Wykrywanie zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki za pomocą ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy w stolcu

Summary

Protokół wykorzystuje nieinwazyjne pobieranie próbek kału w połączeniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy, aby zaoferować wygodną i szybką metodę diagnostyczną infekcji Helicobacter pylori i jej odporności na klarytromycynę i chinolony.

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori) jest szeroko rozpowszechniony na całym świecie, z około 50% światowej populacji ma historię H. pylori infekcja. W Chinach wskaźnik infekcji waha się od 40% do 70%. H. pylori kojarzy się przede wszystkim z chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak przewlekłe zapalenie żołądka, wrzody żołądka i wrzody dwunastnicy. Obecnie leczenie kliniczne <em style="font-size: 14px;">H. pylori infekcja obejmuje potrójną lub poczwórną terapię. Jednak szerokie stosowanie antybiotyków doprowadziło do rozwoju oporności na antybiotyki w H. pylori. W związku z tym wykrycie zarówno H. pylori i jego oporności na antybiotyki ma kluczowe znaczenie dla kierowania leczeniem klinicznym.

Metody diagnostyczne dla H. pylori obejmują test oddechowy mocznika (UBT), test antygenowy, test serologiczny przeciwciał, endoskopię, szybki test ureazy (RUT) i hodowlę bakterii. Chociaż pierwsze trzy metody są nieinwazyjne, nie pozwalają na regenerację bakterii, a zatem nie mogą być stosowane do badania oporności. Trzy ostatnie metody są inwazyjne, drogie, wymagają dużej wiedzy technicznej i mogą zaszkodzić pacjentom.

Dlatego nieinwazyjna, szybka metoda jednoczesnego wykrywania infekcji H. pylori i oporności na antybiotyki ma ogromne znaczenie kliniczne dla skutecznego zwalczania H. pylori. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie specyficznego protokołu, który łączy ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) z technologią sondy fluorescencyjnej TaqMan w celu szybkiego wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na antybiotyki. Ta metoda zapewnia wygodny, szybki i nieinwazyjny sposób diagnozowania infekcji i oporności H. pylori, w przeciwieństwie do tradycyjnej hodowli bakteryjnej i innych technik. qPCR służy do identyfikacji infekcji i wykrywania mutacji w genach 23S rRNA i gyrA, które są związane z opornością odpowiednio na klarytromycynę i chinolony. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami hodowli, podejście to oferuje nieinwazyjną, opłacalną i efektywną czasowo metodę wykrywania zakażenia Helicobacter pylori i określania jej oporności na antybiotyki.

Introduction

Helicobacter pylori to Gram-ujemna, spiralna bakteria, która może uporczywie infekować ludzki nabłonek żołądka¹. W 1994 roku Światowa Organizacja Zdrowia sklasyfikowała H. pylori jako czynnik rakotwórczy grupy 1 dla raka żołądka, przy czym u ~3% zakażonych osób ostatecznie rozwija się choroba². Niedawno opublikowany przegląd systematyczny wykazał, że w ciągu ostatniej dekady zaobserwowano ogólny trend zwiększonej oporności H. pylori na antybiotyki, który osiągnął alarmujący poziom na całym świecie, zwłaszcza oporność na klarytromycynę³. W Chinach najnowsze dane z badań w....

Protocol

To badanie jest zgodne z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Komitet Etyki Prowincjonalnego Szpitala Ludowego Guangdong, Południowy Uniwersytet Medyczny, Guangzhou, Chiny (Nr zatwierdzenia: KY2024-445-01). Szczegółowe informacje na temat materiałów użytych w tych badaniach (odczynniki, chemikalia, sprzęt i oprogramowanie) znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Wybór uczestnika

1. Wybierz uczestników w przedziale wiekowym od 18 do 60 lat.
2. Wybierz uczestników, którzy mogą przejść badania przesiewowe w kierunku zakażenia Helicobacter pylori, takich jak pacjenci z objawami takimi jak....

Results

Zastosowanie qPCR do wykrywania zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki w próbkach kału
Zaprojektowaliśmy startery i sondy w oparciu o mutacje punktowe w konserwatywnych genach Helicobacter pylori, a także w genie 23S rRNA i genie gyrA. Te startery i sondy zostały znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie wykorzystane do wykrywania qPCR. Wyniki kontroli jakości dla eksperym.......

Discussion

W ostatnich latach metody wykrywania molekularnego są szeroko stosowane w dziedzinie mikrobiologii, znacząco zmieniając kliniczne postępowanie w kilku chorobach zakaźnych. Metody te działają na poziomie genetycznym, pozwalając nie tylko na potwierdzenie obecności bakterii, ale także na testowanie typowania genów i antybiotykooporności. Ilościowy PCR fluorescencyjny w czasie rzeczywistym (qPCR) jest coraz bardziej preferowany ze względu na krótki czas przetwarzania, wysoką czułość i dokładność oraz niskie ryzyko zanieczys.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA	Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Jednorazowa probówka do zbierania i przechowywania kału	Kret		Zbieraj próbki kału
E-wirówka	WEALTEC		Odwiruj pozostałą ciecz ze ścianki rurki
Kwas nukleinowy Helicobacter pylori, klarytromycyna i zestaw do wykrywania mutacji oporności na chinolon	Kret		Wykrywanie zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki; liofilizowany odczynnik H. pylori (zawierający startery, sondy, polimerazę Taq, enzym UNG, dNTP itp.), kontrola pozytywna na H. pylori (zawierająca Helicobacter pylori i ludzkie geny docelowe β-aktyny) oraz kontrola ujemna dla H. pylori (zawierający docelowe geny ludzkiej &beta-aktyny)
Mole 96M automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych	Kret Do		ekstrakcji DNA
Zestaw do ekstrakcji kwasów nukleinowych	Mole		Do ekstrakcji kwasu nukleinowego; zawiera bufor do lizy (sól guanidyny, tris hydroksymetyloaminometan, Tween-20, chlorek sodu), bufor do płukania 1 (chlorek sodu), bufor do płukania 2 (tris hydroksymetyloaminometan, Tween-20), bufor do płukania 3 (kulki magnetyczne, Tween-20), bufor płuczący 4 (woda wolna od nukleaz) i bufor elucyjny (tris hydroksymetyloaminometan), wraz ze stojakiem magnetycznym
SLAN W pełni automatyczny system analizy medycznej PCR	Analiza danych	HONGSHI
SLAN-96S Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym	HONGSHI		Fluorescencyjne ilościowe amplifikacje PCR
Zamrażarki ultraniskotemperaturowe (DW-YL450)	MELING	SEDA	20172220091-20 ° C do przechowywania odczynników
Vortex-5	Kylin-bell		Do mieszania odczynnika