Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

DOI:

10.3791/67651

⸱

18 kwietnia 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki linii monocyty-makrofagi są wielofunkcyjne i znajdują się w prawie wszystkich tkankach ciała. Koordynują one fazy inicjacji i ustępowania odporności wrodzonej i nabytej, znacząco wpływając na odporność ochronną i patologiczne uszkodzenia o podłożu immunologicznym. Podczas gdy makrofagi rezydujące w tkankach odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy w stanie ustalonym, duże ilości monocytów są rekrutowane z krwi obwodowej do tkanki w wyniku uszkodzenia lub uszkodzenia stanu zapalnego. Makrofagi pochodzące z monocytów (M-DM) mogą różnicować się w wiele dynamicznych podtypów, a ich fenotypy i funkcje zależą od lokalnego środowiska tkankowego.

Aby porównać różne bodźce lub warunki środowiskowe podczas różnicowania i polaryzacji M-DM, ustandaryzowaliśmy model in vitro ludzkiego niespolaryzowanego M-DM M0 i niektórych makrofagów spolaryzowanych cytokinami kardynalnymi, M1 pochodzącego z IFNγ/LPS, M2a pochodzącego z IL-4 oraz M2c pochodzącego z IL-10 lub deksametazonu, aby przeanalizować przeprogramowanie skośne M-DM za pomocą cytometrii przepływowej i PCR w czasie rzeczywistym. Odkryliśmy, że CD64, CD206, CD163, CD14 i MERTK mogą wyraźnie rozróżniać niespolaryzowane M0 i spolaryzowane M1, M2a i M2c za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto zdefiniowaliśmy IRF1 i CXCL10 jako specyficzne geny dla klasycznych transkryptów M1-, IRF4-, CCL22 i TGM2 pochodzących z IFNγ / LPS dla M2a pochodzących z IL-4 oraz genu MERTK dla M2c pochodzącego z deksametazonu. Podsumowując, nasz ustandaryzowany protokół M-DM może dostarczyć kardynalnej mapy in vitro do analizy zróżnicowania i polaryzacji ludzkiego M-DM pod wpływem różnych bodźców.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofagi, po raz pierwszy zidentyfikowane przez Metchnikoffa ze względu na ich zdolność fagocytową, są starożytnymi komórkami o fundamentalnym znaczeniu dla życia metazoan. Występujące powszechnie u dorosłych ssaków, wykazują niezwykłą różnorodność anatomiczną i funkcjonalną. Jako część jednojądrzastego systemu fagocytarnego, obok komórek dendrytycznych i monocytów, makrofagi odgrywają kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, od rozwoju i homeostazy po odpowiedzi immunologiczne przeciwko patogenom1,2. Rezydujące makrofagi, wyspecjalizowane w mikrośrodowiskach tkankowych, działają jako strażnicy, monitorując stan tkanek i reagując na zmiany fizjologiczne i zagrożenia zewnętrzne. Uważa się, że ich ograniczona plastyczność jest ewolucyjną adaptacją do utrzymania homeostazy tkanek. W przeciwieństwie do tego, rekrutowane monocyty są bardziej elastyczne i mogą różnicować się w różne fenotypy makrofagów podczas stanu zapalnego. Ten podwójny wpływ stanu zapalnego i niszy tkankowej kształtuje różnorodność funkcjonalną makrofagów3. Tak więc, w zależności od lokalnego środowiska tkankowego, makrofagi pochodzące z monocytów (M-DM) mogą różnicować się w wiele podtypów. Lokalne metabolity, czynniki wzrostu, cytokiny i interakcja komórka-komórka4,5,6 opisują ich fenotypy i funkcje. Ponadto makrofagi są kluczowymi producentami czynników, które tłumią stan zapalny i napędzają rewaskularyzację oraz naprawę tkanek7,8.

Biorąc pod uwagę, że co najmniej trzy główne ramiona kontrolują polaryzację (warunki środowiska zewnętrznego, wewnętrznego i tkankowego), polaryzacja makrofagów powinna być postrzegana jako wielowymiarowa2. Głównymi przeszkodami i pułapkami w opisywaniu różnicowania i polaryzacji makrofagów są niejednorodne warunki eksperymentalne w literaturze oraz brak konsensusu co do definiowania terminów makrofagów w eksperymentach in vitro i in vivo9. Niemniej jednak rozpoczęto pewne ujednolicanie standardów eksperymentalnych dla różnych scenariuszy eksperymentalnych.

Aby lepiej zrozumieć ludzkie pole makrofagów, potrzebujemy ustandaryzowanych i dobrze zdefiniowanych modeli in vitro M-DM do łączenia, różnicowania, polaryzacji, fenotypu i przeprogramowywania, a także określonych funkcji. Naszym celem było ustalenie standaryzowanego modelu in vitro ludzkiego niespolaryzowanego M-DM M0 i makrofagów spolaryzowanych cytokinami w celu zbadania przeprogramowania przeprogramowania M-DM za pomocą cytometrii przepływowej i PCR w czasie rzeczywistym. Chociaż polaryzacja makrofagów jest procesem dynamicznym ze względu na ich wysoką plastyczność i zdolność do integrowania wielu sygnałów z otoczenia, scharakteryzowaliśmy tutaj niespolaryzowany M-DM (M0) i niektóre stany polaryzacji in vitro, jako klasyczne prozapalne, powszechnie rozpoznawane również jako M1, indukowane IFNγ i LPS. Podobnie, makrofagi M2 do naprawy tkanek i regulatora można zdefiniować jako M2a, gdy są indukowane przez IL-4 i M2c, gdy są stymulowane deksametazonem lub IL-10. Te polaryzujące stany uchwyciły migawkę szerokiego spektrum środowiska M-DM w czasie i przestrzeni, ale dają nam kilka kardynalnych punktów, aby ustawić mapę analityczną, gdzie zlokalizować warunki testowe.

Pomimo złożonej i dynamicznej kombinacji markerów powierzchniowych i programów transkrypcyjnych, podczas analizy in vitro M-DM, ustaliliśmy, że CD64, CD206, CD163, CD14 i MERTK mogą oddzielić niespolaryzowany stan M0, od indukowanego przez IFNγ/LPS M1a, indukowanego przez IL-4 M2a i IL-10 lub deksametazonu za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto ekspresję genów IRF1 i CXCL10 zdefiniowano jako specyficzną dla M1 indukowanego przez IFNγ / LPS; Transkrypty specyficzne dla IRF4, CCL22 i TGM2 dla M2a pochodzącego z IL-4; oraz gen MERTK dla M2c pochodzącego z deksametazonu, wyznaczając dodatkowe punkty kardynalne w celu porównania przeprogramowania skośnego M-DM poddanego innym bodźcom lub nawet hodowanego wspólnie z innymi typami komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy zdrowi ochotnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Narodowej Akademii Medycznej (IMEX-CONICET-ANM) Argentyna. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMCs)

UWAGA: PBMC są izolowane z 40 ml antykoagulowanej krwi obwodowej z cytrynianem sodu na poziomie 3,8% i przy użyciu wirowania o gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque (1077). Protokół ten jest wykonywany w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2.

  1. Otrzymaną próbkę krwi obwodowej z antykoagulacją przenieść do odpowiednich probówek o pojemności 15 ml lub 50 ml w celu odwirowania.
  2. Odwirować próbki krwi o masie 200 × g przez 15 minut (przyspieszenie: 4 opóźnienia: 2, gdy maksimum wynosi 5) w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP) na górze i frakcji komórkowej, w tym czerwonych i białych krwinek poniżej. Zobacz Rysunek 1.
  3. Przenieść górną frakcję (PRP) do probówek o pojemności 15 ml (jeśli osocze będzie przechowywane) i odwirować przy 600 × g przez 10 minut (maksymalne przyspieszenie i opóźnienie), aby uzyskać końcową frakcję osocza bez płytek krwi. Przechowywać osocze w temperaturze -20 °C.
  4. Rozcieńczyć frakcję komórkową otrzymaną z pierwszego wirowania, 2x (minimum) do 3x (maksimum) za pomocą sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS) wstępnie podgrzanej w temperaturze pokojowej. Delikatnie homogenizować i używać tej rozcieńczonej frakcji do wirowania w gradiacji gęstości Ficoll-Hypaque.
  5. Przenieść 15 ml Ficoll-Hypaque do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Następnie ostrożnie i powoli dodaj 30 ml rozcieńczonej krwi na wierzch figlu, unikając mieszania faz. Jeśli pracujesz z 10 ml lub mniej rozcieńczonej krwi, przenieś 4 ml Ficoll-Hypaque do probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodaj 10 ml rozcieńczonej próbki krwi.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania frakcji jednojądrzastej.
  6. Odwirować probówkę zawierającą Ficoll i rozcieńczoną krew o stężeniu 600 × g przez 25 minut (przyspieszenie: 1; Opóźnienie: 0) w temperaturze pokojowej.
  7. Usuń część żółtej wierzchniej warstwy za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 3 ml. Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura ostrożnie zebrać granicę faz (jednojądrzastą frakcję "pierścieniową") utworzoną między żółtą warstwą wierzchnią a warstwą Ficollu. Ten "pierścień" zawiera interesujące nas komórki jednojądrzaste (PBMC).
    UWAGA: Część pozostałej fazy osocza może zostać zebrana, ale należy unikać fazy Ficoll, ponieważ może ona być toksyczna dla PBMC.
  8. Przenieść zebrane PBMC do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej co najmniej 3 ml sterylnego 1x PBS. Następnie uzupełnij odpowiednią objętość sterylnego 1x PBS do 12-15 ml. Odwirować PBMC przy masie 600 × g (maksymalne przyspieszanie i zwalnianie) przez 10 minut.
  9. Odrzucić supernatant i ponownie umyć PBMC. Ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 1 ml sterylnego 1x PBS, a następnie uzupełnić do 12-14 ml dodatkowym sterylnym 1x PBS. Odwirować probówki o masie 600 × g (maksymalne przyspieszanie i zwalnianie) przez 10 minut.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad PBMC w sterylnym 1x PBS zawierającym 2% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (1x PBS-2% FBS) i zwiększyć objętość do 10 ml. Użyj automatycznego licznika komórek lub policz komórki, przygotowując zawiesinę komórek 1:5 rozcieńczoną w sterylnym zimnie 1x PBS, a następnie (1:2) w błękit trypanowy, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:10. Do liczenia używaj mikroskopu świetlnego.
  11. Odwirować zawiesinę PBMC w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości sterylnego, zimnego 1x PBS-2% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10-8 komórek/ml. Pozostawić te komórki w temperaturze 4 °C do następnego kroku.
    UWAGA: Jeśli pobrane PBMC nie zostaną użyte tego samego dnia, zaleca się zamrożenie w fiolce kriogenicznej w stężeniu 108 komórek/ml w odpowiedniej pożywce do zamrażania (90% FBS zawierającej 10% dimetylosulfotlenku, DMSO). Przechowywać w temperaturze -80 °C w pojemniku z glikolu polietylenowego przez noc, aby umożliwić powolne zamarzanie komórek, minimalizując w ten sposób ich uszkodzenie. Następnego dnia przenieś komórki do pojemnika do przechowywania i pozostaw je w temperaturze -80 °C na kilka dni lub przenieś do zbiornika z ciekłym azotem na długi okres przechowywania.

2. Sortowanie monocytów CD14+ za pomocą kulek magnetycznych

UWAGA: Ilość monocytów CD14 znalezionych w PBMC zdrowych dawców jest zmienna w zależności od wieku i płci. Jeśli to możliwe, użyj licznika komórek, aby uzyskać % monocytów w każdej próbce, a następnie oblicz liczbę PBMC potrzebnych do posortowania wymaganych monocytów CD14. Jeśli licznik komórek nie jest dostępny, 10% monocytów na próbkę PBMC można uznać za szerokie podejście4,6,7,10,11,12,13.

monocyty CD14+ są izolowane za pomocą ludzkiego zestawu do pozytywnej selekcji CD145. Ustandaryzowaliśmy protokół izolacji przy użyciu 1 do 2 × 107 PBMC w 100 μL reakcji; Użyj tego współczynnika dla wyższych liczb. Sugerowana minimalna objętość reakcji to 100 μl, nawet przy liczbie komórek mniejszej niż 1 × 107 PBMC.

  1. Przygotować zawiesinę komórek PBMC o stężeniu 1-2 × 108 komórek/ml w 1x PBS-2% FBS zawierającym 1 mM buforu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) i przenieść żądaną ilość PBMC do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml.
  2. Dodaj 10 μl koktajlu pozytywnej selekcji na każde 100 μl zawiesiny komórkowej, dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  3. Dodać 10 μl nanocząstek magnetycznych na 100 μl zawiesiny komórek, energicznie pipetować w górę iw dół ponad 5 razy, aby równomiernie zawiesić nanocząstki magnetyczne, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Wirowanie nie jest zalecane.
  4. Dodaj 1x PBS-2% FBS-1 mM bufor EDTA, aby zwiększyć całkowitą objętość zawiesiny komórek do 2,5 ml. Delikatnie pipetuj komórki w probówce w górę i w dół 2-3 razy. Włóż probówkę do sortownika magnetycznego i odstaw ją na 5 minut.
  5. Weź magnes i odwróć go wraz z rurką jednym ciągłym ruchem, odrzucając frakcję supernatantu. Magnetycznie oznakowane ogniwa pozostaną wewnątrz tuby. Pozostaw magnes i rurkę odwrócone na 2-3 s, a następnie obróć je pionowo do pionu.
    UWAGA: Pozostaw wszelkie zwisające krople z otworu tuby; Nie potrząsaj nimi ani nie osuszaj ich.
  6. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie dodaj 2,5 ml 1x PBS-2% FBS-1 mM buforu EDTA do probówki. Delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół 2-3 razy, aby ją wymieszać. Włóż rurkę z powrotem do magnesu i odłóż ją na 5 minut.
  7. Jednym ciągłym ruchem odwróć zarówno magnes, jak i rurkę, odrzucając frakcję supernatantu. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś ogniwa w odpowiedniej ilości buforu 1x PBS-2% FBS (bez EDTA). Pozytywnie wybrane komórki są teraz gotowe do użycia.
    UWAGA: W magnesie wymagane są łącznie dwie 5-minutowe separacje.
  8. Przemyć posortowane komórki CD14 za pomocą 1x PBS-2% buforu FBS, doprowadzając zawiesinę komórek do 12-14 ml w celu rozcieńczenia pozostałego EDTA, a następnie odwirować przy 600 × g (maksymalne przyspieszenie i opóźnienie) przez 10 minut.
  9. Wyrzucić supernatant i powtórzyć mycie, ponownie zawieszając osad komórkowy za pomocą 1 ml buforu FBS 1x PBS-2%, a następnie uzupełniając objętość do 12-14 ml. Odwirować probówki o masie 600 × g (maksymalne przyspieszanie i zwalnianie) przez 10 minut.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić dodatnie wybrane monocyty CD14 w 2 ml 1x PBS-2% buforu FBS. Użyj automatycznego licznika komórek lub policz komórki, rozcieńczając zawiesinę komórek (1:5) w sterylnym zimnie 1x PBS, a następnie (1:2) w błękitu trypanowym za pomocą mikroskopu świetlnego. Pozostaw komórki na lodzie do czasu przygotowania hodowli.
    UWAGA: Czystość komórek można zbadać za pomocą cytometrii przepływowej, pobierając 50 μl zawiesiny komórkowej i barwiąc ją pod kątem komórek CD14+ (klon HCD14). Zalecana jest czystość wyższa niż 90%.
  11. W przypadku hodowli należy odwirować zawiesinę komórek w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Zawiesić osad przy stężeniu 106 komórek/ml za pomocą RPMI 1640 uzupełnionego 10% inaktywowanym FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (RPMI-10% FBS-1% P/S).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać wysokiej jakości FBS o niskiej zawartości endotoksyn, inaktywowanego termicznie. Utrzymuj zawsze na lodzie, aby uniknąć przylegania monocytów do plastikowej ścianki przed posiewem.

3. Różnicowanie i polaryzacja makrofagów pochodzących z monocytów (M-DM)

UWAGA: Hodowla M-DM jest przeprowadzana przez posiew 2,5 × 105 monocytów CD14+ na 48-dołkowych płytkach zawierających 500 μL RPMI-10% FBS-1% P/S i hodowla w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z CO2 (5%) przez 7 dni. Wybierz poddane działaniu substancji płytki, aby zwiększyć przyleganie monocytów do płytki.

  1. Zdefiniuj wszystkie warunki eksperymentalne do uruchomienia, w tym studzienki dla podstawowego M-DM (M0), zapalnego M1, M2a naprawy tkanek, regulatorowego M2c i żądanych warunków testowania.
  2. Odpipetować 250 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 2.11, aby wysiać 2,5 ×10 5 monocytów CD14+ w każdym dołku.
  3. Dodaj 250 μl RPMI-10% FBS-1% P/S plus 50 ng/ml M-CSF do każdego dołka, aby uzupełnić 500 μl całkowitej objętości.
  4. Inkubować płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 dni, aby umożliwić pierwszy etap różnicowania makrofagów.
    UWAGA: Okresowo sprawdzaj różnicowanie kultur komórkowych, aby zobaczyć, czy zmiany morfologiczne wystąpiły zgodnie z oczekiwaniami lub czy istnieją niepożądane nieprzyłączone komórki.
  5. Wymień połowę pożywki hodowlanej (250 μl RPMI-10% FBS-1% P/S) w 4. dniu hodowli M-DM. Dodaj cytokiny lub odczynniki do warunków polaryzacji i hoduj je przez 3 dni (punktem końcowym jest dzień 7): LPS (1 ng / ml) plus IFNγ (50 ng / ml) dla M1, IL-4 (40 ng / ml) dla M2a, IL-10 (50 ng / ml) lub deksametazon (0,1 μM) dla M2c.
  6. Zbierz M-DM w dniu 7, aby przeprowadzić charakterystykę fenotypową, zbierz je do ekspresji mRNA, jak wskazano w następnych dwóch krokach, lub wykonaj test funkcjonalny.

4. Charakterystyka fenotypu powierzchniowego w spolaryzowanym M-DM za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Odrzucić całkowitą objętość pożywki hodowlanej (500 μl płytki 48-dołkowej) i dodać 200 μl 1x PBS-2% FBS-1 mM buforu EDTA do pobierania komórek. Inkubować przez 20 minut na lodzie, a następnie dodać 200 μl 1x PBS-2% FBS w celu rozcieńczenia buforu EDTA. Zebrać M-DM, pipetując w górę i w dół do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Zebrane komórki przemyć raz 1x PBS-2% FBS i odwirować w temperaturze 800 × g przez 3 minuty.
  2. Zawiesić osad M-DM z 200 μl 1x PBS-5% FBS i przenieść je do 96-dołkowej mikropłytki okrągłodennej w celu zablokowania w temperaturze pokojowej na 15 minut. Odwirować komórki w temperaturze 800 × g przez 3 minuty.
  3. Przygotować odpowiednią kombinację bezpośrednio sprzężonych przeciwciał w 1x PBS-2% FBS. Zabarwić każdą studzienkę lub stan (1x) 50 μl panelu przeciwciał i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
    UWAGA: W tym przypadku panel przeciwciał składał się z CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 i MERTK-biotyna plus Streptawidyna-PE. Pretiterowane stężenie przeciwciał podano w tabeli 1.
  4. Przepłukać zabarwiony M-DM, dodając 150 μl 1x PBS i odwirować przy 800 × g przez 3 min.
  5. Aby zmierzyć żywotność komórek, dodaj 100 μl barwnika do utrwalania żywotności Zombie Violet (1:1,000 w 1x PBS) i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
  6. Przepłukać poplamione komórki, dodając 100 μl 1x PBS i odwirować przy 800 × g przez 3 min. Powtórzyć procedurę mycia, używając 200 μl 1x PBS.
  7. Fix poprzez ponowne zawieszenie osadu M-DM ze 100 μl odczynnika utrwalającego (z zestawu utrwalającego/przepuszczalnego) i inkubowanie go przez 20 minut na lodzie i w ciemności.
    UWAGA: Aby uzyskać odpowiednie utrwalenie, konieczna jest prawidłowa homogenizacja osadu komórkowego.
  8. Umyj M-DM dodając 100 μL 1x PBS-2% FBS i odwiruj przy 800 × g przez 3 min. Powtórz procedurę mycia przy użyciu 200 μL 1x PBS-2% FBS.
  9. Zawiesić osad M-DM w 200 μl 1x PBS i uruchomić wybarwione komórki w cytometrze przepływowym.

5. Profil programu genowego do rozróżniania polaryzacji M-DM za pomocą qPCR

UWAGA: W 7 dniu hodowli, 2,5 × 105 M-DM może być zebrane przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA w celu izolacji wysokiej jakości całkowitego RNA. Izolację RNA można również przeprowadzić przy użyciu alternatywnych metod, takich jak ekstrakcja RNA oparta na kolumnie i zestaw do elucji.

  1. Odrzucić całkowitą objętość pożywki hodowlanej i zlizowaną M-DM, dodając bezpośrednio 350 μl odczynnika ekstrakcyjnego. Homogenizować i przenieść tę zawiesinę komórkową do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNazy/DNaz i kontynuować izolację RNA.
    UWAGA: Jeśli izolacja RNA nie zostanie przeprowadzona tego samego dnia, próbka z kroku 5.1 może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc lub -20 °C przez okres do roku.
  2. Aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksu nukleoprotein, należy inkubować homogenizowane próbki z etapu 5.1 przez 5 minut w temperaturze 25 °C
  3. Dodać 70 μl chloroformu do każdej próbki. Bezpiecznie zakryj każdą probówkę, aby zapobiec wyciekom i dokładnie wymieszaj zawartość, potrząsając probówką. Inkubować próbki przez 2-3 minuty, a następnie odwirowywać próbki o masie 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ten krok całkowicie rozdzieli fazy na dolną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną.
    UWAGA: Objętość chloroformu opiera się na stosunku 0,2 ml chloroformu na 1 ml odczynnika ekstrakcyjnego użytego na etapie lizy.
  4. Przenieś fazę wodną zawierającą RNA do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNazy/DNaz.
    UWAGA: Pozostaw niewielką objętość podczas przyjmowania fazy wodnej, aby uniknąć przeniesienia jakichkolwiek warstw interfazowych lub organicznych.
  5. Dodać 175 μl izopropanolu do każdej próbki, aby wytrącić RNA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C lub alternatywnie przez noc w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Objętość izopropanolu opiera się na stosunku 0,5 ml izopropanolu na ml odczynnika do ekstrakcji początkowej.
  6. Odwirować próbki o masie 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki wytrąci się biała żelowa osadzka całkowitego RNA. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety.
  7. Przemyć RNA, ponownie zawieszając biały żelowy osad w 350 μl 75% etanolu (1 ml na 1 ml odczynnika ekstrakcyjnego (v/v) używanego do lizy).
    UWAGA: RNA może być przechowywane w 75% etanolu przez okres do 1 roku w temperaturze -20 °C lub do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
  8. Krótko zmieszać zawieszony osad i odwirować w temperaturze 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety. Wysuszyć na powietrzu lub odkurzyć osad RNA przez 5-10 min.
    UWAGA: Aby rozpuścić RNA, unikaj nadmiernego wysuszenia osadu RNA.
  9. Zawiesić osad w 20-30 μl wody wolnej od RNaz, pipetując w górę iw dół. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym ustawionym na 55-60 °C przez 10-15 minut. Przystąp do pomiaru stężenia RNA i przechowuj RNA w temperaturze -70 °C.
  10. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję (kopię cDNA) przy użyciu 100-500 ng RNA (odpowiednio minimalnego i maksymalnego) w 20 μl objętości reakcyjnej, stosując zestaw do syntezy cDNA.
  11. Uruchom reakcje PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu 1 μl cDNA (5-25 ng).
    1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną dla każdej probówki (1x), używając 5 μl zielonej mieszanki SYBR (2x), 0,2 μl każdego startera (do przodu i do tyłu) i 3,6 μl wody wolnej od nukleaz. Wyskaluj wszystkie komponenty zgodnie z numerem próbki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną i dozuj 9 μl do każdej probówki qPCR, a na koniec 1 μl cDNA, aby osiągnąć końcową całkowitą objętość 10 μl.
    2. Zaprogramuj protokół cykli termicznych na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym w następujący sposób: 2-3 minuty w 98 °C (1x); 5-15 s w 98 °C plus 15-30 s w 60 °C (35-40x); na koniec uwzględnij analizę krzywej topnienia (65-95 °C) z przyrostem 0,5 °C przy 2-5 s/krok lub użyj domyślnego ustawienia urządzenia.
      UWAGA: Reakcja ta została znormalizowana przy użyciu uniwersalnej mieszanki SYBR Green. Startery zalecane do analizy polaryzacji M-DM wymieniono w tabeli 2.
  12. Znormalizować wyniki, używając jako genu odniesienia eukariotycznego czynnika wydłużenia translacji 1 alfa 1 (EEF1A1) i sprawdzić swoistość amplifikowanych produktów poprzez analizę krzywych dysocjacji.
    UWAGA: Analiza krzywej dysocjacji pozwala potwierdzić obecność w reakcji tylko jednego produktu amplifikacji qPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na podstawie naszej kilkuletniej pracy nad charakteryzacją makrofagów, ustaliliśmy dokładną kombinację markerów, która wyraźnie odróżnia różne podzbiory M-DM in vitro. Markery fenotypu zostały wybrane na podstawie literatury i szerokiego wcześniejszego badania, które wcześniej przeprowadziliśmy9,14,15,16,17. Ponadto ustaliliśmy, że CD64, CD206, CD163,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie, aktywacja i polaryzacja makrofagów stały się głównym przedmiotem zainteresowania w immunologii, homeostazie tkanek, patogenezie chorób i rozwiązywaniu stanów zapalnych. Ponadto wyłaniający się obraz, że makrofagi tkankowe mogą pochodzić z krążących monocytów w warunkach zakłóconej homeostazy, podkreśla konieczność precyzyjnych modeli M-DM charakteryzujących się zdefiniowanymi fenotypami, programami transkrypcyjnymi i szlakami aktywacji.

W tym miejscu należy omówić kilka krytyczny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Agencję Promocji Nauki i Technologii (ANPCyT-FONCYT) poprzez granty PICT 2018-3070 i 2021-I-A-00807 dla E.A.C.S. i PICT 2021-I-A-00716 dla A.E.E, oraz przez Narodową Radę Badań Naukowych i Technicznych (CONICET) poprzez grant 2022-0763 oraz przez Uniwersytet w Buenos Aires poprzez Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 do A.E.E., E.A.C.S. i A.E.E. są zawodowymi badaczami w CONICET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysz Alexa Fluor 488 anty-ludzka  Klon przeciwciała CD206 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 321113; RRID:AB_571874
Mysz APC klon przeciwciała anty-ludzkiego CD64 10.1BioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 305013; RRID:AB_1595539
APC/Cy7 szczurzy klon przeciwciała przeciw myszy/ludzkiemu CD11b M1/70BioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix / CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USACat# 554714zestaw utrwalający/przepuszczalny
Biotyna anty-ludzka Przeciwciało MERTK klon 590H11G1E3BioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 367616; RRID:AB_2721500 
Sprzęt CFX-Connect Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA
Zestaw pozytywnej selekcji człowieka EasySep CD14; Koktajl EasySep Pozytywna Selekcja; EasySep Nanocząstki magnetyczne; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, KanadaKat# 18058
Cytometr Canto FACS Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone.
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, Nowa Zelandia Gibco&handel;   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA Stany Zjednoczone 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Nauki Przyrodnicze, USAKat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
Pryzmat GraphPad   Oprogramowanie GraphPad Inc.RRID:SCR_002798
Zestaw do syntezy cDNA iScript, zawiera 5x mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji, odwrotną transkryptazę iScript, wodę wolną od nukleazBio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1708891
Cytometr kosmiczny Partec CyFlow Sysmex Partec, Niemcy
PE StreptavidinBioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 405203
PE/Cy7 mysi klon przeciwciała anty-ludzkiego CD14 HCD14BioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 325618; RRID:AB_830691
Mysi klon przeciwciała anty-ludzkiego CD163 PerCP/Cy5.5 GHI/61BioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 ŚredniGibco&handel;   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA Stany Zjednoczone 		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, zawiera Sso7d fusió za pośrednictwem przeciwciał na gorąco; n polimerazy, dNTP, MgCl2, SYBR Green I Dye, wzmacniacze, stabilizatory i mieszanka pasywnych barwników referencyjnych (w tym ROX i fluoresceina).Bio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1725271
TriZol OdczynnikThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad, CA, USA 		Kat#  15596026odczynnik do ekstrakcji RNA
Zombie Violet Fixable Viability KitBioLegend, San Diego, CA, USA.Kot# 423113

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R. Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity. Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).
  4. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  5. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  6. Olexen, C. M., et al. Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition. Clin Immunol. 263, 110203(2024).
  7. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  8. Das, A., et al. Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration. Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Carrera Silva, E. A., et al. CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis. Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).
  11. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  12. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  13. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection. PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).
  14. Ambarus, C. A., et al. Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages. J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).
  15. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  16. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  17. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  18. Tiemessen, M. M., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).
  19. Bosurgi, L., et al. Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells. Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).
  20. Sanin, D. E., et al. A common framework of monocyte-derived macrophage activation. Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).
  21. Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).
  22. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction. J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).
  23. Mccoll, A., et al. Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages. J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).
  24. Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
  25. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  26. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  27. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  28. Hawley, K. L., et al. IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages. Front Immunol. 8, 1227(2017).
  29. Akinrinmade, O. A., et al. CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases. Biomedicines. 5 (3), 56(2017).
  30. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  31. Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages. Front Immunol. 6, 253(2015).
  32. Martinez, F. O., et al. Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences. Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).
  33. Platanitis, E., Decker, T. Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation. Front Immunol. 9, 2542(2018).
  34. Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149 (2), 274-293 (2012).
  35. Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling. Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).
  36. Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways. Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

Powiązane artykuły