Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zbieranie naturalnie uwolnionych egzosomów z tkanki nowotworowej

597 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

10 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje nowatorską metodę ekstrakcji egzosomów z tkanek nowotworowych poprzez ich naturalne uwalnianie i wielokrotne zbieranie, aby zapewnić eksperymentalną podstawę do badania funkcji egzosomów w rozwoju nowotworu.

Streszczenie

Jako pęcherzyki wydzielane przez komórki, egzosomy otaczają i przenoszą różne kwasy nukleinowe, białka i lipidy, uczestnicząc w komunikacji między różnymi komórkami. Egzosomy w mikrośrodowisku guza odgrywają ważną rolę w charakterystyce biologicznej komórek nowotworowych i mogą silnie wpływać na stany innych komórek. Dlatego, aby dalej badać specyficzne funkcje egzosomów w rozwoju nowotworów, niewątpliwie konieczne jest wyekstrahowanie i wyizolowanie egzosomów z tkanek nowotworowych. Bezpośrednia ekstrakcja egzosomów z tkanki nowotworowej zmniejsza potrzebę hodowli komórek in vitro, a egzosomy z tkanki nowotworowej mogą być bardziej podobne do tych w stanie naturalnym. Dlatego utrzymanie naturalnego stanu egzosomów w tkance nowotworowej jest kluczem do procesu ekstrakcji. Trawienie enzymatyczne jest często łączone z ultrawirowaniem w celu ekstrakcji egzosomów z tkanek nowotworowych. Tutaj przedstawiamy nowatorską metodę ekstrakcji egzosomów z tkanki nowotworowej. Użyliśmy pożywki bez surowicy do inkubacji małych fragmentów tkanki nowotworowej na stole do wytrząsania, wielokrotnie zbieraliśmy i ekstrahowaliśmy egzosomy naturalnie uwalniane z tkanki nowotworowej i zidentyfikowaliśmy wyekstrahowaną strukturę, stężenie i charakterystykę egzosomu, zapewniając nową metodę dla naukowców badających funkcję egzosomów w rozwoju guza.

Wprowadzenie

Egzosomy to podtyp pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez komórki, zazwyczaj o rozmiarach od 30 nm do 200 nm1,2. Uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej i dostarczają różne cząsteczki sygnałowe, w tym kwasy nukleinowe (np. kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA), informacyjny RNA (mRNA), kwas mikro rybonukleinowy (miRNA), długie niekodujące RNA (lncRNA), koliste RNA (circRNA)), białka i lipidy1,3,4,5, do komórek biorcy, aby wpływać na ich funkcje fizjologiczne6,7. Początkowo zidentyfikowane w retikulocytach owiec8, egzosomy zostały od tego czasu zidentyfikowane w różnych płynach ustrojowych, w tym we krwi, ślinie, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym, wodobrzuszu, płynie owodniowym i mleku matki9,10,11,12,13,14,15,16. Co więcej, egzosomy mogą być wydzielane przez wiele typów komórek, w tym limfocyty, makrofagi, komórki tuczne, komórki tłuszczowe i komórki nowotworowe17. Dzięki swojej szerokiej dystrybucji egzosomy odgrywają kluczową rolę w różnych procesach patologicznych, zwłaszcza w raku, oraz w różnych procesach fizjologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, naprawie i regeneracji tkanek oraz regulacji immunologicznej18,19,20.

W ostatnich latach wykazano, że egzosomy sprzyjają występowaniu nowotworów, inwazji, przerzutom, oporności na chemioterapię oraz odporności przeciw- lub pronowotworowej20,21,22. Egzosomy pochodzące z raka mogą aktywować ekspresję genów w receptorach lub sąsiednich komórkach rakowych, aby zmienić ich fenotypy biologiczne, a komórki rakowe mogą wchodzić w interakcje z komórkami zrębu w mikrośrodowisku guza, aby promować proliferację, inwazję i angiogenezę komórek rakowych23,24,25. Egzosomy uwalniane przez komórki nowotworowe mogą pomóc im w wydalaniu toksycznych leków, a egzosomy pochodzące z komórek zrębu mogą sprzyjać tworzeniu się komórek rakowych20. Egzosomy pochodzące z raka biorą udział w różnych etapach przerzutów komórek rakowych, w tym w inwazji sąsiednich tkanek, przenoszeniu przez układ krążenia i rozprzestrzenianiu się do odległych narządów20. Wreszcie, egzosomy pełnią zarówno funkcje immunoaktywacji, jak i immunosupresji w raku, w zależności od ligandów, białek i miRNA, które przenoszą20. Ze względu na ważne funkcje egzosomów pochodzących z tkanek nowotworowych, wykazują one potencjalną wartość aplikacyjną we wczesnej diagnostyce, dokładnym leczeniu i monitorowaniu prognostycznym21,22.

Biorąc pod uwagę znaczenie egzosomów pochodzących z tkanki nowotworowej, wielu badaczy próbowało je wyodrębnić, aby dalej badać ich właściwości i funkcje. Bezpośrednia ekstrakcja egzosomów z tkanek nowotworowych nie tylko zmniejsza potrzebę hodowli komórek in vitro, ale także bardziej przypomina naturalny stan egzosomów. Dlatego utrzymanie naturalnego stanu egzosomów w tkance nowotworowej jest kluczem do procesu ekstrakcji. Właściwości fizyczne egzosomów są podstawą powszechnych metod ekstrakcji i rzadko bierze się pod uwagę zmiany w składnikach egzosomów spowodowane stymulacją podczas procesu ekstrakcji. W rzeczywistości na jakość egzosomów duży wpływ mają różne procedury ekstrakcji egzosomów26,27. Obecnie tkanki nowotworowe są trawione przez enzymy i poddawane takim metodom, jak wirowanie w gradiencie gęstości, ultrawirowanie, ultrafiltracja, chromatografia wykluczania wielkości (SEC), wytrącanie polimerów, chromatografia immunopowinowactwa i metody mikroprzepływowe, przed separacją2,21,28,29. Tutaj podajemy metodę ekstrakcji egzosomów z tkanki nowotworowej. Użyliśmy pożywki bez surowicy do hodowli małych bloków tkanki nowotworowej w shakerze, a następnie zebraliśmy i wyekstrahowaliśmy egzosomy naturalnie uwalniane przez tkankę nowotworową i zidentyfikowaliśmy stężenie i charakterystykę wyekstrahowanych egzosomów, dostarczając podstawowych materiałów i dowodów eksperymentalnych do badania funkcji egzosomów w rozwoju guza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty związane z egzosomami tkanki nowotworowej zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Badanie to zostało zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego (20220301101). Cztery tygodnie po inokulacji komórkami SGC-7901, jedna naga mysz (BALB/c, samiec, 8 tygodni, 26 g) została poddana eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.

1. Pozyskanie tkanki nowotworowej

  1. Moczyć w 75% alkoholu przez 5 min.
  2. Przenieś się na sterylny stół operacyjny, użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć zewnętrzną skórę guza ektopowego.
  3. Oderwij ektopową tkankę nowotworową, a następnie pokrój i zważ, aby uzyskać dwa kawałki o równej wadze.
    UWAGA: Jeden fragment tkanki nowotworowej jest używany do ekstrakcji egzosomu zgodnie z tym protokołem, a inny fragment tkanki nowotworowej o równej wadze jest używany do ekstrakcji egzosomu przez trawienie enzymatyczne30.

2. Wstępne kondycjonowanie tkanki nowotworowej

UWAGA: Wykonaj te kroki na lodzie i w sterylnym środowisku.

  1. Odpipetować 10 ml wstępnie schłodzonego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (0,01 M) w celu przepłukania tkanki nowotworowej w celu usunięcia krwi i tłuszczu z powierzchni.
  2. Pokrój tkankę nowotworową (~400 mm3) na 1-2 mm kawałki za pomocą nożyczek okulistycznych w 20 ml PBS z 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm. Przenieść powyższą mieszaninę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

3. Uwalnianie egzosomów

  1. Odwirować probówkę z kroku 1.2 przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 ml pożywki o minimalnej ilości niezbędnej pożywki α (α-MEM). Inkubować w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min przez 1 godzinę w wytrząsarce o stałej temperaturze.
  3. Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki α-MEM. Inkubować w temperaturze 37 °C przy 100 obr./min przez 6 godzin w wytrząsarce o stałej temperaturze.
    UWAGA: Bądź delikatny przy wszystkich krokach. Wystarczy krótka inkubacja i jedno przemycie pożywką α-MEM, aby usunąć składniki wewnątrzkomórkowe, które przeciekają w wyniku cięcia, w tym pęcherzyki wewnątrzkomórkowe i organelle.
  5. Odwirować przy 200 × g przez 5 minut, 4 °C i zebrać supernatant do nowej probówki.
  6. Ponownie zawiesić tkankę nowotworową za pomocą 10 ml pożywki α-MEM.
  7. Powtórzyć inkubację od kroku 2.4, a następnie kroku 2.5.
  8. Zmieszać supernatanty z pożywką zebrane w krokach 2.5 i 2.7.
    UWAGA: Bądź delikatny przy wszystkich krokach. Dwie 6-godzinne inkubacje indukowały naturalne uwalnianie egzosomów z fragmentów tkanki nowotworowej.

4. Ultrawirowanie

  1. Przefiltrować supernatant przez mikroporowaty filtr 0,45 μm.
  2. Odwirować supernatant o stężeniu 12 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia dużych pęcherzyków.
  3. Przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 120 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania egzosomów.
  4. Przemyć osad egzosomu PBS (0,01 M) i ponownie odwirować przy 140 000 × g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić wytrącone egzosomy w PBS (0,01 M) do natychmiastowego użycia lub przechowywania w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Bądź delikatny przy wszystkich krokach. Wykonuj każdy krok z najmniejszą możliwą siłą odśrodkową i najkrótszym czasem odśrodkowym.

5. Prezentacja wyników identyfikacji egzosomów

  1. Zidentyfikuj morfologię egzosomów z tkanki nowotworowej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)30.
  2. Określ rozmiar i stężenie egzosomów w tkance nowotworowej za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)30.
  3. Zidentyfikuj egzosomalne markery białkowe CD9 i CD63 za pomocą western blot (WB)30.
    UWAGA: Najnowsze wytyczne dotyczące badań egzosomów, w tym stosowanie CD63, CD9, jako kryteriów dla markerów egzosomów31.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie TEM wykazało, że egzosomy pochodzące z tkanki nowotworowej otrzymane tą metodą posiadały typowe struktury w kształcie filiżanki (Rysunek 1A), a między kształtem egzosomów wyizolowanych tą metodą a tymi otrzymanymi poprzez trawienie enzymatyczne nie stwierdzono istotnych różnic (Rysunek 1B). Wyniki NTA wykazały, że średnica egzosomów wynosiła średnio 172,8 nm, co mieści się w zakresie 30-200 nm i jest zgodne z typowym rozmiarem egzosomów; stężenie cząstec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tej metodzie egzosomy pochodzące z tkanki nowotworowej zostały wyekstrahowane z tkanek ektopowego raka żołądka nagich myszy, a kluczowymi etapami były uwolnienie, wysięk, separacja i oczyszczenie egzosomów. Różne metody separacji egzosomów zostały zaprojektowane i zweryfikowane zgodnie z właściwościami fizycznymi i składem egzosomów 2,21,28,29, z których każda ma zalety i wady, ale celem jest zminimalizowanie wpływu różnych procedur ekstrakcji egzosomów na właś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Przeciwciało anty-CD63Biossbsm-43117M
Przeciwciało anty-CD9Biossbs-2489R
Probówka wirówkowaThermo339650
Wytrząsarka do stałej temperaturyThermoMAXQ4450
Jednorazowa sterylna pipeta-10 mlJET
EDTABiosharpBS107
Pipeta elektrycznaThermo9501
Wirówka pozioma z kontrolowaną temperaturąThermoSorvall ST1R plus
Analizator śledzenia nanocząstekMalvinNanoSight Pro
JinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Kwas fosfowolframowy   Sigma455970-10G
Nożyczki chirurgiczneJinzhongJ21010
Przeciwciało wtórneBiossBs-0295GKoza IgG Anty-Królicza H& Transmisyjny mikroskop elektronowy L / FITC
NikonPlan Apo WF
Ultraodśrodkowa rurkaBeckman355618
GSP01001 Nożyczki okulistyczne

Bibliografia

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

egzosomy nowotworoweizolacja egzosomówekstrakcja egzosomówmikrośrodowisko nowotworuultrawirowanietrawienie enzymatycznekomunikacja międzykomórkowacharakterystyka egzosomówmedium bezsurowicze

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.