Artykuł metodologiczny

Skuteczna jednoosobowa technika pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67669

⸱

28 marca 2025

 , 
1Department of Nutritional Sciences, Rutgers -The State University of New Jersey, 2Rutgers Center for Lipid Research, Rutgers -The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje, jak złożyć urządzenie, które może być używane do zbierania mleka od myszy laboratoryjnych. To urządzenie jest niedrogie, przenośne i umożliwia pobranie 0,1–0,5 ml mleka przez jedną przeszkoloną osobę. Dołączony jest również szczegółowy protokół doju.

Streszczenie

Modele gryzoni są powszechnie używane w biologii od początku XX wieku do badania podstawowych mechanizmów fizjologicznych i biochemicznych. W badaniach nad laktacją i rozwojem noworodków istnieje potrzeba pobrania próbki mleka w celu określenia składu i sposobu, w jaki manipulacje eksperymentalne mogą wpływać na mleko, wpływając w ten sposób na rozwój noworodka. Zbieranie biopłynów w wystarczających ilościach od małych gryzoni może być trudne. Kilka badań wykazało różne techniki pozyskiwania mleka od myszy. Jednak techniki te często wymagają co najmniej dwóch przeszkolonych pracowników, co w niektórych przypadkach może być trudne.

Tutaj demonstrujemy technikę modyfikowanego pobierania próbek mleka opartą na metodzie opublikowanej w 2009 roku. Dzięki tej niedrogiej i łatwej w montażu metodzie, jedna przeszkolona osoba może rutynowo uzyskać 0,1–0,5 ml mleka od matki pod narkozą w mniej niż 10 minut. Korzystając z tej metody, zebraliśmy wystarczającą ilość mleka w 2. dniu po porodzie (PD2) i 10. dniu po porodzie (PD10). Zmierzyliśmy składniki makroskładników odżywczych mleka i porównaliśmy je z istniejącą literaturą, aby potwierdzić naszą metodę zbierania.

Odnotowaliśmy, że na PD2 białko mleka wynosiło średnio 70,1 ± 5,2 g/L, tłuszcz mleczny wynosił 174,4 ± 7,1 g/L, a laktoza mleczna wynosiła 12,3 ± 0,6 g/L. W PD10, podczas gdy laktoza i białko mleka pozostały w podobnych stężeniach jak w PD2, tłuszcz mleczny był znacznie wyższy (224,4 ± 17,1 g/l). Zaobserwowaliśmy również, że względna obfitość poszczególnych białek mleka wahała się między PD2 a PD10. Mówiąc dokładniej, αS1-kazeina i kwaśne białko serwatkowe były wyższe, podczas gdy β-kazeina była niższa przy PD10 w porównaniu z PD2. Ogólnie rzecz biorąc, demonstrujemy skuteczną jednoosobową technikę pobierania próbek mleka od myszy za pomocą urządzenia, które można łatwo zmontować z powszechnie używanym sprzętem laboratoryjnym.

Wprowadzenie

Medycyna porównawcza odnosi się do idei, że ludzie i inne zwierzęta mają podobieństwa w anatomii i fizjologii; tak więc informacje uzyskane od jednego gatunku mogą być wykorzystane do badania podobnych ścieżek w drugim1,2. Od początku XX wieku gryzonie, w szczególności myszy i szczury, są szeroko wykorzystywane w badaniach biomedycznych ze względu na stosunkowo łatwą manipulację genetyczną w celu opracowania modeli chorób1,2. Dodatkowo są stosunkowo niewielkie; W związku z tym do utrzymania kolonii potrzeba mniej zasobów w porównaniu z innymi modelami ssaków innych niż gryzonie2. Jednak ich małe rozmiary ciała wiążą się również z wyzwaniami. Niektórych procedur nie można łatwo wykonać na myszach. Na przykład technikę różnicowania tętniczo-żylnego można przeprowadzić na szczurach3,4,5, ale może to być trudne u myszy, ponieważ ich małe naczynia krwionośne mogą łatwo pęknąć6,7. Ilość tkanki, którą można pobrać od myszy, jest również ograniczona. Na przykład u myszy w okresie laktacji trzewna tkanka tłuszczowa znacznie się zmniejsza8,9, a w niektórych przypadkach do prawie niewykrywalnych ilości. Ponadto pobieranie próbek płynu biologicznego od myszy jest również ograniczone pod względem ilości; W zależności od techniki, objętość pobieranej krwi może się różnić, ale zawsze jest nieco ograniczona7, co ogranicza liczbę analiz, które można wykonać.

W badaniach nad laktacją i rozwojem noworodków istnieje potrzeba pobrania próbki mleka w celu oceny składu i wydajności mlecznej. W badaniach przeprowadzonych na myszach, ze względu na ograniczoną objętość mleka, próbki są często łączone z kilku matek, aby uzyskać odpowiednią ilość10. Liczne badania demonstrują techniki pobierania wystarczających objętości analitycznych mleka z pojedynczej myszy 11,12,13. Metody te wymagają jednak zazwyczaj dwóch przeszkolonych pracowników11,12: jeden do trzymania zwierzęcia podczas ręcznego odciągania pokarmu, a drugi do zbierania mleka za pomocą pipety; lub wymagają sprzętu i narzędzi, które nie są łatwo dostępne w laboratorium. Tutaj demonstrujemy modyfikację techniki opracowanej przez DePetersa i Hoveya14. Urządzenie używane w tej procedurze można łatwo zmontować ze sprzętem dostępnym w laboratorium lub łatwo zakupić u popularnych dostawców. Korzystając z tego urządzenia, jedna osoba może rutynowo uzyskać 0,1–0,5 ml mleka mysiego w mniej niż 10 minut, aby wykorzystać je do większości analiz. Pobraliśmy mleko w 2. dniu po porodzie (PD2, wczesna laktacja) i 10. dniu po porodzie (PD10, szczyt laktacji) i zmierzyliśmy makroskładniki odżywcze mleka, aby zwalidować metodę.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi federalnymi i uzyskały zatwierdzenie Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Rutgers. Samice myszy (tło C57BL/6) były kojone w wieku 8 tygodni. Otrzymywały standardową karmę dla hodowców ad libitum i były utrzymywane w regularnym 12:12-godzinnym cyklu światło:ciemność. Dzień porodu liczono jako 1. dzień po porodzie (PD1). W dniu PD2 (wczesna laktacja) oraz PD10 (szczyt laktacji) pobrano próbki mleka zgodnie z opisem poniżej.

1. Montaż urządzenia do udoju

  1. Podłącz jeden koniec rurki z polichlorku winylu (PVC) o średnicy wewnętrznej (ID) 5/32'', a następnie zabezpiecz połączenie za pomocą taśmy (oznaczone literą a na Rysunku 1A).
    UWAGA: Pompę próżniową można zastąpić jakąkolwiek odpowiednią pompą lub centralnym systemem próżniowym (tzw. „próżnią laboratoryjną”) dostępnym w laboratorium.
  2. Podłącz drugi koniec rurki PVC o ID 5/32'' do rurki PVC o ID 1/8'' za pomocą prostego łącznika z karbem.
  3. Podłącz drugi koniec rurki PVC o ID 1/8'' do igły hipodermicznej 18G za pomocą łącznika (oznaczone literą b na Rysunku 1A).
  4. Odetnij końcówkę tipu do pipety P200 na około 0,2 cm, aby stworzyć większy otwór. Wsuń tip do pipety P200 przez otwór w zatyczce z septą tak, aby tip był skierowany ku górze (Rysunek 1B).
    UWAGA: Wymieniaj tipy do pipet pomiędzy zwierzętami.
  5. Mocuj zatyczkę z septą do sterylnej probówki zbiorczej. Wykonaj nakłucie przez zatyczkę z septą za pomocą igły hipodermicznej 18 G.
  6. Sprawdź ciśnienie ssania, włączając pompę próżniową i przykładając palec (w rękawiczce laboratoryjnej) do otworu tipu pipety.
    UWAGA: Jeśli układ został poprawnie złożony, powinno być wyczuwalne delikatne ssanie. Probówka zbiorcza, igła hipodermiczna 18 G oraz tipy do pipety P200 powinny być sterylne.

Proces udoju; schemat pompy próżniowej; eksperyment na myszach; pobieranie próbek do probówki.
Rysunek 1: Urządzenie do udoju. (A) Urządzenie do udoju z pompą próżniową podłączoną do igły hipodermicznej 18 G za pomocą rurki PVC. Igła przechodzi przez korek z septem przymocowany do probówki do wirowania służącej do zbierania próbek. Odwrócony końcówka pipety P-200, służąca do pobierania mleka z sutka, jest włożona przez otwór w korku z septem. (B) Schemat przekroju urządzenia do udoju. (C) Samica poddawana udojowi opisaną metodą. (D) Reprezentatywna porcja (0,3 mL) mleka pobranego od samicy w szczycie laktacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. Oddzielenie matki od szczeniąt

  1. W dniu udoju oddziel matkę od młodych, aby umożliwić gromadzenie się mleka w gruczołach.
  2. Utrzymuj młode w cieple w gnieździe.
  3. W przypadku pobierania mleka we wczesnej fazie laktacji (np. PD2 w niniejszym badaniu) zastosuj 2 h separacji.
  4. W przypadku pobierania mleka w szczycie laktacji (np. PD10 w niniejszym badaniu) zastosuj 30–45 min separacji.

3. Znieczulenie samicy

  1. Gdy samica będzie gotowa do udoju, podaj wtryskowo roztwór ketaminy/ksylazyny (dojecznie, i.p.) do jednej strony jamy otrzewnej pomiędzy 4th a 5th parą sutków.
    UWAGA: Ilość podawanego roztworu anestetyka oblicza się na podstawie masy samicy (80–100 mg/kg ketaminy, 5–12 mg/kg ksylazyny, zgodnie z protokołem IACUC Uniwersytetu Rutgers). Taka dawka uspokoi mysz na 45–60 min, zapewniając wystarczającą ilość czasu na pobranie mleka.
  2. Potwierdź znieczulenie, mocno, ale bez powodowania urazu, ściskając stopę, aby sprawdzić percepcję doznań i bólu u zwierzęcia. O odpowiednim znieczuleniu świadczy brak jakiegokolwiek ruchu.
  3. Nałóż weterynaryjną maść do oczu na gałki oczne samicy, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia.

4. Pobieranie mleka

  1. Umieść znieczuloną samicę na plecach na stabilnej powierzchni roboczej. Delikatnie przemyj okolicę gruczołów mlecznych sterylną chusteczką nasączoną alkoholem, aby oczyścić ten obszar przed udojem.
  2. Podaj 1–2 jednostki oksytocyny (i.p.) pomiędzy 4.ą a 5.ą parą suteczek po stronie jamy otrzewnej, w którą nie wprowadzono wcześniej żadnego zastrzyku.
    UWAGA: Oksytocyna jest małą cząsteczką, która może być szybko wchłaniana i ma krótki okres półtrwania 14,15. Udoj należy rozpocząć w ciągu minuty od podania zastrzyku.
  3. Przytrzymaj samicę, delikatnie chwytając ją za kark niedominującą ręką.
  4. Ręcznie wyciśnij mleko z suteczki, ściskając tkankę gruczołu mlekowego od podstawy do czubka suteczki, aż pojawi się kropla mleka.
  5. Włącz urządzenie próżniowe, naciskając przycisk zasilania.
  6. Rozpocznij udoj, delikatnie przykładając odwróconą końcówkę pipety P200 do suteczki. Wykonuj delikatne ruchy ciągnące, aby pomóc w wydobyciu mleka (Rycina 1C).
  7. Powtórz kroki 4.4–4.6 dla wszystkich suteczek, aż do zebrania odpowiedniej objętości mleka.
    UWAGA: Podczas udoju mleko może przypadkowo zostać zaciągnięte do igły hipodermicznej 18 G lub PVC rurki linii próżniowej. Można to łatwo naprawić, wymieniając igłę lub rurkę PVC przed udojem kolejnego zwierzęcia.

5. Rekonwalescencja samicy po pobraniu mleka

  1. Zwróć znieczuloną samicę do klatki z młodymi i utrzymuj ją w cieple. Monitoruj zwierzę do momentu odzyskania przez nią przytomności.
    UWAGA: Samica może odmówić ponownego karmienia, jeśli pozwoli się jej obudzić w osobnej klatce przed powrotem do młodych. Zjawisko to występuje częściej, gdy pobieranie mleka odbywa się we wczesnej fazie laktacji (PD2).
  2. Gdy samica zacznie się budzić, pozwól jej oddalić się od młodych w celu pełnej regeneracji; jest to normalne zachowanie.
    UWAGA: Obserwuje się, że samice okresowo wracają do młodych i w pełni wznawiają karmienie po kilku godzinach.

6. Analiza mleka

  1. Użyj komercyjnego zestawu do oznaczania laktozy (patrz Tabela materiałów) w celu oznaczenia zawartości laktozy w mleku. Rozcieńczyć mleko 75-krotnie w wodzie sterylnej i przeprowadzić analizę zgodnie z protokołem zestawu.
  2. Należy zmierzyć zawartość tłuszczu w mleku metodą krematokrytyczną, opisaną w innych publikacjach.16,17.
  3. Oznaczenie zawartości białek w mleku za pomocą metody Bradforda18 z albuminąy wołową jako standardem19Przed przeprowadzeniem analizy odwiruj mleko przy 4 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °CNależy pobrać infranadpłyn za pomocą pipety i rozcieńczyć go w stosunku 1:10 sterylną wodą przed przeprowadzeniem analizy.
  4. Przeprowadź elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE); rozdziel 10 µg białek na gotowym żelu Bis-Tris 4%–12% zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie należy przenieść białka na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) i zabarwić je błękitem Coomassie R-250.

Wyniki

Stosując tę technikę, z powodzeniem pobraliśmy wystarczającą ilość mleka w różnych odstępach czasu podczas 21-dniowego okresu laktacji. Za pierwszy dzień po porodzie (PD1) uznaliśmy dzieńy urodzenia, a w niniejszej pracy pobieraliśmy próbki mleka w PD2 (wczesna laktacja) oraz PD10 (szczyt laktacji), przy n = 4 dla każdego z tych terminów. Z łatwością uzyskaliśmy 0,1–0,5 mL mleka od każdej matki (Rycina 1D). Aby zwalidować tę metodę, zmierzyliśmy ogólny skład makroskładników tych próbek mleka i porównaliśmy różnice między mlekiem pobranym we wczesnej i szczytowej fazie laktacji za pomocą testu t Studenta.

Stwierdzono, że stężenie laktozy w mleku wynosiło średnio 12,3 ± 0,6 g/L w dniu PD2 oraz 12,0 ± 0,9 g/L w dniu PD10 (Tabela 1). Procentowa zawartość tłuszczu mlecznego wyniosła odpowiednio 26,0 ± 1,0% w dniu PD2 i 33,4 ± 2,5% w dniu PD10. Stężenie tłuszczu wynosiło 174,4 ± 7,1 g/L w dniu PD2 i było istotnie wyższe, osiągając 224,4 ± 17,1 g/L w dniu PD10 (Tabela 1). Średnia zawartość białek wynosiła 70,1 ± 5,2 g/L w dniu PD2 oraz 75,1 ± 2,6 g/L w dniu PD10 (Tabela 1). Chociaż całkowita zawartość białek w mleku nie różniła się pomiędzy PD2 a PD10, różniła się względna obfitość poszczególnych białek mlecznych. Konkretnie, poziom αS1-kazeiny oraz kwasowego białka serwatkowego był wyższy w mleku z PD10 niż w mleku z PD2 (p < 0,05), natomiast β-kazeina (p < 0,05) wykazywała większą obfitość w PD2 niż w PD10 (Rysunek 2).

SDS-PAGE i wykres słupkowy analizujący wzorce ekspresji białek; próbki PD2 vs PD10; względna obfitość.
Rysunek 2: Analiza białek mleka. (A) Analiza PAGE z barwieniem błękitem Coomassie dla mleka pobranego w PD2 i PD10. Identyfikację białek przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem14. (B) Poszczególne sygnały białkowe analizowano w programie ImageJ i normalizowano względem całkowitej ilości barwionego białka. Wyniki przedstawiono jako średnią z słupkami błędów standardowych, a poszczególne punkty danych jako kropki. Średnią liczność każdego białka w dniu PD2 i PD10 porównano za pomocą dwustronnego testu Studenta. t-test. *p < 0,05, n = 4. Skróty: PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; PDn = n-ty dzień po urodzeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

ŚredniaSEM (skaningowa mikroskopia elektronowa)wartość p
Laktoza
(g/L)		PD212.30.60.75
PD1012.00.9
Tłuszcz
(g/L)		PD2174.47.10.04
PD10224.417.1
Białko
(g/L)		PD270.15.20.42
PD1075.12.6

Tabela 1: Skład makroskładników mleka pobranego w dniach PD2 i PD10. Wyniki, przedstawione jako średnia i błąd standardowy średniej (SEM), zostały poddane analizie w celu zbadania wpływu dnia laktacji na skład mleka przy użyciu obustronnego testu t Student’a, n = 4.

Dyskusja

Zademonstrowaliśmy zmodyfikowaną technikę doju, która może być wykonywana przez jedną osobę za pomocą urządzenia, które można łatwo zmontować i przenosić. Tradycyjnie, mleko gryzoni zbiera się za pomocą kapilar10,17, szklanych pipet Pasteura12 lub mikropipet11. Metody te wymagają, aby jedna osoba przytrzymywała matkę i ręcznie odciągała mleko, a inna zbierała mleko. Czasami może to być trudne, zwłaszcza gdy pobieranie próbek mleka odbywa się w weekendy lub święta. Mleko zebrane tymi metodami musi zostać przeniesione do sterylnych probówek do przechowywania. Ponieważ mleko gryzoni jest stosunkowo bogate w tłuszcz (jak wykazano tutaj i w innych badaniach20,21), a zatem jest lepkie, proces przenoszenia mleka prawdopodobnie powoduje utratę objętości mleka, co ogranicza ilości do analiz. Opisywane tutaj urządzenie można zmontować w mniej niż 5 minut za pomocą narzędzi dostępnych w laboratorium. Może być z łatwością używany przez jedną osobę do pobierania próbki wystarczającej ilości mleka w ciągu 10 minut. Ciągłe, delikatne ssanie związane z tą metodą łagodzi problem utraty próbki w wyniku przenoszenia, ponieważ mleko jest stale wciągane prosto do rurki zbiorczej. Minimalizacja strat próbki jest szczególnie ważna w przypadku zbierania mleka już w PD2, ponieważ wiadomo, że uzysk mleka jest na tym etapie stosunkowo niski10. Co więcej, to samo urządzenie i protokół zostały użyte do pomyślnego zebrania mleka od innego szczepu myszy (tło FVB/N), co sugeruje, że ta metoda prawdopodobnie działa równie dobrze w przypadku szczepów myszy.

W tym badaniu zaobserwowaliśmy również, że czas separacji może się różnić w zależności od etapu laktacji. Wcześniejsze badania donoszą, że matki powinny być oddzielone od swoich młodych na co najmniej 2 godziny i do 16 godzin przed pobraniem mleka, aby uzyskać wystarczającą objętość mleka11,13. Stosując tę metodę, stwierdziliśmy, że oddzielenie matek od ich młodych na 2 godziny we wczesnej laktacji (PD2) i tylko na 30–45 minut w szczycie laktacji (PD10) było wystarczające do uzyskania odpowiedniej objętości mleka. Ponieważ matka potrzebuje dodatkowego czasu, aby dojść do siebie po znieczuleniu, zminimalizowanie czasu separacji nie tylko skraca czas pobierania próbek, ale także zmniejsza potencjalny wpływ, jaki może to stanowić na matkę i jej młode.

Ponadto odkryliśmy, że zbieranie mleka już w PD2 może negatywnie wpływać na późniejszy wzrost młodych ze względu na długi czas separacji i rekonwalescencji matki, co prowadzi do okresu niewystarczającego karmienia. Nie zaobserwowano tego, gdy próbki mleka pobierano w szczytowym okresie laktacji (PD10). W związku z tym, jeśli badacz jest zainteresowany pobraniem próbek mleka w różnych punktach czasowych w ciągu 21-dniowego okresu laktacji, zaleca się pobranie próbki mleka we wczesnej laktacji z oddzielnej grupy matek. Pobieranie mleka może być jednak wielokrotnie przeprowadzane na tej samej matce w szczycie i pod koniec laktacji w przypadku badań podłużnych.

Alternatywnie badacze mogą zdecydować się na inne środki znieczulające, aby zminimalizować czas rekonwalescencji tamy. Na przykład inhalacja izofluranu może pomóc w skróceniu czasu rekonwalescencji, ponieważ zwierzęta zazwyczaj szybko wracają do zdrowia po odstawieniu izofluranu22. Chociaż ten wybór znieczulenia jest wykonywany przez wiele osób13,23, doniesiono, że inhalacja izofluranu może negatywnie wpływać na objętość pobieranego mleka13. Dodatkowo inhalacja izofluranu wymaga odpowiedniej aparatury, aby zapewnić precyzyjną kontrolę dawkowania. Badania nad wpływem środków znieczulających, takich jak ketamina/ksylazyna i izofluran, na laktację i skład mleka oraz ich potencjalny transfer do mleka kobiecego są ograniczone 24,25,26. W związku z tym zaleca się, aby interpretacja danych była starannie przeprowadzana podczas porównywania badań z zastosowaniem różnych metod znieczulenia. Inną alternatywą jest pobranie próbki mleka bez znieczulenia, jak opisali inni badacze 14,27,28,29. Procedura ta może jednak potencjalnie powodować nadmierny stres matki i wymagać dodatkowej osoby do unieruchomienia zwierzęcia.

Badanie to wykazało również, że testy makroskładników odżywczych można przeprowadzić na podstawie próbek mleka, a nadwyżka pozostała na więcej procedur, takich jak analizy omiczne. Poziomy laktozy, białka i tłuszczu w mleku zostały zmierzone i porównane z opublikowanymi danymi w celu walidacji opisanej metody. Stężenie laktozy w mleku stanowiło ~1,2% składnika mleka, co jest podobne do stężenia myszy na diecie kontrolnej opisanej w innych badaniach 30,31,32. Potwierdzono, że mleko myszy ma wysoki procent tłuszczu, wynoszący od 26% do 33%, jak podawano wcześniej20,30. Całkowite stężenie białka zgłoszone tutaj było podobne do tego zgłoszonego przez Chen i wsp.30, ale niższe niż to zgłoszone w innych badaniach31,32. Jeśli chodzi o zmiany od wczesnej laktacji do szczytowej laktacji, stwierdziliśmy, że poziomy laktozy i białka pozostały względnie stałe, ale procent tłuszczu mlecznego wzrósł od wczesnego do szczytu laktacji. Nie zgadza się to z Ragueneau32, ale rozbieżność może wynikać z różnic w wielkości próby. Chociaż całkowite stężenie białka było podobne między wczesną a szczytową laktacją, stwierdziliśmy, że obfitość poszczególnych białek (αS1-kazeina, β-kazeina i kwaśne białko serwatkowe) różniła się, prawdopodobnie odzwierciedlając zmiany w potrzebach noworodków na różnych etapach rozwoju.

Chociaż technika ta nie pozwala na ilościowe określenie produkcji mleka, można ją obliczyć za pomocą wskaźnika wydajności (IOP) zaproponowanego przez Falconera w 1947 r.33. Produkcja mleka w dużej mierze zależy od wielkości miotu i dnia pobrania próbek. Wskaźnik ten może być stosowany jako miara produkcji mleka z uwzględnieniem różnic w wielkości miotu. Na przykład cały miot można zważyć na PD10 (gdy matka jest oddzielona w celu pobrania próbek mleka). Ciśnienie wewnątrzgałkowe matki oblicza się następnie, dzieląc masę jej miotu przez średnią masę miotów tej samej wielkości na PD10. Podsumowując, demonstrujemy skuteczną technikę pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych przez jedną osobę za pomocą urządzenia, które można łatwo zmontować za pomocą stosunkowo niedrogiego i łatwo dostępnego sprzętu. Technika ta pozwala na konsekwentne pobieranie wystarczającej ilości mleka dla większości analiz.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NJAES Hatch Project 14190 i NIH R21HD 108496.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fiolki kriogeniczne 1 mlCorning430658Preferowane do wczesnego pobierania mleka
Strzykawka 1 mlExel26048
Probówka do mikrowirówki o pojemności 2 mlFisher Scientific02-681-344Preferowana do szczytowego i późnego pobierania mleka
Igła podskórna 18 GBD PrecisionGlide305195
27 G igła podskórnaBD PrecisionGlide305109
Chusteczka nasączona alkoholemHoneywell154818
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnikaBio-Rad5000006
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Immobilon -P Membrana PVDFImmobilonIPVH00010
KetaminaDechra1000001250Zakupione za pośrednictwem Gabinetu Weterynaryjnego 
Taśma do etykietowania laboratoryjnegoVWR International89097
Zestaw do oznaczania laktozySigma-AldrichMAK487
Mini Złączki polipropylenowe z zadzioramiCole-Parmer Instrument Company6365-90
Dieta myszyLab Diet5015
NuPAGE Bis-Tris Mini żele białkowe, 4– 12%InvitrogenNP0335BOX
Optixcare Eye LubeAventixN/A zakupionyw gabinecie weterynaryjnym 
OksytocynaBimeda1OXY015zakupiona za pośrednictwem gabinetu weterynaryjnego 
Końcówki do pipet P200GilsonF1733001
Rurka PVC: 1/8'' IDVWR InternationalMFLX07407-75 
Rurki PVC: 5/32'' IDVWR InternationalMFLX07407-77
Korek przegrodyChemglass Life SciencesCG-3022-91
Pompa próżniowaDrummond Scientific Co.P-103635
XylazineAkorn Animal HealthNDC 59399-110-20Zakupiony za pośrednictwem Gabinetu Weterynaryjnego 
barwnika

Bibliografia

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Mo Med. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Watford, M., Erbelding, E. J., Smith, E. M. Glutamine metabolism in rat small intestine: Response to lactation. Biochem Soc Trans. 14 (6), 1058-1059 (1986).
  4. Robinson, A. M., Williamson, D. H. Comparison of glucose metabolism in the lactating mammary gland of the rat in vivo and in vitro. Effects of starvation, prolactin or insulin deficiency. Biochem J. 164 (1), 153-159 (1977).
  5. Kowalski, T. J., Wu, G., Watford, M. Rat adipose tissue amino acid metabolism in vivo as assessed by microdialysis and arteriovenous techniques. Am J Physiol. 273 (3 Pt 1), E613-E622 (1997).
  6. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  7. Hallemeesch, M. M., Ten Have, G. A., Deutz, N. E. Metabolic flux measurements across portal drained viscera, liver, kidney and hindquarter in mice. Lab Animal. 35 (1), 101-110 (2001).
  8. Le, H., Nguyen, M., Manso, H. E. C., Wang, M. D., Watford, M. Adipocytes are the only site of glutamine synthetase expression within the lactating mouse mammary gland. Curr Dev Nutr. 8 (6), 102168(2024).
  9. Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: The extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
  10. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 84 (1), 127-133 (1986).
  11. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), e51007(2014).
  12. Muranishi, Y., et al. Method for collecting mouse milk without exogenous oxytocin stimulation. Biotechniques. 60 (1), 47-49 (2016).
  13. Gómez-Gallego, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (mus musculus). Anales de Veterinaria de Murcia. 29, 55-61 (2014).
  14. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  15. Oxytocin- oxytocin injection. , https://dailymed.nlm.nih.gov/dailymed/fda/fdaDrugXsl.cfm?setid=a9b62187-4141-487c-a9da-f42ad7f9b408&type=display (2019).
  16. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: Simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  17. Paul, H. A., Hallam, M. C., Reimer, R. A. Milk collection in the rat using capillary tubes and estimation of milk fat content by creamatocrit. J Vis Exp. (106), e53476(2015).
  18. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford protein assay. J Vis Exp. (38), e1918(1918).
  19. Hueso, D., Fontecha, J., Gomez-Cortes, P. Comparative study of the most commonly used methods for total protein determination in milk of different species and their ultrafiltration products. Front Nutr. 9, 925565(2022).
  20. Anderson, S. M., Rudolph, M. C., Mcmanaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: It's not just about milk protein synthesis. Breast Cancer Res. 9 (1), 204(2007).
  21. Meier, H., Hoag, W. G., Mcburney, J. J. Chemical characterization of inbred-strain mouse milk. I. Gross composition and amino acid analysis. J Nutr. 85 (3), 305-308 (1965).
  22. Hohlbaum, K., et al. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in c57bl/6jrj mice-assessing the degree of distress. PLoS One. 12 (6), e0179588(2017).
  23. Weaver, S. R., et al. Serotonin deficiency rescues lactation on day 1 in mice fed a high fat diet. PLoS One. 11 (9), e0162432(2016).
  24. Statement on resuming breastfeeding after anesthesia. , Committee on Obstetric Anesthesia. https://www.asahq.org/standards-and-practice-parameters/statement-on-resuming-breastfeeding-after-anesthesia (2009).
  25. Lee, J. J., Rubin, A. P. Breast feeding and anaesthesia. Anaesthesia. 48 (7), 616-625 (1993).
  26. Reece-Stremtan, S., Campos, M., Kokajko, L. Academy of Breastfeeding, M. Abm clinical protocol #15: Analgesia and anesthesia for the breastfeeding mother, revised 2017. Breastfeed Med. 12 (9), 500-506 (2017).
  27. Oosting, A., Verkade, H. J., Kegler, D., Van De Heijning, B. J., Van Der Beek, E. M. Rapid and selective manipulation of milk fatty acid composition in mice through the maternal diet during lactation. J Nutr Sci. 4, e19(2015).
  28. Silverman, J., Stone, D. W., Powers, J. D. The lipid composition of milk from mice fed high or low fat diets. Lab Animal. 26 (2), 127-131 (1992).
  29. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Animal. 29 (4), 450-455 (1995).
  30. Chen, Y., et al. Effect of high-fat diet on secreted milk transcriptome in midlactation mice. Physiol Genomics. 49 (12), 747-762 (2017).
  31. Kucia, M., et al. High-protein diet during gestation and lactation affects mammary gland mrna abundance, milk composition and pre-weaning litter growth in mice. Animal. 5 (2), 268-277 (2011).
  32. Ragueneau, S. Early development in mice. Iv: Quantity and gross composition of milk in five inbred strains. Physiol Behav. 40 (4), 431-435 (1987).
  33. Falconer, D. S. Milk production in mice. J Agric Sci. 37 (3), 224-235 (1947).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Badania nad laktacjpobieranie mleka od gryzonimakrosk adniki mlekapodawanie oksytocynymetoda pompy pr niowejgruczo mlekowyanaliza bia ek mleka
Skuteczna jednoosobowa technika pobierania próbek mleka od myszy laboratoryjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.