Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67765

⸱

17 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

W tym artykule

Podsumowanie

Procedura ta ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami za pomocą 2H2O lub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Buhaje znakowane deuterem są kojarzone z matkami nieoznakowanymi. Pobrane zarodki przedimplantacyjne są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu oddzielenia metabolitów ojcowskich (deuterowanych) od matczynych (niedeuterowanych).

Streszczenie

Wkład ojców w genetykę zarodków był do tej pory ograniczony do sekwencji alleli przez dziesięciolecia. Dekada wyników sugeruje natomiast, że czynniki epigenetyczne – metylacja DNA, modyfikacje histonów, organizacja chromosomów i regulatorowe RNA – odgrywają kluczową rolę w dziedziczeniu ojcowskim i wpływają na rozwój embrionalny i ekspresję genów zygoty. Wraz z kwasami nukleinowymi metabolom plemników (lipidy, węglowodany, wolne aminokwasy) może działać jako sygnał epigenetyczny. Protokół ten ma na celu identyfikację metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu za pomocą spektrometrii mas. Procedura obejmuje znakowanie plemników stabilnymi izotopami za pomocą 2H2Olub U13C Glukozy w celu prześledzenia, za pomocą metabolomiki, ojcowskich metabolitów przenoszonych do oocytu podczas zapłodnienia. Ogólnym celem protokołu jest ujawnienie roli ojcowskiego metabolomu plemników w podatności potomstwa na dysmetabolizm i może on zostać dostosowany do uzyskania wglądu w to, w jaki sposób warunki środowiskowe, takie jak dieta i narażenie na zanieczyszczenia, zmieniają ojcowskie komunikaty metaboliczne, potencjalnie wpływając na zdrowie potomstwa i predyspozycje do cukrzycy, otyłości, i choroby układu krążenia.

Wprowadzenie

Epigenom ojcowski wpływa na podatność potomstwa na dysmetabolizm
W przeciwieństwie do mnóstwa ról przed i po poczęciu wykorzystywanych przez matki podczas rozwoju zarodka, od dziesięcioleci uważa się, że wkład plemników jest wyłącznie genetyczny. Zgodnie z teorią dziedziczenia genetycznego ojcowski wkład w zmienność fenotypową osobnika (w tym jego podatność na choroby) musiał być przypisany wyłącznie sekwencji genetycznej wariantów alleli dziedziczonych po ojcu i ich interakcjom z wariantami odziedziczonymi pomatce1. W dzisiejszych czasach jasne jest, że allele nie są jedynymi wiadomościami genetycznymi przekazywanymi przez ojca swojemu potomstwu podczas zapłodnienia, a zamiast tego wiele sygnałów epigenetycznych przyczynia się do dziedziczenia ojcowskiego 2,3,4. Dotychczas zidentyfikowane sygnały epigenetyczne obejmują: (1) grupy metylowe kowalencyjnie dodawane do cytozyn genomu rodzicielskiego 5,6,7, (2) modyfikacje potranslacyjne (acetylacja, metylacja) histonów związanych z chromosomami plemników i dostarczanych do oocytów8, (3) organizację 3D chromosomów ojcowskich prowadzącą do interakcji wewnątrzchromosomalnej (znaną również jako domeny asocjacyjne topologicznie, TAD) utrzymujące się w zygocie9,10 i (4) regulatorowe cząsteczki RNA (miRNA, fragmenty pochodzące z tRNA i RNA oddziałujące z piwi)11,12, a także rRNA13 i tRNA14 uwalniane z plemników do oocytu podczas zapłodnienia.

Epigenom ojcowski jest ważnym nośnikiem informacji dla potomstwa. Informacje ojcowskie będą miały wpływ na zygotę, zarodek podczas jego rozwoju, a po urodzeniu na skłonność potomstwa do dysmetabolizmu i chorób. To niemendlowskie dziedziczenie (określane jako międzypokoleniowe lub międzypokoleniowe w zależności od tego, czy dotyczy jednego, czy wielu kolejnych pokoleń) jest uważane przez wielu autorów za jeden z ukrytych czynników odpowiedzialnych za drastyczny wzrost chorób dysmetabolicznych występujących w rozwiniętychkrajach zachodnich. Rzeczywiście, zgodnie z teoriami PoHaD (Ojcowskie Pochodzenie Zdrowia i Choroby) i DoHaD (Rozwojowe Pochodzenie Zdrowia i Choroby), rodzicielski wkład epigenetyczny jest jednym z czynników predysponujących potomstwo do rozwoju cukrzycy, otyłości i chorób sercowo-naczyniowych w wieku dorosłym16,17. Co ciekawe, epigenom rodzicielski jest wyjątkowo podatny na bodźce środowiskowe i mogą na niego wpływać warunki metaboliczne (takie jak zażywanie narkotyków, nawyki żywieniowe i sprawność metaboliczna)18, a także parametry ściśle środowiskowe (takie jak narażenie na zanieczyszczenia, relacje społeczne oraz stres psychiczny i relacyjny)5,11. Każdy z wyżej wymienionych bodźców może więc zmieniać epigenomy komórek rozrodczych (plemników i oocytów) i wpływać na przyszłe pokolenia.

Konsumpcja diety wysokotłuszczowej (HFD) stanowi jeden z najszerzej badanych bodźców środowiskowych, który może zmieniać epigenom ojca i prowadzić do szkodliwych wiadomości dostarczanychpotomstwu. Bodziec ten wpływa na fenotyp potomstwa (do trzeciego pokolenia), które często wykazuje większą skłonność do rozwoju dysmetabolizmu, niezależnie od spożycia kalorii. Potomstwo ojca spożywającego HFD wykazuje opóźnienie wzrostu, nietolerancję glukozy i insulinooporność zarówno u myszy, jak i szczurów20,21. U ludzi dziedziczenie epigenetyczne badano przede wszystkim w pokoleniach urodzonych w okresach głodu lub przekarmienia i bezpośrednio po nich22. W kohorcie Överkalix dostępność pożywienia dziadków ze strony ojca w okresie ich powolnego wzrostu była skorelowana z ogólnym ryzykiem śmiertelności, chorobami sercowo-naczyniowymi, BMI, obwodem talii i masą tłuszczową ich wnuków23. Ostatnio dowody na ojcowską transmisję międzypokoleniową zostały potwierdzone w innych kohortach24.

Metabolity ojcowskie biorące udział w dziedziczeniu międzypokoleniowym
Pomimo dowodów klinicznych i epidemiologicznych, szczegóły molekularne dziedziczenia międzypokoleniowego przez ojca pozostają niejasne. Na początku identyfikacja wszystkich molekularnych przetworników informacji epigenetycznej nie została jeszcze zakończona. Dowody naukowe sugerują, że składnik nukleinowy plemników sam w sobie nie może wyjaśnić złożoności dziedziczenia międzypokoleniowego. Różnice w metylacji DNA zostały rzeczywiście zmierzone w plemnikach myszy i szczurów karmionych HFD, ale u tak niskiego odsetka populacji plemników, że nie może to tłumaczyć wysokiej penetracji fenotypu dysmetabolicznego obserwowaneju potomstwa. Z drugiej strony, pula sygnalizacyjnych RNA przenoszonych z plemników do oocytów ma bardzo krótki okres półtrwania i, chociaż może wpływać na ekspresję genu zygotycznego, wydaje się mało prawdopodobne, aby utrzymała się w efektywnych stężeniach po zapłodnieniu, w zygocie w zarodkach dnia 2, dnia 3, w morulach i blastocystach. Wydaje się więc oczywiste, że w mechanizm dziedziczenia międzypokoleniowego muszą być zaangażowane nowe determinanty molekularne.

Wraz z kwasami nukleinowymi plemniki wnoszą również składniki metabolomiczne do zygoty, takie jak lipidy, węglowodany i aminokwasy 26,27,28,29. Metabolity te, szczególnie te obdarzone aktywnością modulacyjną, mogą wpływać na ekspresję genów zygotycznych i rozwój embrionalny, a tym samym mogą działać jako sygnały epigenetyczne30. Ponadto, podobnie jak w przypadku kwasów nukleinowych, na stężenie i względną obfitość tych metabolitów w plemnikach mogą wpływać warunki środowiskowe doświadczane przez ojca, a tym samym stanowić nośniki informacji dla potomstwa 28,30,31,32,33,34. Rzeczywiście, wykazano, że metabolom dojrzałych plemników zależy od stanu zdrowia ojca i zależy od czynników środowiskowych, takich jak dieta, ćwiczenia fizyczne, substancje toksyczne i substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego.

Zrozumienie roli metabolitów plemników w rozwoju embrionalnym jest skomplikowane z powodu kilku ograniczeń technicznych: (1) różnica wielkości między plemnikiem a oocytem, która skutkuje minimalnym udziałem masy metabolicznej plemników dla zygoty, oraz (2) kilka zmian metabolomicznych, którym ulega plemnik podczas etapów produkcji (spermatogeneza), dojrzewania najądrza, wytrysk i fuzja z oocytem.

Wahania metabolomu plemników podczas dojrzewania plemników
U ssaków plemniki są wytwarzane w jądrach w wyniku spermatogenezy, procesu zależnego od spermatogoniów komórek macierzystych, w którym zaangażowane plemniki przekształcają się w pierwotne spermatocyty, które wchodzą w mejozę i wytwarzają okrągłe haploidalne plemniki. Morfogeneza tych komórek do plemników zachodzi poprzez spermiogenezę, masywną morfofunkcjonalną przebudowę spermatydów, od komórek okrągłych do wydłużonych/zagęszczonych/wysoce wyspecjalizowanych komórek, odpowiadających ostatniej fazie spermatogenezy. Jednak powstałe plemniki są nieruchome i nie są jeszcze zdolne do zapłodnienia35. Po nasieniu, gdy plemniki są uwalniane z jądra rete do najądrza, plemniki oddziałują z komórkami nabłonka najądrza i angażują się w białka i pęcherzyki egzosomalne wydzielane przez te komórki (najądrza, bogate w sfingomielinę i kwas arachidonowy). Przejście przez najądrza umożliwia plemnikom osiągnięcie pełnej dojrzałości i, nawet jeśli są utrzymywane w stanie precapacitowanym, nabywają zdolność do ruchliwości36. Podczas pasażu najądrza błona plemnika staje się bardziej ujemnie naładowana i wzbogacona w sfingomielinę. Błona plemnika staje się również bardziej płynna z powodu postępującego obniżenia poziomu cholesterolu i jednoczesnego wzrostu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (głównie kwasów arachidonowego, dokozapentaenowego i dokozaheksaenowego). Po wytrysku, w żeńskich drogach rodnych, białka płynu nasiennego i albuminy sprzyjają kapacytacji plemników, promując hiperpolaryzację i napływ wapnia w celu aktywacji ruchliwości plemników. Błona plazmatyczna zpojemnościonych plemników wykazuje dodatkowo zwiększoną płynność, niski stosunek cholesterolu do fosfolipidów oraz obniżoną zawartość kwasu sjalowego, gangliozydu GM1 i trójglicerydów31,37.

Przed spotkaniem z oocytem plemnik przechodzi reakcję akrosomową, fuzję akrosomu (błoniastych organelli pochodzących od Golgiego, która pokrywa przednią część jądra plemnika i powstaje podczas spermiogenozy) z błoną plazmatyczną plemnika, która ułatwia reorganizację błony plazmatycznej plemnika i zdolność do przenikania przez osłonkę przejrzystą (ZP), matrycę glikoprotein otaczającą oocyt35, Lokal mieszkalny 38. Ostatnim etapem jest hemifuzja między plemnikiem a błoną oocytów, promowana przez białka plemników IZUMO1, SPACA6 i TMEM9539, powoduje włączenie lipidów plemników do błon oocytów i przeniesienie zawartości nukleinowej i metabolicznej do oocytu.

Uzasadnienie zabiegu
Celem tej procedury jest identyfikacja metabolitów transportowanych przez plemniki i przekazywanych do komórki jajowej w momencie zapłodnienia (ryc. 1). Aby odróżnić metabolity pochodzące z plemników i oocytów w zygocie, plemniki znakuje się deuterem (2H, izotop wodoru) lub 13C (izotop węgla) przy użyciu znakowania metabolicznego in vivo tlenkiem deuteru, 2H2O40 lub jednolicie znakowanym U13C Glukoza41. Samce myszy znakowane izotopami są następnie kojarzone z nieznakowanymi samicami, aby ostatecznie zebrać zygoty, morule i blastocysty. Zarodki we wczesnym stadium rozwoju są przetwarzane w celu ekstrakcji (1) metabolitów polarnych, (2) metabolitów niepolarnych i (3) steroli. Metabolomy są następnie analizowane przy użyciu technik spektrometrii mas. Metabolity znakowane izotopowo (ojcowskie) zostaną zidentyfikowane i odróżnione od metabolitów nieznakowanych (matczynych), jednoznacznie wykazując ich ojcowskie pochodzenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Uniwersytecie Fryderyka II w Neapolu we Włoszech. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Selekcja i grupowanie samców C57BL/6J

  1. Wybierz samce C57BL/6J w wieku około 12 tygodni.
  2. Podziel samce na dwie grupy i nazwij je ZNAKOWANE (poddawane znakowaniu stabilnymi izotopami) lub NIEZNAKOWANE (używane jako kontrola i do pomiaru skuteczności znakowania izotopowego w plemnikach i morulach).
  3. Aby opróżnić najądrze z nieoznakowanych plemników, pozwól samcom na kojarzenie się ze sparowanymi samicami.

2. Stabilne znakowanie izotopowe samców C57BL / 6J

  1. W przypadku stosowania 2H2O do znakowania in vivo , należy przygotować 10% v/v 2H2O - wzbogaconą wodą do użycia jako woda pitna, mieszając 100 ml 2H2O z 900 ml wody z kranu. W przypadku stosowania U13C-Glucose do znakowania in vivo , należy przygotować 5%-15% wody U13C-Glucose do użycia jako woda pitna, rozpuszczając 50-150 g U13C-Glucose w 1 L wody z kranu;
    UWAGA: Długotrwałe spożywanie 2H2O jest toksyczne dla myszy. Ustaw dla każdego konkretnego szczepu myszy, maksymalną ilość 2H2O do dodania do wody pitnej, aby osiągnąć maksymalną skuteczność etykietowania i minimalne skutki uboczne. Długotrwałe spożywanie glukozy powoduje hiperglikemię i cukrzycę u myszy. Ustaw maksymalną ilość U13C-Glucose do dodania do wody pitnej, aby osiągnąć maksymalną skuteczność etykietowania i minimalne skutki uboczne.
  2. Zastąp butelki z wodą na te zawierające wodę pitną znakowaną izotopowo i pozwól myszom pić ją przez 2,5-5 tygodni (obejmując co najmniej połowę spermatogenezy), odnawiając płyn dwa razy w tygodniu.
  3. Pod koniec okresu leczenia pozwól oznakowanym samcom na kojarzenie się z samicami z superowulacją.

3. Superowulacja kobiet C57BL/6J

  1. Wybierz samice w wieku około 4 tygodni o wadze od 12,5 do 14 g, w wieku przedpokwitaniowym.
  2. Wywołać dojrzewanie pęcherzyka przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 IU/50 μL/mysz PMSG (surowica ciężarnej klaczy).
  3. Po 47 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo hormon luteinizujący HCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa, 5 IU / 50 μL / mysz), aby przyspieszyć zakończenie dojrzewania pęcherzyka i wywołać owulację oraz tworzenie ciałka żółtego.
  4. Po wstrzyknięciu HCG pozwól samicom kojarzyć się z myszami ZNAKOWANYMI i NIEZNAKOWANYMI, zgodnie z krokiem 1 na rysunku 1.
  5. Po kryciu wykonaj kontrolę czopa dopochwowego42. Oddziel pozytywne samice i umieść je w klatce.

4. Pobieranie zarodków przed implantacją przez płukanie

  1. Składaj w ofierze samice z czopem pochwowym zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami (2,5 dnia po stosunku w celu pobrania moruli).
  2. Ułóż zwierzęta w pozycji grzbietowej na stole; Zwilż brzuch 70% etanolem i wykonaj szeroką laparotomię.
  3. Usuń macicę z jednej strony, ściskając szyjkę macicy i przecinając ogonowy koniec szyjki macicy; z drugiej strony, poprzez nacięcie na końcu rogu macicy (część lejkowata).
  4. Umieść macicę na szalce Petriego z PBS, aby ją wypłukać, a następnie przenieś ją na inną czystą szalkę Petriego, aby uniknąć obecności pozostałości.
  5. W celu przepłukania macicy należy załadować strzykawkę o pojemności 2,5 ml z pożywką hodowlaną i przymocować ją do igły Hamiltona o sile 33 G z końcówką.
  6. Włóż igłę do lejka jajowodu przygotowanego zgodnie z powyższym opisem i umyj całą macicę.
  7. Zbierz morule w kropli pożywki hodowlanej, aby zmyć je z resztek błony śluzowej i krwi.
  8. Pobrane próbki należy przenieść do nowych probówek zbiorczych i pogrupować je w OZNAKOWANE MORULE i NIEOZNAKOWANE MORULE, w zależności od tego, czy pochodzą one z wydarzeń krytych z udziałem buhajów OZNAKOWANYCH czy NIEOZNAKOWANYCH. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie.
  9. Złóż w ofierze grupę niepokrytych, superowulowanych samic (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) w celu zebrania niezapłodnionych oocytów. Przenieś pobrane próbki do nowych probówek zbiorczych i oznacz je jako NIEOZNAKOWANE OOCYTY. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie.

5. Pobranie nasienia z ogona najądrza

  1. Składanie w ofierze buhajów OZNAKOWANYCH lub NIEOZNAKOWANYCH.
  2. Ułóż zwierzęta w pozycji grzbietowej na stole, zwilż brzuch 70% etanolem i wykonaj szeroką laparotomię.
  3. Usuń najądrza i natychmiast zanurz je w 3 ml PBS (pH 7,6) i luźno je pokrój, aby odprowadzić plemniki z przewodów.
  4. Przefiltruj próbki nasienia przez gazę.
  5. Odwirować plemniki w temperaturze 800 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej).
  6. Zawiesić osad w 1 ml zimnej wody dejonizowanej. Tylko plemniki będą odporne na roztwór hipotoniczny podczas gdy komórki nieplemnikowe pękną.
  7. Odwirować plemniki o masie 800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Oznacz probówki i pogrupuj je jako ZNAKOWANE PLEMNIKI i NIEZNAKOWANE PLEMNIKI, w zależności od tego, czy zostały pobrane od OZNAKOWANYCH czy NIEOZNAKOWANYCH buhajów.
  9. Próbki należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

6. Ekstrakcja lipidów i metabolitów polarnych

  1. Zrównoważyć próbkę z etapów 1-5 w temperaturze 4 °C na lodzie.
  2. Do próbek dodać 225 μl lodowatego metanolu (MeOH) i inkubować w temperaturze -30 °C przez 1 minutę, a następnie umieścić je w łaźni sonicznej na 10 minut.
    1. Opcjonalnie: podczas ustalania warunków doświadczalnych należy dodać 0,1-2 ppm zarówno chlorowodorku C16-Ceramide-13 C3-15 N, jak i chlorowodorku L-lizyny-ε-15N jako wzorców wewnętrznych w celu pomiaru efektywności ekstrakcji odpowiednio dla metabolitów niepolarnych i polarnych.
  3. Dodać 750 μl lodowatego eteru metylowo-tert-butylowego (MTBE) w termomikserze przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C (550 obr./min).
  4. Dodać 188 μlH2Odo próbek po ich odwirowaniu. Oddzielić górne fazy (lipidy) od dolnej fazy (metabolity polarne) i wysuszyć je.
    UWAGA: MeOH powoduje ślepotę i uszkodzenie wątroby, nerek i serca w przypadku połknięcia. Nadmierna ekspozycja ma kumulatywny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy. MTBE może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Praca pod wyciągiem.
  5. Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy masy/spektrometrii.
    UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy, w oczekiwaniu na analizę masy/spektrometrii. W celu identyfikacji metabolitów mniej reprezentowanych w zarodkach przedimplantacyjnych może być konieczne zebranie próbek uzyskanych z tej samej pary kryjącej i zdarzenia krycia.

7. Ekstrakcja steroli

UWAGA: Unikaj używania plastikowych rurek i końcówek [zostaną rozpuszczone przez niepolarny rozpuszczalnik organiczny]; zamiast tego używaj szklanych probówek i szklanych pipet Pasteura do dozowania płynów.

  1. Zrównoważyć próbkę z etapów 1–5 w temperaturze 4 °C na lodzie. Ponownie zawiesić pobrane próbki w 500 μl roztworu metanolu/H20 70% v/v i przenieść zawiesinę do szklanej probówki.
    1. Homogenizować przez wirowanie przez 30 s. Pozostawić homogenat na 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    2. Opcjonalnie: ustalając warunki doświadczalne, dodać 0,1-2 ppm steroli roślinnej Sitostanol-5,6,22,23-d4 jako wzorce wewnętrzne do pomiaru efektywności ekstrakcji steroli.
      UWAGA: MeOH powoduje ślepotę i uszkodzenie wątroby, nerek i serca w przypadku połknięcia. Nadmierna ekspozycja ma kumulatywny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy.
  2. Odwirować próbkę o masie 3,220 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do czystej szklanej probówki i uzupełnić ją 500 μl PBS.
  3. Dodaj 7 ml lodowatego eteru dietylowego i wiruj przez 1 minutę. Pozostaw próbkę na 1-2 minuty i poczekaj na rozdzielenie faz. Zamrozić, zanurzając rurkę w kąpieli suchego lodu/acetonu. Przenieść niezamrożoną fazę eteru dietylowego do nowo oznakowanej szklanej probówki.
    UWAGA: Eter dietylowy jest niezwykle łatwopalną cieczą i parą i rozkłada się na wybuchowe nadtlenki w powietrzu i świetle. Nie pracuj w bliskim kontakcie z płomieniami. Eter dietylowy jest niebezpieczny w przypadku połknięcia i szkodliwy dla skóry.
  4. Rozmrozić fazę wodną w temperaturze 37 °C i powtórzyć krok 4.3. Połączyć fazy eteru dietylowego zebrane w krokach 4.3-4.4 w jednej szklanej probówce.
  5. Wysuszyć próbkę za pomocą koncentratora próżniowego. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu analizy masy/spektrometrii.

8. Derywatyzacja próbki

UWAGA: Próbki skorzystałyby na derywatyzacji TMS do analizy określonych metabolitów (cholesterolu, kwasów tłuszczowych, aminokwasów).

  1. Zrównoważyć próbki w temperaturze pokojowej
    UWAGA: Niepełna równowaga może spowodować kondensację wody atmosferycznej na ściankach rur i próbkach. Woda ostro konkuruje o derywatyzację TMS.
  2. Rozpuścić próbki w 50 μl pirydyny i pochodną przez dodanie 25 μl N,O-bis(trimetylosililo(TMS)trifluoroacetamidu (BSTFA). Inkubować próbki przez 90 minut w temperaturze 60 °C. Odwirować próbki i natychmiast przystąpić do analizy GC-MS.
    UWAGA: Pirydyna jest łatwopalna, drażniąca i toksyczna. BSTFA jest łatwopalny, i drażniący. Pracuj pod wyciągiem i używaj rękawic ochronnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu monitorowania transferu metabolitów z plemnika do oocyty, morule wyizolowane od samic C57 BL/6J kopulowanych z samcami z grup ZNACZNIKOWANEJ (LABELED) i NIEZNACZNIKOWANEJ (UNLABELED) są zbierane i analizowane za pomocą metabolomiki opartej na spektrometrii mas. Metabolity wyekstrahowano zgodnie z opisem w krokach 6-7 i poddano derywatyzacji TMS zgodnie z opisem w kroku 8. Wykonano profilowanie metabolomiczne i lipidomiczne znacznikowych morul, nieznacznikowych morul, nieznacznikowych oocytów oraz znacznikowych i n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia identyfikację metabolitów przenoszonych z plemników do oocytów podczas zapłodnienia za pomocą znakowania stabilnymi izotopami samców myszy za pomocą 2H2Olub U13C Glukozy, a następnie analizy metabolomicznej. Izotopowo znakowane metabolity znajdujące się w morulach są pochodzenia ojcowskiego.

Chociaż wodór i deuter są izotopami, nie są całkowicie identyczne pod względem zachowania chemicznego. Temperatury topnienia i wrzenia 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr 2H2O, 99,8 atomu % 2HSigma Aldrich756822
AcetonSigma Aldrich179124
Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, Kalifornia, Stany Zjednoczone)
C16-Ceramid-13C3-15NNorma LGCTRC-C342770-25MG
DichlorometanuSigma Aldrich34856
Eter dietylowy Sigma Aldrich673811
etanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (ludzka gonadotropina kosmówkowa,Sigma AldrichCG5-1VL
Chlorowodorek L-lizyny-ε-15NSigma Aldrich608971
Mężczyzna i kobieta  Myszy C57BL/6JOlaHsdInotiv C57BL/6JOlaHsd
eter metylowo-tert-butylowy (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-bis(trimetylosililo(TMS)
trifluoroacetamid (BSTFA)		Supelco powiedział:15238
PBSAplikacjaA0965-9010
PMSG (Klacz w ciąży) surowica)Lee Biosolutions493-10
PirydynaSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu powiedział:
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
trifluoroctan soduSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Daltoniki Bruker
TimsTOF Pro Q-TOF Daltoniki Bruker
U13C glukoza Sigma Aldrich389374
Kompletny RS3000 UHPLC Thermo Fisher Naukowy
Kolumna wstępna VanGuard CSHTM (5,0 &razy; 2,1 mm; 1,7 μ m, 130 & Aring ;)Wody

Bibliografia

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie stabilnymi izotopamitransfer plemnik w i oocyt wdziedziczenie epigenetyczneanaliza metabolomicznaekstrakcja lipid wmetabolity polarneznakowanie deuteremanaliza g wnych sk adowych
Znakowanie in vivo stabilnych izotopów do identyfikacji spektrometrii mas ojcowskich metabolitów przenoszonych z plemnika do oocytu podczas zapłodnienia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.