Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
γ-Sekretaza to kompleks proteaz osadzony w błonie komórkowej, składający się z katalitycznych podjednostek presenilin (PS1 lub PS2) oraz trzech dodatkowych koczynników: nikastryny, Aph-1 i Pen2. Rozszczepia domeny transbłonowe białek typu I, takich jak białko prekursorowe amyloidu (APP) i Notch. Rozszczepienie APP generuje peptydy amyloidowe β (Aβ), które gromadzą się u pacjentów z chorobą Alzheimera. Pomimo znaczących badań, dokładny mechanizm tej unikalnej proteolizy, która zachodzi w dwuwarstwach lipidowych, wciąż nie jest w pełni poznany. Aby zbadać właściwości enzymatyczne γ-sekretazy, utworzyliśmy system raportujący drożdże wykorzystując sztuczne substraty γ-sekretazy zawierające fragmenty APP lub Notch połączone z aktywatorem transkrypcyjnym Gal4. Aktywność γ-sekretazy oceniano poprzez transkrypcyjną aktywację genów reporterowych po uwolnieniu Gal4 z podłoża otoczonych błoną, co oceniano na podstawie wzrostu drożdży lub aktywności β-galaktozydazy. Ponadto opracowaliśmy test in vitro do identyfikacji różnych form Aβ produkowanych z mikrosomów drożdżowych. Te modele drożdżowe stanowią platformę do przesiewania mutacji, genów i związków wpływających na funkcję γ-sektazy. Badając właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera (FAD) PS1, możliwe jest przesiewowe badanie mutacji supresorów FAD oraz modulatorów γ-sektazy (GSM), a także inhibitorów γ-sektazy (GSI). W tym raporcie opisujemy metody genetyczne i biochemiczne stosowane do badania aktywności γ-sektazy w układzie drożdżowym wraz z kluczowymi krokami protokołu do filmu.
Wprowadzenie
γ-Sekretaza odpowiada za rozszczepienie wewnątrzbłonowe ponad 150 białek transbłonowych typu I, w tym białka prekursora amyloidu (APP) oraz Notch1. Znaczenie rozszczepienia wewnątrzbłonowego obejmuje nie tylko odmianę białek, ale także transdukcję sygnału przez wygenerowane fragmenty. Na przykład przetwarzanie APP wytwarza małe peptydy amyloidowe β (Aβ). Chociaż Aβ powinno być usuwane jako produkt degradacji, w chorobie Alzheimera gromadzi się w mózgu, tworząc blaszki stróżne2. Z drugiej strony, przetwarzanie Notch jest niezbędne dla sygnalizacji NOTCH3, co jest kluczowe dla rozwoju. γ-Sekretaza s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pomiar aktywności γ-sekretazy za pomocą systemu raportującego drożdży
- Przekształcić plazmidy (Tabela 1) w szczep drożdży PJ-69-4A (Tabela 2) za pomocą standardowej metody octanowego litu, aby wyrazić γ-sekretazę i jej substrat14. Aby odtworzyć reakcję rozszczepienia, przekształc trzy plazmidy: dwa dla γ-sektazy i jeden dla substratu. Wybrane transformanty na medium agarowym SC bez Leu, Trp i Ura (SC-LWU).
- Aby ocenić rozszczepienie podłoża przez wzrost, należy nałożyć szczepy drożdży na medium SC-LWU również pozbawione histydyny i adeniny (SC-LWHUAde) i inkubować w tempe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Korzystając z opisanych dotąd technik, przeanalizowaliśmy geny, mutacje, związki chemiczne i peptydy jako czynniki wpływające na aktywność γ-sekretazy 10,11,12,13,17,18,19. Przesiewowe badania genów i mutacji oparte na wzroście pozwalają na testowanie dużej liczby klonów (100 000-1 000 000)........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe kroki protokołu i rozwiązywanie problemów
Odtworzenie γ-sektazy w drożdżach za pomocą metod genetycznych i biochemicznych jest stosunkowo proste, ale istnieje kilka kluczowych kroków, które zapewnią sukces.
Podczas transformacji drożdży (kroki 1.1, 2.1 i 3.3) należy wprowadzić wiele plazmidów: dwa dla składników γ-sekretazy i jeden dla substratów. Transformacja sekwencyjna (po kolei) również może być wykonywana, ale jest czasochłonna. Należy zauważyć, że wprowadz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Prace te zostały wsparte przez grant JSPS KAKENHI numer 22K06121. Autorzy pragną wyrazić wsparcie członków Laboratorium Enzymologii na Uniwersytecie Tohoku.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| przeciwciała | |||
| antyamyloid i beta; (N) (82E1) przeciwciało | IBL | Cat# 10323 | |
| przeciwciało przeciw Aph1a, 245-265 (koniec C) | BioLegend | Cat# 823101 | |
| przeciwciało anty-FLAG (M2) | Sigma | Katalog# F3165 | |
| przeciwciało przeciw Gal4 | Sigma | Cat# G9293 | |
| Przeciwciała przeciw HA (12CA5) | Sigma | Katalog # 11 583 816 001 | |
| przeciwciało przeciwnikastrynowe | Chemicon | Cat# AB5890 | |
| przeciwciało przeciw PGK1 (22C5D8) | abcam | Cat# ab197960 | |
| przeciwciała przeciw N-terminusowi lub pętli przeciw PS1 (G1Nr) (GIL) | Takasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205 | ||
| antykróliki IgG, przeciwciało powiązane z HRP | Sygnalizacja komórkowa | Katalog# 7074 | |
| Przeciw świnkom morskim IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-2438 | |
| przeciw mysim IgG, przeciwciało związane z HRP | Sygnalizacja komórkowa | Katal# 7076 | |
| szczepy bakteryjne i drożdże | |||
| E. coli DH5α | Invitrogen | Cat# 18265017 | |
| S. cerevisiae PJ-69-4A | James P. i inni. in., Genetics 144:1425-1436 (1996) | ||
| Chemikalia, peptydy, rekombinowane białka | |||
| (3,5-difluorofenylacetylo)-Ala-Phg-OBu< >t (DAPT) | Instytut Peptydów | Cat# 3219-v | |
| Amyloid β-białko (Człowiek, 1-38) | Instytut Peptydów | Cat# 4484-v | |
| Amyloid β-białko (Człowiek, 1-40) | Instytut Peptydów | Cat# 4307-v | |
| Amyloid β-białko (Człowiek, 1-42) | Instytut Peptydów | Katalog# 4349-v | |
| Amyloid β-białko (Człowiek, 1-43) | Instytut Peptydów | Cat# 4370-v | |
| Przeciwból, dihydrochlorek | Instytut Peptydów | Cat# 4062 | |
| Aprotynina | Sigma | Cat# A1153 | |
| CHAPSO | Dojindo | Katalog# 343-05163 | |
| Chymostatyna | Sigma | Cat# C7268 | |
| Diizopropylfluorofosforan (DIFP) | Chemia Wako | Katalog# 049-18921 | |
| L685,458 | Instytut Peptydów | Katalog# 4394-v | |
| Leupeptin | Instytut Peptydów | Katal# 4041 | |
| N-p-Tosyl-L-fenylolanin, chlorometyloketon (TPCK) | Sigma | Cat# T4376 | |
| Nα -p-tosyl-L-lizyna chlorometyloketon (TLCK) | Sigma | Cat# T7254 | |
| o-nitrofenyl-β-D-galaktopiranozyd (ONPG) | Sigma | Cat# N1127 | |
| p-aminobenzamidyna (pABA), dihydrochlorek | Sigma | Cat# 857661 | |
| Pepstatin A | Sigma | Cat# P5318 | |
| Fenantroplina (PNT) | Sigma | Cat# P9375 | |
| Fenylometylosulfonylofluorek (PMSF) | Sigma | Cat# P7626 | |
| fosfatydylowa cholina (PC), żółtko jajka, typ XVI-E | Sigma | Kat# P3556 | |
| Polimeraza DNA Taq | Takara | Cat# R001A | |
| thiolphan | Sigma | Cat# T6031 | |
| Komercyjne zestawy testowe, inne materiały oraz instrumenty | |||
| System testów beta-glo | Promega | Cat# E4720 | |
| Zestaw do testowania białek Bio-Rad | Bio-Rad | Cat# 5000001 | |
| Koraliki szklane, myte kwasowo (425-600 i mu; m) | Sigma | Cat# G8772 | |
| ImageQuant LAS4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS4000 | |
| Zestaw Mutagenezy Site-Directed QuikChange | Agilent | Cat# 200518 |
Bibliografia
- Wolfe, M. S. Unrvaling the complexity of γ-secretase. Semin Cell Dev Biol. 105, 3-11 (2020).
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Zhou, B., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
