Artykuł metodologiczny

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

DOI:

10.3791/67754

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Palo Alto Veterans Institute for Research, 3Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, w jaki sposób ekspresja receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) wpływa na pozycjonowanie komórek w różnych mikrośrodowiskach tkankowych, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów transportu komórek odpornościowych. Przedstawiamy konkurencyjny test naprowadzania przeznaczony do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w narządach wyrażających ich pokrewne ligandy chemoatraktantu, mający zastosowanie zarówno w badaniach krótkoterminowych, jak i długoterminowych. Podejście to obejmuje ulepszony protokół transdukcji rekombinowanego wirusa mysich komórek macierzystych (MSCV) limfocytów T w celu ekspresji GPCR będącego przedmiotem zainteresowania lub konstruktu kontrolnego, a następnie konkurencyjnego naprowadzania u myszy biorców. Rozmieszczenie komórek w różnych narządach jest analizowane za pomocą cytometrii przepływowej i/lub mikroskopii konfokalnej. W krótkoterminowych eksperymentach (10-12 godzin) mikroskopia konfokalna ujawniła wyraźne wzorce lokalizacji komórek, w tym pęcherzyków płucnych, błony podśluzowej oskrzeli, miejsc żylnych i śródmiąższu w płucach, a także nabłonka wyściełającego tchawicę, żołądek i róg macicy. W badaniach długoterminowych (1-7 tygodni) cytometria przepływowa dostarczyła informacji na temat preferencyjnej akumulacji komórek, ujawniając dynamiczne zmiany i potencjalne dojrzewanie lub repozycjonowanie w tkankach w czasie. Ten konkurencyjny test naprowadzania jest solidnym narzędziem do badania pozycjonowania komórek za pośrednictwem GPCR, oferując cenne informacje na temat dystrybucji specyficznej dla tkanek i potencjalnych zastosowań w immunologii i badaniach terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) mają zasadnicze znaczenie w regulacji różnych procesów komórkowych, w tym transdukcji sygnału, neurotransmisji, regulacji hormonów i migracji komórek odpornościowych1. Odgrywają one kluczową rolę w czasoprzestrzennej kontroli migracji i lokalizacji limfocytów2. Podczas fazy pobudzania odpowiedzi immunologicznej, lokalne mikrośrodowisko i interakcje komórkowe skłaniają limfocyty T do ekspresji unikalnego zestawu cząsteczek adhezyjnych i receptorów chemokinowych znanych jako receptory naprowadzające. Ta adaptacja umożliwia limfocytom T doświadczonym w antygenach angażowanie się w komórki śródbłonka specyficzne dla narządu (EC) i migrację do odrębnych tkanek docelowych. Zdolność limfocytów T do nabywania tropizmu tkankowego ma kluczowe znaczenie dla skutecznych odpowiedzi przypominających, szczególnie w kontekście nawracających infekcji dotykających tego samego narządu 3,4.

GPCR kierują komórki odpornościowe do określonych tkanek i narządów, w których pełnią krytyczne funkcje - takie jak kierowanie komórek T i NK CD8 + do miejsc guza w celu działania cytotoksycznego lub wspomaganie limfocytów T CD4 + w koordynowaniu odpowiedzi immunologicznej poprzez wspieranie aktywacji innych komórek odpornościowych. Zrozumienie, w jaki sposób GPCR kierują limfocyty T do ich precyzyjnych lokalizacji, jest niezbędne do rozwoju celowanych immunoterapii 5,6. Wyzwanie polega jednak na modelowaniu tych złożonych interakcji in vitro, ponieważ jednoczesne replikowanie zarówno ograniczonych przestrzennie sygnałów, jak i kierunkowych sygnałów chemotaktycznych jest trudne.

Wyjaśnienie ról określonych receptorów leukocytów jest również często trudne ze względu na ich ograniczoną częstotliwość ekspresji w populacjach endogennych oraz fakt, że receptory te zazwyczaj zdobią różne typy komórek. Ta złożoność sprawia, że trudno jest wyizolować rolę określonego receptora od innych mechanizmów specyficznych dla podzbioru komórki. Idealnie byłoby, gdyby metody porównywały podobne populacje, różniące się jedynie receptorem będącym przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić jasny wgląd.

Aby przezwyciężyć te wyzwania, przyjęliśmy konkurencyjny test naprowadzania, który wykorzystuje rekombinowaną transdukcję retrowirusową MSCV w celu efektywnej ekspresji GPCR w limfocytach T. Wektory retrowirusowe MSCV, które łączą elementy wektorów MESV opartych na wirusie mięsaka mieloproliferacyjnego (PCMV) i wektorów LN opartych na wirusie białaczki mysiej Moloneya (MMLV), zawierają rozszerzony sygnał pakowania hybrydowego pochodzący z wektorów LN7. Modyfikacja ta zwiększa efektywność dostarczania genów, umożliwiając zarówno krótko-, jak i długoterminowe badania lokalizacji limfocytów T in vivo. Dzięki wykorzystaniu cząstek retrowirusowych o wysokim mianie i mikroskopii konfokalnej, podejście to pozwala na precyzyjną wizualizację położenia limfocytów T i interakcji w złożonych środowiskach tkankowych. Przedstawiamy szczegółowe protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych oraz wykonywania wewnętrznie kontrolowanych (tzw. konkurencyjnych) testów naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowiska, w których pośredniczy receptor. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych oraz umożliwienie przyszłych zastosowań zarówno w badaniach podstawowych, jak i w rozwoju terapeutycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy w tym badaniu były utrzymywane w specyficznych placówkach wolnych od patogenów (SPF) w Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Myszy B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) i Rag1-/- zakupiono w Jackson Laboratories. Podczas gdy użyliśmy PepBoya do uzyskania komórek CD45.1, zalecamy użycie JAXBoy (C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J). JAXBoy jest w pełni koizogenicznym szczepem generowanym przez CRISPR zamiast tradycyjnego krzyżowania wstecznego, co poprawia spójność genetyczną. Historycznie rzecz biorąc, badania oznaczone allotypem CD45 na myszach PepBoy (CD45.1), które nie są w pełni wrodzone, obejmowały kontrolne testy naprowadzania i recyrkulacji z porównaniami typu dzikiego (WT / WT) w celu uwzględnienia potencjalnej zmienności. Ponieważ myszy JAXBoy są teraz dostępne jako w pełni izogeniczna alternatywa, te dodatkowe kontrole mogą nie być już konieczne. Naukowcy powinni nadal brać pod uwagę, że różnice między wariantami CD45.1 i CD45.2 - takie jak ich rola jako białkowych fosfataz tyrozynowych - mogą wpływać na zachowanie komórek i wzorce naprowadzania. Wszystkie protokoły omówione w tekście i poniżej zostały zatwierdzone lub spełniają wytyczne akredytowanego Zakładu Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych oraz Panelu Administracyjnego ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi w VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Zwierzęta uśmiercano przy użyciu zatwierdzonych procedur. Do eksperymentów włączono myszy obojga płci w wieku 8-12 tygodni.

1. Przygotowanie wektora MSCV

  1. Zakup wektora retrowirusowego MSCV-IRES-Thy1.1 z regionem kodującym gen będący przedmiotem zainteresowania myszy (GOI) lub ORF_Stuffer (ujemna kontrola ORF)
    UWAGA: Ten konstrukt zawiera marker powierzchniowy Thy1.1 wraz z genem GPCR, który jest przedmiotem zainteresowania. Łącznik Internal Ribosome Entry Site (IRES) pozwala na koekspresję GPCR z Thy1.1, ułatwiając identyfikację transdukowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej lub oczyszczania i izolacji za pomocą kulek magnetycznych. Jest to szczególnie przydatne, gdy przeciwciała specyficzne dla GPCR są niedostępne, jak to często ma miejsce w przypadku słabo przebadanych GPCR.
  2. Pozyskać plazmid MSCV w postaci bakteryjnej i kulturze poprzez zaszczepienie bulionu Luria-Bertani (LB) uzupełnionego odpowiednią selekcją antybiotyków w oparciu o gen oporności kodowany przez plazmid (np. ampicylinę, kanamycynę lub chloramfenikol). Pożywka LB składa się z tryptonu (10 g/l), ekstraktu drożdżowego (5 g/l) i NaCl (10 g/l), dostosowanych do pH 7,0 i sterylizowanych w autoklawie. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (220 obr./min) przez noc.
  3. Przygotuj zapasy plazmidów przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej przy użyciu zestawu do przygotowania DNA.
  4. Po wyizolowaniu DNA zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru i przygotować robocze roztwory plazmidów o stężeniu 1 μg/μl. Plazmidy należy przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Ustalanie hodowli linii komórkowej opakowania

UWAGA: Użyliśmy komórek Platinum E (Plat-E) firmy Cell Biolabs. Komórki Plat-E to linia komórkowa oparta na 293T z promotorem EF1α, który zapewnia stabilną i wysokowydajną ekspresję retrowirusowych białek strukturalnych (geny GAG, Pol i ENV), umożliwiając pakowanie retrowirusowe z pojedynczą transfekcją plazmidu8. Chociaż mogą być używane inne linie komórkowe, takie jak NIH-3T3 lub 293T, nie przetestowaliśmy tych alternatyw.

  1. Przygotuj pożywkę komórkową Plat-E, dodając DMEM, 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, blastycydyny (10 μg/ml) i puromycyny (1 μg/ml). Używaj blastycydyny i puromycyny do utrzymania komórek, ale pomijaj je podczas i po transfekcji.
  2. Komórki Plate Plat-E wysyłane zamrożone w 1,0 ml, w >3 x 106 komórek/ml w DMEM, 20% FBS i 10% DMSO. Szybko rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść wszystkie rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę hodowlaną Plat-E.
  3. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki Plat-E, delikatnie pipetując, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  4. Dodać 9 ml pożywki Plat-E do 10 cm naczynia hodowlanego, a następnie przenieść 1 ml ponownie zawieszonych komórek do naczynia. Potwierdź, że rozmrożone komórki są żywotne, mieszając równą objętość zawiesiny komórek i błękitu trypanowego i licząc żywe (niebarwione) i martwe (zabarwione na niebiesko) komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek, dążąc do >70% żywotności.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 . Nie zmieniaj podłoża przez pierwsze 3 dni; Normalne jest obserwowanie pływających i martwych komórek podczas pierwszej odwilży.
  6. Gdy komórki osiągną zbieżność 85%-90%, przemyć DMEM/PBS Ca-/Mg-. Odłączyć komórki za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny/0,5 mM EDTA i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 8 ml pożywki Plat-E, zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Podzielić w stosunku powierzchni 1:10 lub 1:5 (tj. wysiać nowe płytki z 1/10 lub 1/5 całkowitej objętości z oryginalnego naczynia). Zawiesić w końcowej objętości 10 ml pożywki Plat-E i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .
  8. Resztę komórek należy podzielić na 1 ml FBS z 10% DMSO i zamrozić w temperaturze -80 °C, a następnie w ciekłym azocie do długotrwałego stosowania.
    UWAGA: Traktuj komórki zgodnie z powyższym opisem, gdy zbliżają się do 85% zlewu. Aby utrzymać optymalne zdrowie komórek, unikaj nadmiernej konfluencji i dąż do 3-dniowych podziałów z rozcieńczeniem 1:10. Jeśli wzrost zwalnia, użyj świeżej porcji. Wydajność komórki zwykle spada wraz z kolejnymi pasażami. W celu uzyskania najlepszych wyników zalecamy użycie komórek do transfekcji między przejściami 4 i 15.

3. Produkcja transdukowanych komórek

  1. Dzień 1: Komórki E z płyty nasiennej
    UWAGA: Oblicz liczbę wymaganych ogniw i płytek Plat E. Użyliśmy 1 ml supernatantu wirusowego na studzienkę w 24-dołkowej płytce do transfekcji komórek 2x. Zazwyczaj używamy około dwóch 10-centymetrowych płytek transfekowanych na szalce Petriego z komórkami Plate-E na 24-dołkową płytkę z limfocytami T w hodowli.
    1. Zacznij od pokrycia 10 cm płytek do hodowli tkankowych 5 ml 50 μg/ml poli-D-lizyny w sterylnej wodzie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Przemyć 2x sterylnym PBS Ca-/Mg - aby upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości.
      UWAGA: Zalecamy powlekanie płytek, ponieważ komórki Plat-E mają tendencję do odklejania się po transfekcji, co prowadzi do słabej wydajności komórek i zmniejszonej produkcji miana wirusa.
    2. Odłącz komórki Plat-E, jak opisano powyżej w kroku 2.6 i wykonaj test wykluczania błękitu trypanowego, aby zapewnić żywotność. Wymieszać równą objętość zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego. Policz żywe (niebarwione) i martwe (zabarwione na niebiesko) komórki za pomocą hemocytometru/licznika komórek. Wysiew 3 x 10⁶żywe komórki w 10 cm kulturze tkankowej na szalce Petriego z pożywką Plat-E bez antybiotyków.
      UWAGA: Talerze z nasionami powinny osiągnąć 85%-90% konfluencji następnego dnia. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, rozważ użycie innej podwielokrotności komórki. Dostosuj gęstość siewu w oparciu o czas posiewu; Do wieczornego posiewu można użyć 3,5 x 106 komórek.
  2. Dzień 2: Transfekcja komórek Plat-E i powlekanie płytek limfocytów T przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28
    1. Zastąp pożywkę w hodowlach komórek Plat-E 6,5 ml zredukowanej pożywki surowicy.
    2. Przygotuj mieszankę do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta odczynnika Lipofectamina (w tym badaniu użyto Lipofectamine 2000).
    3. Na każdą płytkę zmieszać 45 μl Lipofectaminy 2000 z 210 μl zredukowanej pożywki surowicy w jednej probówce i 15 μg DNA z 235 μl zredukowanej pożywki surowicy w drugiej probówce. Połączyć zawartość probówek, pipetując 3x-4x.
    4. Inkubować mieszaninę przez 5-20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów lipopektamina/DNA, a następnie dodawać kroplami do płytek. Inkubować płytki przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.
    5. Studzienki aktywujące limfocyty T: Pokryj 24-dołkowe płytki 5 μg/ml anty-mysiego CD28 (37,51) i 10 μg/ml anty-mysiego CD3 (145-2c11) w 375 μl/basenik PBS przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 3-4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w dniu 3.
      UWAGA: Owiń płytki przezroczystą folią podczas inkubacji przez noc, aby zapobiec parowaniu. Aktywator myszy Dynabeads CD3/CD28 może być stosowany jako alternatywa z porównywalnymi wynikami.
  3. Dzień 3: Zmień pożywkę Plat-E oraz wyizoluj i aktywuj limfocyty T
    1. Rano zmienić pożywkę do transfekcji Plat-E na 14 ml kompletnej pożywki DMEM. Przygotuj pożywkę z limfocytów T, dodając RPMI-10: RPMI 1640 z L-glutaminą, 10% FBS, 1% penicyliną/streptomycyną, 1x MEM Aminokwasy endogenne, 1 mM pirogronian sodu, 50 μM β-merkaptoetanol i 1 mM HEPES.
    2. Eutanazja myszy JAXBoy (CD45.1) i C57B6/J (CD45.2) za pomocą inhalacji CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Izoluj śledziony i węzły chłonne w sterylnych warunkach.
    3. Delikatnie rozgnieć śledziony na sitku do komórek z nylonowej siatki o grubości 100 μm z pożywką RPMI na 6-dołkowej płytce za pomocą tłoka strzykawki.
    4. Przenieść roztwór przez sitko z nylonową siatką o grubości 40 μm w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przemyć je PBS Ca-/Mg-.
    5. Wykonaj magnetyczną selekcję ujemną za pomocą zestawu izolacyjnego Mouse T/T CD4 zgodnie z instrukcjami producenta lub alternatywnie posortuj komórki za pomocą sterylnego FACS
    6. Policz limfocyty T za pomocą licznika komórek i umieść je w dołkach aktywacji limfocytów T w odległości 1-1,5 x 106 na dołek w 1 ml pożywki RPMI-10 na dołek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w nawilżonym inkubatorze. Odczekaj 24-48 godzin na prawidłową aktywację, zgodnie z oceną pod mikroskopem, jak wyjaśniono w poniższych uwagach.
      UWAGA: Sieciowanie CD3 i CD28 skutecznie aktywuje limfocyty T w tej konfiguracji. Jedna śledziona myszy zwykle daje około 1 x 108 splenocytów. Limfocyty T CD4 + na ogół stanowią około 10% całkowitej populacji splenocytów. Dlatego, aby przygotować 24-dołkową płytkę z 1-1,5 x 106 limfocytami T CD4+ na dołek, szacuje się, że wystarczą komórki od 2-3 myszy.
  4. Dzień 4: Transdukcja
    1. Sprawdź limfocyty T po 24 godzinach pod mikroskopem. Upewnij się, że limfocyty T są w stanie wybuchu (tworzą skupiska i wydają się powiększone w wyniku aktywacji) przed transdukcją. Wybuchowe limfocyty T zapewniają, że są w stanie podziału, co ma kluczowe znaczenie dla transdukcji MSCV9.
    2. Zebrać ~10 ml supernatantu wirusowego z 10 cm płytek w stożkowej probówce. Zastąp płytki hodowlane Plat-E kolejnymi 10 ml pożywki Plat-E bez antybiotyków, aby zapewnić wystarczającą ilość pożywki do wytworzenia większej ilości pożywki do drugiej transdukcji następnego dnia. Dostosuj objętość pożywki w płytkach PLAT-E w oparciu o liczbę studzienek limfocytów T, które muszą zostać transfekowane następnego dnia.
      UWAGA: Transducing 2x znacznie poprawia wydajność.
    3. Przefiltrować supernatant wirusa, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy 0,45 μm. Dodać 8 μg/ml polibrenu i 1:100 HEPES.
    4. Obracać 24-dołkową płytkę z limfocytów T przez 7 minut w temperaturze 950 x g. Ostrożnie zebrać i zachować supernatant bez usuwania komórek. Ten supernatant zawiera cytokiny i inne czynniki wydzielane przez limfocyty T po aktywacji i zastąpione tym supernatantem po infekcji w celu utrzymania profilu cytokin i czynników wspierających proliferację i wzrost limfocytów T.
    5. Przeprowadzić dezynfekcję, dodając 1 ml supernatantu wirusowego do każdej studzienki i wirując w temperaturze 1 150 x g przez 4 godziny w temperaturze 32 °C. Podczas spinfekcji uszczelnić płytki folią spożywczą.
    6. Po infekcji ostrożnie zastąp pożywkę wcześniej zapisanym supernatantem limfocytów T.
  5. Dzień 5: Powtórz transdukcję
    1. Powtórzyć transfekcję zgodnie z opisem w dniu 4. Opcjonalnie należy zmieszać zapisany w kroku 3.4.3 supernatant początkowo aktywowanych limfocytów T ze świeżymi pożywkami w stosunku 1:1, jeśli pożywka wydaje się wyczerpana.
  6. Dzień 6: Umyj komórki i rozwiń
    1. Przemyj komórki PBS Ca+/Mg+. i przenieść je na nową płytkę hodowlaną ze 130 j./ml mysiej IL2 i 10 ng/ml mysiej IL7. Inkubować komórki przez co najmniej 2 dni lub do momentu, gdy osiągną pożądany poziom ekspansji, w zależności od liczby komórek potrzebnych do wstrzyknięcia.
  7. Dzień 8: Żniwa i oczyszczanie
    1. Zbierz komórki i oczyść je za pomocą gradientu gęstości Histopaque 1,077.
      UWAGA: Ta technika pomaga wyizolować żywe komórki (takie jak limfocyty lub inne komórki odpornościowe) z martwych komórek lub szczątków. Martwe komórki, które mają większą gęstość, osiadają na dnie probówki, podczas gdy żywe komórki zazwyczaj pozostają w warstwie interfejsu.
    2. Dodaj 5 ml Histopaque 1,077 do probówki o pojemności 15 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS Ca+/Mg+. Zawiesinę komórkową należy ostrożnie ułożyć na wierzchu 5 ml preparatu Histopaque 1.077 w probówce wirówkowej.
    4. Wirować przy 400-500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że przerwanie/przyspieszenie wirówki jest ustawione na zero.
    5. Po odwirowaniu komórki rozdzielą się na odrębne warstwy w zależności od gęstości. Pożądane komórki zazwyczaj znajdują się w warstwie styku między histopakiem a górnym podłożem, podczas gdy martwe komórki osiądą na dole. Ostrożnie zebrać warstwę komórek w warstwie granicy faz za pomocą pipety, unikając zanieczyszczenia innymi warstwami. Pobrane komórki są teraz gotowe i czyste do wstrzyknięć.
    6. Oceń wydajność transdukcji, wykonując barwienie Thy1.1 i analizę cytometrii przepływowej. Zobacz strategię bramkowania na rysunku 1.
      UWAGA: Po transdukcji komórki można wykorzystać w testach chemotaksji w celu oceny ich migracji w kierunku określonych chemokin w porównaniu z komórkami wektora kontrolnego, aby funkcjonalnie potwierdzić ich aktywność in vitro przed przystąpieniem do wstrzykiwań.
  8. Długoterminowy test lokalizacji in vivo
    1. Do długoterminowego naprowadzania użyj CD45.1 dla interesującego nas GPCR myszy i CD45.2 dla komórek transdukowanych pustym wektorem (lub odwrotnie). Wymieszaj dwie populacje komórek w stosunku 1:1.
    2. Wstrzyknąć dożylnie 20-30 x 106 komórek dla każdej dorosłej myszy biorcy Rag1-/- przez 1 tydzień tropizmu i 5 x 106 przez 7-tygodniowy tropizm. Używamy biorców Rag1-/- z niedoborem limfocytów, aby zmniejszyć konkurencję z endogennymi limfocytami T.
    3. Po 1 do 7 tygodniach (w zależności od badania) wstrzyknij dożylnie przeciwciało anty-CD45 (dożylnie) myszom 5 minut przed pobraniem, aby oznaczyć komórki krwionośne.
    4. Poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
      UWAGA: Przeprowadzono badania trwające 1 tydzień i 7 tygodni; Dłuższe badania mogą być możliwe, ale nie zostały jeszcze przetestowane.
    5. Pobieraj komórki z różnych narządów będących przedmiotem zainteresowania i kontroli. Trawić tkanki zgodnie ze standardowymi protokołami przygotowania limfocytów dla każdego narządu10,11.
    6. Wybarwić pobrane komórki przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) do analizy cytometrii przepływowej.
  9. Krótkoterminowe konkurencyjne naprowadzanie: pozycjonowanie i obrazowanie limfocytów T
    1. Zalecamy użycie myszy C57B6 / J jako dawców, biorąc pod uwagę, że będziemy znakować fluorescencyjnie komórki. Jednak w przypadku bardzo krótkich testów naprowadzania do kilku godzin można użyć dowolnego szczepu.
    2. W 8 dniu hodowli magnetycznie wyizolować transdukowane (Thy1.1+) komórki za pomocą mikrokulek CD90.1, zgodnie z instrukcjami producenta12.
    3. Utrzymywać tylko transdukowane komórki (czystość >95%) w hodowli po tym punkcie przez 2 dni w IL2 i IL7, jak wskazano powyżej, i pozostawić do ekspansji. Mikrogranulki są biodegradowalne i po 48 godzinach nie zaburzają normalnego funkcjonowania komórek.
    4. W dniu 11 oznacz komórki wyrażające interesujący Cię GPCR estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE jest fluorescencyjnym barwnikiem barwiącym komórki). W przypadku komórek nadziewarki użyj żółtego barwnika fluorescencyjnego lub odwrotnie. Jeśli wolisz, możesz użyć alternatywnych barwników.
      1. Przygotować zawiesinę komórek o stężeniu 1 x 106 komórek/ml w RPMI z 2% FBS. Inkubować komórki z barwnikiem o końcowym stężeniu 5 μM w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej z delikatnym mieszaniem przez 20 minut. Aby zapewnić porównywalne wyniki, naprzemiennie przypisuj barwniki w oddzielnych eksperymentach. Alternatywnie, użyj pojedynczego barwnika, aby oznaczyć wspólny typ komórek jako wzorzec wewnętrzny, w tym komórki eksperymentalne i kontrolne u różnych biorców.
      2. Umyj oznaczone komórki i wymieszaj je w proporcji 1:1. Oszacuj stężenie komórek za pomocą licznika komórek. Wstrzyknij dożylnie 15-30 x 106 komórek myszom biorcom (myszy WT lub transgeniczne biorcy, w zależności od celu eksperymentu).
    5. Około 10-12 godzin później wstrzyknij myszom przeciwciało anty-CD31 (np. DyLight 633 znakowane, klon 390), które powinno być 10-15 minut przed uśmierceniem, aby wyznaczyć naczynia krwionośne i odróżnić komórki wewnątrznaczyniowe od wynaczynionych.
    6. Poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Przeanalizować lokalizację komórek za pomocą FACS zawiesin komórkowych, jak opisano w kroku 3.8 powyżej, lub obrazując całe mocowania tkanek, jak w kroku 3.9.8 lub kroku 3.9.7 dla narządów będących przedmiotem zainteresowania, za pomocą mikroskopii konfokalnej.
    7. W przypadku cienkich narządów, takich jak tchawica, róg macicy lub węzły chłonne, przygotuj mocowania do kabaczków. Umieść chusteczkę na szkiełku z taśmą dwustronną po bokach, dodaj kilka kropel roztworu montażowego Fluoromount-G, przykryj szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie i równomiernie dociśnij, aby przymocować szkiełko nakrywkowe do taśmy za pomocą osobnego szkiełka lub innego płaskiego przedmiotu.
    8. W przypadku zamrożonych skrawków należy zanurzyć tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). W przypadku płuc przed osadzeniem należy wykonać perfuzję 50% OCT/PBS.
    9. Użyj cytometrii przepływowej dla narządów kontrolnych, takich jak obwodowe węzły chłonne (PLN), śledziona lub krew, aby ocenić wydajność transdukcji (% Thy1,1+), jak pokazano na rycinie 1 i znormalizować wyniki. Wizualizacja PLN z mocowaniami lub sekcjami squasha za pomocą mikroskopii konfokalnej. Policz komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej z oprogramowaniem Imaris.
    10. Określ stosunek komórek transdukowanych GPCR do komórek kontrolnych (transdukowanych przez nadziewar) w całych narządach lub określonych przedziałach narządowych. Znormalizować do współczynników wejściowych określonych przez FACS i/lub do stosunku odzyskanego z narządów kontrolnych, o których wiadomo lub zakłada się, że GPCR jest nieistotny.
    11. W celu analizy lokalizacji mikrośrodowiskowej w płucach należy zmierzyć odległość komórek od histologicznych punktów orientacyjnych (np. błon podstawnych oskrzeli lub żył) za pomocą oprogramowania Imaris.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania zdolności określonych receptorów do kierowania lokalizacją komórek T in vivo. Jako demonstrację tego protokołu użyliśmy GPR2513. Przy użyciu tego protokołu jesteśmy w stanie osiągnąć 30%-40% wydajność transdukcji, co oceniano za pomocą barwienia Thy1.1 za pomocą cytometrii przepływowej. Przeprowadziliśmy testy chemotaksji oparte na transwellingu in vitro przy użyciu komórek transdukowanych GPR25 wraz z kontrolami nadziewarki, testuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnętrznie kontrolowany test naprowadzania przedstawiony w tym badaniu jest kompleksową metodą badania transportu i pozycjonowania limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach narządów i tkanek. Takie podejście integruje kilka krytycznych optymalizacji w celu zwiększenia odtwarzalności, dokładności i wydajności.

Krytycznym aspektem tego protokołu jest skuteczna transdukcja limfocytów T za pomocą wektorów retrowirusowych MSCV, co jest ułatwione dzięki zastosowaniu komórek Pla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez NIH przyznaje AI178113 R01 i R01 AI047822, grant 1903-03787 z The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust oraz granty Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) T31IP1880 i T33IR6609 dla ECB; Y.B. był wspierany przez Research Fellows Award przyznawaną przez Crohn's and Colitis Foundation of America (835171). B.O. był wspierany przez stypendium podoktorskie Fundacji Ramona Arecesa (Madryt, Hiszpania) oraz nagrodę Research Fellows Award przyznawaną przez Crohn's and Colitis Foundation of America (574148). AA było wspierane przez Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (CIRM) - EDUC2-12677.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AF647 anty myszy CD90.1-Thy1.1 (OX-7)Legenda biologiczna 202507
anty-CD31 (DyLight 633, klon 390)InvivoMab BE0377 powiedział:
anty-mysz CD28 37.51eNauki biologiczne 
anty-mysz CD3 145-2C11eNauki biologiczne 
APCCy7 anty myszy CD3 (145-2C11)Legenda biologiczna 100329
BV421 anty myszy CD8b  (Ły-3)Legenda biologiczna 126629
BV711 anty mysz CD4 (RM4-5) Legenda biologiczna 100549
Mikrogranulki CD90.1 Miltenyi 130-121-273
Międzynarodowa Organizacja Inwestycyjna Termonauka Zobacz materiał C34554
Anty mysz FITC CD45.2 (104)BDAB_395041
mysz IL2 Peprotech 200-02-50UG
mysz IL7 Peprotech   217-17-10UG
Zestaw izolacyjny Mouse T CD4 Technologie STEMCELL 18000
MSCV-IRES- Ty1.1 GPR25Kreator wektorów 
MSCV-IRES- Nadziewarka Thy1.1Kreator wektorów 
Przeciwciało PE-CD45 (30-F11) Legenda biologiczna 103105
PECy7 przeciw myszom TCRb  (H57-597)Tonbo
Anty mysz PercpCy5.5 CD45.1 (A20)eNauki biologiczne 
Platyna-E (Platyna-E) biolaboratoria komórkowe. Inc Samochód RV-101
Żółty barwnik fluorescencyjny Termonauka 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, L., et al. Structure, function and drug discovery of GPCR signaling. MolBiomed. 4 (1), 46(2023).
  2. Lammermann, T., Kastenmuller, W. Concepts of GPCR-controlled navigation in the immune system. Immunol Rev. 289 (1), 205-231 (2019).
  3. Fu, H., Ward, E. J., Marelli-Berg, F. M. Mechanisms of t cell organotropism. Cell Mol Life Sci. 73 (16), 3009-3033 (2016).
  4. Cinalli, R. M., et al. T cell homeostasis requires g protein-coupled receptor-mediated access to trophic signals that promote growth and inhibit chemotaxis. Eur J Immunol. 35 (3), 786-795 (2005).
  5. Wu, V., et al. Illuminating the onco-GPCRome: Novel g protein-coupled receptor-driven oncocrine networks and targets for cancer immunotherapy. J Biol Chem. 294 (29), 11062-11086 (2019).
  6. Wu, V. H., et al. The GPCR-alpha(s)-pka signaling axis promotes T-cell dysfunction and cancer immunotherapy failure. Nat Immunol. 24 (8), 1318-1330 (2023).
  7. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Stable gammaretroviral vector expression during embryonic stem cell-derived in vitro hematopoietic development. Mol Ther. 14 (2), 245-254 (2006).
  8. Plat-E retroviral packaging cells (RV-101) user manual. , Cell Biolabs. https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/RV-101-plat-e-retroviral-packaging-cells.pdf (2024).
  9. Anderson, J., Hope, T. Intracellular trafficking of retroviral vectors: obstacles and advances. Gene Ther. 12, 1667-1678 (2005).
  10. Kim, E., et al. Isolation and analyses of lamina propria lymphocytes from mouse intestines. STAR Protoc. 3 (2), 101366(2022).
  11. Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  12. Miltenyi Biotec. CD90.1 MicroBeads mouse and rat. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_3ea1u0fdf5423ci3qg8mc8rl4c?content-disposition=inline accessed (2024).
  13. Ocón, B., et al. A lymphocyte chemoaffinity axis for lung, non-intestinal mucosae and CNS. Nature. 635, 736-745 (2024).
  14. Sumida, H., et al. Gpr55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), eaao1135(2017).
  15. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J. Cell Biol. 139 (5), 1349-1360 (1997).
  16. Alawar, N., et al. A solution for highly efficient electroporation of primary cytotoxic T lymphocytes. BMC Biotechnol. 24 (1), 16(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lokalizacja zale na od GPCRtrafficking limfocyt w Tcytometria przep ywowamikroskopia konfokalnawirus kom rek macierzystychpozycjonowanie kom rekmigracja kom rek odporno ciowych

Powiązane artykuły