Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Summary

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Abstract

Urazy skóry inicjują złożoną kaskadę regeneracyjną, która angażuje różne typy komórek. Wśród nich komórki glejowe obwodowe odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu sukcesu procesu naprawy. Jednak nasza wiedza na temat tych procesów pozostaje niepełna ze względu na ograniczenia obecnych technologii. Dlatego zastosowano metodę iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) do charakteryzowania zmian w składzie komórkowym skóry za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko białkom eksprysowanym przez kluczowe typy komórek i struktury zaangażowane w regenerację tkanek. Co ważne, przeciwciała skierowane przeciwko markerom proliferacji komórek często zaniżają liczbę komórek dzielących się w skórze. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, chemia Click-iT EdU została połączona z metodą IBEX, co pozwoliło na szczegółową charakterystykę proliferujących typów komórek. Korzystając z w pełni zautomatyzowanego obrotowego mikroskopu konfokalnego dyskowego, opracowano wysokoprzepustowy workflow do iteracyjnego obrazowania próbek podzielonych na płytki 24-dołkowe. Poza rozszerzeniem metody IBEX do oceny stanów komórek in situ za pomocą Click-iT EdU, wprowadzono także nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów do korekcji, łączenia i rejestracji obrazów, który może być używany przez badaczy bez dużego doświadczenia programistycznego. Ponadto dostarczona jest szczegółowa dokumentacja dotycząca przetwarzania i wizualizacji wysoce multipleksowanych danych obrazowych (przy użyciu konwencjonalnego oprogramowania do analizy obrazów, w tym Fiji i QuPath). Podsumowując, protokół ten podkreśla wszechstronność protokołu IBEX i pokazuje jego adaptację do ugruntowanej konwencjonalnej platformy obrazowania. Warto zauważyć, że połączenie IBEX z oznakowaniem Click-iT EdU umożliwia wykrywanie i kategoryzację aktywnie dzielących się typów komórek w nienaruszonych tkankach oraz podczas wysoce dynamicznych procesów o rozdzielczości przestrzennej.

Introduction

Skóra jest największym organem ludzkiego ciała i pierwotną barierą chroniącą ciało przed środowiskiem zewnętrznym¹. W konsekwencji jest narażona na szereg zewnętrznych wyzwań, które ograniczają jego funkcję bariery. Dlatego skóra rozwinęła złożone mechanizmy przywracające integralność i funkcjonalność tkanek po uszkodzeniu. Gojenje ran skórnych przebiega w trzech nakładających się etapach: zapalenie, proliferacja oraz dojrzewanie/przebudowanie. Te trzy etapy obejmują kilka różnych typów komórek, takich jak włókniki skórne i komórki odpornościowe, które współdziałają w celu przywrócenia początkowych właściwości biologicznych uszkodzonej tkanki skóry ^1,2,3.

Skóra jest narządem o gęstym unerwieniu i wiadomo, że unerwienie nerwów jest kluczowe dla pomyślnego procesu naprawy ^4,5,6. Poza sygnalizacją aksonalną ^4,7,8, glej obwodowy, zwykle oplatający aksony, uczestniczy w pomyślnej regeneracji tkanek ^9,10,11. Jednak rola niedostatecznie reprezentowanych typów komórek, takich jak obwodowe komórki glejowe, pozostaje słabo poznana w dynamicznych procesach, takich jak regeneracja tkanek skóry. Aby lepiej określić funkcję tych komórek, kluczowe jest przeanalizowanie mikrośrodowiska komórkowego oraz sąsiednich typów komórek, z którymi mogą one oddziaływać podczas procesu regeneracji. Ponadto, ponieważ proliferacja komórek jest kluczowym etapem regeneracji tkanek, ważne jest dokładne wykrywanie i klasyfikowanie typów proliferujących się komórek w trakcie procesu naprawy.

Opracowano multipleksowane, wysoko-contentowe, metody obrazowania optycznego, takie jak IBEX¹², które służą do charakteryzacji składu komórkowego, wizualizacji i ilościowej identyfikacji interakcji między komórkami oraz rozkładania wzorców mikrośrodowiskowych w złożonych tkankach w rozdzielczości przestrzennej. Podczas gdy inne metody multipleksowania wymagają specjalistycznych instrumentów i zastrzeżonych odczynników, szczególną zaletą IBEX jest możliwość jego ustanowienia przy stosunkowo niskich kosztach, korzystając z komercyjnie dostępnych przeciwciał, odczynników i mikroskopów dostępnych w standardowym środowisku badawczym. Podczas gdy przeciwciała anty-Ki-67, często stosowane w panelach IBEX, niezawodnie oznaczają proliferujące się typy komórek w wielu tkankach^13,14, liczba komórek Ki-67-dodatnich (Ki-67+) została zaniżona w porównaniu z innymi metodami w stałych przekrojach mrożonej tkanki ostrych ran skóry myszy. Dlatego połączyliśmy chemię Click-iT EdU z IBEX i stwierdziliśmy, że liczba komórek EdU⁺ dokładniej odzwierciedla całkowitą liczbę komórek proliferujących uzyskaną innymi metodami.

Ponadto, dzięki zastosowaniu w pełni zautomatyzowanego obrotowego mikroskopu konfokalnego dyskowego, ustanowiono wysokoprzepustowy workflow do iteracyjnego obrazowania przekrojów tkanek umieszczonych na 24-dołkowej płycie. Powstałe obrazy są następnie przetwarzane przez połączenie wielu otwartych narzędzi Pythona w nowy pipeline przetwarzania obrazów, który koryguje obrazy pod kątem nierównomiernego oświetlenia, wykonuje łączenie poszczególnych kafelków, a ostatecznie rejestruje obrazy. Szczegółowo, biblioteka BaSiCPy¹⁵ była wykorzystywana do korekcji oświetlenia, biblioteka m2stitch do łączenia obrazów oraz korelacja fazowo-krzyżowa do rejestracji cyklu. Zarejestrowane obrazy są zapisywane jako OME-TIFF i mogą być następnie ładowane do konwencjonalnego oprogramowania do analizy obrazów, takich jak Fiji¹⁷ i QuPath¹⁸, gdzie obrazy są następnie dalej przetwarzane, a także kategoryzacja typów komórek i inne pomiary, takie jak obliczanie intensywności i odległości. Łącznie obecny protokół pozwolił nam przeprowadzić szczegółową, bardzo efektywną charakterystykę głównych typów komórek regenerującej się skóry, ze szczególnym uwzględnieniem mikrośrodowiska komórkowego otaczającego populację obwodowych komórek glejowych.

Protocol

Wszystkie hodowle, zakwaterowanie i eksperymenty prowadzone były zgodnie z wytycznymi gabinetu weterynaryjnego kantonu Zurych w Szwajcarii.

1. Rany skóry o pełnej grubości (Dzień 0)

1. Indukuj myszy w wieku 8-10 tygodni z 5% izofluranem w 70%_O2 i utrzymuj to przy użyciu 2,5% izofluranu.
2. Ogol skórę z tyłu i dokładnie ją oczyścić.
3. Dezynfekuj przed zabiegiem za pomocą mydła antybakteryjnego i roztworu 70% EtOH.
4. Należy stosować przedoperacyjne środki przeciwbólowe za pomocą podskórnego zastrzyku buprenorfiny (30 μg∙mg∙kg⁻¹).
5. Ugeneruj cztery okrągłe rany wycinające o pełnej grubości o średnicy 5 mm na dolnej części skóry pleców każdego zwierzęcia, po dwie z każdej strony, 1 cm od linii środkowej zwierzęcia i około 2 cm od siebie oddalone^{o 19} mm.
6. Wykonaj analgezję pooperacyjną z trzydniową terapią buprenorfiną w wodzie pitnej (9 μg/mL z 2% sacharozą).
7. Pozwól ranom się zagoić bez opatrunku.
8. Pobieranie ran w określonych punktach czasowych do badania histologicznego i analizy cytometrii przepływowej.
9. W przypadku protokołu IBEX należy rozciąć i utrwalić tkanki skóry roztworem 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc. Użyj komercyjnie dostępnej kapsułki do biopsji, aby zapobiec zwijaniu próbek podczas utrwalania. Krioprotekcjonuj tkanki o stężeniu 4% PFA w 30% sacharozie w PBS na noc w temperaturze 4 °C. Przelej tkanki do mieszaniny 1:1 30% sacharozy z związkiem O.C.T na 2 godziny w RT, a następnie zanurz w O.C.T. przed zamrożeniem w izopentanie.

2. Przygotowanie próbki (dzień 1)

1. Posmaruj płytę 24-dołkową 200 μL żelatyny chromowo-aluminiowej przez 15 minut na wstrząsance z kołyskami. Następnie całkowicie usuń żelatynę i susz powłokę przez 60 minut w piekarniku o temperaturze 40 °C. Podwójnie potrzebnych studni jako zapasowe. Dodaj 2 mL PBS na dołek.
   UWAGA: Upewnij się, że powłoka jest całkowicie sucha przed nałożeniem chusteczki. Studnie można również pokryć dzień wcześniej i wysuszyć przez noc w RT. Po powleknięciu nie przechowuj powłokowanych dołków w lodówce ani zamrażarce, a dla najlepszych efektów użyj powłokowanej płyty z 24 dołkami w ciągu 1-2 dni.
2. Tkankę osadzoną w O.C.T. przetnij na 15-30 μm w kriostatie i szybko przenieś ją do powłokowanej dołki zawierającej 2 mL PBS.
   UWAGA: Tkankę można przenosić za pomocą metalowej szpatułki lub kleszczy.
3. Ostrożnie usuń PBS pipetą o pojemności 1 mL, starając się utrzymać przekrój tkanki wyśrodkowany w dołku. Aby skutecznie to zrobić, powoli zasysaj PBS od krawędzi dołka, regulując pozycję pipety w razie potrzeby, aby zapobiec przesuwaniu się tkanki.
   UWAGA: Precyzyjne umiejscowienie tkanki jest kluczowe dla powodzenia protokołu. Gdy tkanka przylega do powierzchni powłoki, nie można jej przesunąć.
4. Susz fragmenty chusteczki przez 1 godzinę w piekarniku o temperaturze 37 °C.

3. Blokowanie tkanek, reakcja EdU Click-iT oraz immunoznakowanie przeciwciała, cykl IBEX 1 (dzień 1)

1. Nawilżaj się 1 ml PBS przez 5 minut.
2. Przepuszczaj tkankę 500 μL 0,5% tritonu w PBS przez 30 minut w RT.
3. Krótko umyj chusteczkę 2 razy PBS.
4. Wykonaj reakcję Click-iT, zgodnie z instrukcjami producenta, przez 30 minut w RT.
   UWAGA: Chroń próbki przed światłem.
5. Krótko umyj chusteczkę 2 razy PBS.
6. Blokuj tkankę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą bufora blokującego.
   UWAGA: W tym eksperymencie użyto 10% surowicy osła w PBS, ale można ją dostosować w razie potrzeby; Każdy bufor blokujący zgodny ze standardowymi protokołami immunoznakowania jest odpowiedni.
7. Na pierwszy cykl należy nałożyć przeciwciała pierwotne (rozcieńczone w buforze blokującym; patrz Tabelę materiałów) na pierwszy cykl przez noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Blokowanie i immunoznakowanie można również przeprowadzić przez ~1 godzinę za pomocą mikrofalówki niegrzejczej, jak opisano w Radtke i in. ¹². Jednak dla ran skórnych najlepszy stosunek sygnału do szumu uzyskuje się, gdy przeciwciała pierwotne są inkubowane przez noc. Immunoznakowane fragmenty tkanek można przechowywać w PBS przez kilka dni przed badaniem obrazowym. Obrazowanie zaleca się następnego dnia dla optymalnej jakości sygnału.

4. Wtórne immunoznakowanie przeciwciał i jądrowe barwienie przeciwbarwne (dzień 2)

1. Przemyj studnie 3 x 1 mL PBS.
2. Inkubuj przekrój tkanki barwieniem przeciwciał przeciwtorowych przeciwciał przeciwkrólicznych (1:300) w roztworze blokującym, wraz z barwieniem przeciwjądrowym Hoechst 1:1,000, przez 1 godzinę w stanie RT w ciemności.
3. Myj 3 x 5 minut z 1 mL PBS na RT.
4. Zostaw ~500 μL PBS w każdym dołku i przynieś płytkę do mikroskopu.
   UWAGA: Może to być punkt przerwy: próbki są stabilne przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale stosunek sygnału do szumu jest najlepszy przy obrazowaniu w ciągu 24 godzin od immunoznakowania.

5. Ustawienie mikroskopu i obrazowanie pierwszego cyklu IBEX (dzień 2)

1. Zaloguj się do mikroskopu, załaduj oprogramowanie i zaloguj się do profilu użytkownika.
2. Wejdź w konfigurację akwizycji (otwórz przez Screening | Acquisition Setup) do konfiguracji protokołu i akwizycji obrazów.
3. Użyj przycisku Eject , aby załadować płytkę do mikroskopu.
4. Tuż przed umieszczeniem płytki w mikroskopie oczyść dno płytki z 24 dołkami 70% etanolu. Kliknij przycisk Load Plate, aby załadować płytę do mikroskopu.
5. Wybierz pożądany tryb powiększenia i akwizycji w Obiektyw i Aparat. Jako tryb akwizycji wybierz tryb szczeliny konfokalnej 51 μm .
   UWAGA: Do eksperymentu użyto obiektywu zanurzającego w wodzie 20x o aperturze numerycznej 0,95 oraz obracającego się dysku z otworkami o średnicy 50 μm, rozstawionym w odległości 250 μm.
6. W zakładce Płyta wybierz używany model płyty.
7. Przejdź do zakładki Plate/Sites to Visit. W opcjach Lokalizacja kliknij Stała liczba lokalizacji. Wybierz liczbę kolumn i wierszy tak, aby mniej więcej cała studnia była pokryta. Kliknij Nakładające się strony 10%.
   UWAGA: Ten przycisk musi być aktywowany, aby zapewnić zszycie poszczególnych kafelków.
8. Wybierz tylko pierwszą wypełnioną studnię do przejęcia, klikając prawym przyciskiem myszy na odpowiednią studnię na mapie studni. Wybrane odwierty są zielone, a wykreślone odwierty szare.
9. Przenieś etap do miejsca, gdzie powinna znajdować się tkanka, klikając lewym na pierwszą wypełnioną jamkę na mapie płyty oraz na miejsce blisko środka mapy. Szukaj ciemniejszyego koloru studni i miejsca wskazującego aktualną pozycję.
10. Przejdź do zakładki Akwizycja . Wybierz opcje Włącz ostrość laserową oraz Pobierz serię Z.
11. Przejdź do zakładki Akwizycja/Autofokus . Aby ustawić ostrość dobrze do dobrego, wybierz opcję Ostrość na płycie i dole , a dla Autofokusu na miejscu wybierz opcję Wszystkie miejsca .
12. Przejdź do zakładki Długości fal i wybierz liczbę barwników, które mają być obrazowane w bieżącym cyklu. Szukaj odpowiedniej liczby nowych zakładek, które otwierają się pod zakładką Długości fal.
13. Przejdź do zakładki pierwszej długości fali. W sekcji Oświetlenie wybierz ustawienia filtra najlepiej dopasowane do interesującego fluoroforu (np. wybierz DAPI , jeśli użyto Hoechst).
14. Wybierz laser z przesunięciem z do pozycjonowania z i kliknij przycisk Calculate Offset , aby ustawić właściwą wysokość obrazowania. Seria zdjęć zostanie wykonana w różnych pozycjach z. Wybierz ten, w którym próbka jest najlepiej wyostrzona.
    UWAGA: Upewnij się, że pozycja etapu jest ustawiona na miejsce z chusteczką. Jeśli w tym miejscu nie ma widocznej tkanki, wybierz inne miejsce i spróbuj ponownie (patrz krok 4.9).
15. Naciśnij przycisk Focus i poczekaj na wyostrzone zdjęcie tkanki.
16. Dla Mocy Oświetlenia wybierz 50%. Wpisz 2000 dla maksymalnej intensywności celu i naciśnij Auto Expos, aby automatycznie dostosować czas ekspozycji.
    UWAGA: Aby przyspieszyć akwizycję, można zwiększyć moc lasera, co powinno skrócić czas ekspozycji. Jednak może to prowadzić do częstszego wybielania zdjęć, co prowadzi do powstania artefaktów obrazowych tam, gdzie poszczególne kafelki się nakładają.
17. Dla serii Z wybierz Z-Series i 2D Projection Image, a dla Shading Correction wybierz tylko FL Shading.
18. Powtórz kroki 5.13-5.17 dla pozostałych długości fal, ale zamiast lasera z przesunięciem z, wybierz przesunięcie Z z W1 i wybierz 0.
19. Przejdź do zakładki Serii Z . Wprowadź pożądany rozmiar kroku (dla celu 20x użyj rozmiaru kroku 0,5 μm).
    UWAGA: Szybkość pozyskiwania można zwiększyć używając kroku o rozmiarze 2-3 razy wyższym niż zalecana wartość.
20. Kliknij przycisk Focus i poczekaj na strzałkę oznaczoną aktualną pozycją .
21. Kliknij Start Live i poczekaj na pojawienie się nowego okna z obrazami na żywo. Przeciągnij strzałkę z aktualną pozycją , aż dotrzesz do dolnej części chusteczki i kliknij przycisk Set B . Przeciągnij strzałkę z aktualną pozycją , aż dotrzesz do górnej krawędzi chusteczki i kliknij przycisk Set T . Kliknij na F2: Stop.
    UWAGA: Można wybrać długość fali używaną do obrazowania na żywo w ramach aktywnej długości fali.
22. Wybierz strony do zakupu; Po pierwsze, upewnij się, że etap znajduje się w pierwszym wgłębieniu, klikając na niego prawym przyciskiem myszy i ponownie naciskając Start Live . Przejdź na różne miejsca wewnątrz studni, klikając lewym przyciskiem na różne miejsca na mapie stanowiska. Znajdź brzeg tkanki i zaznacz wszystkie miejsca zawierające tkankę do pobrania , klikając prawym przyciskiem myszy. Wybrane miejsca będą zielone, a wykluczone na szare.
    UWAGA: Na razie rób to tylko dla pierwszego odwiertu i upewnij się, że tylko ten pierwszy zostanie wybrany do przejęcia.
23. Przejdź do zakładki Biegnij . Dla nazwy Tablicy nazwijmy ją "Cycle{i}_Well{w}_{description}"; zastąp {i}, {w} i {description} odpowiadającymi wartościami/opisem.
24. Kliknij na Zapisz Protokół i zapisz go, ponownie dodając w nazwie "Cycle{i}_Well{w}".
25. Ustaw regiony pozyskiwania dla wszystkich pozostałych odwiertów. Do tego celu powtórz kroki 5.22-5.24.
    UWAGA: Dla każdego odwiertu do przejęcia należy zapisać osobny plik protokołu. Upewnij się, że właściwa studnia jest aktywowana przed wyczerpnięciem nowego zwrotu z inwestycji. Efektem powinien być jeden zapisany protokół na odwiert do pozyskania. Jest to konieczne, ponieważ tkanki mają różne kształty od dołka do dołka. Jeśli ROI i stos z są identyczne w odwiercie, można pominąć powtarzające kroki 5.22-5.24, a także kroki 5.26-5.29. W takim przypadku wystarczy wybrać wszystkie studnie do obrazowania (patrz krok 5.22), przejść do zakładki Run i nacisnąć Gain Plate.
26. Kliknij Control | Dziennik | Zacznij nagrywać , a następnie natychmiast Control | Dziennik | Przestań nagrywać. Zapisz utworzony dziennik i otwórz go ponownie za pomocą Control | Dziennik | Edytuj dziennik.
27. W lewym panelu znajdź i kliknij dwa razy na Plate Acquisition - Load Protocol From File oraz na Plate Acquisition , aby dodać te kroki do dziennika; Szukaj ich w odpowiednim panelu. Kliknij dwa razy na dodaną opcję Plate Acquisition - Load Protocol From File i wybierz protokół zapisany dla pierwszego otworu (patrz krok 5.24).
28. Powtarzaj krok 5.27 dla każdej przejętej studni, zawsze ładując odpowiedni protokół.
29. Kliknij na Zapisz i na końcu na Run Journal , aby rozpocząć akwizcję (potrzeba około 3 godzin na zdobycie 180 płytek z stosem 15 μm).

6. Wybielanie fluoroforem (dzień 2)

1. Około 30 minut przed końcem czasopisma przygotuj odczynnik wybielający. Rozpuścić 10 mg borowodniku litu w 10 mL ddH₂O i przepuścić przez filtr 0,22 μm. Zostaw na 10 minut, czekając aż utworzą się bąbelki. Aby zapewnić efektywne wybielanie, użyj odczynnika wybielającego w ciągu 4 godzin po przygotowaniu.
   UWAGA: Pracuj pod maską chemiczną podczas obsługi borohydryku litu, ponieważ może on reagować z powietrzem i powodować łatwopalny wodór.
2. Wybielaj fluorofory 1 mL 1 mg/mL borowodniku litu przez 15 minut, wystawiając je na działanie standardowego światła otoczenia. Podczas wybielania zwracaj uwagę na drobne pęcherzyki na tkance.
   UWAGA: Podczas pracy pod okapem chemicznym upewnij się, że oświetlenie nie jest automatycznie wyłączane podczas procesu wybielania.
3. Powtarzaj wybielanie kolejnym 1 mL 1 mg/ml borowodniku litu (przygotowanego z tego samego roztworu) przez 15 minut.
4. Przemyj studnię przez 3 x 5 minut 1 mL PBS.
   UWAGA: Nie skracaj czasu prania, ponieważ niepełne usunięcie odczynnika wybielającego może uszkodzić kolejny panel przeciwciał.

7. Cykle IBEX (Dzień 2)

1. Na kolejny cykl immunoznakowania należy zastosować przeciwciała pierwotne (krok 3.7) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Powtórz kroki 4.4-5.4.
   UWAGA: Kroki 4.2-4.3 nie są powtarzane, ponieważ niesprzężone przeciwciało królicze jest używane tylko w pierwszym cyklu IBEX. Jednak niesprzężone przeciwciała wyhodowane u rzadszych gatunków, takich jak kurczaki czy świnki morskie, mogą być również stosowane w późniejszych cyklach, ponieważ ich przeciwciała wtórne nie reagują krzyżowo z pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi. Dokładne informacje o przeciwciałach używanych w każdym cyklu można znaleźć w Tabeli Materiałów.
2. Na mikroskopie załaduj ustawienia protokołu z poprzedniego cyklu IBEX dla odpowiedniej studni, klikając na protokół ładowania, zapisane na lokalnym komputerze jako Cycle{i}_Well{w} (krok 5.24). Ustawienia protokołu zawierają ROI (wybrane kafelki do pozyskania), powiększenie, ustawienia autofokusa oraz wszelkie dodatkowe ustawienia akwizycji zapisane z poprzedniego cyklu IBEX (kroki 5.5-5.25).
3. Wybierz zakładki długości fal i dostosuj moc ekspozycji oraz oświetlenia dla nowego panelu przeciwciał (kroki 5.12-5.18). Pamiętaj, aby obrazować jeden marker (zwykle DAPI lub Hoechst) przez wszystkie cykle, aby wyrównać cykle po wszystkim.
   UWAGA: Jak podają Radtke i ^in.18, powszechnie stosowane białka fluorescencyjne, takie jak GFP i tdTomato, nie są wrażliwe na wybielanie borohydridu litu. Podczas pracy z tkankami zawierającymi endogenne białka fluorescencyjne, takie jak tdTomato, odpowiadająca mu długość fali może zostać pominięta z akwizycji po cyklu 1, jeśli nie jest ona potrzebna do rejestracji obrazów – co przyspieszy obrazowanie. Długości fal można usunąć w zakładce Całkowita długość fali poprzez zmniejszenie liczby kanałów akwizycji. Ponadto nie zaobserwowano stałego wzrostu autofluorescencji tkanek w cyklach obrazowania; Jednak prawdopodobnie będzie się to różnić w zależności od typu^{tkanki 18}.
4. Sprawdź, czy ustawienia z-Stack są nadal rozsądne i dostosuj je odpowiednio (kroki 5.19-5.21).
   UWAGA: Upewnij się, że rozmiar kroku stosu z jest taki sam dla wszystkich cykli.
5. Zaktualizuj nazwę Plate w zakładce Run i zapisz Protocol ponownie.
6. Powtórz kroki 7.2-7.5, aby wszystkie odwierty zostały zdobyte.
   UWAGA: Zaleca się zapisywanie ustawień ekspozycji dla wszystkich długości fal używanych w pierwszym dołku i używania tego samego ustawienia we wszystkich kolejnych studniach.
7. Edytuj dziennik, wybierz nowe pliki protokołu i zapisz dziennik na ten cykl.
8. Uruchom dziennik.
9. Powtórz kroki 6.1-6.4, aby wybielić fluorofory.
10. Powtarzaj kroki 7.1-7.9, aż osiągniesz pożądany poziom immunoznakowania.

8. Przetwarzanie obrazu (dzień 2)

1. Po zakończeniu akwizycji zdjęć cykli IBEX, eksportuj dane obrazowe:
   1. Wybierz przesiew | Narzędzia danych płyt | Eksportuj obrazy.
   2. Kliknij Wybierz płytę(y) i wybierz wszystkie zdobyte płyty dla każdego cyklu i studni.
   3. Wybierz Wszystkie Z Planes, wybierz katalog wyjściowy i naciśnij OK , aby wyeksportować dane.
      UWAGA: Dane będą eksportowane jako indywidualne pliki tiff dla każdego kafelka i płaszczyzny. Aby połączyć wszystkie kafelki i cykle, wykonano następujące kroki przetwarzania.
2. Ułóż eksportowane dane w folderach według następującego schematu: upewnij się, że każdy cykl to jeden folder, z każdym z kolejnym folderem dla każdego wstudu. Nazwa następująca: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", gdzie {i} i {well} to odpowiadający cykl i well, a * to dowolny znak. Na przykład: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   UWAGA: Wymagane jest poprawne nazewnictwo i struktura folderów dla kolejnych etapów przetwarzania.
3. Instaluj niezbędne pakiety Pythona: używaj Miniforge do zarządzania środowiskiem Pythona. Zobacz https://github.com/conda-forge/miniforge instrukcje instalacji.
   UWAGA: Kod kroków przetwarzania jest udostępniony w formie Jupyter Notebooks. Można je znaleźć w https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove lub jako pliki uzupełniające (Plik Uzupełniający 1, Plik Uzupełniający 2, Plik Uzupełniający 3, Plik Uzupełniający 4 oraz Plik Uzupełniający 5).
4. Podczas pobierania kodu z Githuba pobierz wszystkie pliki, klikając Code | Pobierz ZIP i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji zawartymi w pliku README.md.
5. Rozpocznij Jupyter-Lab (Plik Uzupełniający 2):
   1. Aktywuj zainstalowane środowisko conda, wpisując conda aktywuj zmb-ibex-jove w terminalu.
   2. W terminalu można zmienić katalog pobrany, wpisując na przykład cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. Rozpocznij Jupyter-Lab, wchodząc do Jupyter-Lab w terminalu. Okno przeglądarki otworzy się z jupyter-lab.
6. Oblicz korektę oświetlenia:
   1. Po lewej stronie kliknij do notesu " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" i otwórz go, klikając dwukrotnie . Ten notes obliczy obrazy korekcji oświetlenia, korzystając z biblioteki BaSiCPy (Plik Uzupełniający 3).
   2. Zmień "base_dir" i "save_dir" na właściwe ścieżki, gdzie znajdują się dane i gdzie powinny być zapisane obrazy korekcji oświetlenia.
   3. Aby uruchomić kod w notesie, wybierz każdą komórkę i naciśnij Shift+Enter , aby ją wykonać. Przeprowadź zeszyt od góry do dołu.
7. Wykonaj ściegi dla każdego cyklu indywidualnego (Plik uzupełniający 4):
   1. Na lewej zakładce przejdź do następnego notesu i otwórz go: "02_stitching_MD.ipynb". W tym zeszycie, dla każdego cyklu, poszczególne kafelki są ładowane, korygowane iluminacją i zszywane, co skutkuje powstaniem jednego pliku obrazu na wgłębienie i cykl. Do haftowania używaj biblioteki m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch).
   2. Zmień wejścia w pierwszej komórce na właściwe ścieżki plików. Wykonaj zeszyt ponownie od góry do dołu.
8. Przeprowadz rejestrację obrazów między cyklami (Plik uzupełniający 5):
   1. Na lewej zakładce przejdź do następnego notesu i otwórz go: "03_registration_pcc.ipynb". W tym notesie poszczególne cykle są wyrównane ze sobą wyłącznie przy użyciu transformacji translacyjnych, które oblicza się za pomocą algorytmu korelacji fazowo-krzyżowej z otwartej biblioteki obrazów scikit-image (https://scikit-image.org/).
   2. Zmień wejścia w pierwszej komórce na właściwe ścieżki plików. Wybierz cykl odniesienia i kanał referencyjny do użycia (zwykle DAPI). Wykonaj zeszyt ponownie od góry do dołu.
      UWAGA: Wystarczy wykonać jeden z rozdziałów "Opcja 1: Załaduj i zapisz wszystkie kanały razem" oraz "Opcja 2: Załaduj i zapisz kanały jako pojedyncze pliki". Pierwszy rozdział utworzy jeden duży plik, zawierający wszystkie kanały wszystkich cykli. Drugi rozdział utworzy osobny plik dla każdego kanału. Druga opcja wymaga mniej pamięci do przetworzenia.

9. Analiza obrazu (dzień 2)

1. Pobierz i otwórz Fidżi (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   UWAGA: Powstałe obrazy będą wielopłaszczyznowe i wielokanałowe, które można analizować jako obrazy 3D. Tutaj pokazano przykładowy workflow analizy wyłącznie dla danych 2D, dla którego najpierw oblicza się projekcję maksymalnej intensywności.
2. Otwórz plik na Fidżi, przeciągając go na okno Fidżi.
3. Oblicz maksymalną projekcję intensywności, wybierając Obraz | Stosy | Projekt Z..., wybierz Maksymalną Intensywność i naciśnij OK. Zapisz obraz ponownie przez Plik | Zapisz jako | OME-TIFF".
4. Do analizy komórek użyj otwartoźródłowego oprogramowania QuPath; Pobierz i zainstaluj ją z https://qupath.github.io/.
5. Otwórz QuPath i stwórz nowy projekt, przeciągając pusty folder na okno.
6. Zaimportuj wszystkie pliki do projektu, przeciągając je do okna QuPath i naciskając Import przy standardowych ustawieniach.
7. Kliknij dwukrotnie na obraz w lewym panelu, aby go otworzyć. Określ to jako fluorescencję , gdy zostaniesz o to poproszony.
8. Otwórz okno Jasność/Kontrast , naciskając Shift+C.
   UWAGA: Tutaj można wybrać, które kanały są wyświetlane, oraz regulować jasność i kontrast. Można także zmienić nazwy kanałów i kolory, dwukrotnie klikając na nazwy.
9. Wybierz narzędzia | Narzędzie wielokątne i adnotuj obszar tkanki. Szukaj nowej adnotacji w zakładce Adnotacje . Ustaw ją do konkretnej klasy, wybierając adnotację, wybierając klasę (np. Inne) i naciskając Zestaw klasę.
10. Wykrywaj komórki: przejdź do analizy | Wykrywanie komórek | Wykrywanie komórek.
    1. Wybierz kanał nuklearny.
    2. Większość ustawień zostaw bez zmienienia, ale dostosuj próg , najedź myszką na jądro i zanotuj intensywność wyświetlaną w prawym dolnym rogu. Najedź kursorem nad obszarem tła i ponownie zauważ intensywność. Wybierz wartość pośrednią między tłem a pierwszym planem jako próg.
    3. Kliknij Uruchom.
11. Sprawdź komórki i pomiary:
12. Dwukrotnie klikając na komórkę lub wybierając ją w zakładce Hierarchia, sprawdź jej wymiary w lewym dolnym panelu. Należy dodać różne pomiary kształtu i intensywności dla komórek, jądra i cytoplazmy.
13. Klasyfikuj komórki:
    1. Aby sklasyfikować wykryte komórki według intensywności w kanale, przejdź do Classify | Klasyfikacja obiektów | Stwórz pojedynczy klasyfikator pomiarowy.
    2. Wybierz pożądany kanał w filtrze kanałowym oraz odpowiedni pomiar w Pomiarze (np. Komórka: Średnia kanału).
    3. Dostosuj próg, ponownie zatrzymując kursor nad dodatnią komórką i ujemną, wybierając wartość pomiędzy nimi.
    4. Wybierz na przykład Dodatnie dla Powyżej Progu i Ujemne dla Poniżej Progu. Sprawdź wynik, sprawdzając podgląd na żywo.
    5. Naciśnij Apply, aby sklasyfikować komórki.
14. Zmierz odległość do obiektów oznaczonych adnotacjami (np. wiązek nerwowych):
    1. Wybierz narzędzia | Narzędzie pędzla .
    2. Rysuj obszary zainteresowania (np. wiązki nerwowe).
    3. Przejdź do zakładki Adnotacji . Wybierz wszystkie nowe adnotacje, wybierz odpowiadającą klasę i naciśnij Zestaw klasę.
       UWAGA: Można utworzyć nową klasę, klikając prawym przyciskiem myszy w oknie klasy i wybierając Dodaj lub Usuń | Dodaj klasę.
    4. Przejdź do analizy przestrzennej | Odległość ze znakiem do adnotacji 2D i naciśnij Tak , gdy pojawi się polecenie.
    5. Dodaj do każdej komórki nowy wymiar, wskazujący odległość do najbliższej adnotacji danej klasy.
15. Pomiary eksportowe:
    1. Przejdź do Measure | Pokaż pomiary detekcji i poczekaj na pojawienie się listy wszystkich pomiarów wszystkich wykryć.
    2. Wyeksportuj tabelę jako .txt za pomocą przycisku Zapisz.
    3. Zaimportuj dane do wybranego oprogramowania do przetwarzania danych, aby zostały dalej przeanalizowane.

Results

Metoda ta pozwala na odpowiednie wykrywanie proliferujących się typów komórek poprzez połączenie chemii EdU Click-iT z IBEX w stałych zamrożeniach przekrojach skóry myszy. Wykrywanie proliferujących typów komórek porównano za pomocą różnych metodologii, w szczególności oznaczania proliferujących się typów komórek przeciwciałem Ki-67 oraz wykrywania proliferacji komórek za pomocą podejścia chemicznego EdU Click-iT (Rysunek 1). Zaobserwowaliśmy, że znakowanie p...

Discussion

Proliferacja komórek jest jednym z czterech głównych etapów naprawy skóry, a przejście między fazą zapalną a fazą proliferacji jest kluczowe dla udanego procesu naprawy²⁰. Dobrze zregulowana odpowiedź immunologiczna jest niezbędna, ponieważ długotrwałe zapalenie może prowadzić do przewlekłych ran, co jest istotnym globalnym problemem zdrowotnym ^1,21. Proliferacja to kluczowy proces biologiczny, ważny nie tylko dla naprawy tkanek, ale także...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przeciwciała i odczynniki	ŹRÓDŁO	IDENTYFIKATOR	Komentarze
przeciwciała
CD31 Alexa Fluor 647 (cykl 2) & c.	BioLegend	Cat#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Cykl 2) & bez śladu;	BioLegend	Cat#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Cykl 1)	BioLegend	Cat#151212	1:50
AB_2814055
Kurczak Ki-67 (ck)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt)	BioLegend	Cat#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilament H& M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (cykl 3)	BioLegend	Katalog#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Cykl 1)	Technologia sygnalizacji komórkowej	Cat#8238                                            AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Cykl 3)	BioLegend	Cat#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 osioł antykróliczy	Jackson ImmunoResearch	Katalog#711-605-152
odczynniki
Cellvis 24-dołkowa szklana płytka dolna	Cellvis	P24-1.5H-N
Żelatyna chromu aluminiowego	Dostawa dla nowicjuszy	Katalog#1033A
Click-iT EdU kit	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Katalog#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, borowodnikiem litu, 95%	Thermo Fisher Scientific	Cat#10438443
Tissue-Tek O.C.T Compound Sakura	Biosystems Switzerland	Katalog#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Katalog#10010-015
Mikroskopy mikroskopowe Superfrost Plus Adhesion	Epredia	Cat#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Kat#T8787
Sprzęt
Szczotka do włosów	Faust AG	Cat#9172051 i 9172050
Łopatka mikrotomu	Biosystems Switzerland	Cat#207500011
Mikroskop	Urządzenia molekularne, ImageXpress Confocal HT.ai
Piekarnik	Thermo Fisher Scientific	Cat#HBMCR4220
Shaker rocker	Edmund Bü hler GmbH	Cat#32310015