Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

979 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67733

⸱

24 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Streszczenie

γ-Sekretaza to kompleks proteaz osadzony w błonie komórkowej, składający się z katalitycznych podjednostek presenilin (PS1 lub PS2) oraz trzech dodatkowych koczynników: nikastryny, Aph-1 i Pen2. Rozszczepia domeny transbłonowe białek typu I, takich jak białko prekursorowe amyloidu (APP) i Notch. Rozszczepienie APP generuje peptydy amyloidowe β (Aβ), które gromadzą się u pacjentów z chorobą Alzheimera. Pomimo znaczących badań, dokładny mechanizm tej unikalnej proteolizy, która zachodzi w dwuwarstwach lipidowych, wciąż nie jest w pełni poznany. Aby zbadać właściwości enzymatyczne γ-sekretazy, utworzyliśmy system raportujący drożdże wykorzystując sztuczne substraty γ-sekretazy zawierające fragmenty APP lub Notch połączone z aktywatorem transkrypcyjnym Gal4. Aktywność γ-sekretazy oceniano poprzez transkrypcyjną aktywację genów reporterowych po uwolnieniu Gal4 z podłoża otoczonych błoną, co oceniano na podstawie wzrostu drożdży lub aktywności β-galaktozydazy. Ponadto opracowaliśmy test in vitro do identyfikacji różnych form Aβ produkowanych z mikrosomów drożdżowych. Te modele drożdżowe stanowią platformę do przesiewania mutacji, genów i związków wpływających na funkcję γ-sektazy. Badając właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera (FAD) PS1, możliwe jest przesiewowe badanie mutacji supresorów FAD oraz modulatorów γ-sektazy (GSM), a także inhibitorów γ-sektazy (GSI). W tym raporcie opisujemy metody genetyczne i biochemiczne stosowane do badania aktywności γ-sektazy w układzie drożdżowym wraz z kluczowymi krokami protokołu do filmu.

Wprowadzenie

γ-Sekretaza odpowiada za rozszczepienie wewnątrzbłonowe ponad 150 białek transbłonowych typu I, w tym białka prekursora amyloidu (APP) oraz Notch1. Znaczenie rozszczepienia wewnątrzbłonowego obejmuje nie tylko odmianę białek, ale także transdukcję sygnału przez wygenerowane fragmenty. Na przykład przetwarzanie APP wytwarza małe peptydy amyloidowe β (Aβ). Chociaż Aβ powinno być usuwane jako produkt degradacji, w chorobie Alzheimera gromadzi się w mózgu, tworząc blaszki stróżne2. Z drugiej strony, przetwarzanie Notch jest niezbędne dla sygnalizacji NOTCH3, co jest kluczowe dla rozwoju. γ-Sekretaza składa się z czterech białek transbłonowych: preseniliny (PS1 lub PS2), nikastryny (NCT), przedniego gardła-1 (Aph-1a lub 1b) oraz wspomagacza preseniliny 2 (Pen2)4. Białka te mają łącznie 19 domen transbłonowych: dziewięć w PS, siedem w Aph1, dwie w Pen2 i jedna w NCT. PS pełni rolę podjednostki katalitycznej i zawiera dwie reszty kwasu asparagowego znajdujące się w domenach transbłonowych: TM6 i TM7-5. Podczas dojrzewania kompleksu PS ulega endoproteolitycznej rozszczepieniu w swojej pętli hydrofilowej HL6, co prowadzi do powstania fragmentów aminoterminalnych i karboksylowo-końcowych4. Mutacje związane z rodzinną chorobą Alzheimera (FAD) występują zarówno w genach APP, jak i PS2. Te patogenne mutacje błędne negatywnie wpływają na aktywność γ-sekretazy, zmniejszając jej zdolność do skutecznego przetwarzania APP. Prowadzi to do zwiększonej produkcji form Aβ42 podatnych na agregację, zamiast typowych Aβ40-6. Dokładne mechanizmy, przez które te mutacje zakłócają rozszczepienie, pozostają niejasne. Modulatory γ-sektazy (GSM), które mogą zmieniać stosunek Aβ42 do innych form Aβ, wykazują obiecujące szanse jako potencjalne środki terapeutyczne w leczeniu choroby Alzheimera poprzez obniżenie poziomu Aβ427.

Rozwijająca się drożdże Saccharomyces cerevisiae od dawna służą jako organizm modelowy do badania kluczowych funkcji komórek eukariotycznych, takich jak podział komórkowy, transport białek i autofagia. Naukowcy stosowali funkcjonalną komplementację do badania homologów ludzkich, w tym cyklu podziału komórkowego (CDC), wydzielania (SEC) oraz genów związanych z autofagią (ATG). Przekształcanie mutantów drożdży za pomocą ludzkich genów pozwala badaczom analizować procesy komórkowe z perspektywy funkcjonalnej. Spośród pięciu znanych rodzin proteaz wewnątrzbłonowych, drożdże posiadają tylko trzy: peptydazę sygnałową (Ypf1), romboidy (Pcp1 i Rbd2) oraz enzym konwertujący Ras (Rce1). Jednak w drożdżach8 nie występują homologiczne proteazy γ-sekretazy ani proteazy z miejsca-2, co czyni podejście komplementarnym nieodpowiednim. Pomimo braku odpowiedników drożdży dla tych proteaz, S. cerevisiae pozostaje cenna do badania ludzkich białek. Stosowane są techniki takie jak testy drożdżowe jedno-hybrydowe, dwu-hybrydowe i trzy-hybrydowe, wykorzystujące aktywator transkrypcyjne drożdży Gal4, aby wykrywać interakcje między DNA, czynnikami transkrypcyjnymi, białkami lub RNA9. Zmodyfikowaliśmy system Gal4 do monitorowania proteolizy wewnątrzbłonowej pośredniczonej przez γ-sekretazę.

Udało nam się z powodzeniem odtworzyć reakcję rozszczepienia γ-sekretazy u drożdży, wprowadzając ludzką sekretazę γ wraz ze sztucznymi substratami zfuzowanymi z Gal4 (Rysunek 1)10. Reakcję rozszczepienia śledzono za pomocą systemu raportującego Gal, monitorując wzrost drożdży lub mierząc aktywność β-galaktozydazy. Dodatkowo zidentyfikowaliśmy różne formy Aβ (Aβ38, Aβ40, Aβ42, Aβ43 i Aβ45) uwalniane w mikrosomach drożdży poprzez immunoblotting (Rysunek 1)11.

Gdy do tego systemu wprowadzono mutanty związane z FAD PS1 lub APP, zaobserwowano zmienny stopień aktywności utraty funkcji12. Przeprowadziliśmy przesiewowe badanie wzrostowe, aby zidentyfikować mutacje supresorowe przywracające upośledzoną funkcję tych mutantów FAD (Rysunek 2). Tłumiki te nie tylko ratowały defekt, ale także niezależnie wzmacniały aktywność przycinania γ-sekretazy. Konkretnie, obniżyły poziomy dłuższych form Aβ, szczególnie Aβ42, podobnie jak modulatory γ-sekretazy obniżające Aβ42 (GSM). System rekonstrukcji drożdży umożliwia badanie mutacji, genów i związków regulujących aktywność, w tym inhibitora γ-sekretazy (GSI) i modulatora (GSM)13.

Celem tego protokołu jest osiągnięcie dwóch głównych celów: i) ustanowienie systemu przesiewowego γ sekretazy na drożdżach oraz ii) przedstawienie przykładu technik rekonstrukcji dla ludzkich reakcji enzymatycznych u drożdży, podkreślając istotę metod rekonstrukcji. Przedstawiamy metody w trzech kluczowych procedurach, z następującymi kluczowymi krokami: 1) rekonstytuacją γ-sektazy w drożdżach, 2) przeprowadzeniem in vitro testu γ-sekretazy z użyciem mikrosomów drożdżowych oraz 3-5) przesiewowym badaniu mutacji γ-sekretazy i regulatorów chemicznych u drożdży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pomiar aktywności γ-sekretazy za pomocą systemu raportującego drożdży

  1. Przekształcić plazmidy (Tabela 1) w szczep drożdży PJ-69-4A (Tabela 2) za pomocą standardowej metody octanowego litu, aby wyrazić γ-sekretazę i jej substrat14. Aby odtworzyć reakcję rozszczepienia, przekształc trzy plazmidy: dwa dla γ-sektazy i jeden dla substratu. Wybrane transformanty na medium agarowym SC bez Leu, Trp i Ura (SC-LWU).
  2. Aby ocenić rozszczepienie podłoża przez wzrost, należy nałożyć szczepy drożdży na medium SC-LWU również pozbawione histydyny i adeniny (SC-LWHUAde) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 dni.
  3. Użyj wielkości kolonii, aby ocenić poziomy ekspresji HIS3 i ADE2. Rozmiar kolonii należy ocenić następująco: +++ oznacza wzrost typu dzikiego z koloniami większymi niż 1 mm, - oznacza brak wzrostu, a ++ lub + oznacza częściowy wzrost z koloniami większymi niż 0,5 mm lub mniejszymi niż 0,5 mm, odpowiednio. Ekspresja tych genów jest pośrednim pomiarem aktywności γ-sektazy (Rysunek 1).
  4. Aby ocenić rozszczepienie podłoża za pomocą aktywności β-galaktozydazy, czyli poziomu ekspresji lacZ (Rysunek 1), hodować szczepy w podłożu SC-LWU w temperaturze 30 °C, aż hodowla osiągnie stężenie 1 x 107 komórek /mL, odpowiadające OD600 wynoszącemu 0,8-1,0.
    1. Komórki z hodowli 1,5 mL przez wirowanie w probówce o pojemności 1,5 mL o pojemności 21 100 x g przez 3 minuty w 4 °C, przemyj 100 μL lodowato zimnej wody i ponownie zawiesij w 30 μL buforu D-buffera (20 mM Tris/Cl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% glicerol) z 1 mM ditiotreitolu (DTT) i koktajlami inhibitorów proteazy PI/woda (1000x roztwór: 1 M p-aminobenzamidyny (pABA), 1 mg/mL przeciwbólowy, 1 mg/mL aprotyniny, 1 mg/mL leupeptyny) oraz PIs/DMSO (1000x roztwór: 1 M fenylometylosulfonylowofluorku (PMSF), 0,1 M N-p-Tosl-L-fenyloalaniny chlorometyloketylowego keton (TPCK), 1 mg/mL Chymostatyny, 1 mg/mL Pepstatyny).
    2. Dodaj szklaną kulkę wypraną kwasowo tuż pod powierzchnię roztworu i lizuj komórki, wirując mieszankę 10 razy z maksymalną prędkością przez 1 minutę, umieszczając ją na lodzie co 1 minutę.
    3. Komórki lizowane w wirówce w dawce 21 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i pobierać supernatant w postaci surowego lizatu.
    4. Przygotuj mieszaninę reakcji z 5-10 μL surowego lizatu i 0,4 mL buforu Z (40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4). Rozpocznij reakcję, dodając 80 μL roztworu 0,4% o-nitrofenyl-β-D-galaktopiranozydu (ONPG), następnie inkubuj w temperaturze 37 °C, aż roztwór stanie się bladożółty z powodu powstawania nitrofenolu.
    5. Zatrzymaj reakcję, dodając 0,2 mL roztworu 1 M Na2CO3 i zmierz absorpcję przy 420 nm, aby obliczyć aktywność β-galaktozydazy.
    6. Ilościowo określić stężenia białek w prymitywnych lizatach za pomocą zestawu do testów białek, opartego na metodzie Bradforda, stosując jako standard albuminę surowicową bydła (BSA). Przygotuj odczynnik barwnika, rozcieńczając 1 część zapasu barwnika 4 częściami wody desocjalizowanej podwójnie dejonizowanej (DDI).
    7. Wymieszaj 1-5 μL lizatu lub roztworu BSA ze 100 μL rozcieńczonego barwnika w dołku z płytką mikromiareczkową. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut i mierz absorpcję na 595 nm. Określ stężenie białka na podstawie krzywej standardowej BSA.
      β-jednostka galaktozydazy = (1 000 x A420) / (t x c x V)
      gdzie t = czas inkubacji, c = stężenie białka (mg/mL), V = objętość lizatu w teście (mL). Jedna jednostka β-galaktozydazy definiowana jest jako ilość enzymu potrzebnego do hydrolizy 1 μmol ONPG w celu uzyskania o-nitrofenolu i D-galaktozy na minutę na mg białka.
  5. Aby potwierdzić ekspresję podjednostek γ-sekretazy i podłoży, hodować szczepy w podłożu SC-LWU w temperaturze 30 °C, aż hodowla osiągnie OD600 0,8-1,0.
    1. Komórki z hodowli 10 mL przez wirowanie w probówce o pojemności 50 mL o pojemności 2 100 x g przez 10 minut w 4 °C, płucze 1 ml lodowato zimnej wody, a następnie wirowanie w probówce o pojemności 1,5 mL o pojemności 21 100 x g przez 3 minuty w 4 °C, a następnie ponownie zawiesij w 100 μL buforu B88 (20 mM Hepes/KOH (pH 6,8). 250 mM Sorbitol, 150 mM KOAc, 5 mM Mg(OAc)2) z 1 mM DTT oraz koktajlami inhibitorów proteazy, PI/wodą oraz PIs/DMSO.
    2. Dodaj szklane kulki tuż pod powierzchnią roztworu i lizuj komórkę, wirując 10 razy z maksymalną prędkością przez 1 minutę, utrzymując mieszankę na lodzie przez 1 minutę.
    3. Wirówka lizatuje w dawce 845 x g przez 2 minuty w 4 °C i zbiera supernatant jako całkowity lizat zawierający frakcję błonową.
    4. Wymieszaj 100 μL całkowitego lizatu z 96 mg mocznika i 40 μL buforu próbki 6x SDS (0,4 M Tris/Cl (pH 6,8), 12% SDS, 0,6M DTT, 0,05% Bromophenol Blue, 50% glicerol) i inkubuj w 65 °C przez 10 minut. Dodanie mocznika jest konieczne, aby zapobiec gromadzeniu się preseniliny.
    5. Przeanalizuj ekspresję γ-sekretazy i jej substratów, wykonując próbki na żelach Tris/glycine o stężeniu 12,5% poliakrylamidu oraz immunoblottingu.
    6. Wykrywanie γ-sekretazy i jej substratów za pomocą przeciwciał przeciwko presenilinie, nikastrynie, Aph1, Gal4, FLAG, HA lub Pgk1 (kontrola obciążenia) oraz przeciwciału wtórnego sprzężonego z nadksiędksydą chrzanu (HRP) przeciwko myszy IgG (dla FLAG, HA i Pgk1), króliczemu IgG (dla preseniliny, Aph1 i Gal4) lub śwince morskiej IgG (dla nikastryny).
    7. Do wykrywania chemiluminescencji wymieszaj roztwór A (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 1,25 mM luminol, 0,02 mM p-kwas kumarowy) z roztworem B (50 mM Tris/Cl (pH 8,5), 0,009% H2O2) bezpośrednio przed użyciem. Inkubuj plamę w odpowiedniej ilości mieszanki przez 1 minutę. Wymagana objętość zależy od wielkości plamy; do rozpylania o wymiarach 10 cm x 6 cm stosuje się 4 mL. Rozwijaj blot i ilościowo określaj intensywność sygnału za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazu.

2. Pomiar produkcji Aβ za pomocą testu mikrosomów in vitro

  1. Przekształcić plazmidy APP C55, APP C99 lub γ-sektazy (Tabela 1) w szczep drożdży PJ-69-4A pep4Δ , jak opisano w kroku 1.1. aby osobno wyrażać γ-sekretazę i jej podłoże (Tabela 2; szczepy γ311, γ312 i γ313)14. Wybierz szczepy C55 i C99 na medium agarowym SC-U oraz szczep γ-sektazy na medium agarowym SC-LW.
  2. Izoluj mikrosomy od szczepów drożdży wyrażających APP C55, APP C99 lub γ-sektazę zgodnie ze standardowym protokołem11. Oddziel mikrosomy poprzez wirowanie gradientu gęstości sacharozy i odzyskaj na styku 1,2 M-1,5 M sacharozy za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Określ stężenie białek w mikrosomach, mierząc absorpcję na 260 nm po ich rozpuszczeniu w stężeniu 0,2% SDS.
  3. Przygotować mieszaninę reakcji z dwoma mikrosomami, tj. APPC55 lub γ-sektazą, zawierającymi po 40 μg białka każdy oraz γ-buforem (50 mM RUR/KOH (pH 7,0), 250 mM sacharozy, 1 mM EGTA) w końcowej objętości 12,5 μL. Rozpuszczaj przez mieszanie z równą objętością (12,5 μL) 2% CHAPSO w buforze γ i inkubuj w 1% CHAPSO przez 1 godzinę.
  4. Aby rozpocząć reakcję, rozcieńcz mieszaniny czterokrotnie do końcowej objętości 100 μL przy użyciu mieszanki γ-buforu zawierającego inhibitor proteazy (PI): 50 μM diizopropylofluorofosforanu (DIFP), 50 μM PMSF, 0,1 μg/mL N α-p-tosyl-L-lizyna chlorometyloketonu (TLCK), 0,1 μg/mL przeciwbólowego, 0,1 μg/mL leupeptyny, 0,1 mM EGTA, 1 mM tiolfan oraz 5 mM fenantropliny (PNT) do 0,25% CHAPSO z białkami 400 μg/mL. Inkubuj mieszaninę reakcji w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. W razie potrzeby należy dodać 0,1% fosfatydylocholiny (PC), 10 μM L685,458 lub DAPT (inhibitory γ-sekretazy).
  5. Zatrzymaj reakcję, dodając 500 μL chloroformu/metanolu (2:1) i inkubuj przez godzinę z przerywanym wirowaniem. Dodaj 900 μL metanolu, wymieszaj i wiruj w 21 100 x g przez 15 minut, aby zebrać peptydy Aβ w pelecie.
  6. Przemyj pellet 500 μL chloroformu/metanolu/wody (1:2:0,8), pozwól mu wyschnąć na powietrzu, zawiesz w 40 μL buforu SDS i gotuj mieszankę przez 10 minut. Przeanalizuj produkcję Aβ, wykonując próbki na żelu poliakrylamidowym Tris/Tricine o stężeniu 16,5%. Aby zidentyfikować formy Aβ, użyj żelu poliakrylamidowego Tris/Tricine o stężeniu 10% z mocznikiem 8 M (pH 8,45).
  7. Wykrywanie Aβ poprzez immunoblotting przy użyciu przeciwciała 82E1 specyficznego dla miejsca Asp-1 ludzkiego Aβ oraz przeciwciała wtórnego sprzężonego z HRP przeciwko myszy IgG. Do wykrywania chemiluminescencji wymieszaj równe ilości roztworu A i B tuż przed użyciem, jak opisano w kroku 1.5.7, i inkubuj blot w odpowiedniej objętości mieszaniny przez 1 minutę. Wymagana objętość zależy od wielkości plamy; do rozpylania o wymiarach 10 cm x 6 cm stosuje się 4 mL.
  8. Opracuj blot i ilościowo określ intensywność sygnału za pomocą luminescencyjnego analizatora obrazów.

3. Przesiewowe badanie mutacji γ-sekretazy lub APP z efektem modulacyjnym

  1. Aby generować losowe mutacje za pomocą podatnego na błędy PCR, zaprojektuj startery tak, aby uwzględniały 40 bp nakładające się obszary interesującego genu na końcu 5' każdego primeru.
  2. Przygotuj 50 μL podatnej na błędy reakcji PCR w 1x buforze Taq z 50 ng DNA szablonowego, 0,2 mM dGTP, 1 mM dATP/dTTP/dCTP, 3 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 1,25 U polimerazy Taq oraz 400 nM starterami. Stosuj następujący protokół PCR: 94 °C przez 5 minut, następnie 30 cykli 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 120 s, kończąc na 72 °C przez 10 minut. To ustawienie daje przybliżony wskaźnik mutacji 1,9 na kilobazę10.
  3. Przekształcić zmutagenizowane fragmenty DNA (4 μg) za pomocą zlinearyzowanego plazmidowego DNA (4 μg) w szczep drożdży PJ69-4A zawierający mutacje FAD APPlub PS11 14. Nakładanie się 40 bp w starterach ułatwia homologiczną rekombinację fragmentów w drożdżach, prowadząc do rekonstrukcji plazmidu. Wybierz transformanty na płytach SC-LWU zgodnie z krokiem 1.1.
  4. Policz transformanty na płytkach SC-LWU i replikuj je na płytkach SC-LWHUAde za pomocą aksamitu. Aby odtworzyć, należy przycisnąć płytkę transformacyjną do cylindrycznego bloku pokrytego aksamitem, a następnie przycisnąć nową płytkę SC-LWHUAde na aksamit, aby przenieść kolonie. Szczepy wyrażające mutanty APP lub PS1 FAD rosną słabo na SC-LWHUAde, podczas gdy te z mutacjami modulacyjnymi wykazują silny wzrost i tworzą kolonie.
  5. Aby odzyskać plazmidowe DNA z pozytywnych klonów, hodować szczepy w 3 mL medium SC-LWU przez noc w temperaturze 30 °C aż do OD600 >1,0. Wirówka ogniwa w probówce o pojemności 15 mL o pojemności 2 100 x g przez 10 minut w 4 °C, przemyj w 0,8 mL zimnej wodzie, następnie wiruj w probówce o pojemności 1,5 mL o pojemności 21 100 x g przez 3 minuty w 4 °C, a następnie ponownie zawiesij w 0,3 mL roztworu lizycznego (10 mM Tris/Cl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% Triton X-100, 1% SDS).
  6. Limfocyty lizują, dodając 0,3 mL fenol:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) oraz 0,3 g szklanych kulek. Wiruj z maksymalną prędkością przez 10 minut, następnie wiruj w 21 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Po wirowaniu próbka rozdziela się na fazę górną wodną i dolną fazę fenolową. Odzyskaj fazę wodną i wymieszaj z 30 μL 3 M octaniego sodu oraz 700 μL 100% etanolu. Unikaj zabierania materiałów podczas interfazy.
  8. Wiruj roztwór w 21 100 x g przez 10 minut w 4 °C, myj pellet 70% etanolem, susz na powietrzu i ponownie zawiesij w 15 μL buforu TE.
  9. Ponieważ stężenie DNA plazmidowego jest zazwyczaj zbyt niskie do dalszej analizy, konieczne jest jego amplifikowanie w E. coli. Przekształcić DNA plazmidu w E. coli DH5α metodą wysokowydajnej transformacji15 i oczyścić do dalszej analizy. Identyfikacja mutacji poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu metodySangera 16.
  10. Metoda ta jest stosowalna do zmutagenizowanych plazmidów przygotowanych różnymi metodami (jak w krokach 3.1 i 3.2). Jeśli celujesz w konkretne regiony białkowe, zaprojektuj odwrotne primery PCR z losowymi nukleotydami. Po PCR i ligacji w celu cyrkularyzacji DNA plazmidów uzyskuje się bibliotekę zmutagenizowanych plazmidów. Wprowadź konkretne mutacje za pomocą zestawu mutagenezy specyficznego dla miejsca.

4. Badanie przesiewowe inhibitora γ-sekretazy (GSI) u drożdży

  1. Wykorzystaj wysokowydajny przesiew chemiczny GSI opracowany na podstawie wzrostu drożdży lub testu β-galaktozydazy, jak opisano poniżej.
  2. Przeprowadź badanie GSI szczepami drożdży γ124, γ126 i γ190 (Tabela 2). Wybierz kandydatów GSI jako związki zmniejszające wzrost lub aktywność β-galaktozydazy dzikiego typu γ-secretazy na APP (γ124) i/lub Notch (γ126) (Tabela 3).
  3. Wybierz GSI oszczędzające APP lub Notch-sparing specyficzne dla podłoża. Wyklucz toksyczne związki poprzez kontrprzesiewowe badanie rozpuszczalnym ekspresją Gal4. Kandydaci GSI nie powinni wpływać na wzrost ani aktywność β-galaktozydazy szczepu kontrolnego Gal4 (γ190) (Tabela 3).
  4. Do testu wzrostu uprawiano szczepy w podłożu SC-LWHUAde zawierającym potencjalne GSI w płytkach 384-dołków z OD600 0,03. Inkubuj przez noc w 30 °C bez trzęsania. Monitoruj wzrost po 24 godzinach do OD600.
  5. W testach β-galaktozydazy w formacie 384-dołków hodować szczepy do stężenia 1 x 107 komórek/mL w medium SC-LWU zawierającym potencjalne GSI. Analizuj komórki za pomocą systemu testów Beta-Glo i mierz aktywność β-galaktozydazy, używając 6-0-β-galaktopiranonosyl-lucyferyny jako substratu zgodnie z protokołem producenta.
  6. Dla kandydatów GSI należy zmierzyć produkcję Aβ za pomocą testu in vitro mikrosomowego, aby potwierdzić efekt hamujący.

5. Przesiewowe badania pod kątem modulatora γ-sektazy (GSM) u drożdży

  1. Wykorzystaj wysokoprzepustowe badanie chemiczne GSM, które zostało opracowane na podstawie testu wzrostu drożdży lub testu β-galaktozydazy, jak opisano poniżej.
  2. Przeprowadź badanie GSM szczepami drożdży γ106, γ112 i γ5 (Tabela 2). Wybieraj kandydatów GSM jako związki zwiększające aktywność wzrostu lub aktywność β-galaktozydazy w mutantnych szczepach FAD PS1 (γ106 i γ112) lub FAD APP (Tabela 4). Wyłącz niespecyficzne substancje aktywujące raporty poprzez kontrscreening szczepem bez γ podjednostki katalitycznej sekretazy. Kandydaci GSM nie powinni wpływać na wzrost ani aktywność β-galaktozydazy szczepu kontrolnego bez PS1 (γ5) (Tabela 4).
  3. Do testu wzrostu uprawiaj szczepy w podłożu SC-LWHUAde zawierającym potencjalne GSM w płytkach 384-dołkowych od OD600 0,03. Inkubuj przez noc w 30 °C bez trzęsania. Monitoruj wzrost po 48 godzinach według OD600.
  4. W testach β-galaktozydazy w formacie 384-dołków hodować szczepy do stężenia 1 x 10komórek/mL w medium SC-LWU zawierającym potencjalne GSM. Analizuj komórki za pomocą systemu testów Beta-Glo i mierz aktywność β-galaktozydazy przy użyciu 6-0-β-galaktopiranozyluferyny jako substratu zgodnie z protokołem producenta.
  5. Dla kandydatów GSM należy zmierzyć produkcję Aβ za pomocą testu in vitro mikrosomów, aby potwierdzić efekt modulacyjny, tj. redukcję toksycznych form Aβ Aβ42 i Aβ43.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Korzystając z opisanych dotąd technik, przeanalizowaliśmy geny, mutacje, związki chemiczne i peptydy jako czynniki wpływające na aktywność γ-sekretazy 10,11,12,13,17,18,19. Przesiewowe badania genów i mutacji oparte na wzroście pozwalają na testowanie dużej liczby klonów (100 000-1 000 000)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki protokołu i rozwiązywanie problemów
Odtworzenie γ-sektazy w drożdżach za pomocą metod genetycznych i biochemicznych jest stosunkowo proste, ale istnieje kilka kluczowych kroków, które zapewnią sukces.

Podczas transformacji drożdży (kroki 1.1, 2.1 i 3.3) należy wprowadzić wiele plazmidów: dwa dla składników γ-sekretazy i jeden dla substratów. Transformacja sekwencyjna (po kolei) również może być wykonywana, ale jest czasochłonna. Należy zauważyć, że wprowadz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te zostały wsparte przez grant JSPS KAKENHI numer 22K06121. Autorzy pragną wyrazić wsparcie członków Laboratorium Enzymologii na Uniwersytecie Tohoku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciała
antyamyloid i beta; (N) (82E1) przeciwciałoIBLCat# 10323
przeciwciało przeciw Aph1a, 245-265 (koniec C)BioLegendCat# 823101
przeciwciało anty-FLAG (M2)SigmaKatalog# F3165
przeciwciało przeciw Gal4SigmaCat# G9293
Przeciwciała przeciw HA (12CA5)SigmaKatalog # 11 583 816 001
przeciwciało przeciwnikastrynoweChemiconCat# AB5890
przeciwciało przeciw PGK1 (22C5D8)abcamCat# ab197960
przeciwciała przeciw N-terminusowi lub pętli przeciw PS1 (G1Nr) (GIL)Takasugi et.al., J. Biol. Chem., 277, 50198-50205
antykróliki   IgG, przeciwciało powiązane z HRPSygnalizacja komórkowaKatalog# 7074
Przeciw świnkom morskim IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyCat# sc-2438
przeciw mysim IgG, przeciwciało związane z HRPSygnalizacja komórkowaKatal# 7076
szczepy bakteryjne i drożdże
E. coli DH5αInvitrogenCat# 18265017
S. cerevisiae PJ-69-4AJames P. i inni. in., Genetics 144:1425-1436 (1996)
Chemikalia, peptydy, rekombinowane białka
(3,5-difluorofenylacetylo)-Ala-Phg-OBu< >t (DAPT)Instytut PeptydówCat# 3219-v
Amyloid β-białko (Człowiek, 1-38)Instytut PeptydówCat# 4484-v
Amyloid β-białko (Człowiek, 1-40)Instytut PeptydówCat# 4307-v
Amyloid β-białko (Człowiek, 1-42)Instytut PeptydówKatalog# 4349-v
Amyloid β-białko (Człowiek, 1-43)Instytut PeptydówCat# 4370-v
Przeciwból, dihydrochlorekInstytut PeptydówCat# 4062
AprotyninaSigmaCat# A1153
CHAPSODojindoKatalog# 343-05163
ChymostatynaSigmaCat# C7268
Diizopropylfluorofosforan (DIFP)Chemia WakoKatalog# 049-18921
L685,458Instytut PeptydówKatalog# 4394-v
LeupeptinInstytut PeptydówKatal# 4041
N-p-Tosyl-L-fenylolanin, chlorometyloketon (TPCK)SigmaCat# T4376
Nα -p-tosyl-L-lizyna chlorometyloketon (TLCK)SigmaCat# T7254
o-nitrofenyl-β-D-galaktopiranozyd (ONPG)SigmaCat# N1127
p-aminobenzamidyna (pABA), dihydrochlorekSigmaCat# 857661
Pepstatin ASigmaCat# P5318
Fenantroplina (PNT)SigmaCat# P9375
Fenylometylosulfonylofluorek (PMSF)SigmaCat# P7626
fosfatydylowa cholina (PC), żółtko jajka, typ XVI-ESigmaKat# P3556
Polimeraza DNA TaqTakaraCat# R001A
thiolphanSigmaCat# T6031
Komercyjne zestawy testowe, inne materiały oraz instrumenty
System testów beta-gloPromegaCat# E4720
Zestaw do testowania białek Bio-RadBio-RadCat# 5000001
Koraliki szklane, myte kwasowo (425-600 i mu; m)SigmaCat# G8772
ImageQuant LAS4000GE HealthcareImageQuant LAS4000
Zestaw Mutagenezy Site-Directed QuikChangeAgilentCat# 200518

Bibliografia

  1. Wolfe, M. S. Unrvaling the complexity of γ-secretase. Semin Cell Dev Biol. 105, 3-11 (2020).
  2. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  3. Zhou, B., et al. Notch Signaling pathway: architecture, disease, and therapeutics. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 95(2022).
  4. Takasugi, N., et al. The role of presenilin cofactors in the gamma-secretase complex. Nature. 422 (6930), 438-441 (2003).
  5. Wolfe, M. S., et al. Two transmembrane aspartates in pre-senilin-1 required for presenilin endoproteolysis and gamma-secretase activity. Nature. 398 (6727), 513-517 (1999).
  6. Valdez-Gaxiola, C. A., Rosales-Leycegui, F. R., Gaxiola-Rubio, A., Moreno-Ortiz, J. M., Figuera, L. E. Early- and late-onset Alzheimer's disease: two sides of the same coin. Diseases. 12 (6), 110(2024).
  7. Nordvall, G., Lundkvist, J., Snadin, J. Gamma-secretase modulators: a promising route for the treatment of Alzheimer's disease. Front Mol Neurosci. 16, 129740(2023).
  8. Sun, L., Li, X., Shi, Y. Structural biology of intramembrane proteases: mechanistic insights from rhomboid and S2P to γ-secretase. Curr Opin Struct Biol. 37, 97-107 (2016).
  9. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int J Mol Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  10. Futai, E., Yagishita, S., Ishiura, S. Nicastrin is dispensable for gamma-secretase protease activity in the presence of specific mutations. J Biol Chem. 284 (19), 13013-13022 (2009).
  11. Yagishita, S., Futai, E., Ishiura, S. In vitro reconstitution of gamma-secretase activity using yeast microsomes. Biochem Biophys Res Commun. 377 (1), 141-145 (2008).
  12. Futai, E., et al. Suppressor mutations for presenilin 1 familial Alzheimer Disease mutants modulate γ-secretase activities. J Biol Chem. 291 (1), 435-446 (2016).
  13. Futai, E. Advanced yeast models of familial Alzheimer disease expressing FAD-linked presenilin to screen mutations and γ-secretase modulators. Methods Mol Biol. 2049, 403-417 (2019).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Transforming yeast with DNA. Methods Mol Cell Biol. 5 (5), 255-269 (1995).
  15. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  16. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  17. Imai, S., Cai, T., Yoshida, C., Tomita, T., Futai, E. Specific mutations in presenilin 1 cause conformational change in γ-secretase to modulate amyloid β trimming. J Biochem. 165 (1), 37-46 (2019).
  18. Watanabe, H., et al. Specific mutations in Aph1 cause γ-secretase activation. Int J Mol Sci. 23 (1), 507(2022).
  19. Suzuki, R., et al. Specific mutations near the amyloid precursor protein cleavage site increase γ-secretase sensitivity and modulate amyloid-β production. Int J Mol Sci. 24 (4), 3970(2023).
  20. Zinser, E., Daum, G. Isolation and biochemical characterization of organelles from the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 11 (6), 493-536 (1995).
  21. Imamura,, et al. Inhibition of gamma-secretase activity by helical beta-peptide foldamers. J Am Chem Soc. 131 (21), 7353-7359 (2009).
  22. Han, J. H., et al. OCIAD2 activates γ-secretase to enhance amyloid β production by interacting with nicastrin. Cell Mol Life Sci. 71 (13), 2561-2576 (2014).
  23. Self, W. K., Holtzman, D. M. Emerging diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease. Nat Med. 29, 2187-2199 (2023).
  24. Solopova, E., et al. Fatal iatrogenic cerebral β-amyloid-related arteritis in a woman treated with lecanemab for Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8220(2023).
  25. Zhang, Y., Chen, H., Li, R., Sterling, K., Song, W. Amyloid β-based therapy for Alzheimer's disease: challenges, successes and future. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 248(2023).
  26. Xia, W. γ-Secretase and its modulators: twenty years and beyond. Neurosci Lett. 701, 162-169 (2019).
  27. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 20 (4), 309-325 (2021).
  28. Souza, J. M., Goncalves, B. D. C., Gomez, M. V., Vieira, L. B., Ribeiro, F. M. Animal toxins as therapeutic tools to treat neurodegenerative disease. Front Pharmacol. 9, 145(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Aktywność gamma-sekretazydrożdżowy model choroby Alzheimerarodzinne mutacje choroby Alzheimeratest beta-galaktozydazykwantyfikacja białekPCR podatny na błędytransformacja plazmidowadetekcja immunoblotemmodulatory chemiczne
Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.