Wykrywanie zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki za pomocą ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy w stolcu

Podsumowanie

Protokół wykorzystuje nieinwazyjne pobieranie próbek kału w połączeniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy, aby zaoferować wygodną i szybką metodę diagnostyczną infekcji Helicobacter pylori i jej odporności na klarytromycynę i chinolony.

Streszczenie

Helicobacter pylori (H. pylori) jest szeroko rozpowszechniony na całym świecie, z około 50% światowej populacji ma historię H. pylori infekcja. W Chinach wskaźnik infekcji waha się od 40% do 70%. H. pylori kojarzy się przede wszystkim z chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak przewlekłe zapalenie żołądka, wrzody żołądka i wrzody dwunastnicy. Obecnie leczenie kliniczne <em style="font-size: 14px;">H. pylori infekcja obejmuje potrójną lub poczwórną terapię. Jednak szerokie stosowanie antybiotyków doprowadziło do rozwoju oporności na antybiotyki w H. pylori. W związku z tym wykrycie zarówno H. pylori i jego oporności na antybiotyki ma kluczowe znaczenie dla kierowania leczeniem klinicznym.

Metody diagnostyczne dla H. pylori obejmują test oddechowy mocznika (UBT), test antygenowy, test serologiczny przeciwciał, endoskopię, szybki test ureazy (RUT) i hodowlę bakterii. Chociaż pierwsze trzy metody są nieinwazyjne, nie pozwalają na regenerację bakterii, a zatem nie mogą być stosowane do badania oporności. Trzy ostatnie metody są inwazyjne, drogie, wymagają dużej wiedzy technicznej i mogą zaszkodzić pacjentom.

Dlatego nieinwazyjna, szybka metoda jednoczesnego wykrywania infekcji H. pylori i oporności na antybiotyki ma ogromne znaczenie kliniczne dla skutecznego zwalczania H. pylori. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie specyficznego protokołu, który łączy ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) z technologią sondy fluorescencyjnej TaqMan w celu szybkiego wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na antybiotyki. Ta metoda zapewnia wygodny, szybki i nieinwazyjny sposób diagnozowania infekcji i oporności H. pylori, w przeciwieństwie do tradycyjnej hodowli bakteryjnej i innych technik. qPCR służy do identyfikacji infekcji i wykrywania mutacji w genach 23S rRNA i gyrA, które są związane z opornością odpowiednio na klarytromycynę i chinolony. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami hodowli, podejście to oferuje nieinwazyjną, opłacalną i efektywną czasowo metodę wykrywania zakażenia Helicobacter pylori i określania jej oporności na antybiotyki.

Wprowadzenie

Helicobacter pylori to Gram-ujemna, spiralna bakteria, która może uporczywie infekować ludzki nabłonek żołądka¹. W 1994 roku Światowa Organizacja Zdrowia sklasyfikowała H. pylori jako czynnik rakotwórczy grupy 1 dla raka żołądka, przy czym u ~3% zakażonych osób ostatecznie rozwija się choroba². Niedawno opublikowany przegląd systematyczny wykazał, że w ciągu ostatniej dekady zaobserwowano ogólny trend zwiększonej oporności H. pylori na antybiotyki, który osiągnął alarmujący poziom na całym świecie, zwłaszcza oporność na klarytromycynę³. W Chinach najnowsze dane z badań wykazały, że łączne rozpowszechnienie H. pylori wśród mieszkańców miast wynosi 27,08%; wskaźniki oporności na klarytromycynę i lewofloksacynę wynosiły 50,83% i 47,17%⁴, które są wyższe niż w Stanach Zjednoczonych (lewofloksacyna 37,6%, klarytromycyna 31,5%)5i Europa (lewofloksacyna 15,8% i klarytromycyna 21,4%)6. W związku z tym kluczowa jest wczesna i dokładna diagnoza oraz leczenie. Jednak rosnąca oporność H. pylori na antybiotyki znacznie zmniejsza skuteczność leczenia, co podkreśla pilną potrzebę ciągłych badań nad jej diagnostyką i leczeniem.

Metody diagnostyczne H. pylori dzielą się na techniki inwazyjne i nieinwazyjne⁷. Metody inwazyjne obejmują badanie histopatologiczne, szybki test ureazowy (RUT) oraz hodowlę bakterii⁸. Badanie histopatologiczne polega na przetwarzaniu i obserwacji mikroskopowej próbek biopsyjnych, z dokładnością ograniczoną przez przygotowanie histologiczne i wiedzę patologiczną⁹. RUT wykrywa H. pylori poprzez aktywność ureazy, która hydrolizuje mocznik w celu wytworzenia amoniaku, powodując alkaliczne przesunięcie odczynnika, wskazując w ten sposób na obecność bakterii⁹. Jest to proste i opłacalne. Hodowla bakterii, uważana za "złoty standard", często ma wskaźnik sukcesu poniżej 50% ze względu na unikalne cechy fizjologiczne H. pylori¹⁰.

Metody nieinwazyjne obejmują test oddechowy mocznika 13C/14C (UBT), diagnostykę serologiczną i badanie antygenu w stolcu (SAT)¹¹. Test wydychanego powietrza działa na zasadzie podobnej do RUT, wykrywając izotopowo znakowany CO₂ w wydychanym powietrzu w celu potwierdzenia infekcji¹². Diagnostyka serologiczna wykrywa przeciwciała, które mogą utrzymywać się po eradykacji bakteryjnej, co utrudnia ocenę skuteczności leczenia¹³. Testy antygenowe kału wykrywają antygeny specyficzne dla H. pylori w próbkach kału, zapewniając niezawodną nieinwazyjną metodę z niższym odsetkiem wyników fałszywie dodatnich i dobrą dokładnością w diagnozowaniu aktywnych infekcji¹⁴.

Każda metoda diagnostyczna ma swoje zalety i ograniczenia¹⁵. Oprócz hodowli bakteryjnej, inne metody mają problemy z wykrywaniem oporności na antybiotyki, podczas gdy hodowla jest utrudniona przez niskie wskaźniki sukcesu¹⁶. Ostatnio molekularne metody diagnostyczne, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), są szeroko stosowane do wykrywania drobnoustrojów¹⁷. qPCR może dokładnie wykrywać H. pylori i analizować mutacje genów oporności, oferując bardziej kompleksowy obraz infekcji¹⁸.

Sondy fluorescencyjne są zaprojektowane tak, aby wiązać się specyficznie z docelową sekwencją w DNA podczas procesu qPCR. Sondy te są zwykle znakowane barwnikiem fluorescencyjnym, który emituje sygnał, gdy sonda wiąże się z celem i jest rozszczepiana przez polimerazę podczas amplifikacji. Zapewnia to pomiar procesu PCR w czasie rzeczywistym. Sondy fluorescencyjne są znane ze swojej wysokiej specyficzności ze względu na unikalną konstrukcję sondy, która zapewnia, że wykrywana jest tylko docelowa sekwencja DNA, zmniejszając szanse na niespecyficzne wiązanie i poprawiając swoistość testu. To sprawia, że technologia sond fluorescencyjnych jest szczególnie przydatna do wykrywania celów o niskiej liczebności, takich jak DNA Helicobacter pylori w próbkach kału. Chociaż SYBR Green jest powszechnie stosowanym barwnikiem wiążącym DNA w PCR, może wiązać się z dowolnym dwuniciowym DNA, co może skutkować niespecyficzną amplifikacją i fałszywie dodatnimi.

Hodowla Helicobacter pylori z próbek klinicznych nie dostarcza bezpośrednio danych na temat oporności na antybiotyki. Natomiast qPCR oparty na sondzie fluorescencyjnej jest szybszy, wygodniejszy i może być przystosowany do jednoczesnego wykrywania H. pylori i markerów oporności na antybiotyki. Metoda ta nie tylko zapewnia szybsze wyniki niż tradycyjne metody hodowli, ale także pozwala na jednoczesne wykrywanie genów oporności na antybiotyki, co znacznie zwiększa skuteczność i wygodę wykrywania. Ta metoda zapewnia wygodny, szybki i nieinwazyjny sposób diagnozowania infekcji i oporności H. pylori, w przeciwieństwie do tradycyjnej hodowli bakteryjnej i innych technik.

Są dwie kluczowe kwestie, które należy wziąć pod uwagę dla oporności H. pylori na antybiotyki: i) spójność genotypu i fenotypu, ii) oporność na wiele leków. Zakrojone na szeroką skalę wieloośrodkowe badanie przeprowadzone w Chinach wykazało, że wzorce podwójnej oporności na klarytromycynę/lewofloksacynę wynosiły 26,1%. Fenotypy i genotypy H pylori odporne na klarytromycynę i lewofloksacynę wykazały zadowalającą zgodność (współczynnik kappa = odpowiednio 0,810 i 0,782)19. W związku z tym możliwe jest zastosowanie metody qPCR do wykrywania zakażenia H. pylori i oporności na leki. Test antygenowy kału (SAT) i metody qPCR są coraz częściej stosowane ze względu na wygodę pobierania próbek. Czułość, swoistość i dokładność metod wykrywania H. pylori są następujące: qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > culture²⁰. Wszystkie metody nieinwazyjne nadają się do pierwotnych badań przesiewowych. Ponieważ qPCR może dodatkowo wykrywać geny oporności na leki, qPCR i hodowla będą bardziej odpowiednie do kierowania leczeniem.

Inne innowacyjne podejścia, takie jak algorytmy sztucznej inteligencji (AI) w połączeniu z obrazami endoskopowymi²¹, cyfrowa mikrofluidyka²², oraz RPA-CRISPR/Cas12a²³, teoretycznie wykazują dobrą skuteczność diagnostyczną i obiecujące perspektywy zastosowań. Jednak qPCR jest obecnie najbardziej zaawansowaną techniką biologii molekularnej, która może zapewnić doskonałe rozwiązanie w diagnostyce i leczeniu zakażeń H. pylori.

Protokół

To badanie jest zgodne z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Komitet Etyki Prowincjonalnego Szpitala Ludowego Guangdong, Południowy Uniwersytet Medyczny, Guangzhou, Chiny (Nr zatwierdzenia: KY2024-445-01). Szczegółowe informacje na temat materiałów użytych w tych badaniach (odczynniki, chemikalia, sprzęt i oprogramowanie) znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Wybór uczestnika

1. Wybierz uczestników w przedziale wiekowym od 18 do 60 lat.
2. Wybierz uczestników, którzy mogą przejść badania przesiewowe w kierunku zakażenia Helicobacter pylori, takich jak pacjenci z objawami takimi jak zapalenie błony śluzowej żołądka, wrzody trawienne lub niestrawność, a także osoby bezobjawowe.
3. Należy wykluczyć z badania pacjentów, którzy w ciągu ostatniego miesiąca stosowali antybiotyki, środki zawierające bizmut (takie jak kapsułki z cytrynianem bizmutu potasu, kapsułki z koloidalnymi pektynami bizmutu lub tabletki z dodatkiem bizmutu i glinu) lub chińskie leki przeciwbakteryjne lub te, które stosowały inhibitory pompy protonowej lub antagonistów receptora H2 (takie jak omeprazol, pantoprazol, rabeprazol, cymetydyna lub nizatydyna) w ciągu ostatnich 2 tygodni. Z badania należy również wykluczyć kobiety w okresie menstruacji.

2. Pobieranie próbek kału

UWAGA: Przekaż sekcję 2 jako instrukcje dla uczestników.

1. Upewnij się, że opakowanie zewnętrzne zestawu do pobierania próbek nie jest uszkodzone i nie upływa przed upływem terminu ważności. Usuń materiały z zestawu.
2. Umieść białą bibułę do zbierania kału w muszli klozetowej i wypróżnij się (aby uniknąć zanieczyszczenia moczem).
3. Za pomocą szpatułki zebrać porcję kału wielkości mniej więcej bobu (~5 g) i przenieść ją do pojemnika na próbkę.
4. Umieścić szpatułkę do pobierania próbek wraz z próbką kału w probówce zbiorczej, upewniając się, że poziom cieczy wzrośnie do poziomu zbliżonego do linii pobierania próbek wskazanej na probówce.
5. Mocno dokręć nakrętkę rurki. Odwróć probówkę kilka razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbki z roztworem konserwującym.
6. Próbkę należy przechowywać w lodówce do czasu dostarczenia do laboratorium klinicznego w celu identyfikacji H. pylori i oceny profili oporności na antybiotyki za pomocą qPCR.

3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

UWAGA: Wykonaj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć skażenia.

1. Odwróć probówkę do konserwacji próbki i dokładnie wymieszaj. Przenieść 1,0 ml roztworu próbki kału do probówki mikrowirówkowej.
2. Po wymieszaniu probówek wirówkowych umieścić je w metalowej łaźni o temperaturze 80 °C na 10 minut, z przerywanym mieszaniem przez 30 s w piątej minucie. Gdy probówki ostygną do temperatury pokojowej, odwirować przy 10 000 × g przez 5 minut i zebrać supernatant do dalszej obróbki.
3. Odwróć 96-dołkową płytkę wiele razy, aby ponownie zawiesić kulki magnetyczne. Ostrożnie zdejmij uszczelkę z folii aluminiowej, uważając, aby nie wstrząsnąć i zapobiec rozlaniu.
4. Dodać 200 μl przygotowanej próbki (z kroku 3.2) do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej bufor do lizy, upewniając się, że każda studzienka odpowiada pojedynczej próbce. Umieść 96-dołkową płytkę w wyznaczonej komorze na próbki przyrządu do ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu automatycznej ekstrakcji.
5. Wszelkie pozostałe próbki i wyekstrahowane próbki kwasów nukleinowych należy przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania i wykorzystania w przyszłości.

4. qPCR Wykrywanie kwasów nukleinowych Helicobacter pylori i mutacji oporności na klarytromycynę i chinolony

1. Wyjmij odczynniki z obszaru przechowywania odczynników i rozmroź je w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Ten zestaw został użyty do jakościowego wykrywania kwasu nukleinowego H. pylori, w tym mutacji w genie 23S rRNA (A2143G, A2143C, A2144G) i genie gyrA (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G). Startery, sondy, enzym Taq, enzym UNG i dNTP były dostępne w zestawie. Geny docelowe H. pylori i ludzkiej β-aktyny zostały włączone do pozytywnej kontroli jakości. Ludzki gen β-aktyny został wybrany jako wewnętrzna kontrola jakości.
2. W zależności od liczby próbek, które mają być badane, należy użyć N + 2 kopii liofilizowanego odczynnika, gdzie N oznacza liczbę próbek do badania, a 2 oznacza ujemne i dodatnie QC.
3. Odwirować na krótko, aby upewnić się, że liofilizowany proszek osiada na dnie probówek. Otwórz pokrywę liofilizowanego odczynnika (uważając, aby nie rozlać proszku) i dodać 25 μl do studzienki wyekstrahowanych kwasów nukleinowych z próbek, które mają być badane, a także kontroli dodatniej i ujemnej. Zamknij szczelnie rurki.
4. Wiruj odczynniki PCR przez 8-10 s, a następnie krótko wiruj przez 3-5 sekund, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
5. Umieścić 96-dołkową płytkę qPCR na maszynie qPCR. Ustaw program cykliczny w następujący sposób: najpierw inkubować mieszaninę reakcyjną (zawierającą startery, sondy, polimerazę Taq, enzym UNG, dNTP itp.) w temperaturze 42 °C i 95 °C (oba etapy w jednym cyklu) przez 2 minuty; następnie cykl 10x z 10 s w temperaturze 95 °C i 45 s w temperaturze 65 °C; na koniec cykl 35x z 10 s w 95 °C i 45 s w 58 °C w celu denaturacji, wyżarzania i przedłużania.
6. Ustaw parametry wykrywania sygnału fluorescencji w następujący sposób: Znakowanie fluorescencyjne ROX konserwatywnych genów H. pylori; Fluorescencyjne znakowanie FAM genów oporności na klarytromycynę H. pylori; znakowanie fluorescencyjne HEX genów oporności na chinolony H. pylori; i znakowanie fluorescencyjne CY5 ludzkiego genu β-aktyny zastosowano jako wewnętrzną kontrolę zestawu. Zbieraj dane w temperaturze 58 °C. Po zakończeniu reakcji upewnij się, że dane zostały zapisane do przyszłej analizy.
7. Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla qPCR, ponieważ urządzenie automatycznie wybiera próg bazowy. Ustawić wszystkie kryteria diagnostyczne, w tym obecność zakażenia lub oporności na Helicobacter pylori, na wartość CT ≤30; potwierdzają, że wykazują charakterystyczną krzywą w kształcie litery S.

Wyniki

Zastosowanie qPCR do wykrywania zakażenia Helicobacter pylori oraz oporności na antybiotyki w próbkach kału
Zaprojektowano startery i sondy na podstawie mutacji punktowych w konserwowanych genach Helicobacter pylori, a także w genie 23S rRNA oraz genie gyrA. Startery i sondy te zostały znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie wykorzystane do detekcji metodą qPCR. Wyniki kontroli jakości dl...

Dyskusja

W ostatnich latach metody wykrywania molekularnego są szeroko stosowane w dziedzinie mikrobiologii, znacząco zmieniając kliniczne postępowanie w kilku chorobach zakaźnych. Metody te działają na poziomie genetycznym, pozwalając nie tylko na potwierdzenie obecności bakterii, ale także na testowanie typowania genów i antybiotykooporności. Ilościowy PCR fluorescencyjny w czasie rzeczywistym (qPCR) jest coraz bardziej preferowany ze względu na krótki czas przetwarzania, wysoką czułość i dokładność oraz niskie ryzyko zanieczys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA	Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Jednorazowa probówka do zbierania i przechowywania kału	Kret		Zbieraj próbki kału
E-wirówka	WEALTEC		Odwiruj pozostałą ciecz ze ścianki rurki
Kwas nukleinowy Helicobacter pylori, klarytromycyna i zestaw do wykrywania mutacji oporności na chinolon	Kret		Wykrywanie zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki; liofilizowany odczynnik H. pylori (zawierający startery, sondy, polimerazę Taq, enzym UNG, dNTP itp.), kontrola pozytywna na H. pylori (zawierająca Helicobacter pylori i ludzkie geny docelowe β-aktyny) oraz kontrola ujemna dla H. pylori (zawierający docelowe geny ludzkiej &beta-aktyny)
Mole 96M automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych	Kret Do		ekstrakcji DNA
Zestaw do ekstrakcji kwasów nukleinowych	Mole		Do ekstrakcji kwasu nukleinowego; zawiera bufor do lizy (sól guanidyny, tris hydroksymetyloaminometan, Tween-20, chlorek sodu), bufor do płukania 1 (chlorek sodu), bufor do płukania 2 (tris hydroksymetyloaminometan, Tween-20), bufor do płukania 3 (kulki magnetyczne, Tween-20), bufor płuczący 4 (woda wolna od nukleaz) i bufor elucyjny (tris hydroksymetyloaminometan), wraz ze stojakiem magnetycznym
SLAN W pełni automatyczny system analizy medycznej PCR	Analiza danych	HONGSHI
SLAN-96S Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym	HONGSHI		Fluorescencyjne ilościowe amplifikacje PCR
Zamrażarki ultraniskotemperaturowe (DW-YL450)	MELING	SEDA	20172220091-20 ° C do przechowywania odczynników
Vortex-5	Kylin-bell		Do mieszania odczynnika

20143222263