Artykuł metodologiczny

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67643

⸱

7 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Radiobiology, Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2Comprehensive Cancer Center Erlangen-EMN, 3Bayerischerisches Zentrum für Krebsforschung, 4Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Streszczenie

Cytotoksyczne limfocyty T odgrywają kluczową rolę w eliminacji komórek nowotworowych i dlatego są intensywnie badane w immunologii nowotworów. Częstość i aktywność cytotoksycznych limfocytów T w obrębie guzów i ich mikrośrodowiska guza (TME) są obecnie dobrze znanymi biomarkerami prognostycznymi i predykcyjnymi dla wielu typów nowotworów. Jednak dobrze wiadomo, że różne metody leczenia nowotworów, w tym radioterapia, chemioterapia, immunoterapia i terapia celowana, modulują nie tylko immunogenność guza, ale także sam układ odpornościowy. W związku z tym interakcja między komórkami nowotworowymi a limfocytami T wymaga bardziej intensywnych badań w różnych kontekstach terapeutycznych, aby w pełni zrozumieć złożoną rolę limfocytów T podczas terapii nowotworów. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowano protokół do analizy aktywności i zdolności proliferacyjnej ludzkich cytotoksycznych (CD8+) limfocytów T w kohodowli ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. W szczególności limfocyty T CD8 + od zdrowych dawców są barwione nietoksycznym markerem proliferacji estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE) i stymulowane za pomocą płytek pokrytych CD3 / CD28. Następnie limfocyty T są hodowane wspólnie z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi. Jako odczyt, proliferacja limfocytów T jest określana ilościowo poprzez pomiar rozkładu sygnału CFSE i ocenę ekspresji markerów aktywacji powierzchniowej za pomocą cytometrii przepływowej. Można to dodatkowo uzupełnić poprzez ilościowe określenie uwalniania cytokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Metoda ta ułatwia ocenę wywołanych leczeniem zmian w interakcji między komórkami nowotworowymi a limfocytami T, stanowiąc podstawę do bardziej szczegółowych analiz metod leczenia nowotworów i ich immunogenności w warunkach ex vivo u ludzi. Dodatkowo przyczynia się do zmniejszenia liczby przedklinicznych analiz in vivo.

Wprowadzenie

Obecnie staje się coraz bardziej oczywiste, że wzrost i postęp nowotworów są silnie zależne od skutecznej manipulacji i tłumienia układu odpornościowego gospodarza. Przekształcone komórki pojawiają się każdego dnia, nawet w zdrowym organizmie. Jednak powstawanie makroskopowych guzów jest raczej rzadkim zjawiskiem, ponieważ powstające przekształcone komórki są usuwane z organizmu z dużą wydajnością. Do usuwania komórek nowotworowych wkraczają różne typy komórek odpornościowych, takie jak cytotoksyczne limfocyty T, limfocyty T NK (NK), komórki NK lub makrofagi1,2,3. Niemniej jednak czasami mogą pojawić się przekształcone klony komórek, które przetrwają w stanie równowagi z układem odpornościowym gospodarza, który charakteryzuje się różnymi strategiami immunosupresyjnymi klonu komórek nowotworowych4. W końcu niektóre przekształcone komórki nabywają dalsze funkcje, które umożliwiają komórkom nowotworowym aktywne tłumienie odpowiedzi immunologicznej, co w konsekwencji prowadzi do wyrostka guza. Ta immunosupresja jest pośredniczona przez liczne mechanizmy, które obejmują ekspresję ligandów immunosupresyjnych na komórkach nowotworowych lub aktywną rekrutację lub pobudzanie immunoregulacyjnych lub immunosupresyjnych populacji komórek odpornościowych. Ta tak zwana koncepcja edycji immunologicznej pokazuje kluczową rolę modulacji immunologicznej podczas tworzenia i wzrostu nowotworu5.

Nie jest więc zaskakujące, że układ odpornościowy jest obecnie głównym celem nie tylko w terapii raka, ale także jako czynnik predykcyjny i prognostyczny w wielu jednostkach nowotworowych i warunkach terapeutycznych. W ciągu ostatnich lat inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI) okazały się obiecującymi opcjami terapeutycznymi w różnych jednostkach raka litego, takich jak rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) lub niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) w celu modulacji mikrośrodowiska guza (TME) w kierunku bardziej efektywnej przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej i zmniejszonej immunosupresji komórek nowotworowych6. Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych mają na celu zwiększenie zabijania komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T poprzez celowanie w cząsteczki immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak cząsteczki białka programowanej śmierci 1 (PD-1) i jego oś liganda 1 (PD1 / PD-L1). Fakt ten podkreśla kluczową rolę limfocytów T w odporności przeciwnowotworowej. Na przykład w HNSCC ICI zostały z powodzeniem zatwierdzone jako terapia pierwszego rzutu w nawrotach i przerzutach HNSCC7. W związku z tym obecność cytotoksycznych limfocytów T w TME, a także ekspresja PD1 i PD-L1 na komórkach nowotworowych i limfocytach T, mogą służyć jako biomarkery predykcyjne w HNSCC8,9,10.

Mimo że limfocyty T odgrywają kluczową rolę w immunologii nowotworów i terapii nowotworów, wiele otwartych pytań dotyczących ich interakcji z nowotworem nadal wymaga rozwiązania. Obecnie dobrze wiadomo, że odpowiedź immunologiczna guza jest procesem dynamicznym i że immunogenność nowotworów może się zmieniać w trakcie trwania choroby i leczenia. Różne metody leczenia, takie jak chemioterapia (CT), radioterapia (RT) lub terapia celowana (TT), są szczególnie znane z modulowania fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych. RT może napędzać regulację w górę cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego w tkance nowotworowej i zmieniać częstotliwość komórek naciekających nowotwór11,12. Z drugiej strony TT może również popierać korzystne zmiany w obrębie guza i TME poprzez bezpośrednią modulację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej13,14,15,16. Jednak modulacje te są trudne do zbadania u pacjentów, ponieważ wymagałoby to powtarzalnego badania tkanki nowotworowej w trakcie leczenia. W związku z tym potrzebne są rozstrzygające eksperymentalne systemy modelowe do badania dynamicznego fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych i limfocytów T oraz, co ważniejsze, ich interakcji.

Stąd, w celu analizy aktywności komórek T i interakcji komórek nowotworowych i limfocytów T, potrzebny jest kompleksowy test kohodowli ex vivo, który jest łatwy do wdrożenia w każdym laboratorium w oparciu o proste prace hodowlane i powszechnie stosowane analizy cytometrii przepływowej. Na podstawie istniejącego i dostępnego piśmiennictwa nie opublikowano dotychczas łatwego w użyciu i powszechnie stosowanego protokołu dotyczącego kohodowli limfocytów T i komórek nowotworowych. Mimo że ostatnio opublikowano kilka testów kohodowlanych dla limfocytów T i organoidów nowotworowych, technika hodowli komórkowych 3D nadal nie jest wdrażana jako standardowa technika w każdym laboratorium. W związku z tym udostępniamy protokół do stosowania w hodowli komórkowej 2D, który równie dobrze może zostać ustanowiony dla hodowli komórek 3D w przyszłości. Inne protokoły kohodowli 2D są często bardziej złożone, ponieważ wymagają na przykład transdukcji komórek nowotworowych za pomocą lucyferazy17 lub są odpowiednie tylko dla nowotworów hematologicznych (kokultura niedopasowanych limfocytów T z komórkami białaczkowymi)18. W opisanym tutaj teście limfocyty T od normalnych zdrowych dawców są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Następnie limfocyty T są hodowane wspólnie z (wstępnie) leczonymi komórkami nowotworowymi w celu analizy zdolności proliferacyjnej limfocytów T, a także ich aktywności za pomocą cytometrii przepływowej. W ten sposób wpływ różnych metod leczenia na fenotyp immunologiczny komórek nowotworowych, takich jak RT, CT lub TT, co z kolei wpływa na aktywność i proliferację limfocytów T, można łatwo przebadać i wykorzystać jako podstawę do głębszych analiz mechanistycznych i kolejnych wybranych analiz przedklinicznych in vivo. Opisany tutaj test oferuje łatwą w użyciu konfigurację, ponieważ nie są potrzebne żadne niekonwencjonalne urządzenia, techniki ani materiały. Ponadto test można łatwo dostosować do różnych linii komórek nowotworowych lub określonych podzbiorów limfocytów T (np. Limfocyty T CD4 +). Dzięki tej technice uzyskuje się wysoką standaryzację i powtarzalność.

Protokół

Analiza ta obejmuje pobieranie krwi oraz hodowlę pierwotnych komórek ludzkich. W związku z tym dla tych analiz wymagana jest zgoda komisji etycznej. Wszystkie wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie są objęte zatwierdzeniem etycznym badania IMMO-NHD, a od wszystkich dawców uzyskano pisemną świadomą zgodę. Zgoda została udzielona przez instytucjonalną komisję rewizyjną Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg w dniu 9 listopada 2022 r. (numer wniosku 21-415-B). Komórki nowotworowe HSC4 wykorzystane w tej badaniu pochodzą z dostępnej komercyjnie linii komórkowej.

Ten test egzemplifikuje wszystkie etapy analizy kokultury limfocytów T i komórek nowotworowych, z wykorzystaniem linii komórkowej raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) HSC4 w schemacie leczenia obejmującym radioterapię (RT) oraz dwa specyficzne inhibitory kinaz. W związku z tym parametry takie jak liczba komórek, czasy trypsynizacji i schematy leczenia są specyficzne dla tej konfiguracji kokultury i powinny zostać dostosowane do innych linii komórek nowotworowych (patrz również sekcja Dyskusja). Wszystkie etapy wirowania przeprowadzono w temperaturze pokojowej. W niniejszym badaniu inhibitory kinaz AZD0156 i VE-822 zostały użyte w celu ukierunkowania na system naprawy uszkodzeń DNA (DDR) komórek HSC4. AZD0156 (Selleckchem) hamuje białko ATM (ataxia telangiectasia mutated), natomiast VE-822 (Selleckchem) celuje w białko ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related). Oba inhibitory były omawiane jako potencjalne środki zwiększające radiowrażliwość komórek nowotworowych. Są one rozpuszczone w dimetylosulfozydzie (DMSO) i przechowywane w temperaturze -20 °C. Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy analizy ex vivo, szczegółowo opisujący kokulturę wcześniej potraktowanych komórek nowotworowych z ludzkimi limfocytami T CD8+ stymulowanymi CD3/CD28. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli Materiałów.

Schemat kokultury komórek nowotworowych z radioterapią/chemioterapią; obejmuje etapy analizy FACS i ELISA.
Rycina 1: Schemat blokowy badania ex vivo poddanych wstępnej obróbce komórek nowotworowych w kokulturze z ludzkimi limfocytami T CD8+ stymulowanymi (CD3/CD28). Dzień 1: Wysiew komórek nowotworowych HSC4. Dzień 2: Obróbka komórek nowotworowych oraz izolacja, barwienie CFSE i wysiew ludzkich limfocytów T CD8+ na płytki pokryte przeciwciałami anty-CD3/CD28. Dzień 3: Obróbka komórek nowotworowych. Dzień 4: Policzanie komórek nowotworowych w reprezentatywnych studniach. Zbiór i policzanie wszystkich limfocytów T. Kokultywacja limfocytów T i komórek nowotworowych HSC4 w stosunku 1:1. Dzień 5–Dzień 8: Inkubacja kokultury. Dzień 8: Zbiór kokultury, zamrażanie supernatantów, barwienie przeciwciałami i analiza komórek metodą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Wysiewanie komórek nowotworowych (Dzień 1)

UWAGA: Czas trwania: 1 h. Ludzkie komórki nowotworowe HSC4 są przesiewane z butelek hodowlanych T75 do płytek 96-dołkowych.

  1. Odlać supernatant (pożywka D10) z butelki z hodowlą komórek.
  2. Przemyć komórki nowotworowe 5 mL podgrzanego do 37 °C PBS. Odlać PBS.
  3. Ponieważ komórki nowotworowe HSC4 mają tendencję do silnego przylegania do kolbek hodowlanych, zaleca się dwustopniową trypsynizację, aby zapewnić odczepienie wszystkich komórek. W tym celu dodać 3 mL trypsyny i umieścić butelkę na płycie grzejnej w temperaturze 37 °C przez 3 min, a następnie odessać trypsynę pipetą.
  4. Dodać kolejne 3 mL trypsyny, umieścić butelkę na płycie grzejnej i czekać do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Sprawdzić pod mikroskopem, czy uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek.
  5. Zatrzymać działanie trypsyny, dodając podwójną objętość pożywki D10 (DMEM uzupełniony o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny), dokładnie resuspendować i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL.
  6. Wyznaczyć liczbę komórek w zawiesinie pojedynczych komórek, a następnie obliczyć całkowitą liczbę komórek nowotworowych na podstawie całkowitej objętości. Do wyznaczenia liczby komórek zaleca się użycie komory licznikowej Neubauera.
  7. Odwirować probówkę wirówkową 50 mL zawierającą komórki nowotworowe przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant.
  8. Resuspendować komórki nowotworowe HSC4 w odpowiedniej objętości pożywki D10, aby osiągnąć stężenie 15 000 komórek w 200 µL pożywki.
  9. Zgodnie z zaplanowanymi zabiegami komórek nowotworowych, dla każdego wariantu zasiać co najmniej 3 studzienki zawierające 15 000 komórek HSC4 w 200 µL pożywki w dwóch płytkach 96-dołkowych (1x próbka, 1x kontrola tylko z komórkami nowotworowymi, 1x studzienka do liczenia komórek w dniu kokultury).
    UWAGA: Liczba komórek zależy od linii komórkowej i czasu podwojenia. Liczbę komórek dla różnych zabiegów należy zbadać w eksperymentach wstępnych, aby uniknąć 100% konfluencji podczas inkubacji.
  10. Inkubować komórki przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy nasyconej wilgotności.

2. Traktowanie komórek nowotworowych (Dzień 2)

UWAGA: Czas trwania: 3-5 h. Po 24 h inkubacji wcześniej wysiane komórki HSC4 można poddać działaniu zgodnie z wybranym schematem traktowania. W tym przykładowym przypadku komórki nowotworowe są traktowane inhibitorem ATM lub ATR. Ponadto, jedna z dwóch płytek 96-dołkowych jest następnie naświetlana dawką 2x 5 Gy.

  1. Przygotować inhibitory kinaz w stężeniach 1 µM AZD0156 (inhibitor ATM) oraz 0,1 µM VE-822 (inhibitor ATR) do obróbki komórek nowotworowych.
  2. Poddać komórki nowotworowe odpowiedniej obróbce, na przykład stosując 3,1 µL inhibitora ATM w jednym rzędzie próbek oraz 3,1 µL inhibitora ATR w drugim rzędzie w każdej płytce.
  3. Po 3–5 h inkubacji w temperaturze 37 °C napromieniować jedną płytkę dawką 5 Gy.
  4. Po kolejnych 24 h inkubacji ponownie napromieniować tę samą płytkę dawką 5 Gy.

3. Izolacja limfocytów T (Dzień 2)

UWAGA: Czas trwania: 4 h. Komórki T CD8+ są izolowane magnetycznie za pomocą anti-CD8 MicroBeads z PBMC po wirowaniu krwi obwodowej (PB) pochodzącej od zdrowych dorosłych dawców w gradiencie gęstości. Izolowane komórki T są następnie barwione CFSE i inkubowane na płytce wielodołkowej pokrytej CD3/CD28 w celu stymulacji. Aby w późniejszych etapach pracować w sposób oszczędny pod kątem zasobów i materiałów, istotne jest oszacowanie ilości komórek T potrzebnych do eksperymentów z kokulturą. W zależności od dawcy, z około 45 ml krwi z EDTA można wyizolować od 50 000 000 do 100 000 000 PBMC. Około 10% całkowitej liczby PBMC stanowią komórki T CD8+.

  1. Wirowanie w gradiencie gęstości
    1. Przenieść 3-5 probótek z krwią z EDTA o pojemności 9 mL pobranych od zdrowego dawcy do dwóch probótek wirówkowych o pojemności 50 mL.
    2. Uzupełnić obie probówki wirówkowe do 50 mL za pomocą PBS + 2% FBS.
    3. Przygotować sześć probówek wirówkowych (z wkładką plastikową do oddzielania PBMC) i napełnić każdą z nich 15 mL schłodzonego do + 4 °C medium do gradientu gęstości.
    4. Ostrożnie nanieść na medium do gradientu gęstości 12-15 mL rozcieńczonej krwi z kroku 3.1.2.
    5. Wirować przy 1200 x g przez 10 min (bez konieczności stosowania hamowania).
  2. Przygotowanie płytki 6-dołkowej do stymulacji limfocytów T
    1. Przygotować przeciwciała: przygotować roztwór przeciw-CD3 (klon OKT3) o stężeniu 1 mg/mL w PBS. Przygotować roztwór przeciw-CD28 (klon 28.2) o stężeniu 0,1 mg/mL w PBS.
    2. Zalecenie: wykorzystać czas wirowania (krok 3.1.5) na przygotowanie roztworów do powlekania oraz samo powlekanie dołków w celu stymulacji limfocytów T.
    3. Zmieszać 5 µL roztworu przeciwciał CD3 z 4,995 µL PBS oraz 50 µL roztworu przeciwciał CD28 z 4,950 µL PBS (stężenie końcowe: 1 µg/µL).
    4. Dodać 1,000 µL obu roztworów przeciwciał do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
    5. Powlec 2 lub 3 dołki płytki 6-dołkowej, w zależności od przewidywanej liczby limfocytów T, i inkubować przez co najmniej 2 h w 37 °C.
  3. Przygotowanie medium dla limfocytów T
    UWAGA: Przygotowanie 100x L-Lizyny: rozpuścić 200 mg chlorowodorku L-lizyny w 50 mL wody destylowanej w probówce wirówkowej 50 mL. Zsterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm i przenieść do nowej probówki 50 mL za pomocą strzykawki perfuzyjnej 50 mL. Przechowywać roztwór w temperaturze 4-8 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Przygotowanie 15 mM L-argininy: rozpuścić 26 mg L-argininy w 10 mL DPBS. Zsterylizować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm i przenieść do nowej probówki za pomocą strzykawki 10 mL. Przechowywać roztwór w temperaturze 4-8 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy.
    1. Wykorzystać czas wirowania wspomniany w kroku 1.5 do przygotowania medium dla limfocytów T.
    2. Przygotować około 10-30 mL medium dla limfocytów T, w zależności od przewidywanej liczby limfocytów T.
    3. Zmieszać medium RPMI wolne od L-argininy i L-lizyny z 10% inaktywowanym ciepłem FBS, 1% penicyliną-streptomycyną, 1% L-argininą, 1% L-lizyną i 1% L-glutaminą. Przykład: 25,8 mL medium RPMI + 3 mL FBS + 0,3 mL Pen/Strep + 0,3 mL L-argininy + 0,3 mL L-lizyny + 0,3 mL L-glutaminy.
    4. Przechowywać pozostałe medium w 4 °C przez kolejne dwa dni, aby użyć go w dniu 4. – rozpoczęciu kokultury. Przy każdym nowym uruchomieniu całego eksperymentu zaleca się przygotowanie świeżego medium hodowlanego.
  4. Izolacja PBMC
    1. Po wirowaniu (krok 3.1.5) przenieść supernatant do czterech nowych probówek wirówkowych 50 mL i wyrzucić zużyte probówki.
    2. Uzupełnić probówki wirówkowe do 50 mL za pomocą PBS + 2% FBS.
    3. Wirować przy 300 x g przez 8 min w temperaturze pokojowej.
    4. Odlać supernatant, resuspender osad komórkowy w 1 mL PBS + 2% FBS dla każdej probówki i połączyć je w dwóch probówkach wirówkowych.
    5. Uzupełnić probówki do 50 mL za pomocą PBS + 2% FCS.
    6. Wirować przy 120 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    7. Odlać supernatant, ostrożnie resuspender osad komórkowy w 1 mL PBS + 2% FBS i połączyć oba osady w jednej probówce typu Falcon.
    8. Uzupełnić probówkę wirówkową do 50 mL za pomocą PBS + 2% FBS.
    9. Policzyć całkowitą liczbę PBMC za pomocą komory liczbowej Neubauera. Zalecenie: rozcieńczyć zawiesinę komórkową 1:10 błękitem trypanowym w celu policzenia.
  5. Separacja limfocytów T CD8+
    UWAGA: Użyć CD8 MicroBeads human wraz z kolumnami do separacji magnetycznej (MS) i buforem MACS+ (magnetic activated cell sorting plus) do magnetycznej separacji limfocytów T CD8+ zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów).
    1. Wirować PBMC (po policzeniu komórek) przy 300 x g przez 10 min.
    2. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 80 µL buforu MACS+ (500 mL PBS uzupełnionego o 10 mM EDTA i 0,5% BSA) na każde 107 komórek (na przykład 60 000 000 PBMC resuspender w 6 x 80 µL = 480 µL buforu).
      UWAGA: Przykład: 465 mL PBS + 10 mL (0,5 M) EDTA i 25 mL roztworu stokowego BSA.
    3. Dodać 20 µL CD8 MicroBeads na 107 komórek i ostrożnie zmieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubować przez 15 min w 4 °C.
    4. Po inkubacji przemyć komórki, dodając 2 mL buforu MACS+ na 107 komórek.
    5. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant i resuspender komórki w 1 000 µL buforu MACS+.
    6. Umieścić dwie kolumny MS w magnesie i postawić pod nimi dwie probówki wirówkowe 15 mL.
    7. Przygotować kolumny, używając 500 µL buforu MACS+. Bufor przepływa przez kolumny i może być zbierany do probówek wirówkowych poniżej. Ten krok można wykonać równolegle do kroku 3.5.6.
    8. Następnie pipetować zawiesinę komórkową po równo do przygotowanych kolumn MS. Przelew można zbierać do tych samych probówek wirówkowych. Zawiera on teraz wszystkie nieoznaczone komórki CD8-ujemne.
    9. Przepłukać kolumny, dodając 3 x 500 µL buforu MACS+. Nowy bufor dodawać na górę kolumn dopiero wtedy, gdy całkowicie spłyną lub przestaną kapać.
    10. Oznaczyć końcowe zebrane komórki jako „Przelew” lub „CD8 ujemne” i połączyć je w jednej probówce wirówkowej. Może to posłużyć później do pomiaru czystości izolacji via cytometrii przepływowej.
    11. Wziąć nową probówkę wirówkową 15 mL oznaczoną jako „limfocyty T CD8+”. Kolumny zostają zdjęte z magnesu i umieszczone na probówce wirówkowej.
    12. Przepłukać obie kolumny zawierające magnetycznie oznakowane limfocyty T CD8-dodatnie za pomocą 1 000 µL buforu MACS+ każda. W tym celu pipetować bufor do kolumn i niezwłocznie zacząć ostrożnie wypychać roztwór z kolumn za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta.
      UWAGA: Wykonać to dla obu kolumn, zbierając 2 mL całkowitej zawiesiny limfocytów T do probówki wirówkowej.
    13. Policzyć całkowitą liczbę limfocytów T za pomocą komory liczbowej Neubauera. Zalecenie: użyć rozcieńczenia 1:4 z błękitem trypanowym.
  6. Barwienie limfocytów T przy użyciu CFSE
    1. Wirować wyizolowane limfocyty T przy 300 x g przez 5 min.
    2. Podczas wirowania przygotować roztwór barwiący CFSE, mieszając 1,1 µL roztworu CFSE w 10 mL PBS. Stężenie końcowe musi wynosić 1 µM.
    3. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 000 µL PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    4. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 2000 µL roztworu barwiącego CFSE (1 µM). Inkubować przez 20 min w 37 °C.
    5. Wirować zabarwione komórki przy 300 x g przez 5 min. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w 1 000 µL PBS.
    6. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Odlać supernatant i resuspender osad komórkowy w odpowiedniej ilości medium dla limfocytów T, aby osiągnąć stężenie 1,5-2 x 106 limfocytów T w około 3-4 mL medium dla limfocytów T.
  7. Wysiew limfocytów T do płytki 6-dołkowej
    1. Odlać roztwór do powlekania z płytki 6-dołkowej.
    2. Wysiać 1,5-2 miliony wyizolowanych i zabarwionych limfocytów T w 3-4 mL medium dla limfocytów T na dołek.
    3. Inkubować limfocyty T w 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 48 h
      ​UWAGA: Gęstość wysiewu zawsze dostosowywać do 1,5 mln komórek / 3 mL. Unikać wysiewania limfocytów T w niższej gęstości. Wyższa gęstość jest możliwa, ale musi zostać przetestowana.

4. Rozpoczęcie kokultury (Dzień 4)

UWAGA: Czas trwania: 2 h. Po ustaleniu liczby komórek nowotworowych HSC4, do płytek 96-dołkowych dodaje się limfocyty T w stosunku 1:1.

  1. Zbiór komórek z jednej studni na warunek w celu określenia reprezentatywnej liczby komórek
    1. Odrzucić supernatant ze studni, która została przygotowana jako przykład do określenia liczby komórek.
    2. Najpierw przemyć komórki 100 µL PBS, a następnie odpić PBS.
    3. Dodać 100 µL trypsyny i inkubować przez 5 min na płycie grzejnej. Następnie resuspendować i sprawdzić pod mikroskopem, czy uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek; jeśli komórki nie odczepiły się, dodać kolejne 50 µL trypsyny.
    4. Gdy wszystkie komórki odczepią się, zatrzymać reakcję trypsyny, dodając 100 µL (lub 150 µL, jeśli wcześniej dodano dodatkowe 50 µL trypsyny) pożywki D10 i resuspendować.
    5. Przenieść całą objętość 200 µL ze studni do probówki 1,5 mL i użyć 100 µL do pomiaru liczby komórek. Pamiętać o przeliczeniu zmierzonej liczby komórek na objętość próbki.
  2. Barwienie komórek nowotworowych HSC4 nietoksycznym fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek
    1. Przygotować marker komórkowy (patrz Tabela materiałów), rozpuszczając 2 µL w 20 mL PBS (stężenie końcowe 0,1 µM zgodnie z zaleceniami producenta).
    2. Odpipetować pożywkę D10 ze wszystkich studni zawierających komórki nowotworowe i ją odrzucić.
    3. Dodać 200 µL roztworu markera komórkowego do studni z komórkami nowotworowymi. Inkubować przez 20 min w temperaturze 37 °C.
    4. Po inkubacji odpić roztwór barwiący i przemyć, dodając 100 µL PBS. Następnie odpić PBS.
    5. Dodać 200 µL świeżej pożywki D10.
  3. Zbiór limfocytów T (płyta 6-dołkowa)
    1. Ostrożnie resuspendować limfocyty T w pożywce; większość limfocytów T znajduje się w zawiesinie i można je zebrać, po prostu odpipetowując je ze studni.
    2. Sprawdzić pod mikroskopem, czy studnie są puste; jeśli nie, zebrać komórki, używając 1 000 µL trypsyny, umieścić płytę na płycie grzejnej w temperaturze 37 °C aż do odczepienia się limfocytów T, a następnie zatrzymać reakcję, dodając 1 000 µL PBS lub pożywki dla limfocytów T (opcjonalnie).
    3. Policzyć limfocyty T, używając komory licznikowej Neubauera. Następnie odwirować limfocyty T przy 300 x g przez 5 min.
    4. Resuspendować limfocyty T w pożywce dla limfocytów T (użyć tej samej pożywki, którą przygotowano drugiego dnia podczas izolacji limfocytów T) do stężenia końcowego 10 000 limfocytów T na 20 µL.
  4. Dodanie limfocytów T do komórek nowotworowych HSC4 (płyta 96-dołkowa)
    1. Dodać pożądaną ilość limfocytów T do studni z komórkami nowotworowymi, zgodnie z wcześniej określoną liczbą komórek nowotworowych, w stosunku 1:1.
    2. Pozostawić jedną studnię z komórkami nowotworowymi na warunek bez limfocytów T jako kontrolę „tylko komórki nowotworowe”. Kontrola ta umożliwia precyzyjne ustawienie bramek (gating) dla danych z cytometrii przepływowej.
    3. Dodać 200 µL zawiesiny limfocytów T do pustej studni jako kontrolę „tylko limfocyty T” (200 000 limfocytów T). Kontrola ta umożliwia precyzyjne ustawienie bramek dla danych z cytometrii przepływowej.
    4. Inkubować kokulturę przez 96 h (37 °C, 5% CO2)

5. Ilościowe oznaczenie proliferacji limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej (Dzień 7)

UWAGA: Czas trwania: 3 h. Po inkubacji kokultury przez kolejne 96 h, zawartość dołków jest zbierana i barwiona mieszanką przeciwciał zawierającą różne przeciwciała w zależności od hipotezy badawczej (na przykład przeciwciała anty-CD3, CD8, HLA-DR i CD25). Następnie komórki są analizowane za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej.

  1. Przygotować i opisać zestaw probówek do FACS oraz probówek do mikrocentryfugi dla każdej studzienki, z której będą zbierane komórki.
  2. Zbieranie komórek
    1. Resuspender komórki w ich medium i przenieść je do probówek do FACS.
    2. Przemyć komórki, używając 100 µL PBS, a następnie przenieść ten płyn do probówek do FACS.
    3. Dodać 100 µL trypsyny do studzienek i inkubować na płycie grzejnej (37 °C) przez 5 min.
    4. Resuspender komórki, a następnie sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie komórki się oddzieliły. Jeśli tak, przenieść zawiesinę komórek potraktowanych trypsyną do probówek do FACS.
    5. Sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie studzienki są puste; jeśli nie, powtórzyć kroki 5.2.3-5.2.4.
  3. Zbieranie supernatantu z kokultury do dalszych eksperymentów
    1. Wirować probówki wypełnione komórkami przy 300 x g przez 5 min.
    2. Ostrożnie pipetować około 300 µL supernatantu z probówek do innego zestawu probówek do mikrocentryfugi i zamrozić w temperaturze -20° C. Supernatant można później wykorzystać do przeprowadzenia np. analiz ELISA w celu ilościowego oznaczenia wydzielanych cytokin.
  4. Barwienie komórek przeciwciałami w celu wykonania cytometrii przepływowej
    1. Przygotować mieszaninę przeciwciał: dodać 5 µL anti-CD3-Krome Orange, 0.5 µL anti-CD8-PerCE-Cyp5.5, 1 µL anti-HLA-DR-APCVio770 oraz 2.5 µL anti-CD25-PE-Dazzle do 91 µL PBS/buforu do FACS.
    2. Dodać 200 µL buforu do FACS (PBS uzupełniony o 2% FBS i 2% EDTA) do każdej probówki i resuspender.
    3. Ponownie wirować przy 300 x g przez 5 min. Odlać supernatant i resuspender komórki w 100 µL wcześniej przygotowanej mieszaniny przeciwciał (krok 5.4.1). Inkubować przez 30-45 min w temperaturze 4 °C w lodówce, chroniąc przed światłem.
    4. Po inkubacji wirować przy 300 x g przez 5 min. Odlać supernatant i resuspender komórki w 100 µL buforu do FACS.
    5. Wykonać cytometrię przepływową na cytometrze zdolnym do rozróżnienia wszystkich wspomnianych przeciwciał fluorescencyjnych oraz sygnału CFSE.

6. Strategia bramowania i analiza danych

  1. Wykluczanie dubletów i identyfikacja właściwej populacji limfocytów T (Rysunek 2A).
    1. Wyklucz populację dubletów na podstawie powierzchni rozproszonego światła przedniego vs. bocznego (FSC-A vs. SSC-A) (Singlety).
    2. Wykreśl "Singlety" w celu identyfikacji limfocytów T na podstawie powierzchni rozproszonego światła przedniego vs. bocznego (FSC-A vs. SSC-A) (limfocyty T).
      UWAGA: Aby uzyskać najlepszą separację rozmiarów, należy mierzyć równolegle próbki zawierające "tylko limfocyty T" oraz "tylko komórki nowotworowe" (Rysunek 2B).
    3. Wykreśl ekspresję CD3 względem SSC-A w celu wyodrębnienia limfocytów T. Następnie limfocyty T CD8-dodatnie można zidentyfikować, wykreślając sygnał CD8 względem SSC-A. Wszystkie limfocyty T są CD3+/CD8+ (limfocyty T CD8+) (Rysunek 2A).
    4. Wykreśl sygnał CFSE dla wszystkich "limfocytów T CD8+" w formie histogramu.
      UWAGA: Gating subpopulacji nieproliferującej (najwyższy sygnał CFSE), subpopulacji proliferującej (wszystkie limfocyty T ze zredukowanym sygnałem CFSE) oraz subpopulacji silnie proliferującej (wszystkie limfocyty T z 4.go lub mniej intensywnego piku CFSE).
  2. Analiza markerów powierzchniowych związanych z aktywnością w populacji limfocytów T
    1. Postępuj zgodnie z krokami gatingu (krok 6.1) (Rysunek 3A).
    2. Opcja A: Wybierz "limfocyty T CD8+" jako dane wejściowe i przeanalizuj je pod kątem ekspresji CD25 lub HLA-DR, wykreślając fluorescencję odpowiedniego markera powierzchniowego względem charakterystyki SSC-A.
      UWAGA: Jeśli można wykryć wyraźną subpopulację CD25-high, zaleca się gating populacji CD25-high. To samo dotyczy gatingu/analizy HLA-DR na limfocytach T (Rysunek 3B).
    3. Opcja B: Wybierz "limfocyty T CD8+" jako dane wejściowe i przeanalizuj je pod kątem ekspresji CD25 lub HLA-DR, wykreślając fluorescencję odpowiedniego markera powierzchniowego względem charakterystyki SSC-A.
      ​UWAGA: Jeśli nie można wykryć wyraźnej subpopulacji (zależnie od analizowanego markera powierzchniowego), zaleca się analizę przesunięcia średniej intensywności fluorescencji (MFI) całej populacji limfocytów T (Rysunek 3C).

Schemat cytometrii przepływowej: analiza proliferacji limfocytów T z użyciem testu CFSE; dane dotyczące aktywności limfocytów T CD8+.
Rysunek 2: Strategia bramkowania wstępnie stymulowanych limfocytów T barwionych CFSE w celu analizy proliferacji po 96 h kokultury z wstępnie potraktowanymi komórkami nowotworu HNSCC. Limfocyty T i komórki nowotworowe są zbierane 96 h po kokulturze z płytki 96-dołkowej, barwione za pomocą specyficznego dla limfocytów T markera powierzchniowego i mierzone przy użyciu cytometru przepływowego. (A) Dublety wykluczono na podstawie FSC-A/FSC-H, a limfocyty T wybrano w pierwszej kolejności ze względu na wielkość (FSC-A/SSC-A). Następnie analizowano ekspresję CD3 (anty-CD3 Krome Orange) i CD8 (anty-CD8 PerCP-Cy5.5) w limfocytach T. Limfocyty T CD3+/CD8+ przedstawiono na histogramie i przeanalizowano intensywność sygnału CFSE. Sygnał CFSE reprezentuje podgrupy limfocytów T o zróżnicowanym zachowaniu proliferacyjnym. Limfocyty T z najwyższym sygnałem CFSE zdefiniowano jako „nieproliferujące”. Wszystkie subpopulacje wykazujące utratę sygnału CFSE, spowodowaną podziałem komórkowym prowadzącym do zmniejszenia sygnału o połowę, w oddzielnych pikuach, podsumowano jako „proliferujące”. Limfocyty T, które podzieliły się więcej niż trzy razy (więcej niż trzy piki sygnału CFSE), zdefiniowano jako „silnie proliferujące”. (B) Jako kontrolę dodatkowo zmierzono próbki składające się z samych wstępnie stymulowanych limfocytów T oraz samych wstępnie potraktowanych komórek nowotworowych. Limfocyty T i komórki nowotworu HSC4 można rozróżnić ze względu na wielkość, używając sygnału FSC-A vs. SSC-A. Ponadto przeanalizowano niestymulowane limfocyty T CD8+, aby sprawdzić aktywację limfocytów T wynikającą z samej kokultywacji z allogenicznymi komórkami nowotworowymi. (C) Jako kontrolę włączono inkubację niestymulowanych limfocytów T barwionych CFSE przez 96 h równolegle do kokultury. (D) Niestymulowane, barwione CFSE limfocyty T kokultywowano z wstępnie potraktowanymi komórkami nowotworowymi. Po 96 h zebrano komórki i zmierzono sygnał CFSE zgodnie ze standardową procedurą. Niestymulowane limfocyty T nie wykazały proliferacji ani samodzielnie, ani po kokultywacji z wstępnie potraktowanymi komórkami nowotworowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów T; markery CD3, CD25; analiza intensywności fluorescencji.
Rycina 3: Strategia bramkowania ekspresji markerów powierzchniowych (CD25 i HLA-DR) związanych z aktywnością limfocytów T po 96 h współhodowli z uprzednio potraktowanymi komórkami HNSCC. (A) Dublety wykluczono na podstawie charakterystyki FSC-A/FSC-H, a następnie limfocyty T wybrano za pomocą bramkowania według wielkości (FSC-A/SSC-A). Następnie analizowano ekspresję CD3 (anty-CD3 Krome Orange) oraz CD8 (anty-CD8 PerCP-Cy5.5) w limfocytach T. Bramkowanie markerów aktywności CD25 (anty-CD25 PEDazzle594) i HLA-DR (anty-HLA-DR APC-Vio770) na powierzchni limfocytów T można przeprowadzić w dwóch różnych ustawieniach. (B) Bramkowanie wszystkich limfocytów T CD8+ w celu wyznaczenia procentowego udziału konkretnej subpopulacji CD25high lub HLA-DRhigh na podstawie wykresów gęstości. (C) Alternatywnie, dla obu markerów aktywności mierzono przesunięcie MFI dla całej populacji limfocytów T CD8+. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z analizy ekspresji markerów powierzchniowych limfocytów T po współhodowli z komórkami nowotworowymi HSC4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Komórki nowotworowe HSC4 pochodzące z HNSCC zostały wysiane i inkubowane przez noc. Po 24 h komórki poddano działaniu inhibitora kinazy. Po 3 h zastosowano dwie pierwsze dawki po 5 Gy na frakcję. Po 24 h podano drugą dawkę, a następnie komórki ponownie inkubowano przez noc. Równolegle, na 48 h przed rozpoczęciem kokultury, wyizolowano limfocyty T z krwi zdrowego dawcy. Najpierw PBMC wyizolowano przy użyciu probówek do centryfugowania w gradiencie gęstości oraz sterylnego medium separacyjnego. PBMC policzono za pomocą komory do liczenia komórek, a limfocyty T CD8+ wyizolowano przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD8+. Wyizolowane limfocyty T CD8+ zabarwiono CFSE (1 µM), a następnie przeliczono. Limfocyty T wysiano na płytki z dołkami uprzednio powleczonymi CD3/CD28 z gęstością 1,5 x 106 komórek/3 mL. Po 48 h stymulacji limfocyty T zebrano, policzono i resuspendowano do gęstości 10 000 komórek/10 µL. Dodatkowo zebrano i policzono reprezentatywne dołki z wysianymi komórkami nowotworowymi, a w pozostałych dołkach wymieniono medium. Limfocyty T dodano do komórek nowotworowych w stosunku 1:1. Kokulturę zebrano po 96 h, supernatant przechowywano w temperaturze -20 °C, a komórki zabarwiono i zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (Rycina 1).

Limfocyty T zidentyfikowano na podstawie wykluczenia wielkościowego oraz pozytywności dla CD3/CD8. Sygnał CFSE komórek CD3+/CD8+ wykazał rozkład nieproliferujących limfocytów T (wysoki sygnał CFSE) oraz wyraźne subpopulacje proliferujących limfocytów T (spadek intensywności sygnału CFSE). Proporcję proliferujących limfocytów T zmierzono przykładowo dla linii komórkowej HSC4 HNSCC (Rysunek 4A). Wszystkie limfocyty T, które przeszły co najmniej jeden podział, zdefiniowano jako „proliferujące”. Limfocyty T, które przeszły więcej niż 3 podziały, zdefiniowano jako „silnie proliferujące” (Rysunek 4B). W przypadku linii komórkowej HSC4 ujemnej pod kątem HPV wykryto niewielki wzrost tempa proliferacji, gdy limfocyty T były współhodowane z napromieniowanymi komórkami nowotworowymi. RT oraz RT wraz z inhibicją ATR doprowadziły do istotnie zwiększonej następczej proliferacji limfocytów T w porównaniu do współhodowli limfocytów T z komórkami HSC4 traktowanymi RT wraz z inhibicją ATM. W odniesieniu do frakcji „silnie proliferującej” limfocytów T, najskuteczniejszą metodą stymulowania proliferacji limfocytów T było wcześniejsze traktowanie komórek HSC4 za pomocą RT wraz z inhibicją ATR (Rysunek 4B).

Wykres słupkowy proliferacji limfocytów T HSC4; pokazuje efekty inhibicji ATM i ATR; zaznaczono istotność statystyczną.
Rysunek 4: Proliferacja limfocytów T barwionych CFSE w celu analizy zmian w proliferacji limfocytów T zależnych od traktowania komórek HSC4. (A) Odsetek proliferujących limfocytów T po 96h kokultury z uprzednio potraktowanymi, HPV-ujemnymi komórkami nowotworu HSC4. Proliferacja limfocytów T była znacząco niższa po kokulturze z komórkami nowotworu HSC4 traktowanymi RT+ATMi w porównaniu do traktowania RT lub RT plus ATRi. (B) RT komórek nowotworu HSC4 indukowała wyższą frakcję silnie proliferujących limfocytów T (więcej niż trzy podziały komórkowe). Po kokulturze uprzednio potraktowanych RT+ATRi komórek nowotworu HSC4 z limfocytami T, odsetek silnie proliferujących limfocytów T był najwyższy. Słupki przedstawiają dane z czterech niezależnych eksperymentów z limfocytami T od czterech niezależnych, zdrowych dawców (n = 4; średnia ± SD). (*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001, ****p≤ 0.0001; istotność statystyczną przetestowano poprzez porównanie wszystkich warunków eksperymentalnych ze sobą przy użyciu dwustronnego testu U Manna-Whitneya dla danych o rozkładzie nieprawidłowym). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Utratę CFSE w zależności od proliferacji można wykorzystać do ilościowego określenia tempa proliferacji limfocytów T. Ponadto opisano kilka markerów powierzchniowych komórek, które są powiązane z aktywnością limfocytów T, takich jak CD25 i HLA-DR. W związku z tym przeprowadzono analizę CD25 i HLA-DR na powierzchni wszystkich limfocytów T CD3+ i CD8+ za pomocą cytometrii przepływowej (Rycina 5). Ekspresję można określić ilościowo, jeśli możliwe jest wykrycie wyraźnych subpopulacji CD25high lub HLA-DRhigh, które można wydzielić poprzez gating tych silnie pozytywnych komórek (Rycina 3B). W przypadku braku wyraźnych subpopulacji można zmierzyć średnią intensywność fluorescencji (MFI) całej populacji i określić ilościowo przesunięcia MFI zależne od warunków (Rycina 3C).

Przykładowo, ekspresję CD25 i HLA-DR, określoną za pomocą MFI, przeanalizowano po 96 h kokultury z uprzednio potraktowanymi komórkami nowotworowymi HSC4 (Rysunek 5). Po kokulturze limfocytów T z komórkami nowotworowymi HSC4 poddanymi RT, ekspresja CD25 na limfocytach T była silnie obniżona. Warto zauważyć, że potraktowanie komórek nowotworowych jedynie ATMi doprowadziło do znaczącego zmniejszenia ekspresji CD25 w porównaniu z potraktowaniem ATRi. W układzie łączonym z RT, mimo że RT spowodowała zmniejszenie ekspresji CD25 na limfocytach T, kombinacja RT z ATMi doprowadziła do zwiększenia ekspresji CD25 w porównaniu z RT plus ATRi (Rysunek 5A). W odniesieniu do ekspresji HLA-DR na limfocytach T, RT ogólnie prowadziła do upregulacji HLA-DR, lecz ponownie w kombinacji z ATMi lub ATRi zaobserwowano odmienne zachowanie (Rysunek 5B). Limfocyty T w kokulturze z komórkami HSC4 potraktowanymi kombinacją RT+ATRi wykazały zwiększoną ekspresję HLA-DR w porównaniu z samą RT lub RT+ATMi.

Wykres pudełkowy porównujący ekspresję HLA-DR i CD25 na limfocytach T; analiza MFI w kokulturze komórek nowotworowych.
Rysunek 5: Ekspresja markerów aktywacji CD25 i HLA-DR na powierzchni limfocytów T po 96 h kokultury z wstępnie potraktowanymi komórkami nowotworowymi HSC4. Ekspresję CD25 i HLA-DR analizowano na podstawie przesunięcia MFI całej populacji limfocytów T. RT komórek HSC4 spowodowało zmniejszenie ekspresji CD25 na limfocytach T oraz zwiększenie ekspresji HLA-DR. Połączenie RT z ATMi doprowadziło do znacznie odmiennych wzorców ekspresji w porównaniu do RT i ATRi. Wykresy pudełkowe przedstawiają dane z czterech niezależnych eksperymentów z użyciem limfocytów T od czterech niezależnych, zdrowych dawców (n = 4; średnia ± SD). Dane analizowano poprzez porównanie wszystkich warunków eksperymentalnych między sobą, stosując dwustronny test U Mann-Whitneya dla danych o rozkładzie nieparametrycznym (*p≤ 0.050). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dane te egzemplarycznie wskazują, że traktowanie komórek nowotworowych, w tym przypadku komórek HSC4 HNSCC, wpływa na immunogenność komórek nowotworowych. Można to monitorować poprzez kokultywację komórek nowotworowych z wcześniej stymulowanymi limfocytami T, co prowadzi do zróżnicowanego zachowania proliferacyjnego i ekspresji markerów aktywacji na ludzkich limfocytach T, w zależności od zastosowanego schematu traktowania komórek nowotworowych.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół oferuje szybką i łatwą metodę analizy zdolności proliferacyjnych limfocytów T wraz z ich statusem aktywacji w warunkach kohodowli ze wstępnie leczonymi komórkami nowotworowymi. W ten sposób można łatwo badać wpływ różnych metod leczenia, takich jak RT, CT lub TT, na aktywność i proliferację limfocytów T, budując podstawy do dalszych głębszych analiz immunologicznych obiecujących podejść. Reprezentatywne wyniki przedstawione w tym manuskrypcie dowodzą, że ten allogeniczny test kohodowli limfocytów T działa dobrze. Znaczące różnice w proliferacji limfocytów T, a także w aktywności limfocytów T, zaobserwowano w przypadku kohodowli z inaczej traktowanymi ludzkimi komórkami HSC4 (HNSCC) (Figura 4 i Figura 5). Stwierdzono, że leczenie HSC4 samą RT lub w połączeniu z TT spowodowało zwiększoną proliferację limfocytów T, w szczególności w odniesieniu do wysoce proliferacyjnej frakcji limfocytów T (ryc. 4). Zgodnie z ilościowym określeniem szybkości proliferacji, na stan aktywacji limfocytów T również w różny sposób wpływały różne schematy leczenia. Podsumowując, zastosowanie RT spowodowało silną regulację w dół ekspresji CD25 na limfocytach T, podczas gdy ekspresja HLA-DR była regulowana w górę. RT indukuje uszkodzenia DNA w napromieniowanych komórkach nowotworowych, co z kolei prowadzi do komórkowych reakcji na stres, które obejmują uwalnianie cząsteczek i cytokin związanych ze stresem i uszkodzeniem, a także ekspresję modulujących immunologicznie ligandów powierzchniowych komórek19.

Połączenie RT z TT w postaci inhibitorów naprawy DNA dodatkowo wzmacnia i utrzymuje te efekty, ponieważ komórki nowotworowe nie są w stanie skutecznie naprawić uszkodzeń DNA wywołanych przez RT. Może to dodatkowo promować i utrzymywać wydzielanie czynników immunogennych i ekspresję immunogennych ligandów powierzchniowychkomórek 20. W związku z tym wykazaliśmy wcześniej, że leczenie komórek nowotworowych (HNSCC) inhibitorami RT i uszkodzeń DNA zmienia fenotyp immunologiczny na powierzchni komórki nowotworowej. Modulacja fenotypu immunologicznego obejmowała regulację cząsteczki stymulującej układ odpornościowy ICOS-L, a także cząsteczki immunosupresyjnej PD-L111. W odpowiedzi na tę modulację fenotypu immunologicznego komórek nowotworowych, limfocyty T mogą również regulować ekspresję markerów aktywacji na powierzchni komórki. Co więcej, RT jest dobrze znany z tego, że stymuluje uwalnianie cytokin prozapalnych, takich jak IFNγ lub IL-6, które z kolei wpływają na proliferację i aktywność limfocytów T21. Ekspresja markerów aktywacji na limfocytach T jest procesem bardzo dynamicznym. Dane z Zimmerman i wsp.22 wykazały, że CD25 ulega wysokiej ekspresji 24 godziny po stymulacji, ale jest ponownie obniżony po 96 godzinach po stymulacji. Jest to zgodne z naszymi ustaleniami. Natomiast HLA-DR jest markerem aktywacji późnej fazy i jest na ogół poprzedzony wzrostem CD25 i CD6923. Zauważalnie połączenie RT + ATRi prowadzi do znacznej regulacji w górę HLA-DR na limfocytach T w porównaniu z RT + ATMi. Odkrycie to jest zgodne z pracami Dilliona i wsp., którzy wykazali synergistyczne działanie ATRi + RT w indukowaniu stanu zapalnego TME24. Mniej wyraźną modulację aktywności i proliferacji limfocytów T osiągnięto dzięki leczeniu komórek nowotworowych samymi inhibitorami kinazy (ryc. 5). Może to wynikać z faktu, że inhibitory naprawy DNA ATMi i ATRi działają jako wzmacniacz uszkodzeń DNA wywołanych przez RT i w związku z tym nie są bardzo immunogenne, gdy są stosowane w monoterapii. Wykazaliśmy już minimalną toksyczność ATMi lub samego ATRi11. Podsumowując, wyniki potwierdzają potencjał immunogenny RT (i TT z inhibitorami uszkodzeń DNA) i dodatkowo wskazują, że ten eksperymentalny system jest odpowiedni do badań przesiewowych zdolności immunostymulacyjnych różnych metod leczenia w ludzkich komórkach raka głowy i szyi.

Mimo że przedstawiona tutaj metoda jest łatwa i solidna, w protokole należy wcześniej rozważyć kilka krytycznych kroków. Konieczna jest obecność wysokich stężeń EDTA podczas procesu izolacji, a także podczas analizy cytometrycznej przepływowej limfocytów T. Dlatego zaleca się pobranie krwi dawcy do probówek pobranych pokrytych EDTA i użycie buforu MACS uzupełnionego 10 mM EDTA w celu zapewnienia skutecznej izolacji limfocytów T i wytworzenia jednorodnej zawiesiny pojedynczej komórki do oceny cytometrii przepływowej. Ponadto skład pożywki limfocytów T ma duże znaczenie dla zdolności proliferacyjnej limfocytów T. Po przetestowaniu różnych składów pożywek hodowlanych, pożywka o niskich stężeniach L-argininy i L-lizyny daje najlepszy sygnał proliferacji limfocytów T, ponieważ L-arginina ma kluczowe znaczenie dla metabolizmu i przeżycia komórek T i powinna być dostarczana w odpowiednim stężeniu25,26. Należy jednak pamiętać, że roztwory L-argininy i L-lizyny nie są stabilne przez długi czas i dlatego należy je zużyć w ciągu 3 miesięcy. Aby uzyskać optymalną stymulację, pożywka z limfocytów T uzupełniona aminokwasami musi być przygotowywana na świeżo do każdego eksperymentu z hodowlą limfocytów T. Co więcej, liczba komórek limfocytów T, a także komórek nowotworowych, są krytycznymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, ponieważ wpływają one na odczyt eksperymentu.

W przypadku komórek nowotworowych, z jednej strony, pożądana jest zbieżność komórek od 70% do 80% pod koniec eksperymentu z kokulturą. Przerost komórek nowotworowych może powodować wydzielanie czynników, które hamują wzrost komórek, a następnie wpływa również na tempo proliferacji limfocytów T. Ponieważ wzrost komórek nowotworowych jest w dużym stopniu zależny od pojedynczej linii komórkowej, zalecamy dokładne przetestowanie zachowania wzrostu odpowiedniej linii komórek nowotworowych w różnych płytkach dołkowych i dla różnych schematów leczenia. Ponadto komórki nowotworowe i limfocyty T powinny być hodowane wspólnie w stosunku 1:1. W związku z tym obowiązkowe jest wysiewanie dodatkowej studzienki komórek nowotworowych dla każdego warunku leczenia, która może być wykorzystana do określenia liczby komórek w dniu rozpoczęcia kohodowli. W ten sposób można zapewnić, że odpowiednia liczba limfocytów T zostanie wysiana dla różnych warunków leczenia. Jeśli chodzi o liczbę komórek limfocytów T, należy wziąć pod uwagę, że ilość limfocytów T, które można wyizolować od zdrowego dawcy, jest bardzo indywidualna. Limfocyty T stanowią około 45% do 70% PBMC zdrowego dawcy27. W związku z tym wymagana ilość limfocytów T powinna być już ogólnie oszacowana w momencie pobrania krwi. Ponadto gęstość limfocytów T jest ważna dla skuteczności aktywacji limfocytów T i ich przeżycia. W związku z tym limfocyty T należy wysiać w stężeniu co najmniej 1,5 miliona komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki w 3 ml pożywki z komórek T w celu wstępnej stymulacji przed rozpoczęciem kohodowli. Możliwa jest wyższa gęstość limfocytów T, ale należy unikać mniejszej gęstości. Aktywację limfocytów T można również ocenić morfologicznie pod mikroskopem, ponieważ aktywowane limfocyty T mają tendencję do tworzenia klastrów komórek.

Ponieważ metoda ta jest uproszczonym systemem eksperymentalnym do badania zdolności immunostymulacyjnych różnych linii komórek nowotworowych i metod leczenia, ma pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, test ten opiera się na systemie allogenicznym, co oznacza, że limfocyty T dawcy nie są dopasowane do HLA z odpowiednią linią komórek nowotworowych. Tak więc to niedopasowanie HLA może już indukować stymulację limfocytów T, a następnie proliferację limfocytów T bez dalszej stymulacji ze strony leczenia komórkami nowotworowymi28. Aby określić ilościowo ten niepożądany efekt, wyizolowane limfocyty T hodowano wspólnie z linią komórkową HSC4 bez wcześniejszej stymulacji przeciwciałami CD28 i CD3. Stwierdzono, że w tym otoczeniu prawie nie indukowano proliferacji, co wskazuje, że niedopasowanie HLA ma tylko niewielki wpływ na aktywację limfocytów T w tym konkretnym środowisku eksperymentalnym. Poza tym stwierdzono istotne różnice w proliferacji i aktywacji limfocytów T w oparciu o leczenie komórkami nowotworowymi pomimo ustawienia allogenicznego. Niemniej jednak, w celu ustanowienia tego testu, potencjalna proliferacja limfocytów T indukowana przez allogeny powinna zostać przetestowana i określona ilościowo raz na początku doświadczeń. Zalecane kontrole "tylko limfocyty T" i "tylko komórki nowotworowe" są potrzebne do wystarczającego bramkowania i są obowiązkowe w każdej powtórzeniu eksperymentów. Niemniej jednak należy pamiętać, że allogeniczny system kohodowli nie rozpoznaje antygenu specyficznego dla nowotworu. W związku z tym system ten może nie odzwierciedlać dokładnie specyficznej odpowiedzi przeciwnowotworowej, tak jak miałoby to miejsce in vivo u pacjentów29,30. W celu dalszej poprawy bardziej wyrafinowanym otoczeniem byłoby autologiczne podejście oparte na współkulturze. W tym ustawieniu biopsje guza pochodzące od pacjenta muszą być hodowane i wprowadzane do hodowli z limfocytami T wyizolowanymi z krwi obwodowej tego samego pacjenta28. To eksperymentalne podejście może być jednak wyzwaniem nie tylko pod względem hodowli pierwotnych komórek nowotworowych, ale także pod względem dostępności biomateriału pochodzącego od pacjenta. Kolejnym ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest stosunek komórek nowotworowych do limfocytów T w kohodowli. Ponieważ zalecany stosunek komórek wynosi 1:1, stosunek ten nie odzwierciedla fizjologicznej sytuacji TME u pacjentów31. Należy jednak zaakceptować to ograniczenie, ponieważ przy niższej liczbie limfocytów T zmiany w szybkości proliferacji i statusie aktywacji nie są mierzalne.

W dziedzinie immunologii nowotworów test ten daje możliwość przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem immunogenności różnych metod leczenia w łatwym i szybkim eksperymentalnym warunkach in vitro . W związku z tym można zaoszczędzić czas nie tylko poprzez wstępne badania przesiewowe najbardziej obiecujących metod pod względem immunogenności, ale także poprzez eksperymenty in vivo . Modele zwierzęce można ograniczyć, ponieważ tylko obiecujące schematy leczenia mogą być dalej realizowane w modelach zwierzęcych, aby odzwierciedlić układ odpornościowy jako całość w organizmie. Ponadto, ponieważ test ten opiera się na ludzkich komórkach pierwotnych i ludzkich liniach komórek rakowych, wyniki mogą być bardziej przekładalne na praktykę kliniczną niż testy oparte na innych systemach modelowych i gatunkach.

W przyszłości test ten może być modulowany i dostosowywany, aby odpowiadał na bardziej szczegółowe pytania badawcze. Na przykład, można uwzględnić leczenie limfocytami T, aby odzwierciedlić scenariusz leczenia, który jest bliższy sytuacji u pacjentów. Ponieważ limfocyty T reagujące z nowotworem znajdują się głównie w TME, są one w równym stopniu dotknięte terapiami miejscowymi, takimi jak RT, i prawdopodobnie są również dotknięte terapiami ogólnoustrojowymi, takimi jak CT lub TT32. Kolejnym ulepszeniem testu jest współhodowla limfocytów T ze sferoidami guza z linii komórek nowotworowych, a nawet współhodowla z organoidami nowotworowymi pochodzącymi od pacjenta. Te trójwymiarowe hodowle są bardziej porównywalne ze strukturą guza u pacjenta28. Wreszcie, również odczyt eksperymentu za pomocą cytometrii przepływowej może być łatwo dostosowany w celu zbadania dalszych cząsteczek na powierzchni limfocytów T lub poprzez analizę ekspresji cząsteczek immunologicznego punktu kontrolnego na komórkach nowotworowych. Oprócz określenia fenotypu immunologicznego limfocytów T, można wykorzystać supernatanty z hodowli komórkowych z eksperymentów z kokulturą do ilościowego określenia wydzielanych cytokin lub chemokin, aby uzyskać więcej informacji na temat aktywności limfocytów T. Podsumowując, protokół ten zapewnia kompleksowy, solidny i łatwy test kohodowli limfocytów T i komórek nowotworowych, który umożliwia badania przesiewowe pod kątem immunogenności różnych metod leczenia raka. Ponieważ test ten można dostosować do określonych pytań badawczych, doskonale nadaje się do zastosowania w szerokiej dziedzinie immunologii nowotworów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych w Erlangen (IZKF Erlangen) oraz Bayerisches Zentrum für Krebsforschung (BZKF).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki Cellstar 15 mlGreiner Bio-One GmbH188271
Probówki Cellstar 50 mlGreiner Bio-One GmbH227261
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych sterylna, z pokrywkąGreiner Bio-One GmbH657160
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej sterylna, z dnem F, z pokrywkąGreiner Bio-One GmbH655180
AZD0156Selleck Chemicals GmbHS8375
Berzosertib (VE-822)Selleck Chemicals GmbHS7102
CASYcupsOMNI Life Science GmbH & Co KG 
CASYtonOMNI Life Science GmbH & Co KG 
CD25a, PE-Dazzle594, Mysz IgG1Biolegend356126
CD28-UNLBBeckmann Coulter, Inc.IM1376
CD3a, Krome Pomarańczowy, Mysz IgG1Beckmann Coulter, Inc.B00068
Przeciwciało monoklonalne CD3eThermo-Fisher Scientific, Inc.MA1-10176
CD4, APC, Mysi anty-ludzki mysz IgG1BD Pharmingen555349
CD8 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec, Inc.130-045-201
CD8a, PerCP-Cy5.5, Mysz IgG1Biolegend300924
CellTracker Ciemnoczerwony barwnikThermo Fisher Scientific, Inc.C34565
CFSE  Merck KGaA (Sigma-Aldrich)21888
DMEM (Dulbecco´ s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s Medium)PAN-Biotech GmbHP04-02500
Cytometr przepływowy DxFlex (z automatyczną ładowarką)Beckmann Coulter, Inc.C44326, C02846
Sól disodowa EDTA dwuwodnaCarl Roth GmbH + Co. KG8043.2
FBS superior   Merck KGaA (Sigma-Aldrich)S0615-500ML
FBS superior   Merck KGaA (Sigma-Aldrich) S0615-100MLDo produkcji FBS inaktywowanego termicznie. Podgrzewać przez 30 min w temperaturze 56 stopni; C z mieszaniem w celu inaktywacji białek dopełniacza.
Graph Pad Prism (wersja numer 9)Oprogramowanie GraphPad-HLA-DR
, DP, DQ Przeciwciało, anty-ludzkie, APC-Vio770Miltenyi Biotec, Inc.130-123-550
Kaluza (numer wersji 2.1)Beckmann Coulter, Inc.-
L-argininaMerck KGaA (Sigma-Aldrich)A8094-25G
Monochlorowodorek L-lizynyMerck KGaA (Sigma-Aldrich)L5626-100G
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec, Inc.130-091-376
Kolumny MSMiltenyi Biotec, Inc.130-042-201
Ulepszona komora licząca NeubauerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG 640010
PBSMerck KGaA (Sigma-Aldrich)D8537-500mL
Penicylina-StreptomycynaThermo-Fisher Scientific, Inc.1514-122
ROTISep 1077Carl Roth GmbH + Co. KG0642.2
RPMI-1640 MediumMerck KGaA (Sigma-Aldrich)R1790
SepMate 50mL probówkiStemcell Technologies85450
Trypan niebieskiMerck KGaA (Sigma-Aldrich)T6146-25G
TrypsinThermo-Fisher Scientific, Inc.
5651794565180815400054

Bibliografia

  1. Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. Systemic immunity in cancer. Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).
  2. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  3. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From t cell basic science to clinical practice. Nat Rev Immunol. 20 (11), 651-668 (2020).
  4. Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).
  5. Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. New insights into cancer immunoediting and its three component phases--elimination, equilibrium and escape. Curr Opin Immunol. 27, 6-25 (2014).
  6. Irianto, T., Gaipl, U. S., Ruckert, M. Immune modulation during anti-cancer radio(immuno)therapy. Int Rev Cell Mol Biol. 382, 239-277 (2024).
  7. Burtness, B., et al. Pembrolizumab alone or with chemotherapy versus cetuximab with chemotherapy for recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (keynote-048): A randomized, open-label, phase 3 study. Lancet. 394 (10212), 1915-1928 (2019).
  8. Hecht, M., et al. Safety and efficacy of single cycle induction treatment with cisplatin/docetaxel/ durvalumab/tremelimumab in locally advanced HNSCC: First results of checkered-CD8. J Immunother Cancer. 8 (2), e001378(2020).
  9. Chen, J. A., Ma, W., Yuan, J., Li, T. Translational biomarkers and rationale strategies to overcome resistance to immune checkpoint inhibitors in solid tumors. Cancer Treat Res. 180, 251-279 (2020).
  10. Solomon, B., Young, R. J., Rischin, D. Head and neck squamous cell carcinoma: Genomics and emerging biomarkers for immunomodulatory cancer treatments. Semin Cancer Biol. 52 (Pt 2), 228-240 (2018).
  11. Meidenbauer, J., et al. Inhibition of atm or atr in combination with hypo-fractionated radiotherapy leads to a different immunophenotype on transcript and protein level in HNSCC. Front Oncol. 14, 1460150(2024).
  12. Kumari, S., et al. Immunomodulatory effects of radiotherapy. Int J Mol Sci. 21 (21), 8151(2020).
  13. Wimmer, S., et al. Hypofractionated radiotherapy upregulates several immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma cells independently of the HPV status while icos-l is upregulated only on HPV-positive cells. Int J Mol Sci. 22 (17), 9114(2021).
  14. Derer, A., et al. Chemoradiation increases pd-l1 expression in certain melanoma and glioblastoma cells. Front Immunol. 7, 610(2016).
  15. Schatz, J., et al. Normofractionated irradiation and not temozolomide modulates the immunogenic and oncogenic phenotype of human glioblastoma cell lines. Strahlenther Onkol. 199 (12), 1140-1151 (2023).
  16. Xu, M. M., Pu, Y., Zhang, Y., Fu, Y. X. The role of adaptive immunity in the efficacy of targeted cancer therapies. Trends Immunol. 37 (2), 141-153 (2016).
  17. Olivo Pimentel, V., Yaromina, A., Marcus, D., Dubois, L. J., Lambin, P. A novel co-culture assay to assess anti-tumor cd8(+) t cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flow cytometry. J Immunol Methods. 487, 112899(2020).
  18. Kulp, M., Diehl, L., Bonig, H., Marschalek, R. Co-culture of primary human t cells with leukemia cells to measure regulatory t cell expansion. STAR Protoc. 3 (3), 101661(2022).
  19. Ruckert, M., et al. Immune modulatory effects of radiotherapy as basis for well-reasoned radioimmunotherapies. Strahlenther Onkol. 194 (6), 509-519 (2018).
  20. Samstein, R. M., Riaz, N. The DNA damage response in immunotherapy and radiation. Adv Radiat Oncol. 3 (4), 527-533 (2018).
  21. Meeren, A. V., Bertho, J. M., Vandamme, M., Gaugler, M. H. Ionizing radiation enhances il-6 and il-8 production by human endothelial cells. Mediators Inflamm. 6 (3), 185-193 (1997).
  22. Zimmerman, M., et al. Ifn-gamma upregulates survivin and ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells. PLoS One. 5 (11), e14076(2010).
  23. Saraiva, D. P., et al. Expression of HLA-dr in cytotoxic t lymphocytes: A validated predictive biomarker and a potential therapeutic strategy in breast cancer. Cancers (Basel). 13 (15), (2021).
  24. Dillon, M. T., et al. Atr inhibition potentiates the radiation-induced inflammatory tumor microenvironment. Clin Cancer Res. 25 (11), 3392-3403 (2019).
  25. Geiger, R., et al. L-Arginine modulates T cell metabolism and enhances survival and anti-tumor activity. Cell. 167 (3), 829-842.e13 (2016).
  26. Rodriguez, P. C., Quiceno, D. G., Ochoa, A. C. L-Arginine availability regulates t-lymphocyte cell-cycle progression. Blood. 109 (4), 1568-1573 (2007).
  27. Lozano-Ojalvo, D., López-Fandiño, R., López-Expósito, I., et al. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. Cham. 169-180 (2015).
  28. Gronholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  29. Perez, C., Gruber, I., Arber, C. Off-the-shelf allogeneic t cell therapies for cancer: Opportunities and challenges using naturally occurring "universal" donor t cells. Front Immunol. 11, 583716(2020).
  30. Martinez Bedoya, D., Dutoit, D., Migliorini, D. Allogeneic car t cells: An alternative to overcome challenges of car t cell therapy in glioblastoma. Front Immunol. 12, 640082(2021).
  31. Schnellhardt, S., et al. The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density. Front Immunol. 13, 781222(2022).
  32. Zitvogel, L., Kroemer, G. Oncoimmunology: A practical guide for cancer immunotherapy. , Springer International Publishing. Cham. 23-39 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstępna obróbka komórek nowotworowychcytotoksyczne limfocyty Tcytometria przepływowalimfocyty T CD8+barwienie CFSEinhibitory kinazradioterapiamikrośrodowisko guza
Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.