Artykuł metodologiczny

Skuteczna jednoosobowa technika pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych

DOI:

10.3791/67669

⸱

28 marca 2025

 , 
1Department of Nutritional Sciences, Rutgers -The State University of New Jersey, 2Rutgers Center for Lipid Research, Rutgers -The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje, jak złożyć urządzenie, które może być używane do zbierania mleka od myszy laboratoryjnych. To urządzenie jest niedrogie, przenośne i umożliwia pobranie 0,1–0,5 ml mleka przez jedną przeszkoloną osobę. Dołączony jest również szczegółowy protokół doju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele gryzoni są powszechnie używane w biologii od początku XX wieku do badania podstawowych mechanizmów fizjologicznych i biochemicznych. W badaniach nad laktacją i rozwojem noworodków istnieje potrzeba pobrania próbki mleka w celu określenia składu i sposobu, w jaki manipulacje eksperymentalne mogą wpływać na mleko, wpływając w ten sposób na rozwój noworodka. Zbieranie biopłynów w wystarczających ilościach od małych gryzoni może być trudne. Kilka badań wykazało różne techniki pozyskiwania mleka od myszy. Jednak techniki te często wymagają co najmniej dwóch przeszkolonych pracowników, co w niektórych przypadkach może być trudne.

Tutaj demonstrujemy technikę modyfikowanego pobierania próbek mleka opartą na metodzie opublikowanej w 2009 roku. Dzięki tej niedrogiej i łatwej w montażu metodzie, jedna przeszkolona osoba może rutynowo uzyskać 0,1–0,5 ml mleka od matki pod narkozą w mniej niż 10 minut. Korzystając z tej metody, zebraliśmy wystarczającą ilość mleka w 2. dniu po porodzie (PD2) i 10. dniu po porodzie (PD10). Zmierzyliśmy składniki makroskładników odżywczych mleka i porównaliśmy je z istniejącą literaturą, aby potwierdzić naszą metodę zbierania.

Odnotowaliśmy, że na PD2 białko mleka wynosiło średnio 70,1 ± 5,2 g/L, tłuszcz mleczny wynosił 174,4 ± 7,1 g/L, a laktoza mleczna wynosiła 12,3 ± 0,6 g/L. W PD10, podczas gdy laktoza i białko mleka pozostały w podobnych stężeniach jak w PD2, tłuszcz mleczny był znacznie wyższy (224,4 ± 17,1 g/l). Zaobserwowaliśmy również, że względna obfitość poszczególnych białek mleka wahała się między PD2 a PD10. Mówiąc dokładniej, αS1-kazeina i kwaśne białko serwatkowe były wyższe, podczas gdy β-kazeina była niższa przy PD10 w porównaniu z PD2. Ogólnie rzecz biorąc, demonstrujemy skuteczną jednoosobową technikę pobierania próbek mleka od myszy za pomocą urządzenia, które można łatwo zmontować z powszechnie używanym sprzętem laboratoryjnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Medycyna porównawcza odnosi się do idei, że ludzie i inne zwierzęta mają podobieństwa w anatomii i fizjologii; tak więc informacje uzyskane od jednego gatunku mogą być wykorzystane do badania podobnych ścieżek w drugim1,2. Od początku XX wieku gryzonie, w szczególności myszy i szczury, są szeroko wykorzystywane w badaniach biomedycznych ze względu na stosunkowo łatwą manipulację genetyczną w celu opracowania modeli chorób1,2. Dodatkowo są stosunkowo niewielkie; W związku z tym do utrzymania kolonii potrzeba mniej zasobów w porównaniu z innymi modelami ssaków innych niż gryzonie2. Jednak ich małe rozmiary ciała wiążą się również z wyzwaniami. Niektórych procedur nie można łatwo wykonać na myszach. Na przykład technikę różnicowania tętniczo-żylnego można przeprowadzić na szczurach3,4,5, ale może to być trudne u myszy, ponieważ ich małe naczynia krwionośne mogą łatwo pęknąć6,7. Ilość tkanki, którą można pobrać od myszy, jest również ograniczona. Na przykład u myszy w okresie laktacji trzewna tkanka tłuszczowa znacznie się zmniejsza8,9, a w niektórych przypadkach do prawie niewykrywalnych ilości. Ponadto pobieranie próbek płynu biologicznego od myszy jest również ograniczone pod względem ilości; W zależności od techniki, objętość pobieranej krwi może się różnić, ale zawsze jest nieco ograniczona7, co ogranicza liczbę analiz, które można wykonać.

W badaniach nad laktacją i rozwojem noworodków istnieje potrzeba pobrania próbki mleka w celu oceny składu i wydajności mlecznej. W badaniach przeprowadzonych na myszach, ze względu na ograniczoną objętość mleka, próbki są często łączone z kilku matek, aby uzyskać odpowiednią ilość10. Liczne badania demonstrują techniki pobierania wystarczających objętości analitycznych mleka z pojedynczej myszy 11,12,13. Metody te wymagają jednak zazwyczaj dwóch przeszkolonych pracowników11,12: jeden do trzymania zwierzęcia podczas ręcznego odciągania pokarmu, a drugi do zbierania mleka za pomocą pipety; lub wymagają sprzętu i narzędzi, które nie są łatwo dostępne w laboratorium. Tutaj demonstrujemy modyfikację techniki opracowanej przez DePetersa i Hoveya14. Urządzenie używane w tej procedurze można łatwo zmontować ze sprzętem dostępnym w laboratorium lub łatwo zakupić u popularnych dostawców. Korzystając z tego urządzenia, jedna osoba może rutynowo uzyskać 0,1–0,5 ml mleka mysiego w mniej niż 10 minut, aby wykorzystać je do większości analiz. Pobraliśmy mleko w 2. dniu po porodzie (PD2, wczesna laktacja) i 10. dniu po porodzie (PD10, szczyt laktacji) i zmierzyliśmy makroskładniki odżywcze mleka, aby zwalidować metodę.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów były zgodne z wytycznymi federalnymi i otrzymały zgodę od Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rutgers. Samice myszy (tło C57BL/6) kryto w wieku 8 tygodni. Były karmione standardową karmą hodowlaną ad libitum i trzymane w regularnym cyklu 12:12 h światło:ciemność. Dzień dostawy został policzony jako dzień po dostawie 1 (PD1). W przypadku PD2 (wczesna laktacja) i PD10 (szczyt laktacji) próbki mleka pobierano w sposób opisany poniżej.

1. Montaż urządzenia udojowego

    Przymocuj jeden koniec rurki z polichlorku winylu (PVC) o średnicy wewnętrznej 5/32 '' (ID) do pompy próżniowej i użyj taśmy, aby zabezpieczyć mocowanie (oznaczone w Rysunek 1A).
  1. UWAGA: Pompę próżniową można zastąpić dowolną odpowiednią pompą lub odkurzaczem centralnym (czasami nazywanym "odkurzaczem domowym") dostępnym w laboratorium.
  2. Przymocuj drugi koniec rurki PVC o średnicy wewnętrznej 5/32 cala do rurki PVC o średnicy wewnętrznej 1/8 cala za pomocą prostego łącznika kolczastego.
  3. Przymocuj drugi koniec rurki PVC 1/8'' ID do igły podskórnej 18G za pomocą łącznika (oznaczonego b w Rysunek 1A).
  4. Odetnij koniec końcówki pipety P200 o ~0,2 cm, aby utworzyć większy otwór. Włóż końcówkę pipety P200 przez otwór korka przegrody tak, aby końcówka była skierowana do góry (Rysunek 1B).
    UWAGA: Wymieniaj końcówki pipet między zwierzętami.
  5. Przymocuj korek do przegrody ustnej do sterylnej probówki zbiorczej. Wykonać nakłucie przez korek przegrody za pomocą igły podskórnej 18 G.
  6. Sprawdź ciśnienie ssania, włączając pompę próżniową i przykładając palec (pokryty rękawicą laboratoryjną) do otworu końcówki pipety.
    UWAGA: Powinieneś poczuć delikatne ssanie, jeśli jest prawidłowo zmontowany. Probówka zbiorcza, igła podskórna 18 G i końcówki do pipet P200 powinny być sterylne.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Urządzenie udojowe. (A) Urządzenie udojowe z pompą próżniową przymocowaną do igły podskórnej 18 G za pomocą rurki z PVC. Igła przechodzi przez korek przegrody, który jest przymocowany do probówki zbiorczej mikrowirówki. Odwrócona końcówka pipety P-200, która służy do pobierania mleka ze smoczka, jest wprowadzana przez otwór w korku przegrody. (B) Schemat przekroju poprzecznego urządzenia udojowego. C) Dojenie matki przy użyciu opisanej metody. (D) Reprezentatywna podwielokrotność (0,3 ml) mleka pobranego od matki w szczytowym okresie laktacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Oddzielenie matki od szczeniąt

  1. W dniu doju należy oddzielić matkę od jej młodych, aby umożliwić gromadzenie się mleka w gruczołach.
  2. Utrzymuj szczenięta w cieple w gnieździe.
  3. Należy odczekać 2 godziny separacji, jeśli mleko jest zbierane we wczesnej laktacji (np. PD2 w tym badaniu).
  4. Odczekaj 30–45 minut separacji, jeśli mleko jest zbierane w szczycie laktacji (np. PD10 w tym badaniu).

3. Znieczulenie matki

  1. Gdy matka jest gotowa do dojenia, należy wstrzyknąć roztwór ketaminy/ksylazyny (dootrzewnowy, i.p.) po jednej stronie jamy otrzewnej między 4. a 5. parą strzyków.
    UWAGA: Ilość roztworu znieczulającego, który należy podać, oblicza się na podstawie masy matki (80–100 mg/kg ketaminy, 5–12 mg/kg ksylazyny, zgodnie z protokołem IACUC Uniwersytetu Rutgers). Dawka ta uspokaja mysz na 45–60 minut, zapewniając wystarczająco dużo czasu na pobranie mleka.
  2. Potwierdź znieczulenie, mocno ściskając stopę, ale bez jej zranienia, aby przetestować percepcję czucia i bólu przez zwierzę. Odpowiednie znieczulenie jest wskazane przez brak jakiegokolwiek ruchu.
  3. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną na oczy matki, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.

4. Odbiór mleka

  1. Umieść znieczuloną koferdam na plecach na solidnej powierzchni roboczej. Delikatnie przetrzyj obszar sutka sterylną chusteczką nasączoną alkoholem, aby oczyścić obszar przed dojeniem.
  2. Podawać 1-2 jednostki oksytocyny (i.p.) między 4. a 5. parą strzyków po stronie jamy otrzewnej, która nie została wstrzyknięta.
    UWAGA: Oksytocyna to mała cząsteczka, która może być szybko wchłonięta i ma krótki okres półtrwania 14,15. Dój powinien rozpocząć się w ciągu minuty po wstrzyknięciu.
  3. Przytrzymaj koferdam, delikatnie muskając jej szyję ręką niedominującą.
  4. Ręcznie odciągaj pokarm ze smoczka, ściskając tkankę sutkową od podstawy do czubka smoczka, aż będzie widoczna kropla mleka.
  5. Włącz urządzenie próżniowe, włączając przycisk zasilania.
  6. Dój należy rozpocząć od delikatnego przyłożenia odwróconej końcówki pipety P200 do smoczka. Użyj delikatnego ruchu ciągnięcia, aby pomóc wyciągnąć mleko (Rysunek 1C).
  7. Powtarzać czynności 4.4–4.6 na wszystkich strzykach, aż do uzyskania wystarczającej ilości mleka.
    UWAGA: Podczas doju mleko może zostać przypadkowo pobrane do igły podskórnej 18 G lub rurki PVC przewodu próżniowego. Można temu łatwo zaradzić, wymieniając igłę lub rurkę PVC przed dojeniem następnego zwierzęcia.

5. Odzyskiwanie matki po odbiorze mleka

  1. Włóż znieczuloną matkę do klatki z jej młodymi i trzymaj się w cieple. Monitoruj zwierzę, aż odzyska przytomność.
    UWAGA: Matka może odmówić ponownego karmienia, jeśli pozwoli się jej obudzić samodzielnie w oddzielnej klatce przed powrotem do swoich młodych. Jest to bardziej powszechne, gdy pobieranie mleka odbywa się we wczesnej laktacji (PD2).
  2. Pozwól matce odsunąć się od jej szczeniąt, aby w pełni się zregenerować, gdy zacznie się budzić; jest to normalne zachowanie.
    UWAGA: Obserwujemy, że matki okresowo wracają do swoich młodych i wracają do pełnego karmienia po kilku godzinach.

6. Analiza mleka

  1. Użyj dostępnego w handlu zestawu do oznaczania laktozy (patrz Tabela materiałów), aby zmierzyć laktozę w mleku. Rozcieńczyć mleko 75x sterylną wodą i wykonać test zgodnie z protokołem zestawu.
  2. Zmierz zawartość tłuszczu mlecznego za pomocą metody creamatocrit opisanej w innych publikacjach16,17.
  3. Oszacuj białko mleka, wykonując test białka Bradforda18 z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem19. Przed wykonaniem testu należy odwirować mleko o sile 4 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przed badaniem ekstrahować infranatant przez pipetowanie i rozcieńczyć go w stosunku 1:10 sterylną wodą.
  4. Wykonać elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE); oddzielić 10 μg białka od prefabrykowanego żelu Bis-Tris o stężeniu 4%–12% zgodnie z instrukcją producenta. Przenieś białka na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) i wybarwić je Coomassie Blue R-250.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej techniki, udało nam się pobrać próbki wystarczającej ilości mleka w różnych momentach podczas 21-dniowej laktacji. Za dzień porodu uznajemy dzień po porodzie 1 (PD1), a w tej pracy pobraliśmy próbki mleka w PD2 (wczesna laktacja) i PD10 (szczyt laktacji), n = 4 każde. Z łatwością uzyskaliśmy 0,1–0,5 ml mleka od każdej matki (Ryc. 1D). Aby zwalidować tę metodę, zmierzyliśmy skład makroskładników odżywczych brutto tych próbek mleka i porównaliśmy różnice między mlekiem zebranym we wczesnej laktacji a szczytem laktacji za pomocą testu t Studenta.

Stwierdziliśmy, że stężenie laktozy w mleku wynosiło średnio 12,3 ± 0,6 g/L na PD2 i 12,0 ± 0,9 g/L na PD10 (Tabela 1). Zawartość tłuszczu w mleku wynosiła odpowiednio 26,0 ± 1,0% i 33,4 ± 2,5% odpowiednio dla PD2 i PD10. Stężenie tłuszczu w PD2 wynosiło 174,4 ± 7,1 g/l i istotnie wyższe 224,4 ± 17,1 g/l w PD10 (tab. 1). Średnia zawartość białka wynosiła 70,1 ± 5,2 g/l w PD2 i 75,1 ± 2,6 g/l w PD10 (tab. 1). Chociaż całkowita zawartość białka mleka nie różniła się między PD2 a PD10, względna obfitość poszczególnych białek mleka była różna. W szczególności αS1-kazeina i kwaśne białko serwatkowe były wyższe w mleku PD10 niż w mleku PD2 (p < 0,05), podczas gdy β-kazeina (p < 0,05) wykazywała wyższą obfitość w PD2 niż PD10 (Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 2: Analiza białka mleka. (A) Analiza PAGE Coomassie zabarwiona na niebiesko mleka zebranego w PD2 i PD10. Identyfikacja białka została przeprowadzona w sposób opisany wcześniej14. (B) Poszczególne sygnały białkowe analizowano w ImageJ i normalizowano do barwionego białka całkowitego. Wyniki zostały wyrażone jako średnia ze standardowymi słupkami błędów, a poszczególne punkty danych jako kropki. Średnią obfitość każdego białka w PD2 i PD10 porównano za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. *p < 0,05, n = 4. Skróty: PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; PDn = dzień po dostawie n. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt.
średniaSemWartość p
Laktoza
(g/L)		PD2 powiedział:Rozdział 12.30,60.75
Płyta PD1012,00,9
Tłuszcz
(g/L)		PD2 powiedział:174,47,10.04
Płyta PD10224,4Rozdział 17.1
Białko
(g/L)		PD2 powiedział:70,15.20.42
Płyta PD1075,12.6

Tabela 1: Skład makroskładników odżywczych w mleku zebranym w PD2 i PD10. Wyniki, wyrażone jako średnia i błąd standardowy średniej (SEM), analizowano w celu zbadania wpływu dnia laktacji na skład mleka za pomocą dwustronnego testu t-Studenta, n = 4.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zademonstrowaliśmy zmodyfikowaną technikę doju, która może być wykonywana przez jedną osobę za pomocą urządzenia, które można łatwo zmontować i przenosić. Tradycyjnie, mleko gryzoni zbiera się za pomocą kapilar10,17, szklanych pipet Pasteura12 lub mikropipet11. Metody te wymagają, aby jedna osoba przytrzymywała matkę i ręcznie odciągała mleko, a inna zbierała mleko. Czasami może to być trudne, zwłaszcza gdy pobieranie próbek mleka odbywa się w weekendy lub święta. Mleko zebrane tymi metodami musi zostać przeniesione do sterylnych probówek do przechowywania. Ponieważ mleko gryzoni jest stosunkowo bogate w tłuszcz (jak wykazano tutaj i w innych badaniach20,21), a zatem jest lepkie, proces przenoszenia mleka prawdopodobnie powoduje utratę objętości mleka, co ogranicza ilości do analiz. Opisywane tutaj urządzenie można zmontować w mniej niż 5 minut za pomocą narzędzi dostępnych w laboratorium. Może być z łatwością używany przez jedną osobę do pobierania próbki wystarczającej ilości mleka w ciągu 10 minut. Ciągłe, delikatne ssanie związane z tą metodą łagodzi problem utraty próbki w wyniku przenoszenia, ponieważ mleko jest stale wciągane prosto do rurki zbiorczej. Minimalizacja strat próbki jest szczególnie ważna w przypadku zbierania mleka już w PD2, ponieważ wiadomo, że uzysk mleka jest na tym etapie stosunkowo niski10. Co więcej, to samo urządzenie i protokół zostały użyte do pomyślnego zebrania mleka od innego szczepu myszy (tło FVB/N), co sugeruje, że ta metoda prawdopodobnie działa równie dobrze w przypadku szczepów myszy.

W tym badaniu zaobserwowaliśmy również, że czas separacji może się różnić w zależności od etapu laktacji. Wcześniejsze badania donoszą, że matki powinny być oddzielone od swoich młodych na co najmniej 2 godziny i do 16 godzin przed pobraniem mleka, aby uzyskać wystarczającą objętość mleka11,13. Stosując tę metodę, stwierdziliśmy, że oddzielenie matek od ich młodych na 2 godziny we wczesnej laktacji (PD2) i tylko na 30–45 minut w szczycie laktacji (PD10) było wystarczające do uzyskania odpowiedniej objętości mleka. Ponieważ matka potrzebuje dodatkowego czasu, aby dojść do siebie po znieczuleniu, zminimalizowanie czasu separacji nie tylko skraca czas pobierania próbek, ale także zmniejsza potencjalny wpływ, jaki może to stanowić na matkę i jej młode.

Ponadto odkryliśmy, że zbieranie mleka już w PD2 może negatywnie wpływać na późniejszy wzrost młodych ze względu na długi czas separacji i rekonwalescencji matki, co prowadzi do okresu niewystarczającego karmienia. Nie zaobserwowano tego, gdy próbki mleka pobierano w szczytowym okresie laktacji (PD10). W związku z tym, jeśli badacz jest zainteresowany pobraniem próbek mleka w różnych punktach czasowych w ciągu 21-dniowego okresu laktacji, zaleca się pobranie próbki mleka we wczesnej laktacji z oddzielnej grupy matek. Pobieranie mleka może być jednak wielokrotnie przeprowadzane na tej samej matce w szczycie i pod koniec laktacji w przypadku badań podłużnych.

Alternatywnie badacze mogą zdecydować się na inne środki znieczulające, aby zminimalizować czas rekonwalescencji tamy. Na przykład inhalacja izofluranu może pomóc w skróceniu czasu rekonwalescencji, ponieważ zwierzęta zazwyczaj szybko wracają do zdrowia po odstawieniu izofluranu22. Chociaż ten wybór znieczulenia jest wykonywany przez wiele osób13,23, doniesiono, że inhalacja izofluranu może negatywnie wpływać na objętość pobieranego mleka13. Dodatkowo inhalacja izofluranu wymaga odpowiedniej aparatury, aby zapewnić precyzyjną kontrolę dawkowania. Badania nad wpływem środków znieczulających, takich jak ketamina/ksylazyna i izofluran, na laktację i skład mleka oraz ich potencjalny transfer do mleka kobiecego są ograniczone 24,25,26. W związku z tym zaleca się, aby interpretacja danych była starannie przeprowadzana podczas porównywania badań z zastosowaniem różnych metod znieczulenia. Inną alternatywą jest pobranie próbki mleka bez znieczulenia, jak opisali inni badacze 14,27,28,29. Procedura ta może jednak potencjalnie powodować nadmierny stres matki i wymagać dodatkowej osoby do unieruchomienia zwierzęcia.

Badanie to wykazało również, że testy makroskładników odżywczych można przeprowadzić na podstawie próbek mleka, a nadwyżka pozostała na więcej procedur, takich jak analizy omiczne. Poziomy laktozy, białka i tłuszczu w mleku zostały zmierzone i porównane z opublikowanymi danymi w celu walidacji opisanej metody. Stężenie laktozy w mleku stanowiło ~1,2% składnika mleka, co jest podobne do stężenia myszy na diecie kontrolnej opisanej w innych badaniach 30,31,32. Potwierdzono, że mleko myszy ma wysoki procent tłuszczu, wynoszący od 26% do 33%, jak podawano wcześniej20,30. Całkowite stężenie białka zgłoszone tutaj było podobne do tego zgłoszonego przez Chen i wsp.30, ale niższe niż to zgłoszone w innych badaniach31,32. Jeśli chodzi o zmiany od wczesnej laktacji do szczytowej laktacji, stwierdziliśmy, że poziomy laktozy i białka pozostały względnie stałe, ale procent tłuszczu mlecznego wzrósł od wczesnego do szczytu laktacji. Nie zgadza się to z Ragueneau32, ale rozbieżność może wynikać z różnic w wielkości próby. Chociaż całkowite stężenie białka było podobne między wczesną a szczytową laktacją, stwierdziliśmy, że obfitość poszczególnych białek (αS1-kazeina, β-kazeina i kwaśne białko serwatkowe) różniła się, prawdopodobnie odzwierciedlając zmiany w potrzebach noworodków na różnych etapach rozwoju.

Chociaż technika ta nie pozwala na ilościowe określenie produkcji mleka, można ją obliczyć za pomocą wskaźnika wydajności (IOP) zaproponowanego przez Falconera w 1947 r.33. Produkcja mleka w dużej mierze zależy od wielkości miotu i dnia pobrania próbek. Wskaźnik ten może być stosowany jako miara produkcji mleka z uwzględnieniem różnic w wielkości miotu. Na przykład cały miot można zważyć na PD10 (gdy matka jest oddzielona w celu pobrania próbek mleka). Ciśnienie wewnątrzgałkowe matki oblicza się następnie, dzieląc masę jej miotu przez średnią masę miotów tej samej wielkości na PD10. Podsumowując, demonstrujemy skuteczną technikę pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych przez jedną osobę za pomocą urządzenia, które można łatwo zmontować za pomocą stosunkowo niedrogiego i łatwo dostępnego sprzętu. Technika ta pozwala na konsekwentne pobieranie wystarczającej ilości mleka dla większości analiz.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NJAES Hatch Project 14190 i NIH R21HD 108496.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki kriogeniczne 1 mlCorning430658Preferowane do wczesnego pobierania mleka
Strzykawka 1 mlExel26048
Probówka do mikrowirówki o pojemności 2 mlFisher Scientific02-681-344Preferowana do szczytowego i późnego pobierania mleka
Igła podskórna 18 GBD PrecisionGlide305195
27 G igła podskórnaBD PrecisionGlide305109
Chusteczka nasączona alkoholemHoneywell154818
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnikaBio-Rad5000006
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Immobilon -P Membrana PVDFImmobilonIPVH00010
KetaminaDechra1000001250Zakupione za pośrednictwem Gabinetu Weterynaryjnego 
Taśma do etykietowania laboratoryjnegoVWR International89097
Zestaw do oznaczania laktozySigma-AldrichMAK487
Mini Złączki polipropylenowe z zadzioramiCole-Parmer Instrument Company6365-90
Dieta myszyLab Diet5015
NuPAGE Bis-Tris Mini żele białkowe, 4– 12%InvitrogenNP0335BOX
Optixcare Eye LubeAventixN/A zakupionyw gabinecie weterynaryjnym 
OksytocynaBimeda1OXY015zakupiona za pośrednictwem gabinetu weterynaryjnego 
Końcówki do pipet P200GilsonF1733001
Rurka PVC: 1/8'' IDVWR InternationalMFLX07407-75 
Rurki PVC: 5/32'' IDVWR InternationalMFLX07407-77
Korek przegrodyChemglass Life SciencesCG-3022-91
Pompa próżniowaDrummond Scientific Co.P-103635
XylazineAkorn Animal HealthNDC 59399-110-20Zakupiony za pośrednictwem Gabinetu Weterynaryjnego 
barwnika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Mo Med. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Watford, M., Erbelding, E. J., Smith, E. M. Glutamine metabolism in rat small intestine: Response to lactation. Biochem Soc Trans. 14 (6), 1058-1059 (1986).
  4. Robinson, A. M., Williamson, D. H. Comparison of glucose metabolism in the lactating mammary gland of the rat in vivo and in vitro. Effects of starvation, prolactin or insulin deficiency. Biochem J. 164 (1), 153-159 (1977).
  5. Kowalski, T. J., Wu, G., Watford, M. Rat adipose tissue amino acid metabolism in vivo as assessed by microdialysis and arteriovenous techniques. Am J Physiol. 273 (3 Pt 1), E613-E622 (1997).
  6. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  7. Hallemeesch, M. M., Ten Have, G. A., Deutz, N. E. Metabolic flux measurements across portal drained viscera, liver, kidney and hindquarter in mice. Lab Animal. 35 (1), 101-110 (2001).
  8. Le, H., Nguyen, M., Manso, H. E. C., Wang, M. D., Watford, M. Adipocytes are the only site of glutamine synthetase expression within the lactating mouse mammary gland. Curr Dev Nutr. 8 (6), 102168(2024).
  9. Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: The extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
  10. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 84 (1), 127-133 (1986).
  11. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), e51007(2014).
  12. Muranishi, Y., et al. Method for collecting mouse milk without exogenous oxytocin stimulation. Biotechniques. 60 (1), 47-49 (2016).
  13. Gómez-Gallego, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (mus musculus). Anales de Veterinaria de Murcia. 29, 55-61 (2014).
  14. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  15. Oxytocin- oxytocin injection. , https://dailymed.nlm.nih.gov/dailymed/fda/fdaDrugXsl.cfm?setid=a9b62187-4141-487c-a9da-f42ad7f9b408&type=display (2019).
  16. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: Simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  17. Paul, H. A., Hallam, M. C., Reimer, R. A. Milk collection in the rat using capillary tubes and estimation of milk fat content by creamatocrit. J Vis Exp. (106), e53476(2015).
  18. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford protein assay. J Vis Exp. (38), e1918(1918).
  19. Hueso, D., Fontecha, J., Gomez-Cortes, P. Comparative study of the most commonly used methods for total protein determination in milk of different species and their ultrafiltration products. Front Nutr. 9, 925565(2022).
  20. Anderson, S. M., Rudolph, M. C., Mcmanaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: It's not just about milk protein synthesis. Breast Cancer Res. 9 (1), 204(2007).
  21. Meier, H., Hoag, W. G., Mcburney, J. J. Chemical characterization of inbred-strain mouse milk. I. Gross composition and amino acid analysis. J Nutr. 85 (3), 305-308 (1965).
  22. Hohlbaum, K., et al. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in c57bl/6jrj mice-assessing the degree of distress. PLoS One. 12 (6), e0179588(2017).
  23. Weaver, S. R., et al. Serotonin deficiency rescues lactation on day 1 in mice fed a high fat diet. PLoS One. 11 (9), e0162432(2016).
  24. Statement on resuming breastfeeding after anesthesia. , Committee on Obstetric Anesthesia. https://www.asahq.org/standards-and-practice-parameters/statement-on-resuming-breastfeeding-after-anesthesia (2009).
  25. Lee, J. J., Rubin, A. P. Breast feeding and anaesthesia. Anaesthesia. 48 (7), 616-625 (1993).
  26. Reece-Stremtan, S., Campos, M., Kokajko, L. Academy of Breastfeeding, M. Abm clinical protocol #15: Analgesia and anesthesia for the breastfeeding mother, revised 2017. Breastfeed Med. 12 (9), 500-506 (2017).
  27. Oosting, A., Verkade, H. J., Kegler, D., Van De Heijning, B. J., Van Der Beek, E. M. Rapid and selective manipulation of milk fatty acid composition in mice through the maternal diet during lactation. J Nutr Sci. 4, e19(2015).
  28. Silverman, J., Stone, D. W., Powers, J. D. The lipid composition of milk from mice fed high or low fat diets. Lab Animal. 26 (2), 127-131 (1992).
  29. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Animal. 29 (4), 450-455 (1995).
  30. Chen, Y., et al. Effect of high-fat diet on secreted milk transcriptome in midlactation mice. Physiol Genomics. 49 (12), 747-762 (2017).
  31. Kucia, M., et al. High-protein diet during gestation and lactation affects mammary gland mrna abundance, milk composition and pre-weaning litter growth in mice. Animal. 5 (2), 268-277 (2011).
  32. Ragueneau, S. Early development in mice. Iv: Quantity and gross composition of milk in five inbred strains. Physiol Behav. 40 (4), 431-435 (1987).
  33. Falconer, D. S. Milk production in mice. J Agric Sci. 37 (3), 224-235 (1947).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Milk SamplingLaboratory MiceLactation ResearchRodent Milk CollectionSingle Person TechniqueMilk MacronutrientsOxytocin AdministrationVacuum Pump MethodMammary GlandMilk Protein Analysis

Powiązane artykuły