych. Mimo że ostatnio opublikowano kilka testów kohodowlanych dla limfocytów T i organoidów nowotworowych, technika hodowli komórkowych 3D nadal nie jest wdrażana jako standardowa technika w każdym laboratorium. W związku z tym udostępniamy protokół do stosowania w hodowli komórkowej 2D, który równie dobrze może zostać ustanowiony dla hodowli komórek 3D w przyszłości. Inne protokoły kohodowli 2D są często bardziej złożone, ponieważ wymagają na przykład transdukcji komórek nowotworowych za pomocą lucyferazy17 lub są odpowiednie tylko dla nowotworów hematologicznych (kokultura niedopasowanych limfocytów T z komórkami białaczkowymi)18. W opisanym tutaj teście limfocyty T od normalnych zdrowych dawców są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Następnie limfocyty T są hodowane wspólnie z (wstępnie) leczonymi komórkami nowotworowymi w celu analizy zdolności proliferacyjnej limfocytów T, a także ich aktywności za pomocą cytometrii przepływowej. W ten sposób wpływ różnych metod leczenia na fenotyp immunologiczny komórek nowotworowych, takich jak RT, CT lub TT, co z kolei wpływa na aktywność i proliferację limfocytów T, można łatwo przebadać i wykorzystać jako podstawę do głębszych analiz mechanistycznych i kolejnych wybranych analiz przedklinicznych in vivo. Opisany tutaj test oferuje łatwą w użyciu konfigurację, ponieważ nie są potrzebne żadne niekonwencjonalne urządzenia, techniki ani materiały. Ponadto test można łatwo dostosować do różnych linii komórek nowotworowych lub określonych podzbiorów limfocytów T (np. Limfocyty T CD4 +). Dzięki tej technice uzyskuje się wysoką standaryzację i powtarzalność.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test obejmuje pobieranie krwi i hodowlę ludzkich komórek pierwotnych. W związku z tym w przypadku tych analiz obowiązkowy jest etyczny głos. Wszystkie wyniki przedstawione w tym manuskrypcie są objęte aprobatą etyczną badania IMMO-NHD i uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich dawców. Zatwierdzenie zostało udzielone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg w dniu 9 listopada 2022 r. (numer wniosku 21-415-B). Komórki nowotworowe HSC4 użyte w tym badaniu pochodzą z dostępnej na rynku linii komórkowej.

Ten test ilustruje wszystkie etapy testu kohodowli komórek T i komórek nowotworowych, przy użyciu linii komórkowej ludzkiego raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) HSC4 w leczeniu obejmującym radioterapię (RT) i dwa specyficzne inhibitory kinazy. W związku z tym parametry takie jak liczba komórek, czas trypsynizacji i schematy leczenia są specyficzne dla tego środowiska kohodowli i powinny być dostosowane do innych linii komórek nowotworowych (patrz również sekcja Dyskusja). Wszystkie etapy wirowania przeprowadzono w temperaturze pokojowej. W tym badaniu inhibitory kinaz AZD0156 i VE-822 zostały wykorzystane do celowania w system naprawy uszkodzeń DNA (DDR) komórek HSC4. AZD0156 (Selleckchem) hamuje białko zmutowane do ataksji teleangiektazji (ATM), podczas gdy VE-822 (Selleckchem) jest ukierunkowany na ataksję-teleangiektazję i białko związane z Rad3 (ATR). Oba inhibitory zostały omówione jako potencjalne środki zwiększające wrażliwość na promieniowanie w komórkach nowotworowych. Rozpuszcza się je w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowuje w temperaturze -20 °C. Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy testu ex vivo, szczegółowo opisujący kohodowlę wstępnie leczonych komórek nowotworowych z ludzkimi limfocytami T CD8 + stymulowanymi CD3/CD28. Stosowane odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat blokowy testu ex vivo wstępnie leczonych komórek nowotworowych w ko-hodowli z (CD3/CD28) stymulowanymi ludzkimi limfocytami T CD8+. Dzień 1: Wysiew komórek nowotworowych HSC4. Dzień 2: Leczenie komórek nowotworowych i izolacja, barwienie CFSE i wysiew do płytek pokrytych CD3 / CD28 ludzkich limfocytów T CD8 +. Dzień 3: Leczenie komórek nowotworowych. Dzień 4: Liczenie reprezentatywnych dołków komórek nowotworowych. Pobieranie i liczenie wszystkich limfocytów T. Współhodowla limfocytów T i komórek nowotworowych HSC4 w stosunku 1:1. Dzień 5-Dzień 8: Inkubacja kokultur. Dzień 8: Zbiór kokultur, zamrożenie supernatantów, barwienie na podstawie przeciwciał i analiza komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wysiewanie komórek nowotworowych (Dzień 1)

UWAGA: Czas trwania: 1 godzina. Ludzkie komórki nowotworowe HSC4 są wysiewane z butelek do hodowli komórek T75 na płytki 96-dołkowe.

  1. Odrzucić supernatant (pożywkę D10) z butelki do hodowli komórkowych.
  2. Umyj komórki nowotworowe 5 ml ciepłego PBS o temperaturze 37 °C. Odrzuć PBS.
  3. Ponieważ komórki nowotworowe HSC4 mają tendencję do ścisłego przylegania do kolb do hodowli komórkowych, zaleca się dwuetapową trypsynizację, aby upewnić się, że wszystkie komórki są odłączone. W tym celu dodaj 3 ml trypsyny i umieść butelkę na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C na 3 minuty, a następnie wyrzuć trypsynę za pomocą pipety.
  4. Dodaj kolejne 3 ml trypsyny, umieść butelkę na płycie grzewczej i poczekaj, aż uzyskasz zawiesinę jednokomórkową. Sprawdź pod mikroskopem zawiesinę jednokomórkową.
  5. Zatrzymaj trypsynę, dodając podwójną objętość pożywki D10 (DMEM uzupełniony 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny), dokładnie zamieszaj i przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  6. Określ liczbę komórek zawiesiny jednokomórkowej, a następnie oblicz całkowitą ilość komórek nowotworowych zgodnie z całkowitą objętością. Do oznaczania liczby komórek zalecana jest komora Neubauera.
  7. Odwirować probówkę wirówkową o pojemności 50 ml zawierającą komórki nowotworowe o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  8. Ponownie zawiesić komórki nowotworowe HSC4 w odpowiedniej objętości pożywki D10, aby osiągnąć stężenie 15 000 komórek w pożywce o pojemności 200 μl.
  9. Zgodnie z planowanymi zabiegami na komórkach nowotworowych, wysiewaj dla każdego stanu co najmniej 3 dołki zawierające 15 000 komórek nowotworowych HSC4 w 200 μl podłoża na dwóch 96-dołkowych płytkach (1x próbka, 1x kontrola tylko komórek nowotworowych, 1x studnia do liczenia komórek na dzień wspólnej hodowli).
    UWAGA: Liczba komórek zależy od linii komórkowej i czasu podwajania. Liczba komórek do różnych zabiegów musi być zbadana w eksperymentach wstępnych, aby uniknąć 100% konfluencji podczas inkubacji.
  10. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i wilgotności nasyconej.

2. Leczenie komórek nowotworowych (Dzień 2)

UWAGA: Czas trwania: 3-5 godzin. Po czasie inkubacji wynoszącym 24 godziny, wcześniej wysiane komórki HSC4 można poddać zabiegowi zgodnie z pożądanym schematem zabiegu. W tym przykładowym przypadku komórki nowotworowe są leczone inhibitorem ATM lub ATR. W tym przypadku dodatkowo jedna z dwóch 96-dołkowych płytek jest następnie napromieniowywana 2x 5 Gy.

  1. Przygotuj inhibitory kinaz, aby uzyskać stężenie 1 μM AZD0156 (inhibitor ATM) i 0,1 μM VE-822 (inhibitor ATR) do leczenia komórek nowotworowych.
  2. Odpowiednio traktuj komórki nowotworowe, na przykład traktując jeden rząd próbek 3,1 μl inhibitora ATM, a drugi 3,1 μl inhibitora ATR na każdej płytce.
  3. Po 3-5 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C napromienić jedną płytkę 5 Gy.
  4. Po inkubacji przez kolejne 24 godziny ponownie napromienić tę samą płytkę 5 Gy.

3. Izolacja limfocytów T (Dzień 2)

UWAGA: Czas trwania: 4 godziny. Limfocyty T CD8+ są magnetycznie izolowane za pomocą mikrogranulek anty-CD8 z PBMC po odwirowaniu gradientu gęstości krwi obwodowej (PB) pochodzącej od zdrowych dorosłych dawców. Wyizolowane limfocyty T są następnie barwione CFSE i inkubowane na płytce dołkowej pokrytej CD3 / CD28 w celu stymulacji. Aby w późniejszych krokach móc pracować z zasobami i materiałem przyjaznymi dla zasobów, ważne jest, aby oszacować ilość limfocytów T, które są potrzebne do eksperymentów z kokulturą. W zależności od dawcy z około 45 ml krwi EDTA można wyizolować od 50 000 000 do 100 000 000 PBMC. Około 10% wszystkich PBMC to limfocyty T CD8 +.

  1. Wirowanie w gradiacji gęstości
    1. Przenieś 3-5 probówek z krwią EDTA o pojemności 9 ml pochodzącą od zdrowego dawcy do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    2. Napełnij obie probówki wirówkowe do 50 ml PBS + 2% FBS.
    3. Przygotować sześć probówek wirówkowych (z wkładką z tworzywa sztucznego do oddzielania PBMC) i napełnić każdą z nich 15 ml pożywki o gradiencie gęstości na zimno o temperaturze +4 °C.
    4. Ostrożnie nałożyć na pożywkę o gradiencie gęstości 12-15 ml rozcieńczonej krwi z kroku 3.1.2.
    5. Wirować przy 1200 x g przez 10 minut (bez konieczności zwalniania).
  2. Przygotowanie płytki 6-dołkowej do stymulacji limfocytów T
    1. Przygotowanie przeciwciał: Przygotować roztwór anty-CD3 (klon OKT3) o stężeniu 1 mg/ml z PBS. Przygotować roztwór anty-CD28 (klon 28,2) o stężeniu 0,1 mg/ml z PBS.
    2. Zalecenie: czas podczas wirowania (etap 3.1.5) należy wykorzystać na przygotowanie roztworów powlekających i pokrycie samych studzienek w celu stymulacji limfocytów T.
    3. Zmieszać 5 μl roztworu przeciwciała CD3 z 4,995 μl PBS i 50 μl roztworu przeciwciała CD28 z 4,950 μl PBS (stężenie końcowe: 1 μg/μL).
    4. Dodać 1.000 μl obu roztworów przeciwciał do każdego dołka na płytce 6-dołkowej.
    5. Pokryć 2 lub 3 dołki, w zależności od oczekiwanej ilości limfocytów T, płytką 6-dołkową i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotowanie pożywki z limfocytów T
    UWAGA: Przygotowanie 100x L-lizyny: Rozpuść 200 mg chlorowodorku L-lizyny w 50 ml wody destylowanej w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i przenieś go do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki perfuzyjnej o pojemności 50 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4-8 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Przygotowanie 15 mM L-argininy: Rozpuść 26 mg L-argininy w 10 ml DPBS. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i przenieś go do nowej probówki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4-8 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy.
    1. Użyj czasu wirowania, jak wspomniano w kroku 1.5, aby przygotować pożywkę z limfocytów T.
    2. Przygotuj około 10-30 ml pożywki z limfocytów T, w zależności od oczekiwanej ilości limfocytów T.
    3. Wymieszaj pożywkę RPMI wolną od L-argininy i L-lizyny z 10% inaktywowanym termicznie FBS, 1% penicyliną-streptomycyną, 1% L-argininą, 1% L-lizyną i 1% L-glutaminą. Przykład: 25,8 ml pożywki RPMI + 3 ml FBS + 0,3 ml Pen/Strep + 0,3 ml L-argininy + 0,3 ml L-lizyny + 0,3 ml L-glutaminy.
    4. Pozostałą pożywkę przechowywać w temperaturze 4 °C przez następne dwa dni do wykorzystania w dniu 4 – początek kohodowli. Dla każdego nowego przebiegu całego eksperymentu zaleca się przygotowanie świeżej pożywki hodowlanej.
  4. Izolacja PBMC
    1. Po odwirowaniu (etap 3.1.5) przenieść supernatant do czterech nowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wyrzucić zużyte probówki.
    2. Napełnij probówki wirówkowe do 50 ml PBS + 2% FBS.
    3. Wirować przy 300 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 2% FBS każdy i połączyć je w dwóch probówkach wirówkowych.
    5. Napełnij probówki do 50 ml PBS + 2% FCS.
    6. Wirować przy 120 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Wyrzuć supernatant, ostrożnie ponownie zawieś osad komórkowy w 1 ml PBS +2% FBS i połącz dwie osadki w jednym sokoło.
    8. Napełnij probówkę wirówkową do 50 ml PBS + 2% FBS.
    9. Policz całkowitą liczbę PBMC za pomocą komory liczącej Neubauera. Zalecenie: zawiesinę komórek rozcieńczyć w stosunku 1:10 z błękitem trypanowym do liczenia.
  5. Separacja limfocytów T CD8 +
    UWAGA: Użyj ludzkich mikrokulek CD8 wraz z kolumnami separacji magnetycznej (MS) i buforem MACS + (Magnetic Active Cell Sorting Plus) do magnetycznego oddzielania limfocytów T CD8 + zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
    1. Odwirować PBMC (po zliczeniu komórek) przy 300 x g przez 10 minut.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 μl buforu MACS+ (500 ml PBS uzupełnionego 10 mM EDTA i 0,5% BSA) na 107 komórek (na przykład 60 000 000 PBMC zawiesza się w buforze 6 x 80 μL = 480 μL).
      UWAGA: Przykład: 465 ml PBS + 10 ml (0,5 M) EDTA i 25 ml roztworu BSA-Stock.
    3. Dodaj 20 μl mikrokulek CD8 na 107 komórek i ostrożnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Po inkubacji umyj komórki, dodając 2 ml buforu MACS + na 107 komórek.
    5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 000 μl buforu MACS+.
    6. Umieść dwie kolumny MS w magnesie i umieść pod nim dwie probówki wirówkowe o pojemności 15 ml.
    7. Przygotować kolumny z buforem 500 μL MACS+. Bufor przepływa przez kolumny i może być zbierany w probówkach wirówkowych znajdujących się poniżej. Ten krok można również wykonać równolegle do kroku 3.5.6.
    8. Następnie równomiernie odpipetować zawiesinę komórek do przygotowanych kolumn MS. Przepływ można zebrać w tych samych probówkach wirówkowych. Zawiera teraz wszystkie nieznakowane komórki CD8-ujemne.
    9. Przepłukać kolumny, dodając 3x 500 μl buforu MACS+. Dodaj nowy bufor na kolumnach tylko wtedy, gdy wyschną lub przestaną kapać.
    10. Oznacz końcowe zebrane komórki jako "przepływowe" lub "CD8 ujemne" i połącz je w jednej probówce wirówkowej. Można to później wykorzystać do pomiaru czystości izolacji za pomocą cytometrii przepływowej.
    11. Weź nową probówkę wirówkową o pojemności 15 ml oznaczoną jako "Limfocyty T CD8+". Kolumny są wyjmowane z magnesu i umieszczane na probówce wirówkowej.
    12. Przepłukać obie kolumny zawierające znakowane magnetycznie limfocyty T CD8-dodatnie 1,000 μl buforu MACS + każda. W związku z tym należy odpipetować bufor do kolumn i natychmiast rozpocząć ostrożne wypychanie roztworu z kolumn za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta.
      UWAGA: Zrób to dla obu kolumn, zbierając 2 ml całkowitej zawiesiny limfocytów T podczas wirowania.
    13. Policz całkowitą liczbę limfocytów T za pomocą komory liczącej Neubauera. Zalecenie: Użyć rozcieńczenia 1:4 z błękitem trypanowym.
  6. Barwienie limfocytów T za pomocą CFSE
    1. Odwirować wyizolowane limfocyty T przy 300 x g przez 5 minut.
    2. Podczas wirowania należy przygotować roztwór barwiący CFSE, mieszając 1,1 μl roztworu CFSE z 10 ml PBS. Końcowe stężenie musi wynosić 1 μM.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 000 μl PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2000 μl roztworu barwiącego CFSE (1 μM). Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Odwirować wybarwione komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 000 μl PBS.
    6. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości pożywki z limfocytów T, aby osiągnąć stężenie 1,5-2 x 106 limfocytów T w około 3-4 ml pożywki z limfocytów T.
  7. Wysiew limfocytów T do płytki 6-dołkowej
    1. Wylać roztwór powlekający z płytki 6-dołkowej.
    2. Zasiej 1,5-2 miliony izolowanych i barwionych limfocytów T w 3-4 ml pożywki z limfocytów T na dołek.
    3. Inkubować limfocyty T w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez następne 48 h
      UWAGA: Gęstość wysiewu należy zawsze regulować na poziomie 1,5 mln komórek / 3 ml. Unikaj wysiewu limfocytów T o mniejszej gęstości. Większa gęstość jest możliwa, ale musi zostać przetestowana.

4. Początek wspólnej kultury (Dzień 4)

UWAGA: Czas: 2 godziny. Po określeniu liczby komórek nowotworowych HSC4, limfocyty T dodaje się do 96-dołkowych płytek w stosunku 1:1.

  1. Pobranie jednego dołka na warunek w celu określenia reprezentatywnej liczby komórek
    1. Odrzuć supernatant ze studzienki, który został wzorowo wysiany w celu określenia liczby komórek.
    2. Najpierw umyj komórki 100 μl PBS, a następnie wyrzuć PBS.
    3. Dodaj 100 μl trypsyny i inkubuj przez 5 minut na płycie grzewczej. Następnie ponownie zawiesić i sprawdzić zawiesinę jednokomórkową pod mikroskopem; jeśli komórki się nie odłączą, dodaj kolejne 50 μl trypsyny.
    4. Jak tylko wszystkie komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając 100 μl (lub 150 μl, jeśli wcześniej dodano dodatkowe 50 μl trypsyny) pożywki D10 i ponownie zawiesij.
    5. Przenieść całą objętość 200 μl z dołka do probówki z próbką o pojemności 1,5 ml i użyć 100 μl do zmierzenia liczby komórek. Pamiętaj, aby dostosować mierzoną liczbę komórek do objętości próbki.
  2. Barwienie komórek nowotworowych HSC4 nietoksycznym fluorescencyjnym barwnikiem śledzącym komórki
    1. Przygotuj urządzenie do śledzenia komórek (patrz tabela materiałów), rozpuszczając 2 μl w 20 ml PBS (stężenie końcowe 0,1 μM według producenta).
    2. Odpipetuj pożywkę D10 ze wszystkich studzienek zawierających komórki nowotworowe i wyrzuć ją.
    3. Dodaj 200 μl roztworu do śledzenia komórek do studzienek komórek nowotworowych. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Po inkubacji wyrzucić roztwór barwiący i przemyć, dodając 100 μl PBS. Następnie należy również wyrzucić PBS.
    5. Dodać 200 μl świeżej pożywki D10.
  3. Pobieranie limfocytów T (płytka 6-dołkowa)
    1. Ostrożnie zawiesić ponownie limfocyty T w ich pożywce; większość limfocytów T znajduje się w zawiesinie i można je pobrać po prostu pipetując z dołka.
    2. Sprawdzić pod mikroskopem, czy studzienki są puste; jeśli nie, należy zebrać 1000 μl trypsyny, umieścić płytkę na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C, aż limfocyty T się odłączą, a następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 1000 μl PBS lub pożywki z limfocytów T (opcjonalnie).
    3. Policz limfocyty T za pomocą komory liczącej Neubauera. Następnie odwirować limfocyty T przy 300 x g przez 5 minut.
    4. Zawiesić limfocyty T w pożywce z limfocytów T (użyć tej samej pożywki przygotowanej w dniu izolacji limfocytów T) do końcowego stężenia 10 000 limfocytów T na 20 μl.
  4. Dodawanie limfocytów T do komórek nowotworowych HSC4 (płytka 96-dołkowa)
    1. Dodaj żądaną ilość limfocytów T do studzienek komórek nowotworowych zgodnie z wcześniej określoną liczbą komórek nowotworowych w stosunku 1:1.
    2. Utrzymuj jedną komórkę nowotworową w każdym stanie wolnym od limfocytów T jako kontrolę "tylko komórki nowotworowe". Ta kontrola "tylko komórki nowotworowej" umożliwia precyzyjne bramkowanie danych przepływu.
    3. Dodać 200 μl zawiesiny limfocytów T do pustej studzienki jako kontrolę "tylko limfocyty T" (200 000 limfocytów T). To sterowanie "tylko komórką T" umożliwia precyzyjne bramkowanie danych przepływu.
    4. Inkubacja kokultury przez 96 godzin (37 °C, 5% CO2)

5. Kwantyfikacja proliferacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej (Dzień 7)

UWAGA: Czas trwania: 3h. Po inkubacji kokultury przez kolejne 96 godzin, studzienki są zbierane i barwione przez mieszaninę przeciwciał zawierającą różne przeciwciała w zależności od hipotezy badawczej (na przykład przeciwciała anty-CD3, CD8, HLA-DR i CD25). Następnie komórki są analizowane za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej.

  1. Przygotuj i wprowadź partię probówek FACS i probówek do mikrowirówek dla każdej studzienki, która ma być zebrana.
  2. Pobieranie komórek
    1. Ponownie zawiesić komórki w ich pożywce i przenieść je do probówek FACS.
    2. Umyj komórki za pomocą 100 μl PBS, a następnie przenieś je do probówek FACS.
    3. Dodać 100 μl trypsyny do studzienek i inkubować na płycie grzewczej (37 °C) przez 5 minut.
    4. Ponownie zawieś komórki, a następnie kontroluj pod mikroskopem, czy wszystkie komórki są odłączone. Jeśli tak, przenieś trypsynowaną zawiesinę komórek do probówek FACS.
    5. Sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie studzienki są puste; jeśli nie, powtórz kroki 5.2.3-5.2.4.
  3. Zbieranie supernatantu z kokultury do dalszych eksperymentów
    1. Odwirować probówki wypełnione komórkami o masie 300 x g przez 5 minut.
    2. Ostrożnie odpipetować około 300 μl supernatantu z probówek do innej partii probówek do mikrowirówek, które mają zostać zamrożone w temperaturze -20 °C. Supernatant może być później wykorzystany do wykonania np. testów ELISA w celu ilościowego określenia wydzielanych cytokin.
  4. Barwienie komórek przeciwciałami w celu wykonania cytometrii przepływowej
    1. Przygotuj mieszaninę przeciwciał: Dodać 5 μl anty-CD3-Krome Orange, 0,5 μl anty-CD8-PerCE-Cyp5,5, 1 μl anty-HLA-DR-APCVio770, 2,5 μl anty-CD25-PE-Dazzle do 91 μl buforu PBS/FACS.
    2. Dodać 200 μl buforu FACS (PBS uzupełniony o 2% FBS i 2% EDTA) do każdej probówki i ponownie zawiesić.
    3. Ponownie odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl wcześniej przygotowanej mieszanki przeciwciał (etap 5.4.1). Inkubować przez 30-45 minut w temperaturze 4 °C w lodówce, chroniąc przed światłem.
    4. Po inkubacji odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS.
    5. Wykonać cytometrię przepływową na cytometrze zdolnym do rozróżnienia wszystkich wyżej wymienionych przeciwciał fluorescencyjnych i sygnału CSFE.

6. Strategia bramkowania i analiza danych

  1. Wykluczenie dubletów i identyfikacja prawidłowej populacji limfocytów T (Rysunek 2A).
    1. Wyklucz populację dubletów na podstawie obszaru rozproszenia przodu i boku (FSC-A vs. SSC-A) (podkoszulki).
    2. Wykreślić "singlety" do identyfikacji limfocytów T na podstawie obszaru rozproszenia do przodu i z boku (FSC-A vs. SSC-A) (limfocyty T).
      UWAGA: Aby wykluczyć najlepszy rozmiar, mierz równolegle próbki "Tylko limfocyty T" i "Tylko komórki nowotworowe" (Rysunek 2B).
    3. Wykreślić ekspresję CD3 względem SSC-A, aby rozróżnić limfocyty T. Co więcej, limfocyty T CD8-dodatnie można zidentyfikować, wykreślając sygnał CD8 w stosunku do SSC-A. Wszystkie limfocyty T to CD3 + / CD8 + (limfocyty T CD8 +) (Rysunek 2A).
    4. Wykreśl sygnał CFSE wszystkich "limfocytów T CD8 +" jako histogram.
      UWAGA: Bramkowanie subpopulacji nieproliferacyjnej (najwyższy sygnał CFSE), subpopulacji proliferacyjnej (wszystkie limfocyty T ze zredukowanym sygnałem CFSE) i subpopulacji wysoce proliferacyjnej (wszystkie limfocyty T o 4. lub mniej intensywnym szczycie CFSE).
  2. Analiza markerów powierzchniowych związanych z aktywnością w populacji limfocytów T
    1. Postępuj zgodnie z krokami bramkowania (krok 6.1) (Rysunek 3A).
    2. Opcja A: Wybierz "limfocyty T CD8 +" jako dane wejściowe i przeanalizuj je pod kątem ekspresji CD25 lub HLA-DR, wykreślając odpowiedni marker powierzchniowy fluorescencji w stosunku do charakterystyki SSC-A.
      UWAGA: Jeśli wykrywalna jest wyraźna subpopulacja o wysokiej zawartości CD25, zaleca się bramkowanie dla populacji o wysokiej zawartości CD25. To samo dotyczy bramkowania/analizy HLA-DR na limfocytach T (Rysunek 3B).
    3. Opcja B: Wybierz "limfocyty T CD8 +" jako dane wejściowe i przeanalizuj je pod kątem ekspresji CD25 lub HLA-DR, wykreślając odpowiednią fluorescencję markera powierzchniowego w stosunku do charakterystyki SSC-A.
      UWAGA: Jeśli nie jest wykrywalna żadna wyraźna subpopulacja (w zależności od analizowanego markera powierzchniowego), zaleca się analizę przesunięcia średniej intensywności fluorescencji (MFI) całej populacji limfocytów T (Rysunek 3C).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Strategia bramkowania wybarwionych CFSE, wstępnie stymulowanych limfocytów T do analizy proliferacji po 96 godzinach wspólnej hodowli z wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi HNSCC. Limfocyty T i komórki nowotworowe pobiera się 96 godzin po wspólnej hodowli z 96-dołkowej płytki, barwi za pomocą markera powierzchniowego specyficznego dla limfocytów T i mierzy za pomocą urządzenia do cytometrii przepływowej. (A) Dublety wykluczono na podstawie FSC-A / FSC-H, a limfocyty T zostały najpierw bramkowane według wielkości (FSC-A / SSC-A). Limfocyty T poddano dalszej analizie pod kątem ekspresji CD3 (anty-CD3 Krome Orange) i CD8 (anty-CD8 PerCP-Cy5.5). Limfocyty T CD3 + / CD8 + wykreślono na histogramie i przeanalizowano intensywność sygnału CFSE. Sygnał CFSE reprezentuje podgrupy limfocytów T o zróżnicowanym zachowaniu proliferacji. Limfocyty T o najwyższym sygnale CFSE zdefiniowano jako "nieproliferacyjne". Wszystkie subpopulacje wykazujące utratę sygnału CFSE, spowodowaną podziałem komórki prowadzącym do połowy sygnału, w wyraźnych pikach podsumowano jako "proliferacyjne". Limfocyty T, które dzieliły się więcej niż trzy razy (więcej niż trzy piki sygnału CSFE) zostały zdefiniowane jako "wysoce proliferacyjne". (B) Jako kontrola, próbki składające się tylko ze wstępnie stymulowanych limfocytów T i tylko wstępnie leczonych komórek nowotworowych są dodatkowo mierzone. Limfocyty T i komórki nowotworowe HSC4 można rozróżniać według wielkości za pomocą FSC-A vs. Sygnał SCC-A. Ponadto przeanalizowano niestymulowane limfocyty T CD8 + w celu sprawdzenia aktywacji limfocytów T w oparciu o kohodowlę z samymi allogenicznymi komórkami nowotworowymi. (C) Jako kontrolę, włączono inkubację niestymulowanych limfocytów T barwionych CFSE przez 96 godzin równolegle z kokulturą. (D) Niestymulowane, barwione CFSE limfocyty T były współhodowane ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. Po 96 godzinach pobrano komórki, a sygnał CFSE zmierzono przy użyciu standardowej procedury. Niestymulowane limfocyty T nie wykazywały proliferacji ani samodzielnie, ani po współhodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Strategia bramkowania ekspresji markerów powierzchniowych (CD25 i HLA-DR) związanych z aktywnością limfocytów T po 96 godzinach wspólnej hodowli z wcześniej potraktowanymi komórkami HNSCC. (A) Dublety wykluczono na podstawie ich charakterystyki FSC-A / FSC-H, a limfocyty T zostały najpierw bramkowane według wielkości (FSC-A / SSC-A). Limfocyty T poddano dalszej analizie pod kątem ekspresji CD3 (anty-CD3 Krome Orange) i CD8 (anty-CD8 PerCP-Cy5.5). Bramkowanie markerów aktywności CD25 (anty-CD25 PEDazzle594) i HLA-DR (anty-HLA-DR APC-Vio770) na powierzchni limfocytów T można przeprowadzić w dwóch różnych ustawieniach. (B) Bramkowanie wszystkich limfocytów T CD8 + dla procentuokreślonej subpopulacji owysokim poziomie CD25 lub HLA-DR na podstawie wykresów gęstości. (C) Alternatywnie przeprowadza się pomiar przesunięcia MFI całej populacji limfocytów T CD8 + dla obu markerów aktywności. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z analizy ekspresji markerów powierzchniowych limfocytów T po jednoczesnej hodowli z komórkami nowotworowymi HSC4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe HSC4 pochodzące z HNSCC zostały wysiane i inkubowane przez noc. Po 24 godzinach komórki potraktowano inhibitorem kinazy. Po 3 godzinach zastosowano pierwsze dwie dawki po 5 Gy na frakcję. Po 24 godzinach zastosowano drugą dawkę, a komórki ponownie inkubowano przez noc. Równolegle, 48 godzin przed rozpoczęciem kohodowli, limfocyty T wyizolowano z krwi zdrowego dawcy. W pierwszej kolejności PBMC wyizolowano za pomocą probówek wirujących z gradientem gęstości i sterylnego podłoża separacyjnego. PBMC zliczono za pomocą komory do zliczania komórek, a limfocyty T CD8 + wyizolowano za pomocą zestawu do izolacji limfocytów T CD8 +. Wyizolowane limfocyty T CD8 + wybarwiono następnie CFSE (1 μM), a następnie zliczono. Limfocyty T wysiewano w wstępnie powlekanych płytkach dołkowych CD3 / CD28 o gęstości 1,5 x 106 komórek / 3 ml. Po 48 godzinach stymulacji limfocyty T zostały pobrane, policzone i ponownie zawieszone w gęstości 10 000 komórek/10 μl. Dodatkowo zebrano i policzono reprezentatywne studzienki wysianych komórek nowotworowych, a pożywkę wymieniono na wszystkie pozostałe dołki. Limfocyty T dodawano do komórek nowotworowych w stosunku 1:1. Współkulturę zebrano po 96 godzinach, supernatant przechowywano w temperaturze -20 °C, a komórki wybarwiono i zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (Ryc. 1).

T limfocyty zostały zidentyfikowane przez wykluczenie rozmiaru i dodatni wynik CD3/CD8. Sygnał CFSE komórek CD3 + / CD8 + dodatnich wykazał rozmieszczenie nieproliferacyjnych limfocytów T (wysoki sygnał CFSE) i odrębne subpopulacje proliferujących limfocytów T (utrata intensywności sygnału CFSE). Proporcja proliferujących limfocytów T została przykładowo zmierzona dla linii komórkowej HSC4 HNSCC (Figura 4A). Wszystkie limfocyty T, które wykazywały co najmniej jeden podział, zostały zdefiniowane jako "proliferacyjne". Limfocyty T, które wykazywały więcej niż 3 podziały, zostały zdefiniowane jako "wysoce proliferacyjne" (Figura 4B). W przypadku HPV-ujemnej linii komórkowej HSC4 wykryto niewielki wzrost szybkości proliferacji, gdy limfocyty T były współhodowane z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi. RT i RT plus hamowanie ATR skutkowały znacznie zwiększoną sekwencyjną proliferacją limfocytów T w porównaniu z kohodowlami komórek HSC4 traktowanych RT plus ATM z limfocytami T. Jeśli chodzi o "wysoce proliferacyjną" frakcję limfocytów T, wstępne traktowanie komórek HSC4 RT oraz hamowanie ATR było najbardziej skuteczne w stymulowaniu proliferacji limfocytów T (Figura 4B).

figure-results-1
Rysunek 4: Proliferacja limfocytów T barwionych CFSE do analizy zależnych od leczenia zmian w proliferacji limfocytów T. (A) Odsetek proliferujących limfocytów T po 96 godzinach wspólnej hodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi HSC4 HPV-ujemnymi. Proliferacja limfocytów T była znacznie niższa po jednoczesnej hodowli z komórkami nowotworowymi HSC4 traktowanymi RT + ATMi w porównaniu z leczeniem RT lub RT plus ATRi. (B) RT komórek nowotworowych HSC4 indukował większą frakcję wysoce proliferujących limfocytów T (więcej niż trzy podziały komórkowe. Po kohodowli wstępnie potraktowanych komórek nowotworowych HSC4 RT + ATRi z limfocytami T, odsetek wysoce proliferacyjnych komórek T był najwyższy. Paski pokazują dane z czterech niezależnych eksperymentów z limfocytami T od czterech niezależnych, zdrowych dawców (n = 4; Średnia ± SD). (*p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001, ****p≤ 0,0001; istotność statystyczna testowana przez porównanie wszystkich warunków eksperymentalnych z każdym z nich przy użyciu dwustronnego Manna-Whitneya-U dla danych o nierozkładzie normalnym). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Utrata CFSE oparta na proliferacji może być użyta do ilościowego określenia szybkości proliferacji limfocytów T. Ponadto opisano kilka markerów powierzchniowych komórek jako związanych z aktywnością limfocytów T, takich jak CD25 i HLADR. W związku z tym przeprowadzono analizę CD25 i HLA-DR na powierzchni wszystkich limfocytów T CD3 + i CD8 + za pomocą cytometrii przepływowej (Ryc. 5). Wyrażenie można określić ilościowo, jeśli wykrywalne są wyraźne subpopulacjeo wysokim poziomie CD25 lub HLA-DR i można je rozróżnić przez bramkowanie tych wysoce dodatnich komórek (Figura 3B). Jeśli nie są wykrywalne żadne odrębne subpopulacje, można zmierzyć średnią intensywność fluorescencji (MFI) całej populacji i określić ilościowo zmiany MIF oparte na stanie (Rysunek 3C).

Przykładowo, ekspresja zidentyfikowana przez MFI CD25 i HLA-DR została przeanalizowana po 96 godzinach wspólnej hodowli z wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi HSC4 (Rysunek 5). Po kohodowli limfocytów T z komórkami nowotworowymi HSC4 traktowanymi RT, ekspresja CD25 na limfocytach T była silnie obniżona. Warto zauważyć, że wstępne leczenie komórek nowotworowych tylko ATMi spowodowało znacznie zmniejszoną ekspresję CD25 w porównaniu ze wstępnym leczeniem ATRi. W połączeniu z RT, mimo że RT powodowało zmniejszoną ekspresję CD25 na limfocytach T, połączenie RT z ATMi spowodowało zwiększoną ekspresję CD25 w porównaniu z RT plus ATRi (Figura 5A). Jeśli chodzi o ekspresję HLA-DR na limfocytach T, RT generalnie prowadziła do regulacji w górę HLA-DR, ale znowu, w połączeniu z ATMi lub ATRi, zaobserwowano inne zachowanie (Figura 5B). Limfocyty T hodowane jednocześnie z komórkami HSC4, które zostały wstępnie potraktowane kombinacją RT + ATRi, zwiększyły ekspresję HLA-DR w porównaniu z samym RT lub RT + ATMi.

figure-results-2
Rysunek 5: Ekspresja markerów aktywacji CD25 i HLA-DR na powierzchni limfocytów T po 96 godzinach kohodowli z wcześniej potraktowanymi komórkami nowotworowymi HSC4. Ekspresję CD25 i HLA-DR analizowano na podstawie przesunięcia MFI całej populacji limfocytów T. RT HSC4 powodował zmniejszoną ekspresję CD25 na limfocytach T i zwiększoną ekspresję HLA-DR. Połączenie RT z ATMi skutkowało znacząco różnymi wzorcami ekspresji w porównaniu z RT i ATRi. Wykresy pudełkowe pokazują dane z czterech niezależnych eksperymentów z limfocytami T od czterech niezależnych, zdrowych dawców (n = 4; Średnia ± SD). Dane analizowano poprzez porównanie wszystkich warunków eksperymentalnych względem siebie za pomocą dwustronnego testu Manna-Whitneya-U dla danych o nierozkładzie normalnym (*p≤ 0,050). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Te dane przykładowo wskazują, że leczenie komórek nowotworowych, w tym przypadku komórek HSC4 HNSCC, wpływa na immunogenność komórek nowotworowych. Można to monitorować poprzez kohodowlę komórek nowotworowych ze wstępnie stymulowanymi limfocytami T, co prowadzi do zróżnicowanych zachowań proliferacyjnych i ekspresji markerów aktywacji na ludzkich limfocytach T w oparciu o zastosowany schemat leczenia komórek nowotworowych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół oferuje szybką i łatwą metodę analizy zdolności proliferacyjnych limfocytów T wraz z ich statusem aktywacji w warunkach kohodowli ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. W ten sposób można łatwo badać wpływ różnych metod leczenia, takich jak RT, CT lub TT, na aktywność i proliferację limfocytów T, budując podstawy do dalszych głębszych analiz immunologicznych obiecujących podejść. Reprezentatywne wyniki przedstawione w tym manuskrypcie dowodzą, że ten allogeniczny test kohodowli limfocytów T działa dobrze. Znaczące różnice w proliferacji limfocytów T, a także w aktywności limfocytów T, zaobserwowano w przypadku kohodowli z inaczej traktowanymi ludzkimi komórkami HSC4 (HNSCC) (Figura 4 i Figura 5). Stwierdzono, że leczenie HSC4 samą RT lub w połączeniu z TT spowodowało zwiększoną proliferację limfocytów T, w szczególności w odniesieniu do wysoce proliferacyjnej frakcji limfocytów T (ryc. 4). Zgodnie z ilościowym określeniem szybkości proliferacji, na stan aktywacji limfocytów T również w różny sposób wpływały różne schematy leczenia. Podsumowując, zastosowanie RT spowodowało silną regulację w dół ekspresji CD25 na limfocytach T, podczas gdy ekspresja HLA-DR była regulowana w górę. RT indukuje uszkodzenia DNA w napromieniowanych komórkach nowotworowych, co z kolei prowadzi do komórkowych reakcji na stres, które obejmują uwalnianie cząsteczek i cytokin związanych ze stresem i uszkodzeniem, a także ekspresję modulujących immunologicznie ligandów powierzchniowych komórek19.

Połączenie RT z TT w postaci inhibitorów naprawy DNA dodatkowo wzmacnia i utrzymuje te efekty, ponieważ komórki nowotworowe nie są w stanie skutecznie naprawić uszkodzeń DNA wywołanych przez RT. Może to dodatkowo promować i utrzymywać wydzielanie czynników immunogennych i ekspresję immunogennych ligandów powierzchniowychkomórek 20. W związku z tym wykazaliśmy wcześniej, że leczenie komórek nowotworowych (HNSCC) inhibitorami RT i uszkodzeń DNA zmienia fenotyp immunologiczny na powierzchni komórki nowotworowej. Modulacja fenotypu immunologicznego obejmowała regulację cząsteczki stymulującej układ odpornościowy ICOS-L, a także cząsteczki immunosupresyjnej PD-L111. W odpowiedzi na tę modulację fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych, limfocyty T mogą również regulować ekspresję markerów aktywacji na powierzchni komórki. Co więcej, RT jest dobrze znany z tego, że stymuluje uwalnianie cytokin prozapalnych, takich jak IFNγ lub IL-6, które z kolei wpływają na proliferację i aktywność limfocytów T21. Ekspresja markerów aktywacji na limfocytach T jest procesem bardzo dynamicznym. Dane z Zimmerman i wsp.22 wykazały, że CD25 ulega wysokiej ekspresji 24 godziny po stymulacji, ale jest ponownie obniżony po 96 godzinach po stymulacji. Jest to zgodne z naszymi ustaleniami. Natomiast HLA-DR jest markerem aktywacji późnej fazy i jest na ogół poprzedzony wzrostem CD25 i CD6923. Zauważalnie połączenie RT + ATRi prowadzi do znacznej regulacji w górę HLA-DR na limfocytach T w porównaniu z RT + ATMi. Odkrycie to jest zgodne z pracami Dilliona i wsp., którzy wykazali synergistyczne działanie ATRi + RT w indukowaniu stanu zapalnego TME24. Mniej wyraźną modulację aktywności i proliferacji limfocytów T osiągnięto dzięki leczeniu komórek nowotworowych samymi inhibitorami kinazy (ryc. 5). Może to wynikać z faktu, że inhibitory naprawy DNA ATMi i ATRi działają jako wzmacniacz uszkodzeń DNA wywołanych przez RT i w związku z tym nie są bardzo immunogenne, gdy są stosowane w monoterapii. Wykazaliśmy już minimalną toksyczność ATMi lub samego ATRi11. Podsumowując, wyniki potwierdzają potencjał immunogenny RT (i TT z inhibitorami uszkodzeń DNA) i dodatkowo wskazują, że ten eksperymentalny system jest odpowiedni do badań przesiewowych zdolności immunostymulacyjnych różnych metod leczenia w ludzkich komórkach raka głowy i szyi.

Mimo że przedstawiona tutaj metoda jest łatwa i solidna, w protokole należy wcześniej rozważyć kilka krytycznych kroków. Konieczna jest obecność wysokich stężeń EDTA podczas procesu izolacji, a także podczas analizy cytometrycznej przepływowej limfocytów T. Dlatego zaleca się pobranie krwi dawcy do probówek pobranych pokrytych EDTA i użycie buforu MACS uzupełnionego 10 mM EDTA w celu zapewnienia skutecznej izolacji limfocytów T i wytworzenia jednorodnej zawiesiny pojedynczej komórki do oceny cytometrii przepływowej. Ponadto skład pożywki limfocytów T ma duże znaczenie dla zdolności proliferacyjnej limfocytów T. Po przetestowaniu różnych składów pożywek hodowlanych, pożywka o niskich stężeniach L-argininy i L-lizyny daje najlepszy sygnał proliferacji limfocytów T, ponieważ L-arginina ma kluczowe znaczenie dla metabolizmu i przeżycia komórek T i powinna być dostarczana w odpowiednim stężeniu25,26. Należy jednak pamiętać, że roztwory L-argininy i L-lizyny nie są stabilne przez długi czas i dlatego należy je zużyć w ciągu 3 miesięcy. Aby uzyskać optymalną stymulację, pożywka z limfocytów T uzupełniona aminokwasami musi być przygotowywana na świeżo do każdego eksperymentu z hodowlą limfocytów T. Co więcej, liczba komórek limfocytów T, a także komórek nowotworowych, są krytycznymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, ponieważ wpływają one na odczyt eksperymentu.

W przypadku komórek nowotworowych, z jednej strony, pożądana jest zbieżność komórek od 70% do 80% pod koniec eksperymentu z kokulturą. Przerost komórek nowotworowych może powodować wydzielanie czynników, które hamują wzrost komórek, a następnie wpływa również na tempo proliferacji limfocytów T. Ponieważ wzrost komórek nowotworowych jest w dużym stopniu zależny od pojedynczej linii komórkowej, zalecamy dokładne przetestowanie zachowania wzrostu odpowiedniej linii komórek nowotworowych w różnych płytkach dołkowych i dla różnych schematów leczenia. Ponadto komórki nowotworowe i limfocyty T powinny być hodowane wspólnie w stosunku 1:1. W związku z tym obowiązkowe jest wysiewanie dodatkowej studzienki komórek nowotworowych dla każdego warunku leczenia, która może być wykorzystana do określenia liczby komórek w dniu rozpoczęcia kohodowli. W ten sposób można zapewnić, że odpowiednia liczba limfocytów T zostanie wysiana dla różnych warunków leczenia. Jeśli chodzi o liczbę komórek limfocytów T, należy wziąć pod uwagę, że ilość limfocytów T, które można wyizolować od zdrowego dawcy, jest bardzo indywidualna. Limfocyty T stanowią około 45% do 70% PBMC zdrowego dawcy27. W związku z tym wymagana ilość limfocytów T powinna być już ogólnie oszacowana w momencie pobrania krwi. Ponadto gęstość limfocytów T jest ważna dla skuteczności aktywacji limfocytów T i ich przeżycia. W związku z tym limfocyty T należy wysiać w stężeniu co najmniej 1,5 miliona komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki w 3 ml pożywki z komórek T w celu wstępnej stymulacji przed rozpoczęciem kohodowli. Możliwa jest wyższa gęstość limfocytów T, ale należy unikać mniejszej gęstości. Aktywację limfocytów T można również ocenić morfologicznie pod mikroskopem, ponieważ aktywowane limfocyty T mają tendencję do tworzenia klastrów komórek.

Ponieważ metoda ta jest uproszczonym systemem eksperymentalnym do badania zdolności immunostymulacyjnych różnych linii komórek nowotworowych i metod leczenia, ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, test ten opiera się na systemie allogenicznym, co oznacza, że limfocyty T dawcy nie są dopasowane do HLA z odpowiednią linią komórek nowotworowych. Tak więc to niedopasowanie HLA może już indukować stymulację limfocytów T, a następnie proliferację limfocytów T bez dalszej stymulacji ze strony leczenia komórkami nowotworowymi28. Aby określić ilościowo ten niepożądany efekt, wyizolowane limfocyty T hodowano wspólnie z linią komórkową HSC4 bez wcześniejszej stymulacji przeciwciałami CD28 i CD3. Stwierdzono, że w tym otoczeniu prawie nie indukowano proliferacji, co wskazuje, że niedopasowanie HLA ma tylko niewielki wpływ na aktywację limfocytów T w tym konkretnym środowisku eksperymentalnym. Poza tym stwierdzono istotne różnice w proliferacji i aktywacji limfocytów T w oparciu o leczenie komórkami nowotworowymi pomimo ustawienia allogenicznego. Niemniej jednak, w celu ustanowienia tego testu, potencjalna proliferacja limfocytów T indukowana przez allogeny powinna zostać przetestowana i określona ilościowo raz na początku doświadczeń. Zalecane kontrole "tylko limfocyty T" i "tylko komórki nowotworowe" są potrzebne do wystarczającego bramkowania i są obowiązkowe w każdej powtórzeniu eksperymentów. Niemniej jednak należy pamiętać, że allogeniczny system kohodowli nie rozpoznaje antygenu specyficznego dla nowotworu. W związku z tym system ten może nie odzwierciedlać dokładnie specyficznej odpowiedzi przeciwnowotworowej, tak jak miałoby to miejsce in vivo u pacjentów29,30. W celu dalszej poprawy bardziej wyrafinowanym otoczeniem byłoby autologiczne podejście oparte na współkulturze. W tym ustawieniu biopsje guza pochodzące od pacjenta muszą być hodowane i wprowadzane do hodowli z limfocytami T wyizolowanymi z krwi obwodowej tego samego pacjenta28. To eksperymentalne podejście może być jednak wyzwaniem nie tylko pod względem hodowli pierwotnych komórek nowotworowych, ale także pod względem dostępności biomateriału pochodzącego od pacjenta. Kolejnym ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest stosunek komórek nowotworowych do limfocytów T w kohodowli. Ponieważ zalecany stosunek komórek wynosi 1:1, stosunek ten nie odzwierciedla fizjologicznej sytuacji TME u pacjentów31. Należy jednak zaakceptować to ograniczenie, ponieważ przy niższej liczbie limfocytów T zmiany w szybkości proliferacji i statusie aktywacji nie są mierzalne.

W dziedzinie immunologii nowotworów test ten daje możliwość przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem immunogenności różnych metod leczenia w łatwym i szybkim eksperymentalnym warunkach in vitro . W związku z tym można zaoszczędzić czas nie tylko poprzez wstępne badania przesiewowe najbardziej obiecujących metod pod względem immunogenności, ale także poprzez eksperymenty in vivo . Modele zwierzęce można ograniczyć, ponieważ tylko obiecujące schematy leczenia mogą być dalej realizowane w modelach zwierzęcych, aby odzwierciedlić układ odpornościowy jako całość w organizmie. Ponadto, ponieważ test ten opiera się na ludzkich komórkach pierwotnych i ludzkich liniach komórek rakowych, wyniki mogą być bardziej przekładalne na praktykę kliniczną niż testy oparte na innych systemach modelowych i gatunkach.

W przyszłości test ten może być modulowany i dostosowywany, aby odpowiadał na bardziej szczegółowe pytania badawcze. Na przykład, można uwzględnić leczenie limfocytami T, aby odzwierciedlić scenariusz leczenia, który jest bliższy sytuacji u pacjentów. Ponieważ limfocyty T reagujące z nowotworem znajdują się głównie w TME, są one w równym stopniu dotknięte terapiami miejscowymi, takimi jak RT, i prawdopodobnie są również dotknięte terapiami ogólnoustrojowymi, takimi jak CT lub TT32. Kolejnym ulepszeniem testu jest współhodowla limfocytów T ze sferoidami guza z linii komórek nowotworowych, a nawet współhodowla z organoidami nowotworowymi pochodzącymi od pacjenta. Te trójwymiarowe hodowle są bardziej porównywalne ze strukturą guza u pacjenta28. Wreszcie, również odczyt eksperymentu za pomocą cytometrii przepływowej może być łatwo dostosowany w celu zbadania dalszych cząsteczek na powierzchni limfocytów T lub poprzez analizę ekspresji cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego na komórkach nowotworowych. Oprócz określenia fenotypu immunologicznego limfocytów T, można wykorzystać supernatanty z hodowli komórkowych z eksperymentów z kokulturą do ilościowego określenia wydzielanych cytokin lub chemokin, aby uzyskać więcej informacji na temat aktywności limfocytów T. Podsumowując, protokół ten zapewnia kompleksowy, solidny i łatwy test kohodowli limfocytów T i komórek nowotworowych, który umożliwia badania przesiewowe pod kątem immunogenności różnych metod leczenia raka. Ponieważ test ten można dostosować do określonych pytań badawczych, doskonale nadaje się do zastosowania w szerokiej dziedzinie immunologii nowotworów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych w Erlangen (IZKF Erlangen) oraz Bayerisches Zentrum für Krebsforschung (BZKF).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki Cellstar 15 mlGreiner Bio-One GmbH188271
Probówki Cellstar 50 mlGreiner Bio-One GmbH227261
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych sterylna, z pokrywkąGreiner Bio-One GmbH657160
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej sterylna, z dnem F, z pokrywkąGreiner Bio-One GmbH655180
AZD0156Selleck Chemicals GmbHS8375
Berzosertib (VE-822)Selleck Chemicals GmbHS7102
CASYcupsOMNI Life Science GmbH & Co KG 
CASYtonOMNI Life Science GmbH & Co KG 
CD25a, PE-Dazzle594, Mysz IgG1Biolegend356126
CD28-UNLBBeckmann Coulter, Inc.IM1376
CD3a, Krome Pomarańczowy, Mysz IgG1Beckmann Coulter, Inc.B00068
Przeciwciało monoklonalne CD3eThermo-Fisher Scientific, Inc.MA1-10176
CD4, APC, Mysi anty-ludzki mysz IgG1BD Pharmingen555349
CD8 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec, Inc.130-045-201
CD8a, PerCP-Cy5.5, Mysz IgG1Biolegend300924
CellTracker Ciemnoczerwony barwnikThermo Fisher Scientific, Inc.C34565
CFSE  Merck KGaA (Sigma-Aldrich)21888
DMEM (Dulbecco´ s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s Medium)PAN-Biotech GmbHP04-02500
Cytometr przepływowy DxFlex (z automatyczną ładowarką)Beckmann Coulter, Inc.C44326, C02846
Sól disodowa EDTA dwuwodnaCarl Roth GmbH + Co. KG8043.2
FBS superior   Merck KGaA (Sigma-Aldrich)S0615-500ML
FBS superior   Merck KGaA (Sigma-Aldrich) S0615-100MLDo produkcji FBS inaktywowanego termicznie. Podgrzewać przez 30 min w temperaturze 56 stopni; C z mieszaniem w celu inaktywacji białek dopełniacza.
Graph Pad Prism (wersja numer 9)Oprogramowanie GraphPad-HLA-DR
, DP, DQ Przeciwciało, anty-ludzkie, APC-Vio770Miltenyi Biotec, Inc.130-123-550
Kaluza (numer wersji 2.1)Beckmann Coulter, Inc.-
L-argininaMerck KGaA (Sigma-Aldrich)A8094-25G
Monochlorowodorek L-lizynyMerck KGaA (Sigma-Aldrich)L5626-100G
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec, Inc.130-091-376
Kolumny MSMiltenyi Biotec, Inc.130-042-201
Ulepszona komora licząca NeubauerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG 640010
PBSMerck KGaA (Sigma-Aldrich)D8537-500mL
Penicylina-StreptomycynaThermo-Fisher Scientific, Inc.1514-122
ROTISep 1077Carl Roth GmbH + Co. KG0642.2
RPMI-1640 MediumMerck KGaA (Sigma-Aldrich)R1790
SepMate 50mL probówkiStemcell Technologies85450
Trypan niebieskiMerck KGaA (Sigma-Aldrich)T6146-25G
TrypsinThermo-Fisher Scientific, Inc.
5651794565180815400054

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. Systemic immunity in cancer. Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).
  2. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  3. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From t cell basic science to clinical practice. Nat Rev Immunol. 20 (11), 651-668 (2020).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).
  5. Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. New insights into cancer immunoediting and its three component phases--elimination, equilibrium and escape. Curr Opin Immunol. 27, 6-25 (2014).
  6. Irianto, T., Gaipl, U. S., Ruckert, M. Immune modulation during anti-cancer radio(immuno)therapy. Int Rev Cell Mol Biol. 382, 239-277 (2024).
  7. Burtness, B., et al. Pembrolizumab alone or with chemotherapy versus cetuximab with chemotherapy for recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (keynote-048): A randomized, open-label, phase 3 study. Lancet. 394 (10212), 1915-1928 (2019).
  8. Hecht, M., et al. Safety and efficacy of single cycle induction treatment with cisplatin/docetaxel/ durvalumab/tremelimumab in locally advanced HNSCC: First results of checkered-CD8. J Immunother Cancer. 8 (2), e001378(2020).
  9. Chen, J. A., Ma, W., Yuan, J., Li, T. Translational biomarkers and rationale strategies to overcome resistance to immune checkpoint inhibitors in solid tumors. Cancer Treat Res. 180, 251-279 (2020).
  10. Solomon, B., Young, R. J., Rischin, D. Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments. Semin Cancer Biol. 52 (Pt 2), 228-240 (2018).
  11. Meidenbauer, J., et al. Inhibition of atm or atr in combination with hypo-fractionated radiotherapy leads to a different immunophenotype on transcript and protein level in HNSCC. Front Oncol. 14, 1460150(2024).
  12. Kumari, S., et al. Immunomodulatory effects of radiotherapy. Int J Mol Sci. 21 (21), 8151(2020).
  13. Wimmer, S., et al. Hypofractionated radiotherapy upregulates several immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma cells independently of the HPV status while icos-l is upregulated only on HPV-positive cells. Int J Mol Sci. 22 (17), 9114(2021).
  14. Derer, A., et al. Chemoradiation increases pd-l1 expression in certain melanoma and glioblastoma cells. Front Immunol. 7, 610(2016).
  15. Schatz, J., et al. Normofractionated irradiation and not temozolomide modulates the immunogenic and oncogenic phenotype of human glioblastoma cell lines. Strahlenther Onkol. 199 (12), 1140-1151 (2023).
  16. Xu, M. M., Pu, Y., Zhang, Y., Fu, Y. X. The role of adaptive immunity in the efficacy of targeted cancer therapies. Trends Immunol. 37 (2), 141-153 (2016).
  17. Olivo Pimentel, V., Yaromina, A., Marcus, D., Dubois, L. J., Lambin, P. A novel co-culture assay to assess anti-tumor cd8(+) t cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flow cytometry. J Immunol Methods. 487, 112899(2020).
  18. Kulp, M., Diehl, L., Bonig, H., Marschalek, R. Co-culture of primary human t cells with leukemia cells to measure regulatory t cell expansion. STAR Protoc. 3 (3), 101661(2022).
  19. Ruckert, M., et al. Immune modulatory effects of radiotherapy as basis for well-reasoned radioimmunotherapies. Strahlenther Onkol. 194 (6), 509-519 (2018).
  20. Samstein, R. M., Riaz, N. The DNA damage response in immunotherapy and radiation. Adv Radiat Oncol. 3 (4), 527-533 (2018).
  21. Meeren, A. V., Bertho, J. M., Vandamme, M., Gaugler, M. H. Ionizing radiation enhances il-6 and il-8 production by human endothelial cells. Mediators Inflamm. 6 (3), 185-193 (1997).
  22. Zimmerman, M., et al. Ifn-gamma upregulates survivin and ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells. PLoS One. 5 (11), e14076(2010).
  23. Saraiva, D. P., et al. Expression of HLA-dr in cytotoxic t lymphocytes: A validated predictive biomarker and a potential therapeutic strategy in breast cancer. Cancers (Basel). 13 (15), (2021).
  24. Dillon, M. T., et al. Atr inhibition potentiates the radiation-induced inflammatory tumor microenvironment. Clin Cancer Res. 25 (11), 3392-3403 (2019).
  25. Geiger, R., et al. L-Arginine modulates T cell metabolism and enhances survival and anti-tumor activity. Cell. 167 (3), 829-842.e13 (2016).
  26. Rodriguez, P. C., Quiceno, D. G., Ochoa, A. C. L-Arginine availability regulates t-lymphocyte cell-cycle progression. Blood. 109 (4), 1568-1573 (2007).
  27. Lozano-Ojalvo, D., López-Fandiño, R., López-Expósito, I., et al. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. Cham. 169-180 (2015).
  28. Gronholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  29. Perez, C., Gruber, I., Arber, C. Off-the-shelf allogeneic t cell therapies for cancer: Opportunities and challenges using naturally occurring "universal" donor t cells. Front Immunol. 11, 583716(2020).
  30. Martinez Bedoya, D., Dutoit, D., Migliorini, D. Allogeneic car t cells: An alternative to overcome challenges of car t cell therapy in glioblastoma. Front Immunol. 12, 640082(2021).
  31. Schnellhardt, S., et al. The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density. Front Immunol. 13, 781222(2022).
  32. Zitvogel, L., Kroemer, G. Oncoimmunology: A practical guide for cancer immunotherapy. , Springer International Publishing. Cham. 23-39 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wst pna obr bka kom rek nowotworowychcytotoksyczne limfocyty Tcytometria przep ywowalimfocyty T CD8barwienie CFSEinhibitory kinazradioterapiamikro rodowisko guza

Powiązane artykuły